KR101825439B1 - 염산 처리에 의한 그람양성 박테리아 고스트의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 염산 처리에 의해 제조된 그람양성 박테리아 고스트 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 방법에 따라 제조된 그람양성균 박테리아 고스트는 그람양성균의 생균 콜로니 생성을 억제할 수 있는 염산의 최소 억제 농도(MIC)을 처리하여 배양하였을 때, 효과적으로 박테리아 고스트로 형성될 수 있으며, 상기 형성된 박테리아 고스트는 세포의 외막 형태를 온전히 보존하면서 세포질 내 단백질 또는 DNA가 잔존하지 않은 형태이기 때문에, 체내에 투여되었을 때 증식에 의한 2차 감염증 등의 부작용에 대한 위험이 적으므로, 본 발명의 방법에 따라 제조된 그람양성균의 박테리아 고스트는 그람양성균 감염증의 예방 또는 치료용 백신 또는 외래 항원 운반체로서 효과적으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 염산 처리에 의해 제조된 그람양성 박테리아 고스트 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
박테리아 고스트(bacteria ghost, bacterial ghost)는 미생물의 세포 내 구성물(세포질 함유물)을 제거하여, 내부는 비어있는 상태이지만 세포막은 외막(envelope)의 형태를 완전하게 유지하는 구조체로 간단히 정의할 수 있다. 박테리아 고스트는 세포 내 DNA 또는 유전물질이 결여된, 사실상 사균 상태이기 때문에 유전자 재조합 생물체(GMO)로 간주되지 않는다.
그러나, 박테리아 고스트는 생균의 외막 형태를 그대로 유지하기 때문에 외막에 존재하는 항원 결정부위(antigenic determinant)를 유지하고 있어, 기능적으로 생백신과 유사한 효과를 나타낼 수 있다. 특히, 세균 감염증을 치료하는데 있어서, 박테리아 고스트를 사용하는 백신(고스트 백신)은 비특이적인 다량의 세포질로 인한 면역 유도 저해가 없어, 외래적인 보조제(adjuvant)를 첨가하지 않고도 내재 면역과 적응면역 시스템을 쉽게 자극할 수 있다. 이러한 장점으로 인해, 박테리아 고스트를 이용한 백신은 저렴하면서도 종래의 화학약품 백신 등의 한계를 효과적으로 극복할 수 있는 대안으로서 인정받고 있다.
또한, 박테리아 고스트는 생균으로서의 증식 또는 병원성의 기능이 없어, 불활성화된(inactivated) 상태의 박테리아 고스트를 동물, 인간 혹은 식물의 특수한 조직이나 세포에 부착할 수 있다. 뿐만 아니라, 식물 세포 또는 동물 세포의 내부로 도입될 수 있기 때문에 재조합 항원이나 핵산을 표적 세포에 효과적으로 전달할 수 있는 운반시스템(delivery system)으로 활용할 수 있다.
이러한 박테리아 고스트를 생산하기 위한 다양한 방법들이 개발되어 있다. 박테리아 고스트를 생산하는 가장 일반적인 방법은 E 단백질 매개 용해법으로서, 박테리오파아지(bacteriophage) φX174 용해유전자 E를 클로닝한 플라스미드(plasmid)를 그람 음성균에 형질전환(transformation)하여 이를 발현시키는 방법이다. 형질전환된 박테리아는 E 유전자를 억제하였다가 온도 변화에 따라 E 단백질을 발현하는데, 합성된 E 단백질은 박테리아 표면 구조에 물리화학적 손상을 주지 않고 박테리아 세포막 및 세포벽에 막관통 터널을 형성하여 궁극적으로 세포구성물을 방출시킨다(비특허논문 0001). 이러한 방법에 있어서, 플라스미드를 클로닝할 때 항원 유전자를 원하는 단백질로 다양하게 바꿀 수 있으며, 기존의 형질전환기법과 배양법을 통해 대량 생산이 가능하다는 장점이 있다.
그러나, 상기 E 단백질 매개 용해법을 포함하는, 클로닝한 플라스미드의 형질전환을 통한 박테리아 고스트의 제조 방법을 위하여서, 다단계 과정의 분자생물학적 기술과 고가의 비용 및 장기간의 제조 시간을 수반한다는 단점이 있다. 따라서, 간단한 제조 기술, 저가의 생산 비용 및 시간을 절약할 수 있는, 박테리아 고스트의 대량 생산 방법이 요구되고 있다.
최근, 그람 음성균인 대장균(E. coli BL21 (DE3) pLysS)을 모델로 하여, 화학 물질인 SDS, 수산화나트륨(NaOH) 또는 과산화수소(H2O2)를 하여 박테리아 고스트를 제조하는 방법이 보고되었다(비특허문헌 0004). 이 외에도, 대장균(E. coli DH5α)에 최소억제농도(minimum inhibitory concentration; MIC)의 황산암모늄{(NH4)2SO4}, 염화칼슘(CaCl2) 또는 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)을 처리함으로써 세포벽에 영향을 미치도록 유도하여 박테리아 고스트를 제조하는 방법이 보고된 바 있다(특허문헌 0004).
