KR20200094026A

KR20200094026A - 황산을 이용하는 박테리아 고스트 제조방법, 상기 방법으로 제조된 박테리아 고스트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200094026A
Application number: KR1020190011487A
Authority: KR
Inventors: 오성; 최창원; 김성대; 노한별; 이송희
Original assignee: 배재대학교 산학협력단
Priority date: 2019-01-29
Filing date: 2019-01-29
Publication date: 2020-08-06
Also published as: KR102178334B1

Abstract

본 발명은 혐기성 그람양성균 및 황산(sulfuric acid)을 이용하는 박테리아 고스트(bacterial ghost) 제조 방법, 상기 방법으로 제조된 박테리아 고스트 및 이의 용도에 대한 것이다.
따라서, 본 발명의 황산을 이용하여 박테리아 고스트를 제조하는 방법은 박테리아의 외막을 거의 변형시키지 않으면서 그 성장만을 억제시킬 수 있으므로 간단하면서도 시간과 비용을 절약할 수 있는 박테리아 고스트 제조 방법으로서 효과적이다. 특히, 본 발명은 상기 황산을 처리할 때의 최적의 조건을 제공할 수 있으므로 박테리아 고스트 제조 방법으로서 더욱 효과적이다. 또한, 본 발명의 제조 방법으로 제조된 박테리아 고스트는 백신 또는 외래 항원 운반체 용도로서도 사용될 수 있다.

Description

황산을 이용하는 박테리아 고스트 제조방법, 상기 방법으로 제조된 박테리아 고스트 및 이의 용도 {Method for preparing bacterial ghosts by using sulfuric acid, bacterial ghosts prepared by the same and uses thereof}

본 발명은 혐기성 그람양성균 및 황산(sulfuric acid)을 이용하는 박테리아 고스트(bacterial ghost) 제조 방법, 상기 방법으로 제조된 박테리아 고스트 및 이의 용도에 대한 것이다.

박테리아 고스트는 박테리아 세포 내 구성물(세포질 함유물)을 제거하여 내부는 텅 빈 상태이지만, 외막(envelope)의 형태를 완전하게 유지하는 구조체로 간단히 정의할 수 있다. 또한, 박테리아 고스트는 유전물질이 결여된 사균 상태이기 때문에 유전자 재조합생물체(GMO)로 간주되지 않는다.

상기 박테리아 고스트는 생균의 외막을 유지하고 있기 때문에 생균 외막의 항원 결정부위(antigenic determinant)를 그대로 보유하고 있어 기능적으로 생백신과 유사한 효과를 나타낸다. 특히, 박테리아 감염증을 치료하는데 있어서, 박테리아 고스트를 사용하는 백신(고스트 백신)은 비특이적인 다량의 세포질로 인한 면역 유도 저해가 없어, 외래적인 보조제(adjuvant)를 첨가하지 않고도 내재면역과 적응면역 시스템을 쉽게 자극할 수 있다. 또한, 불활성화된(inactivated) 박테리아 고스트는 동물, 인간 혹은 식물의 특수한 조직이나 세포에 부착할 수 있을 뿐만 아니라, 내부로 도입될 수 있기 때문에 재조합 항원이나 핵산을 표적 세포에 효과적으로 전달할 수 있는 운반시스템(delivery system)으로 활용할 수 있다.

이러한 박테리아 고스트를 생산하는 가장 일반적인 방법은 E 단백질 매개 용해법으로서 박테리오파아지(bacteriophage) ΦX174 용해유전자 E를 클로닝한 플라스미드(plasmid)를 그람 음성균에 형질전환(transformation)하여 이를 발현시키는 방법이다. 형질전환된 박테리아는 E 유전자를 억제하였다가 온도 변화에 따라 E 단백질을 발현하는데, 합성된 E 단백질은 박테리아 표면 구조에 물리화학적 손상을 주지 않고 박테리아 세포막 및 세포벽에 막관통 터널을 형성하여 궁극적으로 세포구성물을 방출시킨다(비특허논문 0001). 그러나, 상기와 같은 방법들은 다단계 과정의 분자생물학적 기술과 고가의 비용 및 장기간의 제조 시간이 필요하다. 따라서 박테리아 고스트 대량생산을 위한 간단한 제조기술, 저가의 생산 비용 및 시간을 절약할 수 있는 새로운 제조방법에 대한 연구가 이루어지고 있다.

