KR101976764B1 - 활주세균의 병원성 약독화 기술 및 활주세균병 예방을 위한 생약독화 백신 조성물 - Google Patents

활주세균의 병원성 약독화 기술 및 활주세균병 예방을 위한 생약독화 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 테나시바쿨럼 마리티멈 균주 및 이를 포함하는 어류 질병 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

활주세균의 병원성 약독화 기술 및 활주세균병 예방을 위한 생약독화 백신 조성물 {Tenacibaculum maritimum virulence attenuation technique and live attenuated vaccine for preventing fish Tenacibaculosis disease}
본 발명은 약독화 활주세균 및 이를 이용한 어류 백신 조성물에 관한 것으로서, 활주세균 야생주에 비해 안전한, 활주세균 야생주를 이용한 사백신 대비 우수한 백신 효과에 관한 것이다.
활주세균 (Tenacibaculum maritimum)은 활주세균병의 원인체로서, 초기 Flexibacter maritimus로 불리웠으며, 그람 음성 장간균으로 증식적정온도는 15~25℃ 정도이다. 활주세균증에 감염되면 넙치의 체표면이 회색으로 변하거나 원형의 상처, 궤양이 관찰되며 지느러미가 부식되면서 골격만이 남는다. 아가미가 부식된 넙치는 체색이 검어지고 힘없이 떠다니는 현상을 보인다. 상기 피부궤양은 특정 부위가 정해져 있지 않아, 입과 꼬리, 아가미, 지느러미, 눈에 궤양을 형성하고 다른 균과 원충류에 의해 이차감염이 발생한다. 많은 양어장에서 90~95%의 높은 폐사율이 나타난다.
병원체로부터 양식장의 피해를 최소화하기 위한 방법으로는 병원체를 사멸시키는 항생제와 백신 등이 있다. 항생제의 경우 미생물에 의하여 만들어진 물질로서, 다른 미생물의 성장 또는 생명을 막는다. 항생제는 양식장에서 널리 사용되고 있지만, 항생제의 오남용으로 인한 내성균이 출현하면서 항생제 사용에 따른 심각성이 대두되고 있다.
백신은 인공적으로 병원체의 항원성을 떨어뜨려 만든 것으로 숙주의 면역세포에서 병원체에 대한 항체를 생산하여 면역력을 높이고, 재감염에 대해 예방할 수 있다. 백신은 대표적으로 사백신, 생백신, 톡소이드가 있다.
사백신은 병원체를 열이나 화학 약품으로 처리하여 비활성화시킨 백신이다. 생백신은 병원성을 약화시켜 살아있는 병원미생물로 만든 백신으로 약독화 백신이라고도 불린다. 톡소이드는 병원체가 아닌 질병을 일으키는 독성물질을 비활성화 시켜 그 항원성만 남겨 만들어진 백신이다.
많은 연구들은 생약독화 백신이 사백신과 비교할 때 효과가 좋고 면역력을 강화시킨다고 보고되었다. 생약독화 백신에 사용되는 균주는 병원성을 약하게 하여 숙주의 면역력을 높이지만 질병을 일으키지는 않는다.
현재까지, 생약독화 백신은 사람과 동물에 널리 사용되고 있지만, 한국 양식산업에서 생약독화 백신을 질병치료에 사용하지 않고 있다. 그러므로, 본 발명은 넙치에서 T. maritimum 감염을 예방하기 위한 안전하고 효과가 뛰어난 생약독화 백신을 개발하고자 한다.
본 발명은 활주세균 균주의 약독화 기술을 개발하고 사백신 대비 우수한 백신 효과가 있는 활주세균 약독화 균주 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 생약독화 균주를 이용한 어류용 백신으로서, 상기 어류 병원성 세균인 활주세균의 약독화 균주를 유효성분으로 포함하여, 동일한 농도의 항원을 사용하면서 효과가 우수한 어류 백신 및 이의 제조방법을 제공한다.
이에, 본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위하여, 어류에서 발생하는 세균성 질병의 원인균으로부터 약독화 기술을 개발하였고, 본 기술로부터 얻어진 약독화 균체를 유효성분으로 포함하는 백신을 개발하였다.
본 발명은 어류에서 발생하는 세균성 질병의 원인균인 활주세균의 약독화 방법을 제공한다. 본 발명의 일예는 활주세균 (Tenacibaculum maritimum)을 항생제가 포함된 액체 배지에서 교반하면서 배양하는 단계를 포함하는 약독화 활주세균의 제조방법에 관한 것이다. 상기 제조방법은 배양하는 단계 이후에 배양액을 취하여 고체배지에서 배양하여 콜로니를 선택하는 단계를 포함하며, 상기 항생제가 포함된 액체 배지에서 배양하는 단계와 고체배지에서 배양하여 콜로니를 선택하는 단계를 1회 이상 반복하며, 반복 회수가 증가할수록 항생제의 농도를 증가시킨다. 예를 들면, 상기 항생제의 농도는 0.5 μg/mL 내지 200 μg/mL 범위에서 점진적으로 증가시켜 사용할 수도 있다.