대부분의 박테리아 고스트 및 이를 이용한 백신은 대장균 또는 살모넬라(salmonella)와 같은 그람음성균을 모델로 보고된 바가 대부분이다. 그람양성균을 적용한 박테리아 고스트 제조방법으로서, 그람음성균인 살모넬라 엔테티카(Salmonella enterica Enteriditis) 및 그람양성균인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 염기성인 수산화나트륨을 처리하여 박테리아 고스트로 제조하는 방법에 대하여 보고되었다. 이를 통해 제조된 살모넬라 또는 스타필로코커스의 박테리아 고스트는 실험동물에 면역접종되었을 때, 면역능을 유도하여 백신으로서의 가능성 또한 보고되었다(비특허문헌 0005 및 비특허문헌 0006).
그러나, 세포막에 존재하고 있는 항원결정기의 단백질은 종류에 따라 염기에 유리될 수 있는 경우가 발생할 수 있기 때문에, 염기성인 수산화나트륨을 처리하여 제조된 박테리아 고스트의 경우 백신으로서의 효과가 저감될 수 있다는 우려가 있다. 이를 극복하기 위하여, 산성 환경에서도 박테리아 고스트를 제조하는 과정에 대한 연구가 요구되고 있으나, 산(acid)을 이용한 박테리아 고스트에 대한 연구 및 특허는 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 산을 이용한 그람양성균의 박테리아 고스트 제조 방법을 개발하고자 노력한 결과, 그람양성균인 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)의 생균 콜로니 생성을 억제할 수 있는 염산의 최소 억제 농도(MIC)를 결정하였고, MIC의 염산을 처리하여 리스테리아 모노사이토게네스 균을 배양하였을 때 효과적으로 박테리아 고스트로 형성될 수 있으므로, 본 발명의 리스테리아 균을 이용한 그람양성균의 박테리아 고스트는 그람양성균 감염증의 예방 또는 치료용 백신 또는 외래 항원 운반체로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
Haidinger, W., et al. Applied and environmental microbiology 69.1 (2003): 468-474.
Ebensen, Thomas, et al. The Journal of Immunology 172.11 (2004): 6858-6865.
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이에, 본 발명자들은 염산의 처리를 통한 리스테리아 모노사이토게네스의 박테리아 고스트를 제조하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은, 그람양성균 박테리아 고스트의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법으로 제조된 그람양성균 박테리아 고스트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 그람양성균 박테리아 고스트를 유효성분으로 포함하는, 그람양성균 감염증 예방 및 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은
i) 그람양성균을 배지에 접종하여 배양하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 배양한 배양액으로부터 그람양성균을 수득하는 단계;
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 그람양성균에 염산을 처리하여 박테리아 고스트를 형성하는 단계; 및
iv) 상기 단계 iii)에서 형성한 박테리아 고스트를 수득하는 단계를 포함하는, 그람양성균 박테리아 고스트의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 그람양성균은 리스테리아균(Listeria sp.), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae), 탄저균(Bacillus anthracis), 디프테리아균(Corynebacterium diphtheriae) 및 파상풍균(Clostrium tetani) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 처리는 염산을 최소 억제 농도(MIC)로 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 염산의 최소 억제 농도는 6.25 ㎎/㎖인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 처리는 염산을 10 내지 60 분 동안 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 처리는 염산을 30 내지 40℃에서 처리하는 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 제조 방법으로 제조된 그람양성균 박테리아 고스트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 그람양성균 박테리아 고스트를 유효성분으로 포함하는, 그람양성균 감염증 예방 및 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 그람양성균은 리스테리아균(Listeria sp.), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae), 탄저균(Bacillus anthracis), 디프테리아균(Corynebacterium diphtheriae) 및 파상풍균(Clostrium tetani) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 백신 조성물은 사백신 또는 외래 항원 운반체로서 박테리아 고스트를 포함하는 것일 수 있다.
따라서, 본 발명은 염산의 처리를 통한 그람양성균 박테리아 고스트 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 그람양성균 박테리아 고스트는 그람양성균의 생균 콜로니 생성을 억제할 수 있는 염산의 최소 억제 농도(MIC)을 처리하여 배양하였을 때, 효과적으로 박테리아 고스트로 형성될 수 있다. 또한, 상기 형성된 박테리아 고스트는 세포의 외막 형태를 온전히 보존하면서 세포질 내 단백질 또는 DNA가 잔존하지 않은 형태이기 때문에, 체내에 투여되었을 때 증식에 의한 2차 감염증 등의 부작용에 대한 위험이 적다. 따라서, 본 발명의 그람양성균의 박테리아 고스트는 그람양성균 감염증의 예방 또는 치료용 백신 또는 외래 항원 운반체로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)를 이용한 박테리아 고스트의 제조에 있어서, BHI 액체 배지에서 염산의 최소 억제 농도(minimum inhibition concentration, MIC)를 확인하기 위한 배양 결과를 나타낸다.