최근 그람 음성균인 대장균(E. coli BL21 (DE3) pLysS)을 모델로 하여 화학물질인 SDS, 수산화나트륨(NaOH), 과산화수소(H₂O₂)를 처리함으로써 박테리아 고스트를 제조하는 방법(비특허문헌 0004), 또는 대장균(E. coli DH5α)을 모델로 세포벽에 영향을 미치는 화학물질인 황산암모늄{(NH₄)₂SO₄}, 염화칼슘(CaCl₂) 및 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)의 최소억제농도(minimum inhibitory concentration; MIC)에 기반을 둔 박테리아 고스트 제조방법(특허문헌 0004)이 개발된 바 있다. 또한, 최근 그람음성균인 살모넬라 엔테리카 엔테리디티스(Salmonella enterica Enteriditis) 및 그람양성균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)를 수산화나트륨을 처리하여 박테리아 고스트로 제조하고 실험동물에 면역접종한 후 면역능을 유도하여 백신의 가능성을 증명한 연구가 보고되었다(비특허논문 0005 및 비특허논문 0006).

그러나 수산화나트륨 등 염기성 물질에 의하여 박테리아 고스트의 외막에 존재하는 일부 항원결정기 단백질이 유리될 가능성이 있으며 그 경우 백신으로서의 효능이 떨어질 우려가 있다. 그에 따라 산성 물질인 염산 및 그람양성균인 리스테리아 모노키토게네스(Listeria monocytogenes)를 이용한 박테리아 고스트 제조방법이 개발되었다(특허문헌 0005). 그러나 황산(sulfuric acid)을 이용한 박테리아 고스트에 대한 연구 내지 특허는 개시된 바 없다.

대한민국 등록특허공보 제10-0273847호, 2000. 12. 15. 공고 대한민국 등록특허공보 제10-0765357호, 2007. 10. 10. 공고 US 7968323 B2, 2011. 6. 28. 공개 대한민국 등록특허공보 제10-1449628호, 2014. 10. 02. 공고 대한민국 등록특허공보 제10-1825439호, 2018. 01. 30. 공고

Haidinger, W. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003, Vol. 69(1), pPropionibacterium 468-474 Ebensen, T. et al., J. Immunol. 2004, Vol. 172, pPropionibacterium 6858-6865 Konopa, G. & Taylor, K., Biochim. Biophys. Acta. 1975, Vol. 399(2), pPropionibacterium 460-467 Amara, A. A. et al., The Scientific World Journal, 2013, Vol. 2013, Article ID 545741, 7 pages, doi:10.1155/2013/545741 Vinod, N. et al., Vaccine, 2014, Vol. 32, pPropionibacterium 3249-3255, doi:10.1016/j.vaccine.2014.03.090 Vinod, N. et al., Infection and Immunity, 2015, Vol. 83, pPropionibacterium 2957-2965, doi:10.1155/2013/545741

이에, 본 발명자들은 박테리아 고스트를 대량으로 생산할 수 있으면서, 간단하고 시간 및 비용을 절약할 수 있는 박테리아 고스트 제조 방법을 제공하기 위하여 예의 노력한 결과, 황산을 이용하는 경우 박테리아의 외막을 생균과 동일한 수준으로 유지하면서 박테리아의 성장을 억제하여 효과적으로 박테리아 고스트를 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 황산(sulfuric acid)을 이용하는 박테리아 고스트(bacterial ghost) 제조 방법 및 상기 제조 방법으로 제조된 박테리아 고스트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리아 고스트를 포함하는 혐기성 그람양성균 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물 내지 외래 항원 운반체용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 i) 혐기성 그람양성균을 배지에 접종하여 배양하는 단계;

ii) 상기 단계 i)에서 배양된 균을 분리 및 수득하여 새로운 배지에 접종하여 현탁액을 제조하는 단계; 및

iii) 상기 단계 ii)의 현탁액에 황산(sulfuric acid)을 처리한 후 배양하는 단계;

