KR101449628B1

KR101449628B1 - 화학물질 처리에 의한 박테리아 고스트 제조방법

Info

Publication number: KR101449628B1
Application number: KR1020130097715A
Authority: KR
Inventors: 최창원; 김세창; 나가라잔 비노드
Original assignee: 배재대학교 산학협력단
Priority date: 2013-08-19
Filing date: 2013-08-19
Publication date: 2014-10-22

Abstract

본 발명은 그람 음성균의 성장을 억제하는 3종 화학물질의 최소억제농도를 이용하여 박테리아 고스트를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 박테리아 고스트를 제공한다. 본 발명은 형질전환 등의 분자생물학적 처리 없이 그람 음성균의 성장을 억제하는 화학물질을 처리함으로써 저렴하고 신속하게 박테리아 고스트를 제조할 수 있는 장점을 가지고 있으며, 본 발명에서 제조된 박테리아 고스트는 사백신 및 외래 항원 운반체로 유용하게 활용될 것으로 기재된다.

Description

화학물질 처리에 의한 박테리아 고스트 제조방법{Method for preparing bacterial ghosts by the treatment with chemical compounds}

본 발명은 그람 음성균(Gram-negative bacteria)의 증식을 억제할 수 있는 3종의 화학물질을 이용하여 사백신 혹은 외래 항원 운반체로 활용되는 박테리아 고스트(Bacterial ghost; BG)를 쉽게 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

박테리아 고스트는 박테리아 세포 내 구성물(세포질 함유물)을 제거하여 내부는 텅 빈 상태이지만, 외막(envelope)의 형태를 완전하게 유지하는 구조체로 간단히 정의할 수 있다. 최근 그람 음성균을 박테리아 고스트로 제조하여 사백신 혹은 외래 항원 운반체로 활용하는 연구가 활발히 진행되고 있다(Ebensen, T. et al., J. Immunol. 2004, Vol. 172, pp. 6858-6865). 게다가 박테리아 고스트는 유전물질이 결여된 사균 상태이기 때문에 유전자 재조합생물체(GMO)로 간주되지 않는다.

상기 박테리아 고스트는 생균의 외막과 마찬가지로 항원 결정부위(antigenic determinant)를 보유하기 때문에 기능적으로 생백신과 유사한 효과를 나타낸다. 발표된 연구에 의하면 BG는 외래적인 보조제(adjuvant)를 첨가하지 않고도 내재면역과 적응면역 시스템을 쉽게 자극할 수 있다. 또한, 불활성화된(inactivated) 박테리아 고스트는 동물, 인간 혹은 식물의 특수한 조직이나 세포에 부착할 수 있을 뿐만 아니라, 내부로 도입될 수 있기 때문에 재조합 항원이나 핵산을 표적 세포에 효과적으로 전달할 수 있는 운반시스템(delivery system)으로 활용할 수 있다. 박테리아 종(species)에 따라서 차이는 있지만, 표적 세포는 수지상세포(dendritic cell), 대식세포(macrophage), 결장암(colon cancer), 백혈병(leukemia), 흑색종(melanoma), 미소혈관 상피세포(microvascular endothelial cells) 등을 포함할 수 있다. 따라서 박테리아 고스트는 의료용 및 산업용 단백질, 핵산, 의약 등을 전달할 수 있는 운반시스템으로 널리 활용할 수 있다.

상기 박테리아 고스트를 생산하는 가장 일반적인 방법은 E 단백질 매개 용해법으로서 박테리오파아지(bacteriophage) φX174 용해유전자 E를 클로닝한 플라스미드(plasmid)를 그람 음성균에 형질전환(transformation)하여 이를 발현시키는 방법이다. 형질전환된 박테리아는 E 유전자를 억제하였다가 온도 변화에 따라 E 단백질을 발현하는데, 합성된 E 단백질은 박테리아 표면 구조에 물리화학적 손상을 주지 않고 박테리아 세포막 및 세포벽에 막관통 터널을 형성하여 궁극적으로 세포구성물을 방출시킨다(Haidinger, W. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003, Vol. 69(1), pp. 468-474). Lubitz는 상기와 같은 방법으로 제조된 박테리아 고스트의 마지막 불활성화를 위해 멸균제로 사용되는 베타프로피오락톤(betapropiolactone)을 처리하여 생균이 감소된 박테리아 고스트를 생산하는 방법을 제안하였다(US 7968323 B2).