도 2는 다양한 농도로 처리한 염산 또는 수산화나트륨에 대한 박테리아 생존능(viability)을 확인하기 위하여, BHI 아가 배지에서 콜로니 형성 유무를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 MIC의 염산 또는 수산화나트륨 처리 후, 시간에 따른 리스테리아 모노사이토게네스의 박테리아 고스트 형성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 MIC의 염산 또는 수산화나트륨을 처리한 후, 시간에 따른 리스테리아 모노사이토게네스의 박테리아 고스트 내 잔존 총 단백질량을 확인한 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 5는 MIC의 염산 또는 수산화나트륨을 처리한 후, 리스테리아 모노사이토게네스의 박테리아 고스트 내 잔존 게놈 DNA를 확인하기 위한 아가로즈 전기 영동 결과를 나타낸다.
도 6은 MIC의 염산 또는 수산화나트륨을 처리한 후, 리스테리아 모노사이토게네스의 박테리아 고스트 내 잔존 게놈 DNA를 확인하기 위한 실시간 PCR 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 MIC의 염산 또는 수산화나트륨을 처리한 후, 리스테리아 모노사이토게네스의 박테리아 고스트의 표면 형태를 관찰하기 위한 주사전자현미경(SEM) 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 다양한 농도로 처리한 염산 또는 수산화나트륨에 대한 박테리아 생존능(viability)을 확인하기 위하여, BHI 아가 배지에서 콜로니 형성 유무를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 MIC의 염산 또는 수산화나트륨 처리 후, 시간에 따른 리스테리아 모노사이토게네스의 박테리아 고스트 형성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 MIC의 염산 또는 수산화나트륨을 처리한 후, 시간에 따른 리스테리아 모노사이토게네스의 박테리아 고스트 내 잔존 총 단백질량을 확인한 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 5는 MIC의 염산 또는 수산화나트륨을 처리한 후, 리스테리아 모노사이토게네스의 박테리아 고스트 내 잔존 게놈 DNA를 확인하기 위한 아가로즈 전기 영동 결과를 나타낸다.
도 6은 MIC의 염산 또는 수산화나트륨을 처리한 후, 리스테리아 모노사이토게네스의 박테리아 고스트 내 잔존 게놈 DNA를 확인하기 위한 실시간 PCR 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 MIC의 염산 또는 수산화나트륨을 처리한 후, 리스테리아 모노사이토게네스의 박테리아 고스트의 표면 형태를 관찰하기 위한 주사전자현미경(SEM) 분석 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 화학제 처리를 통한 박테리아 고스트 제조 방법에 있어서, 종래 기술에서는 염기성인 수산화나트륨을 처리하여 그람양성균을 박테리아 고스트로 제조하는 방법이 공지되어 있으나, 산을 처리한 그람양성균 박테리아 고스트 제조방법에 대한 연구는 이루어진 바 없다.
본 발명에 따른 염산의 처리를 통해 제조된 그람양성균 박테리아 고스트는 그람양성균의 생균 콜로니 생성을 억제할 수 있는 염산의 최소 억제 농도(MIC)을 처리하여 배양하였을 때, 효과적으로 박테리아 고스트로 형성될 수 있으며, 상기 형성된 박테리아 고스트는 세포의 외막 형태를 온전히 보존하면서 세포질 내 단백질 또는 DNA가 잔존하지 않은 형태이기 때문에, 체내에 투여되었을 때 증식에 의한 2차 감염증 등의 부작용에 대한 위험이 적으므로, 본 발명의 그람양성균의 박테리아 고스트는 그람양성균 감염증의 예방 또는 치료용 백신 또는 외래 항원 운반체로의 사용에 효과적이다.
따라서, 본 발명은
i) 그람양성균을 배지에 접종하여 배양하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 배양한 배양액으로부터 그람양성균을 수득하는 단계;
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 그람양성균에 염산을 처리하여 박테리아 고스트를 형성하는 단계; 및
iv) 상기 단계 iii)에서 형성한 박테리아 고스트를 수득하는 단계를 포함하는, 그람양성균 박테리아 고스트의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 단계 i)의 “그람양성균”은 리스테리아균(Listeria sp.), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae), 탄저균(Bacillus anthracis), 디프테리아균(Corynebacterium diphtheriae) 및 파상풍균(Clostrium tetani) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 사백신 또는 외래 항원 운반체로서 사용되는 것이 요구되는, 당업계에 병원성균으로서 알려진 그람양성균이라면 어느 것이든지 가능할 수 있다.