를 포함하는 박테리아 고스트(bacterial ghost) 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 혐기성 그람양성균은 프로피오니박테리움(Propionibacterium)속 균, 연쇄상구균(Streptococcus)속 균, 장내구균(Enterococcus)속 균, 락토코코스(Lactococcus)속 균, 류코노스톡(Leuconostoc)속 균, 페디오코쿠스(Pedicoccu)속 균, 클로스트리듐(Clostridium)속 균, 젖산간균(Lactobacillus)속 균 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)속 균 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 ii)의 현탁액에서 균의 농도는 10³ 내지 10⁹ CFU/㎖인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 현탁액의 pH는 0.1 내지 1.5 인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)에서 황산은 최소억제농도로 처리되는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 다르면, 상기 황산의 최소억제농도는 5 내지 100 ㎎/㎖인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)에서 배양은 적어도 5분 이상 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)에서 배양은 25℃ 내지 50℃에서 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 제조 방법으로 제조된 박테리아 고스트(bacterial ghost) 및 상기 박테리아 고스트를 포함하는 혐기성 그람양성균 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물 내지 외래 항원 운반체용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 혐기성 그람양성균은 프로피오니박테리움(Propionibacterium)속 균, 연쇄상구균(Streptococcus)속 균, 장내구균(Enterococcus)속 균, 락토코코스(Lactococcus)속 균, 류코노스톡(Leuconostoc)속 균, 페디오코쿠스(Pedicoccu)속 균, 클로스트리듐(Clostridium)속 균, 젖산간균(Lactobacillus)속 균 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)속 균 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

따라서, 본 발명의 황산을 이용하여 박테리아 고스트를 제조하는 방법은 박테리아의 외막을 거의 변형시키지 않으면서 그 성장만을 억제시킬 수 있으므로 간단하면서도 시간과 비용을 절약할 수 있는 박테리아 고스트 제조 방법으로서 효과적이다. 특히, 본 발명은 상기 황산을 처리할 때의 최적의 조건을 제공할 수 있으므로 박테리아 고스트 제조 방법으로서 더욱 효과적이다. 또한, 본 발명의 제조 방법으로 제조된 박테리아 고스트는 백신 또는 외래 항원 운반체 용도로서도 사용될 수 있다.