상기 박테리아 고스트를 생산하기 위해서는 다단계 과정의 분자생물학적 기술과 고가의 비용 및 장기간의 제조 시간이 필요하다. 따라서 박테리아 고스트 대량생산을 위한 간단한 제조기술, 저가의 생산 비용 및 시간을 절약할 수 있는 새로운 제조방법이 필요하다. 최근 Amara 등은 대장균(E. coli BL21 (DE3) pLysS)을 모델로 하여 화학물질인 SDS, NaOH, H₂O₂를 처리함으로써 박테리아 고스트를 제조하는 방법을 보고하였다.

본 발명에서는 그람 음성균의 세포벽에 영향을 미치는 화학실험에서 일반적으로 사용되는 화학물질인 황산암모늄, 염화칼슘 및 에틸렌다이아민테트라아세트산의 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC)에 기반을 둔 박테리아 고스트 제조방법을 개발하였다.

대한민국 등록특허공보 제10-0273847호, 2000. 12. 15. 공고 대한민국 등록특허공보 제10-0765357호, 2007. 10. 10. 공고 US 7968323 B2, 2011. 6. 28. 공개

Haidinger, W. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003, Vol. 69(1), pp. 468-474 Ebensen, T. et al., J. Immunol. 2004, Vol. 172, pp. 6858-6865 Konopa, G. & Taylor, K., Biochim. Biophys. Acta. 1975, Vol. 399(2), pp. 460-467 Amara, A. A. et al., The Scientific World Journal, 2013, Vol. 2013, Article ID 545741, 7 pages, doi:10.1155/2013/545741

위와 같은 필요성을 해결하기 위하여 본 발명에서는 그람 음성균인 대장균(Escherichia coli)의 성장을 억제할 수 있는 화학물질의 MIC를 결정하고, 이를 이용하여 박테리아 고스트를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이하 본 발명의 해결 수단을 더 상세히 설명한다.

위와 같은 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 그람 음성균의 성장을 억제할 수 있는 황산암모늄((NH₄)₂SO₄), 염화칼슘(CaCl₂), 에틸렌다이아민테트라아세트산(EthyleneDiamineTetraAcetic Acid, EDTA)의 MIC를 결정하였다. 배양된 대장균에 3종의 화학물질을 각각의 MIC에 맞추어 첨가한 후 배양하고, 박테리아 고스트를 수확하였다.

본 발명에서는 그람 음성균의 성장을 억제하는 3종 화학물질의 MIC를 이용하여 박테리아 고스트를 제조하는 방법을 제공한다. 제조된 박테리아 고스트는 사백신 및 외래 항원 운반체로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 two-fold broth dilution 방법에 의해 시험관에서 배양한 대장균의 증식을 억제하는 3종 화학물질의 최소억제농도(MIC)를 보여주고 있다. (A) 황산암모늄((NH₄)₂SO₄₎, (B) 염화칼슘(CaCl₂), (C) 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA).
도 2는 화학물질 처리 후 시간에 따른 분해곡선으로서 분해율은 다음과 같은 공식에 대입하여 결정한다. 분해율=(1-완전히 용해된 CFU/화학물질 처리 전 CFU) x 100%
도 3은 실시예에서 제조된 대장균 박테리아 고스트가 LB 배지 위에서의 성장하지 않는 모습을 보여주고 있다. 1: 무처리 대조구, 2: 황산암모늄 처리구, 3: 염화칼슘 처리구, 4: 에틸렌다이아민테트라아세트산 처리구.
도 4A는 제조된 대장균 박테리아 고스트에서 추출한 총단백질(total protein)의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주고 있고, 도 4B는 제조된 대장균 박테리아 고스트에서 추출한 유전체 DNA의 아가로스(agarose) 전기영동 결과를 보여주고 있다. M: 단백질 분자량 마커, 레인(lane) 1: 무처리 대조구, 2: 황산암모늄 처리구, 3: 염화칼슘 처리구, 4: 에틸렌다이아민테트라아세트산 처리구.
도 5는 3종의 화학물질을 처리하여 제조된 대장균 박테리아 고스트의 주사전자현미경 분석 결과를 보여주고 있다. A: 무처리 대조구, B: 황산암모늄 처리구, C: 염화칼슘 처리구, D: 에틸렌다이아민테트라아세트산 처리구. 화살표는 대장균의 막이 용해되어 형성된 막관통(transmembrane) 터널(tunnel)을 표시하고 있다.

