TW201710282A - 衍生自鮑氏不動桿菌噬菌體之新穎抗菌胜肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種抗菌胜肽，係衍生自鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)之噬菌體之溶菌酶。本發明亦關於包括該抗菌胜肽之殺菌組成物及使用該胜肽之活體外殺菌之方法。

Description

衍生自鮑氏不動桿菌噬菌體之新穎抗菌胜肽及其用途
本發明有關一種新穎之抗菌胜肽，尤係關於衍生自鮑氏不動桿菌噬菌體之抗菌胜肽。
1.鮑氏不動桿菌
鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii,AB)廣泛地存在於土壤、水、食物等自然環境中，也可以在正常人的皮膚表面上發現。鮑氏不動桿菌在革蘭氏染色後經光學顯微鏡觀察為紅色的球桿狀(coccobacilli)並且具有莢膜的構造，在生化特性上屬於非發酵性革蘭氏陰性的球桿菌，嗜氧性，不具運動性，觸酶(catalase)為陽性，能夠在42℃環境下生長，並且具有氧化10%乳糖的能力，適合的生長溫度為20℃到30℃之間。由於不挑剔生長條件，使得鮑氏不動桿菌廣泛存在於各種物體表面及無生命的環境，在乾燥的環境可以存活達13天以上，甚至兩個禮拜。由於這些優勢，使其能長期於醫院裡乾燥或潮濕的環境中存在，而成為了伺機性的病原菌(nosocomial pathogen)，對正常人比較少造成嚴重的感染，但卻容易使長期住院以及免 疫力低下的病患發生伺機性的感染。在1998年，台大醫院也首次分離出幾乎對所有抗生素都具抗藥性的鮑氏不動桿菌(pandrug-resistant A.baumannii)，簡稱PDRAB。除了台灣之外，世界各地也陸續出現對多種抗生素如：β-內醯胺類(beta-lactams)抗生素、胺基醣甘類(aminoglycosides)抗生素、氟喹啉酮類(fluoroquinolones)抗生素及碳青黴烯類(carbapenems)抗生素產生抗藥性的鮑氏不動桿菌。由此可見，無論在國內或國外，多重抗藥性的鮑氏不動桿菌，已成為不可忽視的問題。
2.噬菌體
噬菌體(Bacteriophage或phage)是一種能感染細菌的病毒，如同其他病毒，噬菌體的遺傳物質是由核酸和蛋白質所構成。當噬菌體要感染細菌時，噬菌體會注入遺傳物質，透過宿主的酵素來進行複製，當生存環境惡劣時，噬菌體就會組裝相關蛋白，破菌出去尋找下一個宿主。當噬菌體要破菌而出時所產生之相關蛋白質包括溶菌酶。溶菌酶可以破壞細菌的細胞壁，導致細菌體內滲透壓不平衡而破裂。
3.具抗菌能力之胜肽
自從英國科學家弗萊明發現了盤尼西林(penicillin)後，至今已有許多的抗生素被發現，並且利用修改及改變其化學結構來增加療效。近年來由於抗生素的濫用，使醫治具有抗藥性菌株越來越困難，面對具有抗藥性的細菌，就必需尋找新的抗生素來殺死細菌，因此新型態的抗菌藥 物研究是非常需要的。
在大自然中有許多種類的生物能製造具抗菌能力之胜肽作為先天性免疫對抗外來病原菌的的第一道防線。具抗菌能力之胜肽通常具有以下特性：(1)長度介於約12至約100個胺基酸所組成；(2)具有+2至+9價的靜電荷；(3)具有雙親性(amphipathic)(擁有疏水性(hydrophobic)及親水性(hydrophilic)區域)的結構。此類兼具陽離子及形成雙親性的特性，會使得胜肽更容易和帶有陰離子的細胞膜或微生物的磷脂膜產生交互作用甚至嵌入到膜中。具抗菌能力之胜肽廣泛分布在許多的生物體中，例如在蜜蜂刺裡的毒液中所發現的蜂毒肽(melittins)、在脊椎動物如比目魚中所發現的抗菌胜肽pleurocidin及在植物如小麥種子裡所發現的嘌呤硫素(purothionins)，甚至在人類的嗜中性白血球(neutrophils)、單核球細胞(monocyte)及T淋巴球細胞(T lymphocyte)中都可以發現到具抗菌能力之胜肽的存在。
然而，雖致病性微生物(如鮑氏不動桿菌)之抗藥性增加如此之迅速，但目前所發現之不管是由自然界或經由人為所改良的具抗菌能力之胜肽，其抗菌能力及抗菌範圍仍然遠遠不及抗生素。為了避免使用抗生素而增加致病性微生物抗藥性之風險，亟需可以有效殺菌且不會造成微生物抗藥性之殺菌方法。
