CN107022001A

CN107022001A - 一种分离的母乳内源性抗菌多肽及其应用

Info

Publication number: CN107022001A
Application number: CN201710341745.8A
Authority: CN
Inventors: 季晨博; 崔县伟; 郭锡熔; 王兴; 曹彦; 唐冉冉
Original assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Current assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Priority date: 2017-05-12
Filing date: 2017-05-12
Publication date: 2017-08-08

Abstract

本发明公开了一种分离的母乳内源性抗菌多肽及其应用，该多肽对小肠结肠炎耶尔森菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有显著抑菌效果，通过电镜扫描发现其主要通过破坏细菌细胞膜的完整性从而抑制细菌，利用该多肽可制备抗小肠结肠炎耶尔森菌、抗大肠杆菌、抗金黄色葡萄球菌的药物。

Description

一种分离的母乳内源性抗菌多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体地说涉及一种分离的母乳内源性抗菌多肽及其应用。

背景技术

自1939年第一种抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)从土壤芽孢杆菌中被分离以来，在不同生物中陆续发现了2490多种抗菌肽，并且新的抗菌肽还在不断地开发和鉴定中。抗菌肽是一类由5～100个氨基酸组成的寡肽，具有广谱的抗菌活性，作用靶标包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、病毒、寄生虫以及肿瘤细胞等，使它迅速成为潜在的治疗药物。

抗菌肽的杀菌机制包括通过破坏细胞膜的完整性，抑制蛋白、DNA和RNA的合成，或与胞内某些特定的靶标相结合从而杀死细菌。一般来说，一种抗菌肽仅对一类微生物有效，但是也有一些例外的抗菌肽针对不同的微生物具有不同的杀伤机制，例如抗菌肽indolicidin不仅可以通过渗透细胞抑制DNA的合成杀伤大肠杆菌，而且可以通过损伤真菌细胞膜杀伤真菌，还可以抑制HIV-整合酶抑制HIV活性。还有一些抗菌肽对不同类型微生物具有相同的杀伤模式，PMAP-23能够在细胞膜形成孔隙杀死真菌和寄生虫。抗菌肽不仅可以破坏微生物细胞膜而且可以抑制功能蛋白的合成产生快速杀伤效应的独特机制使其成为理想的抗生素替代品。耐药菌、生物被膜、滞留菌对传统抗生素具有很强的抗性，并且它们在感染中发挥着重要作用。利用抗菌肽破坏细胞膜的效应杀死耐药菌以及对生物被膜基质蛋白酶的作用清除生物被膜，可以有效控制感染的发生，因此具有潜在的开发应用价值。

目前多肽类药物由于其活性和安全性高、特异性强、成药性高，正快速进入市场。近年来，母乳已被鉴定出含有超过300种内源性多肽，其中抗菌肽作为母乳中重要的活性成分之一，是抵抗新生儿感染、消灭致病菌的有效武器，如：人乳铁蛋白来源的短肽hLF_(1-11)不仅可以抵抗耐药金黄色葡萄球菌感染，而且其衍生物在多种动物模型中表现出广谱的抗菌活性。此外，母乳内源性多肽含量丰富、种类繁多，与小分子药物相比，具有分子量小、活性高、无耐受性和毒副反应等优势，展现出母乳内源性多肽作为抗菌药物的良好潜质。因此，从母乳内源性多肽的角度进一步寻找抗菌肽将会给临床治疗带来新的突破口。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种分离的母乳内源性抗菌多肽，本发明还有一个目的是提供编码前述多肽的核苷酸，本发明还有一个目的是提供含有前述核苷酸序列的表达载体；本发明还有一个目的是提供前述表达载体转染的宿主细胞；本发明还有一个目的是提供含有前述多肽的组合物；本发明还有一个目的是提供前述多肽在制备抗小肠结肠炎耶尔森菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌药物上的应用。