이하에서 본 발명을 좀 더 상세히 설명한다.

본 발명은 그람 음성균에 황산암모늄, 염화칼슘 및 에틸렌다이아민테트라아세트산으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 화학물질을 처리하여 박테리아 고스트(bacterial ghost, BG)를 제조하는 방법에 관한 것이다.

바람직하게는 그람 음성균은 대장균(E. coli), Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Klebsiella pneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Heliobacter pylori, Vibrio cholerae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus influenzae, Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Ralstonia eutropha, 및Pectobacterium cypripedii 로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이며, 기타 다른 균에 대해서도 같은 방식으로 적용될 수 있음은 이 기술분야에 있어서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이다. 더 바람직하게는 대장균(E. coli)은 대장균(E. coli) DH5α 균주인 것을 특징으로 한다.

상기 제조하는 방법에서 화학물질의 처리는 배양기에서 각각 황산암모늄는 35 내지 40℃에서 30분에서 90분, 염화칼슘는 35 내지 40℃에서 60분에서 90분 및 에틸렌다이아민테트라아세트산의 처리는 35 내지 40℃에서 45분에서 90분 동안 수행되는 것이 바람직하다. 상기의 온도와 시간은 대장균 생장에 최적온도 및 최대생장을 나타내기 대문이가. 만일 상기의 온도를 낮추거나 높일 경우 최대생장에 걸리는 시간이 더 걸리거나 증식률이 더 낮아질 수 있다.

상기 각각 화학물질의 농도범위 이하일 경우 용해율이 완벽하지 않아 생존한 박테리아가 존재했으며 농도범위 이상일 경우 박테리아가 분해되어 완벽한 터널 구조를 형성할 수 없기 때문에 고스트의 제조가 불가능하다.

상기 화학물질의 최소억제농도 결정 후 박테리아 고스트 제조에 사용되는 대장균은 배양기에서 37℃로 72시간 배양한 후 수행되는 것이 바람직하다. 그 이유는 박테리아 생장단계에서 대수증시기(exponential growth phase)에 있는 세포들의 세포벽은 본 발명에 사용된 화학물질에 민감하나 72시간 배양된 세포는 탄력이 있는 세포벽을 갖기 때문에 용해된 터널 구조를 형성하는데 더 효과적이다.

상기 박테리아 고스트를 제조하는 방법에서 최소억제농도 화학물질을 처리한 후 배양기에서 최대 1.5시간동안 배양한 후 수행되는 것이 바람직하다. 상기 화학물질 처리 15분 후에 모두 20% 이상의 용해율을 보이나, 100% 박테리아 고스트를 완전하게 제조함에 있어서 걸리는 최소 시간은 황산암모늄의 경우 60분, 염화칼슘의 경우 60분, 또는 에틸렌다이아민테트라아세트산의 경우 45분이 소요되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리아의 제조방법으로 제조된 박테리아 고스트에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 박테리아 고스트는 사백신 또는 외래 항원 운반체로 사용되는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다.

이때 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

대장균을 이용한 박테리아 고스트의 제조

1. 대상 균주 및 배양조건

본 발명에 사용된 그람 음성균은 대장균(E. coli) DH5α로서 Luria-Bertani(LB) 배지에 접종하고 37℃, 200 rpm 조건에서 철야(overnight) 진탕배양하였다. 대장균의 성장과 용균은 Biochrom Libra S22 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 O.D. 600nm에서 측정하였다.

2. 최소억제농도(MIC)의 결정

황산암모늄, 염화칼슘, 및 에틸렌다이아민테트라아세트산의 MIC 값은 two-fold broth dilution 법(Penna et al., Infec. Dis. 2001, Vol. 1, pp. 1-8)을 이용하여 측정하였다. 먼저 3종의 화학물질을 각각 단계 희석(serial dilution)하여 대장균 10⁶ CFU/㎖를 접종한 LB 액체배지에 첨가하고, 37℃에서 18시간 배양하였다. 대장균의 최소억제농도는 O.D. 600nm에서 측정하였다.

LB 액체배지에서 대장균의 성장에 대해 3종의 화학물질을 농도별로 처리한 결과는 도 1과 같다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 대장균의 성장을 억제하는 각 화학물질의 최소억제농도는 다양하였으며, 황산암모늄, 염화칼슘 및 에틸렌다이아민테트라아세트산의 MIC는 각각 187.50㎎/㎖, 125㎎/㎖, 9.38㎎/㎖일 때 성장이 효과적으로 억제되었다(표 1. (NH₄)₂SO₄, CaCl₂및 EDTA의 최소억제농도(MIC) 참조). 에틸렌다이아민테트라아세트산이 작은 농도에서도 대장균의 성장을 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있다.