도 1은 2배 연속 희석(two-fold broth dilution) 방법으로 프로피오니박테리움 아크네스균의 증식을 억제하는 화학제의 최소억제농도(MIC)를 나타낸다(A: 수산화나트륨 처리구, B: 염산 처리구 및 C: 황산 처리구 ; 각 처리구의 시험관에 각각 처리한 화학제의 농도: (C) 무처리(대조구), (1) 50 mg/㎖, (2) 25 mg/㎖, (3) 12.5 mg/㎖, (4) 6.25 mg/㎖, (5) 3.125 mg/㎖, (6) 1.5625 mg/㎖, (7) 0.78125 mg/㎖, (8) 0.390625 mg/㎖, (9) 0.1953125 mg/㎖). 수산화나트륨, 염산 및 황산의 MIC는 각각 25 mg/㎖, 12.5 mg/㎖ 및 50 mg/㎖ 임을 확인하였다.
도 2는 상기 [도 1]의 각 처리구에서 박테리아 생존능(viability)을 확인하기 위하여 콜로니 형성 유무를 나타낸다(A: 수산화나트륨 처리구, B: 염산 처리구 및 C: 황산 처리구 ; 각 처리구의 배지에 각각 처리한 시료: (C): [도 1]의 무처리 대조구를 1/1000로 희석한 시료, (1): [도 1]의 1번 시험관 시료, (2): [도 1]의 2번 시험관 시료, (3): [도 1]의 3번 시료 및 (4): [도 1]의 4번 시료). 각 처리구 모두 최소억제농도 이하의 농도에서는 콜로니가 형성되는 것을 확인할 수 있었다.
도 3은 최소억제농도의 화학제 처리 60분 후 제조된 프로피오니박테리움 아크네스 고스트에서 추출한 유전체 DNA의 아가로스(agarose) 전기영동 결과를 나타낸다(M: 단백질 분자량 마커, 레인(lane) 1: 무처리 대조구, 레인 2: 수산화나트륨, 레인 3: 염산, 레인 4: 황산). 무처리 대조구에서는 DNA가 검출되었으나 화학제 처리구에서는 DNA가 검출되지 않음을 확인할 수 있었다.
도 4는 수산화나트륨(NaOH), 염산(HCl) 또는 황산(HCl)을 각각 60분 처리하여 제조한 프로피오니박테리움 아크네스 고스트(PAG) 및 무처리구(Control(P.acnes), Control(E. coli))로부터 추출한 유전체 DNA 시료에 대하여 프로피오니박테리움 아크네스에 특이적인 프라이머와 함께 실시간 PCR(real-time PCR)을 실시한 결과를 나타낸다. 무처리구(Control(P. acnes)) 및 수산화나트륨을 처리하여 제조한 고스트에서만 DNA가 증폭되고, 나머지 실험군에서는 DNA가 증폭되지 않았음을 확인할 수 있었다.
도 5는 최소억제농도의 화학제를 60분 동안 처리하여 제조한 프로피오니박테리움 아크네스 고스트의 주사전자현미경 분석 결과를 나타낸다. 화살표가 가리키는 곳은 프로피오니박테리움 아크네스균의 막이 용해되어 형성된 막관통(transmembrane) 터널(tunnel) 이다(A: 수산화나트륨, B: 염산, C: 황산, D: 무처리 대조구). 수산화나트륨 또는 염산이 처리되는 경우 균의 외막이 심하게 변형된 반면, 황산을 처리하는 경우 무처리 대조구와 거의 동일한 수준의 외막을 가지는 것을 확인하였다.
도 6은 최소억제농도의 황산(50 mg/㎖)을 처리한 후 15, 30, 45, 60 및 90분 경과에 따른 콜로니 형성 유무를 나타낸다. 황산 처리 후 15분이 경과하면 콜로니가 형성되지 않는 것을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래 박테리아 고스트를 제조하는 방법들은 난이도가 높고 비용 내지 시간이 많이 요구된다는 문제점이 있었으며, 간단하게 화학물질을 이용하는 경우에는 제조된 박테리아 고스트의 외막이 심하게 변형된다는 한계점이 존재하였다. 상기 한계점을 극복하기 위하여 간단하면서도 시간과 비용을 절약할 수 있는 박테리아 고스트 제조 방법에 대한 연구가 요구되고 있다.

본 발명에 따른 황산을 이용한 박테리아 고스트 제조 방법은 박테리아의 외막을 손상하지 않으면서 그 성장을 억제할 수 있고, 황산을 최적의 조건으로 처리하는 경우 보다 효과적으로 박테리아 고스트를 제조할 수 있다. 또한 상기 제조 방법으로 제조된 박테리아 고스트는 백신 또는 외래 항원 운반체 용도로서 제공될 수도 있다.

본 발명자들은 혐기성 그람양성균에 수산화나트륨(NaOH), 염산(HCl) 또는 황산(H₂SO₄)의 화학제들을 각각 처리하여 박테리아 고스트를 제조하고자 하였다. 상기 화학제들로 박테리아 고스트를 제조하는데에 필요한 최소억제농도(minimum inhibition concentration; MIC)는 각각 25 ㎎/㎖, 12.5 ㎎/㎖ 및 50 ㎎/㎖ 이었으며([도 1] 및 [도 2]), 상기 화학제들을 MIC로 각각 60분 동안 처리하여 제조된 박테리아 고스트들은 내부에 잔존하는 DNA가 검출되지 않았다([도 3] 및 [도 4]).

수산화나트륨(NaOH), 염산(HCl) 또는 황산(H₂SO₄)의 화학제들을 각각 60분동안 처리하여 제조된 박테리아 고스트들의 표면을 분석한 결과, 수산화나트륨 또는 염산을 처리한 경우에 비하여 황산을 처리하여 제조한 박테리아 고스트의 경우 그 외관이 생균의 외관과 거의 동일한 수준으로 유지되는 것을 확인할 수 있었다(도 5). 이에 본 발명자들은 황산을 이용하여 박테리아 고스트를 제조하는데에 요구되는 시간을 결정하고자 하였으며 이는 15분임을 확인하였다(도 6).

따라서, 본 발명은 i) 혐기성 그람양성균을 배지에 접종하여 배양하는 단계;

를 포함하는 박테리아 고스트(bacterial ghost) 제조 방법 및 상기 제조 방법으로 제조된 박테리아 고스트를 제공할 수 있다.