技术方案：本发明所述的一种分离的母乳内源性抗菌多肽，其至少包含序列如SEQID NO.1所示的多肽片段。

序列SEQ ID NO.1为17个氨基酸组成的多肽(β-casein 190)，其本身对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森菌都有良好的抑制效果，对于含有该序列的更长的多肽片段，优选的长度应当不超过25个氨基酸，基于β-casein 190多肽在其上游和下游进一步连接有其他氨基酸，其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森菌同样也有抑菌效果，有的对其中某个菌种的抑菌效果更优秀。例如β-casein 201(氨基酸序列SEQ IDNO.3)对金黄色葡萄球菌和小肠结肠炎耶尔森菌的抑菌效果更优秀。而β-casein 204(氨基酸序列SEQ ID NO.4)不仅对金黄色葡萄球菌有良好的抑菌效果，对大肠杆菌的抑菌效果更优。前述多肽的氨基酸序列罗列如下：

序列编号	多肽名称	氨基酸序列	氨基酸数
				SEQ ID NO.1	β-casein 190	LNPTHQIYPVTQPLAPV	17
SEQ ID NO.2	β-casein 200	LLNPTHQIYPVTQPLAPV	18
				SEQ ID NO.3	β-casein 201	ELLLNPTHQIYPVTQPLAPV	20
SEQ ID NO.4	β-casein 204	LNPTHQIYPVTQPLAPVHNPIS	22
				SEQ ID NO.5	β-casein 205	LNPTHQIYPVTQPLAPVHNPISV	23

本发明所述的所有母乳内源性抗菌多肽都来源于人类母乳中的β-酪蛋白，结构稳定，不易在体内降解。所述多肽的获得可按照氨基酸序列通过固相合成方法获得；或者通过宿主微生物或细胞内克隆并表达携带编码所述多肽之一的核苷酸序列的DNA片段，通过现有的重组DNA技术制备获得。所使用的表达载体和宿主细胞均为重组技术为公众所知的。表达载体例如pET载体、pGEX载体；宿主细胞例如大肠杆菌(E.coli)，放线菌(Actinomycetes)，芽孢杆菌(Bacillus)，链霉菌(Streptomyces)，本发明所述的多肽可用常规的酶切方法将其从宿主细胞中分离，也可以通过常规的液相色谱法进行分离和纯化，上述的分离纯化方法都是本领域技术人员公知的技术。

本发明还提供编码前述多肽的核苷酸，其至少包含序列为SEQ ID NO.6至SEQ IDNO.10的核苷酸序列。

所述多肽可以单独应用，本发明还提供一种多肽组合物，该组合物含有SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.5任意一个多肽或多个多肽的组合。

所述多肽或所述多肽组合物可制备成药学上可接受的载体，包括但不限于胶囊、片剂、锭剂、丸剂、滴丸、栓剂、喷雾、乳膏、贴剂等形式。

本发明所述多肽对小肠结肠炎耶尔森菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有显著抑菌效果，通过电镜扫描发现其主要通过破坏细菌细胞膜的完整性从而抑制细菌。可用于制备抗小肠结肠炎耶尔森菌、抗大肠杆菌、抗金黄色葡萄球菌的药物。

附图说明

图1为试验例1中β-Casein 201的抑菌效果图；

图2为试验例1中β-Casein 204的抑菌效果图；

图3为试验例2中β-Casein 201荧光显微镜下观察的染色结果；

图4为试验例2中β-Casein 204荧光显微镜下观察的染色结果；

图5为试验例3的试验菌在β-Casein 201处理下的扫描电镜图；

图6为试验例3的试验菌在β-Casein 204处理下的扫描电镜图；

图7为试验例3的试验菌在β-Casein 201处理下的透射电镜图；

图8为试验例3的试验菌在β-Casein 204处理下的透射电镜图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。抑菌试验以两个优选方案β-casein 201、β-casein 204为代表进行，其余的多肽因与β-casein 201、β-casein 204的结构高度相似，且都为天然母源性内源肽的片段，其理化性质相似，经检验都具备一定的抑菌效果。