구체적으로, 상기 리스테리아균(Listeria sp.)은 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아 데니트리피칸스(L. denitrificans), 리스테리아 그라이(L. grayi) 또는 리스테리아 뮤라이(L. murrayi)인 것이 보다 바람직하나, 보다 구체적으로는 리스테리아 증에 대한 병원성을 나타내는 균으로서 리스테리아 모노사이토게네스가 알려져 있으므로 리스테리아 모노사이토게네스인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 단계 i)의 “배양”은, 그람양성균을 30 내지 40 ℃에서 배양하는 것이 바람직하며, 구체적으로 37 ℃에서 배양하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 그람양성균을 65 내지 75 시간 동안 배양하는 것이 바람직하고, 구체적으로 72 시간 배양하는 것이 보다 바람직하다. 상기 그람양성균의 배양에 있어서, 박테리아 생장단계의 대수증식기(exponential growth phase)에 있는 세포의 세포벽은 염산에 민감하나, 대수증식기 이후의 정체기(stationary phase)에 있는 세포의 MIC 염산에 대하여 외막의 손상 정도가 높지 않은, 탄력이 있는 세포벽을 가지고 있어, 용해된 터널 구조를 형성하는 데 효과적이다.
상기 단계 iii)의 “처리”는 염산을 최소 억제 농도(MIC)로 처리하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 상기 염산의 최소 억제 농도는 6 내지 7 ㎎/㎖인 것이 바람직하며, 보다 구체적으로 6.25 ㎎/㎖인 것이 가장 바람직하다. 본 발명에 따른 그람양성균 박테리아 고스트의 제조 방법에 있어서, 염산을 최소 억제 농도로 처리하는 것은 중요하다. 염산을 MIC 미만의 농도로 처리하면 그람양성균의 용해율이 완벽하지 않아 생존하는 박테리아가 존재할 수 있으므로, 제조된 박테리아 고스트를 사백신 또는 외래 항원 운반체로서 이용할 수 없다. 또한, 염산을 MIC 초과의 농도로 처리하면 그람양성균의 외막구조의 손상 수준이 증가하며, 세포막에 완벽한 터널 구조를 형성할 수 없기 때문에 완벽한 형태의 박테리아 고스트를 제조할 수 없으므로, 사백신 또는 외래 항원 운반체로서의 효과가 감소할 수 있다.
상기 단계 iii)의 “처리”는 염산을 10 내지 60 분 동안 처리하는 것이 바람직하며, 구체적으로 15 내지 60분 동안 처리하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 그람양성균 박테리아 고스트의 제조 방법에 있어서, MIC의 염산 처리 후 약 15분 후에 그람양성균의 용해율은 100% 수준일 수 있다. 다만, 박테리아 고스트를 백신으로서 사용하는데 있어서 안전성을 고려한다면, 상기 염산의 처리는 60분 동안 처리하는 것이 가장 바람직하다.
상기 단계 iii)의 “처리”는 염산을 30 내지 40℃에서 처리하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 구체적으로 37℃에서 처리하는 것이 가장 바람직하다. 상기 처리의 온도가 30℃보다 낮거나 40℃보다 높은 경우, 염산의 MIC가 달라질 수 있어, 본 발명의 박테리아 고스트 제조 효율이 달라질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 리스테리아 모노사이토게네스 균을 박테리아 고스트로 제조하기 위해 염산의 MIC를 확인한 결과, 염산이 6.25 ㎎/㎖ 농도로 첨가되었을 때 리스테리아 균의 성장을 효과적으로 억제하므로, 이를 염산의 MIC로 결정하였으며, 생균의 성장 정도가 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 1A 및 도 2). 대조군으로 비교하기 위해 사용한 수산화나트륨의 MIC는 6.25 ㎎/㎖ 이나, 그람음성균에 대하여 박테리아 고스트를 제조할 수 있음이 보고된 황산암모늄 또는 염화칼슘은 500 ㎎/㎖의 처리 농도에서도 생장 억제 효과를 나타내지 않았다(도 1B 내지 1D).
또한, 리스테리아 균의 박테리아 고스트 제조에 있어서, MIC의 염산을 처리하는 최적 조건을 확인한 결과, MIC의 염산 처리 약 15분에 박테리아 고스트의 형성이 효과적으로 완료되는 것을 확인하였다(도 3).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 방법에 따라 제조된 리스테리아 균의 박테리아 고스트가 효과적으로 사용될 수 있는지 확인한 결과, 상기 박테리아 고스트는 세포벽의 용해된 터널이 효과적으로 생성되었기 때문에 세포질 내 잔존하는 단백질 및 게놈 DNA이 결여되고, 박테리아 고스트의 구조를 유지하는 세포벽 단백질만이 존재하는 것을 확인하였다(도 4 및 도 5). 반면, 수산화나트륨을 동일하게 처리하여 제조한 박테리아 고스트의 경우에 세포질 내 게놈 DNA가 극미량 잔존하는 것을 통해, 염산의 처리를 통한 방법이 보다 효과적일 수 있음을 확인하였다(도 6).