본 발명의 상기 단계 i)의 혐기성 그람양성균은 배양기에서 68시간 내지 76시간 배양한 후 수행되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 70시간 내지 74시간 배양한 후 수행되는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 72시간 배양한 후 수행되는 것이 바람직하다. 박테리아 생장단계 중 대수증식기(exponential growth phase)에 있는 박테리아들의 세포벽은 화학제에 민감하나, 상기 시간 이상 배양된 박테리아들은 탄력이 있는 세포벽을 갖기 때문에 화학제를 이용하여 용해된 터널 구조를 형성시키는데에 더욱 효과적일 수 있다.

본 발명의 상기 단계 i)의 혐기성 그람양성균은 프로피오니박테리움(Propionibacterium)속 균, 연쇄상구균(Streptococcus)속 균, 장내구균(Enterococcus)속 균, 락토코코스(Lactococcus)속 균, 류코노스톡(Leuconostoc)속 균, 페디오코쿠스(Pedicoccu)속 균, 클로스트리듐(Clostridium)속 균, 젖산간균(Lactobacillus)속 균 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)속 균 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 프로피오니박테리움(Propionibacterium)속 균인 것이 바람직하다.

상기 프로피오니박테리움(Propionibacterium)속 균이라면 제한없이 본 발명에 사용될 수 있으나 바람직하게는 Propionibacterium acidifaciens , Propionibacterium acidipropionici , Propionibacterium acnes, Propionibacterium australiense , Propionibacterium avidum , Propionibacterium cyclohexanicum , Propionibacterium damnosum , Propionibacterium freudenreichii , Propionibacterium granulosum , Propionibacterium jensenii , Propionibacterium lymphophilum , Propionibacterium microaerophilic , Propionibacterium namnetense , Propionibacterium olivae 및 Propionibacterium propionicus , Propionibacterium thoenii 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 단계 ii)의 현탁액에서 균의 농도는 10³ 내지 10⁹ CFU/㎖인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 10⁴ 내지 10⁸ CFU/㎖ 인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 10⁵ 내지 10⁷ CFU/㎖ 인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 단계 iii)의 현탁액의 pH는 0.1 내지 1.5 인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.3 내지 1.2 인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 0.5 내지 1 인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 단계 iii)에서 황산은 최소억제농도로 처리될 수 있으며, 상기 황산의 최소억제농도는 5 내지 100 ㎎/㎖인 것이 바람직하나 더욱 바람직하게는 20 내지 80 ㎎/㎖ 인 것이 바람직하고 가장 바람직하게는 40 내지 60 ㎎/㎖ 인 것이 바람직하다. 만일 상기 황산이 최소억제농도 이하로 처리되는 경우 용해율이 완벽하지 않아 생존한 박테리아가 존재할 수 있으며, 최소억제농도 이상으로 처리되는 경우 박테리아의 외막구조를 손상시켜 완벽한 터널 구조를 형성할 수 없기 때문에 박테리아 고스트의 제조가 불가능하다.

본 발명의 상기 단계 iii)에서 배양의 최소시간은 10분 내지 20분인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 12분 내지 18분인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 14분 내지 16분 이상 이루어지는 것이 바람직하다. 보다 안전한 박테리아 고스트의 제조를 위하여는 60분 이상 배양하는 것이 바람직하며, 그 이상 배양하는 경우 배양 시간은 해당 기술분야의 통상의 기술자가 박테리아 고스트 제조의 목적에 맞추어 조절할 수 있다.

본 발명의 상기 단계 iii)에서 배양은 25℃ 내지 50℃에서 이루어지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 30℃ 내지 45℃에서 이루어지는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 35℃ 내지 40℃에서 이루어지는 것이 바람직하다.