实施例1

委托上海科肽生物科技有限公司通过固相法合成如下序列：

SEQ ID NO.1 LNPTHQIYPVTQPLAPV

SEQ ID NO.2 LLNPTHQIYPVTQPLAPV

SEQ ID NO.3 ELLLNPTHQIYPVTQPLAPV

SEQ ID NO.4 LNPTHQIYPVTQPLAPVHNPIS

SEQ ID NO.5 LNPTHQIYPVTQPLAPVHNPISV

通过在线工具获取前述多肽序列的主要生物学参数如下：

SEQ ID NO.1

等电点(pI)为6.74，分子质量(Mw)为1888.20Da，具有17个氨基酸，较低的相对分子质量表明该抗菌多肽不易被蛋白酶水解。不稳定系数为50.86，表明该抗菌多肽较为稳定，不易被胃酸所降解破坏。脂溶指数和亲水性分别为108.82和-0.029，表现为弱的亲水性。

SEQ ID NO.2

等电点(pI)为6.74，分子质量(Mw)为2001.36Da，具有18个氨基酸，较低的相对分子质量表明该抗菌多肽不易被蛋白酶水解。不稳定系数为48.59，脂溶指数和亲水性分别为124.44和0.183，表现为弱的疏水性。

SEQ ID NO.3

等电点(DI)为5.24，分子质量(Mw)为2243.63Da，具有20个氨基酸，较低的相对分子质量表明该抗菌多肽不易被蛋白酶水解。不稳定系数为44.74，脂溶指数和亲水性分别为131.50和0.180，表现为弱的疏水性。

SEQ ID NO.4

等电点(pI)为6.92，分子质量(Mw)2436.88Da，具有22个氨基酸，较低的相对分子质量表明该抗菌多肽不易被蛋白酶水解。不稳定系数为51.03，脂溶指数和亲水性分别为101.82和-0.232，表现为弱的亲水性。

SEQ ID NO.5

等电点(pI)为6.92，分子质量(Mw)为2535.93Da，具有23个氨基酸，较低的相对分子质量表明该抗菌多肽不易被蛋白酶水解。不稳定系数为49.25，脂溶指数和亲水性分别为110.00和-0.039，表现为弱的亲水性。

上述序列都是来源于人类母乳中β-酪蛋白的天然序列，这五个序列除了通过化学固相合成法获得，还可以通过对长链多肽通过生物酶切技术获得，亦可通过宿主微生物或细胞内克隆并表达携带编码所述多肽之一的核苷酸序列的DNA片段，通过现有的重组DNA技术制备获得。

所使用的表达载体和宿主细胞均为重组技术为公众所知的。表达载体例如pET载体、pGEX载体；宿主细胞例如大肠杆菌(E.coli)，放线菌(Actinomycetes)，芽孢杆菌(Bacillus)，链霉菌(Streptomyces)，本发明所述的多肽可用常规的酶切方法将其从宿主细胞中分离，也可以通过常规的液相色谱法进行分离和纯化，上述的分离纯化方法都是本领域技术人员公知的技术。

编码上述多肽的核苷酸序列对应如下：

SEQ ID NO.6，编码氨基酸β-casein 190：CTTAACCCCACCCACCAGATCTACCCTGTGACTCAGCCACTTGCCCCAGTT；

SEQ ID NO.7编码氨基酸β-casein 200：CTACTTAACCCCACCCACCAGATCTACCCTGTGACTCAGCCACTTGCCCCAGTT；

SEQ ID NO.8编码氨基酸β-casein 201：GAACTTCTACTTAACCCCACCCACCAGATCTACCCTGTGACTCAGCCACTTGCCCCAGTT；

SEQ ID NO.9编码氨基酸β-casein 204：CTTAACCCCACCCACCAGATCTACCCTGTGACTCAGCCACTTGCCCCAGTTCATAACCCCATTAGT；

SEQ ID NO.10编码氨基酸β-casein 205：CTTAACCCCACCCACCAGATCTACCCTGTGACTCAGCCACTTGCCCCAGTTCATAACCCCATTAGTGTC。

实施例2

实施例1所述的多肽可以单独应用，除此之外，这些多肽还可以多肽组合物联合使用。多肽组合物中包含序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5中至少两个多肽，优选至少包含序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4两种多肽序列。

实施例3

本实施例提供前述实施例1所述的一种多肽，或者实施例2所述的多肽组合物可制备成药学上可接受的载体，例如：胶囊、片剂、锭剂、丸剂、滴丸、栓剂、喷雾、乳膏、贴剂等形式。