최소 억제농도 이상일 경우에는 박테리아가 분해되어 완벽한 터널이 형성되기 어려우며 농도가 너무 낮을 경우 용해율이 완벽하지 않아 생존한 박테리아가 존재할 수 있다. 따라서, 최소 억제농도 이하일 경우 용해율이 완벽하지 않으나 용해가 가능하다. 상기 화학물질의 농도는 각각 0(mg/ml)을 초과하며 하기 표의 MIC 농도 이하인 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 황산암모늄은 180~190(mg/ml)인 것이며, 염화칼슘은 120 내지 125(mg/ml)인 것이며, 에틸렌다이아민테트라아세트산은 8 내지 10(mg/ml)인 것이다.

Chemical agents	MIC (mg/ml)	MIC%
(NH₄)₂SO₄	187.50	17.07
CaCl₂	125.00	22.80
EDTA	9.38	0.09

3. 박테리아 고스트의 제조

박테리아 고스트를 제조하기 위해 LB 액체배지에서 72시간 배양한 대장균 배양액을 10,000g에서 10분간 원심분리한 후 침전물을 수확하여 phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.0) 버퍼용액으로 세척하고, 대장균의 농도를 10⁶ CFU/ml로 조정하였다. 황산암모늄, 염화칼슘, 에틸렌다이아민테트라아세트산의 농축용액(5x) 각각 1 ml을 2 ml의 박테리아 현탁액에 첨가하고 멸균수로 각 화학물질의 농도가 1x가 되도록 적정한 후 37℃에서 90분간 배양하였다. 대장균의 용해가 완료된 후 PBS 버퍼용액으로 2회 세척하고, 10,000g에서 15분간 원심분리하여 박테리아 고스트를 수확하였다.

4. 박테리아 고스트 제조 최소시간 결정

상기의 방법으로 박테리아 고스트를 제조하기 위해 90분간 배양하면서 15분 간격(15분, 30분, 45분, 60분, 75분, 90분)으로 각각 박테리아 고스트를 수확한 후 용해율을 측정하였다.

제조된 박테리아 고스트의 평가

1. 박테리아 고스트의 제조 효율성

3종의 화학물질을 처리하여 제조한 박테리아 고스트를 대상으로 대장균의 Colony Forming Unit(CFU) 수를 측정하기 위하여 표준 분석법인 도말법(plating)을 실시하였다. 각 처리구는 각각 5개의 LB agar 배지에 도말하고, 37℃에서 48시간 배양한 후 생존하여 성장하는 콜로니 수를 측정하였다. 박테리아 고스트의 제조 효율은 다음과 같은 공식으로 계산하였다.

용해율(lysis rate) = (1-CFU of lysis completed / CFU before induction) x 100%

도 2에서 보는 바와 같이 박테리아 고스트를 100% 완벽하게 제조하는데 걸리는 최소 시간은 황산암모늄의 경우 60분, 염화칼슘의 경우 60분, 또는 에틸렌다이아민테트라아세트산의 경우 45분이 소요되는 것을 알 수 있다.

도 3에서 보는 바와 같이 최소억제농도(MIC)를 기초로 3종의 화학물질을 처리하여 제조된 박테리아 고스트를 도말한 LB agar 배지에서 생존한 콜로니는 전혀 관찰되지 않았다. 상기 공식으로 계산한 용해율은 100%로서 이 결과는 E 유전자에 의한 박테리아의 용해율, 99.9% 보다 높았다. 따라서 단순히 상기 화학물질을 처리함으로써 박테리아 고스트를 효율적으로 제조할 수 있다는 것을 알 수 있다.

2. 박테리아 고스트 세포 내에 잔존하는 성분

(1) SDS-PAGE를 이용한 단백질 분석

상기 실시예 1에서 제조된 다양한 박테리아 고스트 시료를 확보하여 변성 완충액(Laemmli, 1970, Nature 227:680-685)을 첨가하고, 3-5분간 가열한 후 변성된 시료를 준비된 젤에 적재하여 지속적인 전류 40 mA에서 12% SDS-PAGE 전기영동을 4시간 실시하였다. 전기영동이 완료된 후 젤은 Coomassie brilliant blue 용액(methanol: glacial acetic acid: water = 5:1:5 v/v/v 혼합액에 0.05% Coommasie brilliant blue R-250를 용해시킴)으로 염색하여 단백질을 분석하였다.