아울러, 본 발명자들은 염산 또는 수산화나트륨의 처리를 통해 제조된 리스테리아 균 박테리아 고스트의 표면을 분석한 결과, 염산 처리구의 박테리아 고스트에서 용해된 터널 구조가 형성되어, 다소 용해된 외막 형태를 유지하는 것을 확인하였다(도 7).
따라서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 그람양성균 박테리아 고스트는 그람양성균의 생균 콜로니 생성을 억제할 수 있는 염산의 최소 억제 농도(MIC)을 처리하여 배양하였을 때, 효과적으로 박테리아 고스트로 형성될 수 있으며, 상기 형성된 박테리아 고스트는 세포의 외막 형태를 온전히 보존하면서 세포질 내 단백질 또는 DNA가 잔존하지 않은 형태이기 때문에, 체내에 투여되었을 때 증식에 의한 2차 감염증 등의 부작용에 대한 위험이 적으므로, 본 발명의 방법에 따라 제조된 그람양성균의 박테리아 고스트는 그람양성균 감염증의 예방 또는 치료용 백신 또는 외래 항원 운반체로서 효과적으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 그람양성균 박테리아 고스트의 제조 방법에 따라 제조된, 그람양성균 박테리아 고스트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 그람양성균 박테리아 고스트를 유효성분으로 포함하는, 그람양성균 감염증 예방 및 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 “그람양성균”은 리스테리아균(Listeria sp.), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae), 탄저균(Bacillus anthracis), 디프테리아균(Corynebacterium diphtheriae) 및 파상풍균(Clostrium tetani) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 사백신 또는 외래 항원 운반체로서 사용되는 것이 요구되는, 당업계에 병원성균으로서 알려진 그람양성균이라면 어느 것이든지 가능할 수 있다.
구체적으로, 상기 리스테리아균(Listeria sp.)은 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아 데니트리피칸스(L. denitrificans), 리스테리아 그라이(L. grayi) 또는 리스테리아 뮤라이(L. murrayi)인 것이 보다 바람직하나, 보다 구체적으로는 리스테리아 증에 대한 병원성을 나타내는 균으로서 리스테리아 모노사이토게네스가 알려져 있으므로 리스테리아 모노사이토게네스인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 “백신 조성물”은 본 발명의 그람양성균 박테리아 고스트를 사백신 또는 외래 항원 운반체로서 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 그람양성균 박테리아 고스트는 그람양성균의 생균 콜로니 생성을 억제할 수 있는 염산의 최소 억제 농도(MIC)을 처리하여 배양하였을 때 효과적으로 박테리아 고스트로 형성될 수 있으며, 상기 형성된 박테리아 고스트는 세포의 외막 형태를 온전히 보존하면서 세포질 내 단백질 또는 DNA가 잔존하지 않은 형태이기 때문에, 체내에 투여되었을 때 증식에 의한 2차 감염증 등의 부작용에 대한 위험이 적으므로, 본 발명의 그람양성균 박테리아 고스트는 그람양성균 감염증의 예방 또는 치료용 백신 또는 외래 항원 운반체로서 효과적으로 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
리스테리아
모노사이토게네스
(
Listeria
monocytogenes
)를 이용한 박테리아 고스트의 제조
<1-1> 박테리아
고스트
제조를 위한 최소 억제 농도(minimum inhibition concentration,
MIC
)의 확인
본 발명에서 리스테리아 모노사이토게네스 균을 박테리아 고스트로 제조하는데 있어서, 필요한 염산의 MIC를 확인하였다.
구체적으로, 그람 양성균인 BHI(brain heart infusion) 배지에 7℃, 200 rpm 조건에서 하룻밤 동안(overnight) 진탕 배양하고, Biochrom Libra S22 분광광도계(spectrophotometer)로 O.D. 600nm에서 흡광도를 측정하여 균의 생장 정도를 확인 하였다. 그런 다음, 새로운 BHI 배지에 하기 [표 1]과 같은 농도로 염산을 단계 희석하고, 상기 배양한 리스테리아 모노사이토게네스 균을 106 CFU/㎖ 농도로 접종하여, 37℃에서 18 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 염산 농도에 따른 리스테리아 모노사이토게네스 균의 생장 정도를, O.D. 600㎚에서 흡광도를 측정하여 확인하였다. 양성 대조군으로 사용하기 위해, 기존 박테리아 고스트 제조 방법에서 보고된 황산암모늄, 염화칼슘 및 수산화나트륨을 하기 [표 1]의 농도로 BHI 배지에 첨가하였고, 무처리 대조군으로는 염산을 처리하지 않은 BHI 배지를 사용하여, 상기와 동일한 방법으로 리스테리아 모노사이토게네스 균의 생장 정도를 확인하였다.