즉, 본 발명의 상기 iii) 단계는 현탁액의 pH, 처리되는 황산의 농도 및 황산을 처리한 후 배양하는 시간 및 온도가 최적의 조건으로 조합되는 경우 이들이 종합적으로 작용하여 시너지효과를 일으켜 결과적으로 가장 효과적인 박테리아 고스트 제조 방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 박테리아 고스트를 포함하는 혐기성 그람양성균 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물 내지 외래 항원 운반체용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 상기 혐기성 그람양성균은 프로피오니박테리움(Propionibacterium)속 균, 연쇄상구균(Streptococcus)속 균, 장내구균(Enterococcus)속 균, 락토코코스(Lactococcus)속 균, 류코노스톡(Leuconostoc)속 균, 페디오코쿠스(Pedicoccu)속 균, 클로스트리듐(Clostridium)속 균, 젖산간균(Lactobacillus)속 균 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)속 균 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.

상기 프로피오니박테리움(Propionibacterium)속 균이라면 제한없이 해당할 수 있으나 바람직하게는 Propionibacterium acidifaciens , Propionibacterium acidipropionici , Propionibacterium acnes , Propionibacterium australiense , Propionibacterium avidum , Propionibacterium cyclohexanicum , Propionibacterium damnosum , Propionibacterium freudenreichii , Propionibacterium granulosum , Propionibacterium jensenii , Propionibacterium lymphophilum , Propionibacterium microaerophilic , Propionibacterium namnetense , Propionibacterium olivae 및 Propionibacterium propionicus , Propionibacterium thoenii 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)인 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다. 이때 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략할 수 있다.

혐기성 그람 양성균

혐기성 그람 양성균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)를 BHI(brain heart infusion) 배지에 접종하고, 37℃, 200 rpm, 혐기조건에서 하루동안 진탕 배양하였다. 아크네스균의 성장과 용균은 Biochrom Libra S22 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 O.D. 600nm에서 측정하였다.

화학제의 최소억제농도 결정

균주에 화학제를 처리하여 박테리아 고스트를 제조하는 경우, 처리할 화학제들의 최소억제농도(minimum inhibition concentration; MIC)를 균주의 증식 및 생존능 확인을 통해 정하고자 하였다.

구체적으로, MIC 값은 two-fold broth dilution 법(Penna et al., Infec. Dis. 2001, Vol. 1, pPropionibacterium 1-8)을 이용하여 측정하였다. 먼저 수산화나트륨 염산 및 황산 50 mg/㎖을 각각 연속 희석(serial dilution; 50 mg/㎖, 25 mg/㎖, 12.5 mg/㎖, 6.25 mg/㎖, 3.125 mg/㎖, 1.5625 mg/㎖, 0.78125 mg/㎖, 0.390625 mg/㎖ 및 0.1953125 mg/㎖)하여 프로피오니박테리움 아크네스균 10⁶ CFU/㎖를 접종한 BHI 액체배지에 첨가하고, 37℃에서 18시간 배양하여 균주의 증식능을 확인하였다. 또한, 균주의 생존능을 확인하기 위하여 각 농도 처리구를 각각 5개의 BHI 아가 배지에 도말하고, 37℃에서 72시간 배양한 후 생존 콜로니를 관찰하였다.

화학제	최소억제농도( MIC , mg/ml)	배지 pH
NaOH	25	13.5
HCl	12.5	1.3
H₂SO₄	50	0.7

그 결과, [도 1] 및 상기 [표 1]에서 나타나는 바와 같이 균주가 자라지 않아 뿌옇지 않고 맑은 배지가 나타나는 농도로서 수산화나트륨(A)의 MIC는 25 mg/㎖(2), 염산(B)의 MIC는 12.5 mg/㎖(3), 황산(C)의 MIC는 50 mg/㎖(1)로 결정되었다.

또한, [도 2]에서 나타나는 바와 같이 각 화학제를 처리하지 않은 균주 배양액을 1/1000로 희석한 무처리구(C)와 비교하여 수산화나트륨(A), 염산(B) 또는 황산(C)의 MIC 이상의 농도를 처리한 배지에서는 콜로니가 전혀 형성되지 않는 것을 확인할 수 있었다.

박테리아 고스트 검증

<3-1> 박테리아 고스트 제조

상기 [실시예 1]의 프로피오니박테리움 아크네스균(이하 아크네스균)을 BHI 액체 배지에서 72시간 배양하고 10,000g에서 10분간 원심분리한 후 침전물을 수확하여 phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.0) 버퍼용액으로 세척하고, 아크네스균의 농도를 10⁶ CFU/ml로 조정하였다. 황산 50 mg/㎖을 2 ㎖의 박테리아 현탁액에 첨가하고 37℃에서 60분간 배양하였다. 아크네스균의 용해가 완료된 후 PBS 버퍼용액으로 2회 세척하고, 10,000g에서 15분간 원심분리하여 박테리아 고스트를 수확하였다.