本發明提供一種抗菌胜肽，係衍生自鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)之噬菌體之溶菌酶，其中，該噬 菌體係鮑氏不動桿菌噬菌體2號，且以登錄號BCRC 970047寄存於食品工業發展研究所。
根據本發明之一具體實施例，該抗菌胜肽係衍生自SEQ ID No.：1之胺基酸序列。於另一具體實施例中，該抗菌胜肽包括與SEQ ID No.：1具有至少72%之相似度之胺基酸序列。
根據本發明之一具體實施例，該抗菌胜肽之疏水性為-0.34至-1.26，雙親性為0.29至0.47，靜電荷為+4至+6。
根據本發明之一具體實施例，該抗菌胜肽具有與SEQ ID No.：2、SEQ ID No.：3、SEQ ID No.：4或SEQ ID No.：5相同之胺基酸序列。
於本發明之一態樣中，亦提供一種殺菌組成物，其包括抗菌胜肽及載體，其中，該抗菌胜肽係衍生自鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)之噬菌體之溶菌酶，且該噬菌體係以登錄號BCRC 970047寄存於食品工業發展研究所。
於本發明之又一態樣中，係提供一種活體外殺菌之方法，包括使該抗菌胜肽與細菌接觸。根據一具體實施例，該細菌為鮑氏不動桿菌，且該抗菌胜肽係對鮑氏不動桿菌具有殺菌能力。
第1圖為細菌之電子顯微鏡圖，其中顯示經LysAB2-113-145處理前後之細菌破壞情形，其中第1A圖 為處理前，第1B圖為經LysAB2-113-145處理後；第2圖為細菌之電子顯微鏡圖，其中顯示經LysAB2 113-145 G4處理前後之細菌破壞情形，其中第2A圖為處理前，第2B圖為經LysAB2 113-145 G4處理後，第2C圖為第2A圖之局部放大圖，第2D圖為第2B圖之局部放大圖；第3圖顯示細菌在明視野和螢光下之顯微鏡圖，顯示經LysAB2 113-145 G1進行殺菌後，FITC進入細菌之情形，其中第3A圖和第3B圖為僅添加磷酸緩衝液處理之負面對照組之明視野和螢光顯微鏡圖，第3C圖和第3D圖為添加LysAB2 113-145 G1一小時之明視野和螢光顯微鏡圖；第4圖為細菌在明視野和螢光下之顯微鏡圖，顯示經LysAB2 113-145 G4進行殺菌後，FITC進入細菌之情形，其中第4A圖和第4B圖為僅添加磷酸緩衝液處理之負面對照組之明視野和螢光顯微鏡圖，第4C圖和第4D圖為添加LysAB2 113-145 G4一小時之明視野和螢光顯微鏡圖。
以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習本技術領域者可由本說明書所揭示之內容了解本發明之其他優點及功效。
本發明提供一種具抗菌能力之胜肽，該胜肽係衍生自鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)之噬菌體之溶菌酶。根據本發明之一具體實施例，該噬菌體係為鮑氏不動桿菌噬菌體2號(BCRC 970047)。
於本文中所述之「胜肽」係指包含多於一個胺基酸單體的短鏈，其中該多於一個胺基酸單體之間係藉由醯胺鍵連接。必須注意的是，本文中所使用之胜肽之胺基酸單體並不限於天然胺基酸，該胜肽之胺基酸序列中亦可包括非天然胺基酸、類似結構之化合物、或是胺基酸之缺失。
於本文中所述之「抗菌能力」係利用最低抑菌濃度實驗和最小殺菌實驗之結果進行評估，該抗菌能力包括抑菌活性和殺菌活性。
於本文中所述之「結構參數」係指影響抗菌胜肽的抗菌活性和選擇性的性質，例如雙親性、構形(conformation)(如α-螺旋及β-褶板)、帶電性(charge)、極性角度(polar angle)、疏水性(hydrophobivity)及疏水性矩(hydrophobic moment)。結構參數是相互影響的，改變其中一種結構參數通常會導致其他參數之改變。
於本文中所述之「雙親性」係指胜肽的一端為疏水性另一端則親水性。於本文中所述之「疏水性矩」係一種用來測量胜肽雙親性程度的方法，可利用胜肽中各個胺基酸疏水性向量的總和來呈現。
此外，本發明提供包含該抗菌胜肽之殺菌組成物，該組成物可進一步包括載劑。此載劑之實例為賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、界面活性劑(如Tween 20、Tween 80)、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑或香料。