| 시험관 No. |
화학제 처리 농도(㎎/㎖) | |||
| 염산 (HCl) |
수산화나트륨 (NaOH) |
황산암모늄 (NH4)2SO4 |
염화칼슘 CaCl2 |
|
| 0 (무처리 대조군) |
- | - | - | - |
| 1 | 50 | 50 | 500 | 500 |
| 2 | 25 | 25 | 250 | 250 |
| 3 | 12.5 | 12.5 | 125 | 125 |
| 4 | 6.25 | 6.25 | 62.5 | 62.5 |
| 5 | 3.125 | 3.125 | 31.25 | 31.25 |
| 6 | 1.5625 | 1.5625 | 15.625 | 15.625 |
| 7 | 0.78125 | 0.78125 | 7.8125 | 7.8125 |
| 8 | 0.390625 | 0.390625 | 3.90625 | 3.90625 |
| 9 | 0.1953125 | 0.1953125 | 1.953125 | 1.953125 |
그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이, BHI 액체 배지에 염산 또는 수산화나트륨이 6.25 ㎎/㎖ 농도로 첨가되었을 때, 배지의 pH는 각각 pH 3.16 및 pH 10.75였으며, 리스테리아 균의 성장을 효과적으로 억제하여, 리스테리아 균에 대한 염산 및 수산화나트륨의 MIC는 6.25 ㎎/㎖임을 확인하였다(도 1A 및 1B). 이에 비해, 기존에 그람음성균인 대장균의 생장을 억제하여 박테리아 고스트를 제조하는데 효과적인 화학제로 보고된 황산암모늄 및 염화칼슘은, 그람양성균인 리스테리아 균에 대하여 500 ㎎/㎖의 처리 농도에서도 생장 억제 효과를 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 1C 및 1D).
<1-2>
리스테리아 균에
대한 박테리아
고스트의
생균
성장능
확인
그람양성균인 리스테리아 균에 대한 염산 및 수산화나트륨의 MIC를 확인하였으므로, MIC의 염산 또는 수산화나트륨이 처리된 배지에서 제조된 박테리아 고스트의 생균 성장 정도를 표준 분석법인 도말법(plating)으로 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에서 배양한 리스테리아 균 중에서, 하기 [표 2]와 같은 농도로 BHI 아가 배지에 도말한 다음, 37℃에서 18시간 배양하여 콜로니의 형성을 유도한 다음, 관찰하였다.
| 시험관 No. |
염산 처리군 | 수산화나트륨 처리군 | ||
| 염산 농도 (㎎/㎖) |
접종 균 희석배수 |
수산화나트륨 농도 (㎎/㎖) |
접종 균 희석배수 |
|
| 0 | - | 10-3 | - | 10-3 |
| 4 | 6.25 | 100 | 6.25 | 100 |
| 5 | 3.125 | 10-1 | 3.125 | 100 |
그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이, 염산의 무처리 대조군을 1/1000 희석 배수로 희석하여 도말한 배지에서는 측정이 불가능 할 정도로 수 많은 콜로니가 형성되었고, 3.125 ㎎/㎖ 농도의 염산 처리군을 1/10 희석 배수로 희석하여 도말한 배지에서도 수 십개의 콜로니가 형성되는 것을 확인하였으나, MIC인 6.25 ㎎/㎖ 농도의 염산 처리군을 희석하지 않고 도말한 배지에서는 생존 콜로니가 전혀 형성되지 않는 것을 확인하였다(도 2A). 또한, 수산화나트륨 처리군에서도 무처리 대조군을 1/1000 희석 배수로 희석하여 도말한 배지에서 수많은 콜로니가 생성되었고, 3.125 ㎎/㎖ 농도의 수산화나트륨 처리군을 원액으로 도말한 배지에서도 수 천개 이상의 콜로니가 형성되는 것을 확인하였으나, MIC인 6.25 ㎎/㎖ 농도의 수산화나트륨 처리군을 원액으로 도말한 배지에서는 생존 콜로니가 전혀 형성되지 않은 것을 확인하였다(도 2B).
<1-3>
리스테리아 균에
대한 박테리아
고스트
제조를 위한, 최적 시간의 결정
그람양성균인 리스테리아 균에 대해 염산 및 수산화나트륨의 MIC에서 박테리아 고스트를 제조할 수 있음을 확인하여, 박테리아 고스트 제조를 위한 최소 시간을 확인하였다.
구체적으로, BHI 액체 배지에 접종한 후 72 시간 동안 배양한 리스테리아 균을 원심분리(10,000g, 10 분)하여 수득하고, 인산염 완충 용액(PBS, pH 7.0)으로 세척한 후, 106 CFU/㎖의 균 농도로 조정하여 리스테리아 균을 준비하였다. 그런 다음, 12.5 ㎎/㎖ 농도의 염산 또는 수산화나트륨을 준비한 리스테리아 균 2 ㎖과 혼합하여 염산의 최종 농도가 6.25 ㎎/㎖가 될 수 있도록 하고 37℃에서 리스테리아 균을 배양하였다. 배양 개시 후 15, 30, 45, 60 및 90 분에 리스테리아 균을 수득하여, 용해율을 측정하고, 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 도말법을 수행하여 리스테리아 균의 콜로니 형성 단위(Colony Forming Unit, CFU)를 확인하였다. 배양 종료 후에는, 리스테리아 균을 수득하여 PBS 용액으로 2 회 세척한 다음, 10,000g에서 15 분간 원심분리하여 최종적인 리스테리아 모노사이토게네스의 박테리아 고스트를 수득하였다.