<3-2> DNA 검출 - 아가로스 젤( agarose gel) DNA 분석

박테리아 고스트 내에 게놈 DNA가 존재하는가를 분석하기 위해서 ethidium bromide(EtBr 0.5g/㎖, w/v)가 들어간 1% 아가로스 젤에 MIC 60분 처리구의 박테리아 고스트를 적재하고 전기영동을 실시하였다.

그 결과, [도 3]에서 나타나는 바와 같이 아가로스 젤 전기영동 분석 결과, (2) 수산화나트륨 MIC 60분 처리구, (3) 염산 MIC 60분 처리구 및 (4) 황산 MIC 60분 처리구 박테리아 고스트에 잔존하는 DNA는 전혀 관찰되지 않았으나, (1) 무처리구의 아크네스균에서는 게놈 DNA 밴드가 관찰되었다. 즉, 수산화나트륨, 염산 및 황산의 MIC를 단순히 처리하여 제조된 박테리아 고스트들은 모두 게놈 DNA를 포함하지 않는 것을 확인하였다.

<3-3> DNA 검출 - 실시간(Real-time) PCR 증폭 분석

상기 실시예 <3-2>에서 더 나아가 박테리아 고스트 내에 게놈 DNA가 존재하는가를 보다 확실하게 증명하고자 하였다.

구체적으로, 무처리구(양성대조구), TE buffer(음성대조구), 수산화나트륨 MIC 60분 처리구, 염산 MIC 60분 처리구, 황산 MIC 60분 처리구 박테리아 고스트로부터 상업용 추출 키트(iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 제조사의 방법에 따라서 게놈 DNA를 추출하였다. 상기 DNA 시료를 주형(template)으로 하여 16s rRNA의 DNA 조각을 하기 [표 2]의 아크네스균 특이적 프라이머로 실시간 PCR(TaqMan Probe Detection, Stratagene Mx3000P real time PCR) 방법으로 증폭하였다(총반응액(20 ㎕): 1 ㎕ 주형 DNA(5ng), 1 ㎕ 정방향 및 역방향 프라이머(10 pmol/㎕), 10 ㎕ 2x HS Prime qPCR Premix with UDG(GeNet Bio, Korea), 7 ㎕ 살균증류수; 반응온도 : 50℃에서 3분(1 사이클), 95℃에서 10분(1 사이클) 및 95℃ 10초 - 60℃에서 30초(40 사이클)).

명 칭	서 열		서열번호
아크네스균 특이적 프라이머	정방향	5’-GGA ATT CCA CGT GTA GCG GTG AAA T-3’	1
아크네스균 특이적 프라이머	역방향	5’-GAC TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT TTG-3’	2
taqman probe	5’-AAC ACC AGT GGC GAA GGC GA-3’		3

그 결과, 상기 실시예 <3-2> 또는 [도 3]과 달리 [도 4]에서 나타나는 바와 같이 수산화나트륨의 MIC 처리구에서 다량의 DNA가 증폭되는 것을 확인하였다. 반면에 염산 및 황산 MIC 처리구에서는 전혀 DNA가 증폭되지 않았다. 결과적으로 박테리아 고스트 제조를 위해서는 염산과 황산이 수산화나트륨보다 효과적임을 알 수 있었다.

박테리아 고스트 표면 분석

수산화나트륨, 염산 및 황산을 각각 MIC로 60분 동안 처리하여 제조된 박테리아 고스트를 2.5% glutaraldehyde를 첨가한 PBS 용액에 4℃에서 2시간 고정한 후 같은 용액으로 세척하고 1% osmium tetroxide(OsO4) 용액에 4℃에서 1.5시간 고정하였다. 이후에 단계 희석된 에탄올로 박테리아 고스트를 탈수시키고, 액화 이산화탄소로 건조 시킨 후 polaron high-resoultion sputter를 이용하여 금(gold) 코팅하였다. 상기 방법으로 준비된 각 처리구의 박테리아 고스트를 Hitachi S-4800 FESEM(Field Emission Scaning Electron Microscope) 주사 전자현미경(Scanning electron mircroscopy; SEM)으로 관찰하였다.