以下係藉由特定之具體實施例進一步說明本發明之特點之功效，但非用於限制本發明之範疇。
實施例1抗菌胜肽之設計和胺基酸序列分析
此實施例利用鮑氏不動桿菌噬菌體2號(已寄存於食品工業發展研究所，登錄號為BCRC 970047)溶菌酶(後文亦稱為LysAB2)之羧端作為設計新穎抗菌胜肽之模板。LysAB2之羧端區域為第113號胺基酸至第145號胺基酸(後文亦稱為LysAB2 113-145)，其序列是由SEQ ID No.：1所示。
LysAB2之羧端結構是以Multiple sequence alignment(clustalw_3D program in STRAP)(參見Gille C,Frommel C(2001)STRAP：editor for STRuctural alignments of proteins.Bioinformatics 17：377-378)分析軟體分析，結果顯示LysAB2的羧端被預測為具有雙極性之螺旋結構且靜電荷為+4，可能具有殺菌活性。
接著，修改LysAB2 113-145胜肽之結構參數，包括胜肽長度、分子量、疏水性(hydrophobicity)、疏水性矩、雙親性(relative H.moment)和靜電荷(charge)。藉由改變該結構參數，以合成出新的具抗菌能力之胜肽。修改結構參數時，係利用本技術領域中習知之生物資訊軟體，包括一級結構分析軟體和二級結構分析軟體，對結構參數進行預測。
其中，一級結構分析軟體可包括但不限於：ProtParam(http：//www.expasy.org/tools/protparam.html)，用來預測胜肽分子量；以及Pepstats(http：//www.ebi.ac.uk/emboss/)，用 來分析胜肽的靜電荷分布。而二級結構分析軟體可包括但不限於：Jpred 3(http：//www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/)；PSIPRED Protein Predictor(http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)；以及consensus hydrophobicity scale(CCS)，用來分析胜肽之疏水性與疏水性矩。該等分析軟體可經由Antimicrobial Peptide Database(APD)提供。
接著，針對上述之結構參數經修改之胜肽進行篩選，以獲得具抗菌活性的抗菌胜肽。經修改後之序列是交由明新生物科技公司合成胜肽，所得之4條衍生自鮑氏不動桿菌噬菌體溶菌酶之抗菌胜肽分別稱為LysAB2 113-145 G1、LysAB2 113-145 G2、LysAB2 113-145 G3及LysAB2 113-145 G4，其胺基酸序列分別由SEQ ID No.：2至5所示。
LysAB2 113-145與衍生之抗菌胜肽的序列及結構參數顯示於表1。
實施例2抗菌胜肽之抑菌/殺菌效果 最低抑菌濃度測定(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)
為了測試本發明之抗菌胜肽的抑菌效果，以肉湯稀釋法(broth microdilution test)測試抗菌胜肽對細菌之最低抑菌濃度(minimal inhibition concentration,MIC)，所代表的是能完全抑制細菌生長的最低具抗菌能力之胜肽濃度。
肉湯稀釋法操作步驟如下：挑取單一菌落，接種於3mL Muller-Hinton液態培養基(M-H broth，美國BBL公司，成分為每公升含：2g牛肉萃取物粉末、17.5g酸水解酪蛋白、1.5g可溶性澱粉)，以37℃培養2至6小時；再以M-H液態培養基調整菌液濃度至光學密度(optimal density)OD600為1(1×109CFU/mL)，再將菌液以10倍序列稀釋至5×105CFU/mL，取75μL至96孔盤，之後加入75μL之256μM的具抗菌能力之胜肽，混合數十次，之後將培養基置於37℃，培養箱培養20至24小時後觀察MIC之結果。
最小殺菌濃度測定(Minimum bactericidal concentration,MBC)