수산화나트륨 처리에 대해서도 배양 개시 후 5, 10, 15, 30, 45 및 60 분 후에 균을 수득하여, 리스테리아 균 박테리아 고스트의 제조를 확인하였다.
그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이, MIC의 염산 처리군에서는 염산을 처리하고 15 분 이내에 박테리아 고스트가 효과적으로 형성되어, 처리 15 분 이후부터 제조된 박테리아 고스트를 도말한 BHI 아가 배지에서 콜로니가 형성되지 않는 것을 확인하였다(도 3A). 또한, MIC의 수산화나트륨 처리군에서는 수산화나트륨을 처리하고 약 10 분에 박테리아 고스트의 제조가 완료되어, 처리 10 분 이후부터 제조된 박테이라 고스트를 도말한 BHI 아가 배지에서 콜로니가 형성되지 않는 것을 확인하였다(도 3B).
리스테리아
모노사이토게네스
박테리아
고스트의
특징 확인
<2-1> 박테리아
고스트
내 잔존 단백질량의 확인
염산 또는 수산화나트륨으로 제조된 리스테리아 균의 박테리아 고스트의 특징을 확인하기 위해서, 박테리나 고스트 내 잔존하는 단백질의 양을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-3>의 방법으로 염산 또는 수산화나트륨을 첨가하고 15, 30, 45 및 60 분 후에 리스테리아 균을 수득하여, 변성 완충액(Laemmli, 1970, Nature 227:680-685)을 첨가하고, 3 내지 5 분간 가열한 후, 변성된 시료를 준비하였다. 준비한 시료는 12% SDS-PAGE 겔에 로딩하여 40 mA의 전류에서 4 시간 동안 전개하여 SDS-PAGE 전기영동 분석을 수행하였다. 전개 완료 후의 젤은 코마시 브릴리언트 블루 R-250을 포함하는 염색 용액(메탄올: 초산: 물 = 5: 1: 5(v:v:v))으로 염색하여, 박테리아 고스트 내의 총 단백질 양을 확인하였다. 무처리 대조군으로는, 대장균을 상기와 동일한 방법으로 SDS-PAGE 전기영동을 수행하여 총 단백질량을 확인하였다
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이, 염산 처리구에서는 박테리아 고스트에 고분자 단백질이 주로 잔존하는 것을 확인한 반면, 수산화나트륨 처리구에서는 저분자 단백질이 주로 잔존하는 것을 확인하였으며, 이는 무처리 대조군인 대장균에서 나타나는 단백질 밴드와 비교하였을 때 소량임을 확인하였다(도 4). 이를 통해, 본 발명에서 제조된 박테리아 고스트는 세포질 내에 존재하는 단백질이 결여되고, 박테리아 고스트의 구조를 유지하는 세포벽에 존재하는 단백질만이 잔존하는 것을 확인하였다.
<2-2> 박테리아
고스트
내 잔존 DNA
량의
확인
본 발명에서 제조된 리스테리아 모노사이토게네스의 박테리아 고스트 내에 단백질 손실을 확인하였으므로, 박테리아 고스트 내 잔존하는 DNA의 양을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-3>의 방법으로 염산 또는 수산화나트륨을 첨가하고 60 분 후에 리스테리아 균을 수득하여, 상업용 추출 키트(iNtRON Biotechnology 사, 한국)을 이용하여 제조사의 제공하는 프로토콜에 따라 게놈 DNA를 추출하였다. 그런 다음, 0.5 g/㎖ 에티듐 브로마이드(ethidium bromide, EtBr)를 포함하는 1% 아가로즈 젤에 상기 추출한 추출액을 로딩하여 전기영동을 실시하였다.
또한, 실시간 PCR을 수행하여 보다 정량적으로 게놈 DNA 양을 분석하기 위해, 상기 추출한 추출액 1 ㎕(1:100 희석), 하기 [표 3]에 기재된 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머 각각 1 ㎕, 2×사이버 그린 II QPCR 마스터 믹스(Agilent Technology 사, 미국) 및 7 ㎕ 증류수를 혼합한 다음, Stratagene Mx3000P 실시간 PCR 분석기에서 하기 [표 4]와 같은 조건을 수행하여, 게놈 DNA를 증폭하기 위한 실시간 PCR을 수행하고 증폭된 산물의 양을 형광분석으로 정량적 확인하였다.