도 4A에서 보는 바와 같이 SDS-PAGE 분석 결과, 각 처리구의 박테리아 고스트에 잔존하는 단백질은 무처리구의 대장균보다 소량의 단백질 밴드가 관찰되었다. 박테리아 고스트에 존재하는 단백질 밴드는 세포질에 존재하는 단백질은 결여되고, 박테리아 고스트의 구조를 유지하는 세포벽에 존재하는 단백질로 판단된다.

(2) 아가로스 젤(agarose gel)을 이용한 DNA 분석

박테리아 고스트 세포 내에 게놈 DNA가 존재하는가를 분석하기 위해서 ethidium bromide(EtBr 0.5g/㎖, w/v)가 들어간 1% 아가로스 젤에 각 처리구의 박테리아 고스트를 적재하고 전기영동을 실시하였다.

도 4B에서 보는 바와 같이 아가로스 젤 전기영동 분석 결과, 각 처리구의 박테리아 고스트에 잔존하는 DNA는 전혀 관찰되지 않았으나, 무처리구의 대장균에서는 게놈 DNA 밴드가 관찰되었다.

상기에서 살펴본 바와 같이 단순히 화학물질을 처리하여 제조된 박테리아 고스트는 게놈 DNA와 세포질 내의 단백질을 전혀 포함하지 않고, 세포벽만을 유지하고 있는 완벽한 형태의 박테리아 고스트를 구성하였다.

3. 주사 전자현미경(Scanning electron mircroscopy; SEM) 분석

3종의 화학물질을 처리하여 제조된 박테리아 고스트는 2.5% glutaraldehyde를 첨가한 PBS 용액에 4℃에서 2시간 고정한 후 같은 용액으로 세척하고 1% osmium tetroxide(OsO4) 용액에 4℃에서 1.5시간 고정하였다. 이후에 단계 희석된 에탄올로 박테리아 고스트를 탈수시키고, 액화 이산화탄소로 건조 시킨 후 polaron high-resoultion sputter를 이용하여 금(gold) 코팅하였다. 상기 방법으로 준비된 각 처리구의 박테리아 고스트를 Leo 1455VP 주사 전자현미경으로 관찰하였다.

도 5에서 보는 바와 같이 박테리아 고스트의 형태를 무처리구 대장균과 비교한 결과, 황산암모늄, 염화칼슘, 에틸렌디아민사아세트산을 처리하여 제조한 대장균박테리아 고스트에서는 용해된 터널 구조가 잘 관찰되었으나, 무처리구는 대장균의 완벽한 형태가 관찰되었다. 박테리아 고스트에서 직경이 100-500nm의 다양한 터널 이외에는 세포막의 손상은 관찰되지 않았다.

Claims

그람 음성균에 황산암모늄, 염화칼슘 및 에틸렌다이아민테트라아세트산으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 화학물질을 처리하여 박테리아 고스트(bacterial ghost, BG)를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 그람 음성균은 대장균(E. coli), Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Klebsiella pneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Heliobacter pylori, Vibrio cholerae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus influenzae, Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Ralstonia eutropha, 및Pectobacterium cypripedii 로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 박테리아 고스트를 제조하는 방법.
제 2항에 있어서, 대장균(E. coli)은 대장균(E. coli) DH5α 균주인 것을 특징으로 하는 박테리아 고스트를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 황산암모늄의 처리는 배양기에서 35 내지 40℃에서 30분에서 90분, 염화칼슘의 처리는 배양기에서 35 내지 40℃에서 60분에서 90분 및 에틸렌다이아민테트라아세트산의 처리는 배양기에서 35 내지 40℃에서 45분에서 90분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 박테리아 고스트를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 화학물질은 최소억제농도로 처리되는 것을 특징으로 하는 박테리아 고스트를 제조하는 방법.
제 5항에 있어서, 화학물질의 최소억제농도는 황산암모늄 187.50㎎/㎖, 염화칼슘 125㎎/㎖ 또는 에틸렌다이아민테트라아세트산 25㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 박테리아 고스트를 제조하는 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 박테리아 고스트.
제 7항에 있어서, 박테리아 고스트는 사백신 또는 외래 항원 운반체로 사용되는 것을 특징으로 하는 박테리아 고스트.