试验例1抑菌试验

抗菌多肽的合成与稀释

本试验实施例1中固相合成获得的抗菌多肽β-Casein 201和β-Casein 204多肽分别为例。取1mg多肽，用无菌双蒸水稀释成1mg/ml-20℃储存备用。

菌株及培养

大肠杆菌(E.coli，ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC25923)和小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica，ACTT23715)来源于美国菌种保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)。每3ml无菌LB培养基中(胰蛋白胨10g/L，酵母膏提取物5g/L，NaCl 10g/L)接种30ul菌种，于37℃恒温摇动培养至生长对数期。通过手持式细胞计数仪(Millipore Scepter 2.0)检测细菌浓度至1,000-5,000CFU/ml。

抑菌实验

LB固态培养基(LB培养基加入琼脂粉15g/L)，高温高压灭菌后冷却至50℃左右倒入10cm无菌培养皿中。采用琼脂糖孔穴扩散法即将两种处于生长对数期试验菌分别均匀接种至LB琼脂平板后，将带有β-Casein 201/β-Casein 204或无菌水(对照组)的无菌纸片放置于接种试验菌的LB琼脂平板。抗菌多在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低，在药物一定的扩散距离内，由于抗菌多的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与抗菌多的抑菌效应成正比。

如图1所示，图1是针对β-Casein 201的抑菌实验结果。其中，上排为对照组，下派为加入抑菌多肽的试验组；左右两图分别接种金黄色为葡萄球菌和小肠结肠炎耶尔森菌。从图中可以看出，加入多肽的纸片周围出现了明显的抑菌圈，而对照组(加灭菌双蒸水)则没有明显抑制区域，表明序列β-Casein 201对金黄色葡萄球菌和小肠结肠炎耶尔森菌均具有明显的抑制作用。

如图2所示，图2是针对β-Casein 204的抑菌实验结果。其中，上排为对照组，下派为加入抑菌多肽的试验组；左右两图分别接种大肠杆菌和金黄色为葡萄球菌。从图中可以看出，加入多肽的纸片周围出现了明显的抑菌圈，而对照组(加灭菌双蒸水)则没有明显抑制区域，表明序列β-Casein 204对大肠杆菌和金黄色为葡萄球菌均具有明显的抑制作用。

试验例2免疫荧光试验

采用LIVE/DEAD BacLight Kit L13152检测试剂盒(Thermo Fisher，USA)。将试剂盒内的A液和B液混合于5ml无菌双蒸水，绿色荧光核酸染料(SYTO 9)终浓度为6uM，红色荧光核酸染料(propidium iodide，PI)终浓度为30uM。细菌膜完整的显示绿色，膜破裂的显示红色。

准备25ml菌液，室温10,000rpm离心10min，去除上清液，保留沉淀。用2ml 0.85％NaCl溶液重悬沉淀。取1ml重悬液加入含20ml 0.85％NaCl溶液的50ml离心管中，室温孵育1h，每15min混合一次。1小时后室温10,000rpm离心10min，并用0.85％NaCl溶液洗涤2次后用10ml 0.85％NaCl溶液重悬。每毫升细菌悬液中加入3ul染色剂混合物彻底混匀，室温避光孵育15min。取5ul反应液滴至载玻片并盖上18mm盖玻片，于荧光显微镜下观察。

通过免疫荧光试验，如图3所示，与对照组相比，β-Casein 201处理组中，红色荧光增多(菌体细胞膜破裂，PI进入细胞核与核酸结合，显示红色荧光)，绿色荧光减少(菌体细胞膜完整，染成绿色)，说明该β-Casein 201对金黄色葡萄球菌和小肠结肠炎耶尔森菌均具有明显的杀伤作用。

如图4所示，β-Casein 204多肽处理组中，红色荧光增多(菌体细胞膜破裂，PI进入细胞核与核酸结合，显示红色荧光)，绿色荧光减少(菌体细胞膜完整，染成绿色)，说明β-Casein 204对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有明显的杀伤作用。