그 결과, [도 5]에서 나타나는 바와 같이 무처리구(D)와 비교하여 수산화나트륨(A) 또는 염산 MIC 처리구(B)에서 외막 형태를 유지하지 못하고 녹거나 분해되어 박테리아 고스트 형태를 갖지 못하는 것을 확인하였다. 반면에 황산 MIC 처리구(C)는 뚜렷한 용해된 터널 구조 및 완벽한 외막 형태를 유지하고 있는 것을 확인하였다. 결과적으로 박테리아 고스트 제조를 위해서는 수산화나트륨 및 염산보다 황산이 효과적임을 알 수 있었으므로 황산을 선택하였다.

박테리아 고스트 제작 최소시간 결정

상기의 방법으로 박테리아 고스트를 제작하는데에 필요한 최소시간을 결정하고자 하였다.

구체적으로, 황산 MIC 처리 후 15분 간격(15분, 30분, 45분, 60분, 90분)으로 각각 박테리아 고스트를 수확한 후 용해율을 측정하였다. 제조한 박테리아 고스트를 대상으로 아크네스균의 Colony Forming Unit(CFU) 수를 측정하기 위하여 표준 분석법인 도말법을 실시하였다. 각 처리구는 각각 5개의 BHI 아가 배지에 도말하고, 37℃에서 배양한 후 생존하여 성장하는 콜로니 수를 측정하였다.

그 결과, [도 6]에서 나타나는 바와 같이 황산 MIC 처리 15분 후부터는 생존한 콜로니가 전혀 관찰되지 않았다. 따라서 박테리아 고스트를 100% 완벽하게 제조하는데 걸리는 최소 시간은 15분이 소요되는 것을 알 수 있다.

<110> PAICHAI UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Method for preparing bacterial ghosts by using sulfuric acid, bacterial ghosts prepared by the same and uses thereof <130> 1065278 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> acnes_F <400> 1 ggaattccac gtgtagcggt gaaat 25 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> acnes_R <400> 2 gactaccagg gtatctaatc ctgtttg 27 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> taqman probe <400> 3 aacaccagtg gcgaaggcga 20

Claims

i) 혐기성 그람양성균을 배지에 접종하여 배양하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 배양된 균을 분리 및 수득하여 새로운 배지에 접종하여 현탁액을 제조하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)의 현탁액에 황산(sulfuric acid)을 처리한 후 배양하는 단계;
를 포함하는 박테리아 고스트(bacterial ghost) 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 i)의 혐기성 그람양성균은 프로피오니박테리움(Propionibacterium)속 균, 연쇄상구균(Streptococcus)속 균, 장내구균(Enterococcus)속 균, 락토코코스(Lactococcus)속 균, 류코노스톡(Leuconostoc)속 균, 페디오코쿠스(Pedicoccu)속 균, 클로스트리듐(Clostridium)속 균, 젖산간균(Lactobacillus)속 균 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)속 균 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 ii)의 현탁액에서 균의 농도는 10³ 내지 10⁹ CFU/㎖인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 현탁액의 pH는 0.1 내지 1.5 인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 iii)에서 황산은 최소억제농도로 처리되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 황산의 최소억제농도는 5 내지 100 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 iii)에서 배양의 최소시간은 10분 내지 20분인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 iii)에서 배양은 25℃ 내지 50℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항의 제조 방법으로 제조된 박테리아 고스트(bacterial ghost).
제9항의 박테리아 고스트를 포함하는 혐기성 그람양성균 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제10항에 있어서, 상기 혐기성 그람양성균은 프로피오니박테리움(Propionibacterium)속 균, 연쇄상구균(Streptococcus)속 균, 장내구균(Enterococcus)속 균, 락토코코스(Lactococcus)속 균, 류코노스톡(Leuconostoc)속 균, 페디오코쿠스(Pedicoccu)속 균, 클로스트리듐(Clostridium)속 균, 젖산간균(Lactobacillus)속 균 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)속 균 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제9항의 박테리아 고스트를 포함하는 외래 항원 운반체용 조성물.