為了瞭解本發明之抗菌胜肽對於細菌的最小殺菌濃度，係取100μL上述所測得的最低抑菌濃度之抗菌胜肽用玻璃珠塗抹於適合的培養基表面，將培養基置於37℃下培養24小時，之後持續觀察三天，若無菌落生長，表示細菌已被殺死，此時能完全抑制細菌生長的最低抑菌胜 肽濃度即為最小殺菌濃度。
此實施例用於進行最低抑菌濃度和最小殺菌濃度實驗所使用之鮑氏不動桿菌菌株如表2所示。
根據本發明之一些具體實施例中所提供之具抗菌能力之胜肽之最低抑菌濃度與最小殺菌濃度的結果如表3所示。
結果顯示，無論針對鮑氏不動桿菌之標準菌株或具有多重抗藥性之鮑氏不動桿菌菌株，本發明所提供之抗菌胜肽皆可良好的產生抑菌和殺菌效果。
此外，如表3所示，LysAB2 113-145之最低抑菌濃度為64μM，而其最小殺菌濃度為64μM。相較於此，經過修改結構參數(如靜電荷及疏水性與雙親性)後，衍生自LysAB2 113-145之抗菌胜肽在較低濃度時即可對鮑氏不動桿菌產生抑菌和殺菌作用。而其中又以LysAB2 113-145 G4對鮑氏不動桿菌之抑菌/殺菌效果最佳，其最低抑菌濃度為4μM，其最小殺菌濃度4μM，其對於臨床多重抗藥鮑氏不動桿菌也表現出一樣優異的抑菌/殺菌效果(最低抑菌濃度為4μM；最小殺菌濃度為4μM)。
實施例3掃描式電子顯微鏡
為了觀察本發明之抗菌胜肽對細菌外觀上是否造成影響，係參考Mangoni,M.L.等人在Effects of the antimicrobial peptide temporin L on cell morphology, membrane permeability and viability of Escherichia coli.(Biochem J(2004)380：859-65)中所述的實驗，將80μM之抗菌胜肽添加至1×109CFU菌量之菌液，在37℃下培養1小時後，利用掃描式電子顯微鏡觀察菌體遭到破壞的情形觀察。
其結果第1及2圖所示，第1A圖為未經處理之負面對照組，第1B圖為經LysAB2 113-145胜肽處理。可以發現，未經抗菌胜肽處理的負面對照組，鮑氏不動桿菌外觀 完整且表面平滑，即一般所稱鮑氏不動桿菌為球桿菌之描述；而在加入具抗菌能力之胜肽處理之鮑氏不動桿菌，如第1B圖所示，可發現菌體表面不完整且有孔洞，甚至破裂，另外，也看到鮑氏不動桿菌從球桿狀變為近似圓球狀，周圍可以看到許多碎屑，此為細菌破碎後產生之碎屑。由此證實抗菌胜肽對鮑氏不動桿菌可以造成其菌體的外部結構不完整及對其外觀上的改變，進一步導致其菌體被破壞。
第2A圖為未經LysAB2 113-145 G4處理之負面對照組，第2B圖為經LysAB2 113-145 G4胜肽處理。第2C圖為第2A圖之局部放大圖，第2D圖為第2B圖之局部放大圖。可以發現，相較於未經抗菌胜肽處理的負面對照組，在加入具抗菌能力之LysAB2 113-145 G4胜肽處理之鮑氏不動桿菌表面不完整且有孔洞，周圍亦可以看到許多碎屑，且LysAB2 113-145 G4對鮑氏不動桿菌菌體外觀之影響，相較於LysAB2 113-145顯得更為廣泛且明顯。
實施例4抗菌胜肽對細菌細胞膜之通透性試驗
為了瞭解本發明之抗菌胜肽是否造成細菌細胞膜通透性改變，參考Mangoni M.L.et al.(2004)的方法，以螢光異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate,FITC)對細胞染色，觀察抗菌胜肽在細菌的細胞膜上是否導致通透性改變，而使FITC進入到細菌內部而呈現綠色螢光。
操作步驟如下：將鮑氏不動桿菌培養於37℃的LB液態培養基(來自加拿大BioShop Canada公司，成分為每公升含：5g NaCl、10g胰化蛋白、5g酵母萃取物)中， 當OD600大約等於1時，離心並以磷酸緩衝液(phosphate buffer,PBS)清洗、回溶；接著利用序列稀釋將菌量稀釋至2×109CFU/mL，取50μL菌液與50μL之LysAB2 113-145 G1於37℃下培養1小時，作為處理組，另外，取50μL菌液加入等量的PBS混合作為負面對照組；接著將1mL FITC溶液(6μg/mL於磷酸鈉緩衝液，Sigma公司)分別與處理組和對照組混合均勻，並滴在玻璃玻片上於37℃的溫度下靜置1小時；接著以螢光顯微鏡(fluorescence microscopy)觀察結果。