试验例3电镜观察试验

处于对数生长期的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和小肠结肠炎耶尔森菌分别于室温12,000离心3min后，用0.1M的PBS洗涤一次，并用PBS重悬。通过手持式细胞计数仪(Millipore Scepter 2.0)将菌液浓度调整为1×10⁸CFU/ml，并分别与抗菌多肽于37℃孵育1h，使抗菌多肽终浓度为100ug/ml，细菌与无菌双蒸水混合作为对照。1小时后，菌液多肽混合物于室温12,000离心3min，0.1M的PBS洗涤两次，去除上清液。

2.5％的戊二醛4℃固定4h，30％-50％-70％-90％-100％乙醇梯度脱水，每步骤15min并吹打混匀；将脱水后的菌液滴加之载玻片，通风厨干燥后将样品分别在-20℃、-20℃和-80℃冷冻过夜；样品送至南京医科大学进行扫描电镜观察；2.5％的戊二醛4℃固定4h，样品送至南京医科大学进行透射电镜观察。

通过扫描电镜发现，抗菌多肽处理组中，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和小肠结肠炎耶尔森菌均观察到细胞膜边缘粗糙不清晰的紊乱结构(如图5、图6试验组所示)，而对照组中均为完整连续光滑的膜结构(如图5、图6对照组所示)，说明β-Casein 201和β-Casein204通过破坏细菌细胞膜从而抑制细菌；进一步借助透射电镜可以清晰的观察到抗菌多肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和小肠结肠炎耶尔森菌的破坏。与对照组相比，β-Casein 201和β-Casein 204处理组中，细菌细胞膜几乎被完全破坏，出现大量气泡样结构，细胞内容物外泄，肌动蛋白细胞骨架几乎无法识别(如图7、图8试验组所示)，进一步说明了本发明的抗菌多肽对细菌的杀伤是通过破坏细菌细胞膜的完整性，使其失去活力。

<110> 南京市妇幼保健院

<120> 一种分离的母乳内源性抗菌多肽及其应用

<130> 17NJ2V0070008

<160> 10

<141> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Asn Pro Thr His Gln Ile Tyr Pro Val Thr Gln Pro Leu Ala Pro Val

1 5 10 15

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Leu Leu Asn Pro Thr His Gln Ile Tyr Pro Val Thr Gln Pro Leu Ala Pro Val

1 5 10 15

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Glu Leu Leu Leu Asn Pro Thr His Gln Ile Tyr Pro Val Thr Gln Pro Leu Ala Pro Val

1 5 10 15 20

<210> 4

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Leu Asn Pro Thr His Gln Ile Tyr Pro Val Thr Gln Pro Leu Ala Pro Val His Asn Pro Ile Ser

1 5 10 15 20

<210> 5

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Leu Asn Pro Thr His Gln Ile Tyr Pro Val Thr Gln Pro Leu Ala Pro Val His Asn Pro Ile Ser Val

1 5 10 15 20

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

CTGAACCCGACCCATCAGATTTATCCGGTGACCCAGCCGCTGGCGCCGGTG 51

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

CTGCTGAACCCGACCCATCAGATTTATCCGGTGACCCAGCCGCTGGCGCCGGTG 54

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

GAACTGCTGCTGAACCCGACCCATCAGATTTATCCGGTGACCCAGCCGCTGGCGCCGGTG 60

<210> 9

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

CTGAACCCGACCCATCAGATTTATCCGGTGACCCAGCCGCTGGCGCCGGTGCATAACCCGATTAGC 66

<210> 10

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

CTGAACCCGACCCATCAGATTTATCCGGTGACCCAGCCGCTGGCGCCGGTGCATAACCCGATTAGCGTG 69

Claims

1.一种分离的母乳内源性抗菌多肽，其至少包含序列如SEQ ID NO.1所示的多肽片段。

2.编码权利要求1所述多肽的核苷酸，其至少包含序列为SEQ ID NO.6所示的核苷酸片段。

3.含有权利要求2所述核苷酸的表达载体。

4.权利要求3所述表达载体转染的宿主细胞。

5.含有权利要求1或权利要求2所述多肽的组合物。

6.权利要求1所述多肽在制备抗小肠结肠炎耶尔森菌药物上的应用。

7.权利要求1所述多肽在制备抗大肠杆菌药物上的应用。

8.权利要求1所述多肽在制备抗金黄色葡萄球菌药物上的应用。