무처리 대조군으로는 염산 또는 수산화나트륨을 처리하지 않은 리스테리아 모노사이토게네스 균을 사용하였으며, 용매 대조군으로는 TE 완충용액을 처리한 리스테리아 균을 사용하였고, 양성 대조군으로는 황산 암모늄을 처리한 리스테리아 균을 사용하여, 상기와 동일한 방법으로 실시간 PCR 분석을 수행하였다.
| 프라이머 명 | 서열 |
| 정방향 프라이머 | 5’-GGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAAT-3’ |
| 역방향 프라이머 | 5’-GACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTG-3’ |
상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 리스테리아 모노사이토게네스 균의 16S rRNA 부분을 특이적으로 증폭할 수 있도록 디자인된 것이다.
| 온도 | 시간 | 반복(cycle) |
| 95℃ | 10분 | 1 회 |
| 95℃ | 10초 | 40 회 |
| 55℃ | 10초 | |
| 72℃ | 30초 |
그 결과, 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 염산 또는 수산화트륨을 60 분 동안 처리한 박테리아 고스트 내에 잔존하는 DNA가 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 5). 이에 비해, 실시간 PCR로 정량분석하였을 때, 수산화나트륨을 처리한 경우 미량의 DNA가 증폭되어 박테리아 고스트 내에 극미량의 리스테리아 모노사이토게네스의 DNA가 존재함을 확인한 반면, 염산을 처리한 경우에는 DNA 증폭이 전혀 나타나지 않을 뿐 아니라, TE 완충용액보다 낮은 Ct 값을 나타내는 것을 확인하였다(도 6). 이를 통해, 본 발명을 통해 염산 또는 수산화나트륨을 처리하여 제조된 박테리아 고스트는 게놈 DNA 및 세포질 내의 단백질을 포함하지 않고, 세포벽만을 유지하고 있는 구조임을 확인하였고, 특히 수산화나트륨보다 염산을 처리하여 제조된 박테리아 고스트가 더욱 낮은 수준의 게놈 DNA 양이 잔존하므로, 사백신 또는 외래 항원 운반체로서 박테리아 고스트를 사용하는 데 안전성의 효과를 가질 수 있음을 확인하였다.
<1-3> 박테리아
고스트
표면의 형태적 분석 확인
본 발명에서 제조된 박테리아 고스트가 사백신 또는 외래 항원 운반체 등 박테리아 고스트로서 효과적으로 사용될 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 박테리아 고스트의 표면을 주사 전자 현미경(Scanning Electron Mircroscopy, SEM)으로 관찰하여 형태적 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-3>의 방법으로 염산 또는 수산화나트륨을 첨가하고 60 분 후에 리스테리아 박테리아 고스트를 수득하여, 2.5% 글루타알데히드(glutaraldehyde)를 첨가한 PBS 용액에 현탁하고 4 ℃에서 2 시간 동안 고정한 후, 동일한 용액에서 세척하였다. 그런 다음, 1% 사산화 오스뮴(osmium tetroxide, OsO4) 용액에 박테리아 고스트를 옮겨 4 ℃에서 1.5 시간 동안 고정한 후, 단계 희석된 에탄올로 박테리아 고스트를 탈수하였다. 탈수된 박테리아 고스트는 액화 이산화탄소로 건조하여 polaron high-resolution sputter를 이용하여 금(gold) 코팅하여 시료를 준비하고, 히타치 S-4800 FESEM 주사 전자현미경으로 박테리아 고스트의 표면을 관찰하였다. 무처리 대조군으로는 리스테리아 생균을 상기와 동일한 방법을 수행하여 SEM 관찰하였다.
그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이, 무처리 대조군에 비해, 염산 처리구의 박테리아 고스트는 세포벽에 뚜렷한 크기를 가지는 용해된 터널 구조가 형성(화살표로 표시)되어, 외막 형태가 다소 용해된 구조를 가지는 것을 확인하였다(도 7A). 이에 비해, 수산화나트륨 처리구에서는 용해된 터널의 크기가 다소 작아, 외막의 형태가 염산 처리구에 비해 완벽한 형태를 유지하는 것을 확인하였다(도 7B).
Claims (10)
- i) 리스테리아균(Listeria sp.)을 배지에 접종하여 배양하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 배양한 배양액으로부터 리스테리아균을 수득하는 단계;
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 리스테리아균에 6 내지 7 ㎎/㎖의 염산을 처리하여 박테리아 고스트를 형성하는 단계; 및
iv) 상기 단계 iii)에서 형성한 박테리아 고스트를 수득하는 단계를 포함하는, 리스테리아균 박테리아 고스트의 제조 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 염산은 6.25 ㎎/㎖로 처리하는 것을 특징으로 하는, 리스테리아균 박테리아 고스트의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 처리는 염산을 10 내지 60 분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는, 리스테리아균 박테리아 고스트의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 처리는 염산을 30 내지 40℃에서 처리하는 것을 특징으로 하는, 리스테리아균 박테리아 고스트의 제조 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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