第3圖為經抗菌胜肽處理後之細菌在明視野和螢光之顯微鏡圖，其中第3A圖和第3B圖分別為負面對照組在明視野和螢光顯微鏡下觀察之結果，如第3A圖所示，在明視野下可以直接觀察菌體所存在的位置，而第3B圖是以螢光顯微鏡觀察，並無發現明顯的綠色(即FITC所呈現的顏色)，可得知以PBS處理鮑氏不動桿菌後，並不會對其細胞膜產生影響。又，第3C圖和第3D圖為加入LysAB2 113-145 G1之處理組分別在明視野和螢光顯微鏡下觀察之結果，第3C圖在明視野下可以直接觀察到菌體的存在之位置，而第3D圖是以螢光顯微鏡觀察，可以看到許多螢光綠色的菌體，由此結果發現本發明之具抗菌能力之胜肽對鮑氏不動桿菌之細胞膜產生影響，改變其通透性導致FITC染劑進入菌體內，使菌體產生綠色螢光。
第4圖則顯示經LysAB2 113-145 G4處理後之細菌在明視野和螢光下之顯微鏡圖，其中第4A圖和第4B圖為負 面對照組，分別顯示在明視野和螢光顯微鏡下觀察之結果，第4A圖在明視野下可以直接觀察菌體所存在的位置，而第3圖B是以螢光顯微鏡觀察，發現並無明顯的綠色(即FITC所呈現的顏色)，可得知以PBS處理鮑氏不動桿菌後，並不會對其細胞膜產生影響。又第4C圖和第4D圖為加入LysAB2 113-145 G4之處理組分別在明視野和螢光顯微鏡下觀察之結果，第4C圖在明視野下可以直接觀察到菌體的存在之位置，而第4D圖是以螢光顯微鏡觀察，可以看到許多螢光綠色的菌體，由此結果發現本發明之抗菌胜肽對鮑氏不動桿菌之細胞膜產生影響，改變其通透性導致FITC染劑進入菌體內，使菌體產生綠色螢光。
綜合上述可知，藉由本發明利用鮑氏不動桿菌噬菌體2號溶菌酶的胜肽序列為模板，並加以修改其結構參數所衍生之抗菌胜肽具有抑菌/殺菌活性，且其效果優於作為模板之鮑氏不動桿菌噬菌體2號溶菌酶胜肽。此外，上述結果亦證實本發明所提供之抗菌胜肽不僅對鮑氏不動桿菌標準菌株具有抗菌效果，對於具有多重抗藥性之鮑氏不動桿菌及臨床多重抗藥性之鮑氏不動桿菌菌株亦具有良好的抗菌能力。
上述實施方式僅為例示性說明本發明之原理及其功效，而非用於限制本發明。任何熟習此項技藝之人士均可在不悖離本發明之精神及範疇下，對上述實施例進行修飾與變化。因此，本發明之權利保護範圍，應如後述之申請專利範圍所列。
本案圖式均為實驗數據圖式，故無指定代表圖。

Claims (9)

  1. 一種抗菌胜肽，係衍生自鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)之噬菌體之溶菌酶，其中，該噬菌體係鮑氏不動桿菌噬菌體2號，且以登錄號BCRC 970047寄存於食品工業發展研究所。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之抗菌胜肽，係衍生自SEQ ID No.：1之胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之抗菌胜肽，其包括與SEQ ID No.：1具有至少72%之相似度之胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之抗菌胜肽，其具有與SEQ ID No.：2、SEQ ID No.：3、SEQ ID No.：4或SEQ ID No.：5相同之胺基酸序列。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之抗菌胜肽，係對鮑氏不動桿菌具有殺菌能力。
  6. 一種殺菌組成物，包括如申請專利範圍第1項所述之抗菌胜肽及載體。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之組成物，其中，該載體為賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、界面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑或香料。
  8. 一種活體外殺菌之方法，包括使如申請專利範圍第1項所述的抗菌胜肽與細菌接觸。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中，該細菌為鮑氏不動桿菌。
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