본 발명에서 항생제로서 병원균을 돌연변이시키고 병원성을 약화시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 항생제의 예는 Novobiocin 등일 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 균주를 배양하는 단계에서 사용되는 균주 배양용 배지는 각 배양 대상 균주에 따라 적절히 선택하여 수행할 수 있으며 구체적 배양 조건은 알려진 배양 조건에서 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 상기 세균을 배양하는 단계를 수행하기 전에, 세균 배양용 배지에서 12 내지 24시간 동안 전배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
구체적인 일예로서, 본 발명에 따른 변이주를 제조하는 일예는, 넙치 피부의 병변으로부터 활주세균 야생주(TM-WT)를 분리하고, 저농도, 예를 들면 0.25 μg/mL의 Novobiocin이 포함된 marine 배지 용액에서 교반하면서 25 ℃의 온도에서 일정시간 동안 배양한다. 상기 배양된 균주를 marine broth 배지에서 20 μL를 취하여, Novobiocin이 포함된 균주 배양용 marine 고체 배지에 도말 후 배양하여 균주 집락이 형성되면 무작위로 집락 하나를 선별한다. 이와 같은 과정을 수회 반복하는데, Novobiocin의 농도를 점진적으로 증가시켜(예, 0.5 μg/mL 내지 200 μg/mL) Novobiocin에 의한 활주세균 변이주를 선별한다. 상기 계대배양 후에 추가적으로 30회 계대배양을 진행하여 목적 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 선별한다.
이에, 본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위하여, 어류에서 발생하는 세균성 질병의 원인균으로부터 약독화 기술을 개발하였고, 본 기술로부터 얻어진 약독화 균체를 유효성분으로 포함하는 백신을 개발하였다.
본 발명은 어류에서 발생하는 세균성 질병의 원인균인 활주세균의 약독화 방법을 제공한다. 본 발명의 일예는 활주세균 (Tenacibaculum maritimum)을 항생제가 포함된 액체 배지에서 교반하면서 배양하는 단계를 포함하는 약독화 활주세균의 제조방법에 관한 것이다. 상기 제조방법은 배양하는 단계 이후에 배양액을 취하여 고체배지에서 배양하여 콜로니를 선택하는 단계를 포함하며, 상기 항생제가 포함된 액체 배지에서 배양하는 단계와 고체배지에서 배양하여 콜로니를 선택하는 단계를 1회 이상 반복하며, 반복 회수가 증가할수록 항생제의 농도를 증가시킨다. 예를 들면, 상기 항생제의 농도는 0.5μg/mL 내지 200μg/mL 범위에서 점진적으로 증가시켜 사용할 수도 있다.
본 발명에서 항생제로서 병원균을 돌연변이시키고 병원성을 약화시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 항생제의 예는 Novobiocin 등일 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 균주를 배양하는 단계에서 사용되는 균주 배양용 배지는 각 배양 대상 균주에 따라 적절히 선택하여 수행할 수 있으며 구체적 배양 조건은 알려진 배양 조건에서 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 상기 세균을 배양하는 단계를 수행하기 전에, 세균 배양용 배지에서 12 내지 24시간 동안 전배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
구체적인 일예로서, 본 발명에 따른 변이주를 제조하는 일예는, 넙치 피부의 병변으로부터 활주세균 야생주(TM-WT)를 분리하고, 저농도, 예를 들면 0.25 μg/mL의 Novobiocin이 포함된 marine 배지 용액에서 교반하면서 25 ℃의 온도에서 일정시간 동안 배양한다. 상기 배양된 균주를 marine broth 배지에서 20μL를 취하여, Novobiocin이 포함된 균주 배양용 marine 고체 배지에 도말 후 배양하여 균주 집락이 형성되면 무작위로 집락 하나를 선별한다. 이와 같은 과정을 수회 반복하는데, Novobiocin의 농도를 점진적으로 증가시켜(예, 0.5μg/mL 내지 200μg/mL) Novobiocin에 의한 활주세균 변이주를 선별한다. 상기 계대배양 후에 추가적으로 30회 계대배양을 진행하여 목적 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 선별한다.
본 발명은 어류에서 발생하는 세균성 질병의 원인균인 활주세균 (Tenacibaculum maritimum)의 약독화 변이 균주를 제공한다.
상기 약독화 활주세균 균주는 1 x 108 CFU/fish 농도로 넙치에 투여하고 야생주를 5 x 107 CFU/fish 내지 1 x 108 CFU/fish 농도로 공격실험한 경우, 넙치에 복강투여시 약독화 균주의 상대생존률은 50 내지 100%이거나, 넙치에 침지투여 시 약독화 균주의 상대생존률은 10 내지 80%, 또는 15 내지 70%인 특성을 갖는다.
상기 균주는 균주 생장 주기 중 정체기(stationary phase)에서의 균체량이, 야생주 100 w/w%를 기준으로 30 내지 80 w/w%, 또는 40 내지 60 w/w%일 수 있다. 본원 발명에 따른 균주는 야생주 대비 병원성이 낮아 안전하며, 구체적으로 TM-NOV의 병원성을 확인하는 실험을 확인하였으며(실시예3), 도 6b에서 활주세균 야생주나 계대배양한 야생주가 폐사율이 80%이상인 것에 비해 TM-NOV는 0%를 나타낸다.
본 발명의 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)는 활주세균 JJ1309 균주로부터 돌연변이가 유발된 것으로서, 예를 들어 본 발명의 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)는 2017년 9월 4일자로 KCTC에 기탁된 기탁번호 KCTC18609P의 균주일 수 있다.
본 발명의 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)는 막대 모양을 가지며 평균 길이가 1.000 내지 3.500 μm, 바람직하게는 2.000 내지 3.000 μm, 더욱 바람직하게는 2.732 μm일 수 있다. 활주세균 야생주(TM-WT)는 젖은 표면에서 활주운동을 하며 집락의 표면은 매끄러웠다. 또한 집락이 노란색을 띄고 배양시간이 길어질수록 갈색으로 집락의 색이 변하는 것을 특징으로 한다. 상기 균주는 집락의 표면이 마른듯한 모습을 띈 것을 특징으로 할 수 있고, 옅은 노란 색 또는 흰색의 집락을 형성하며, 배양시간이 길어져도 집락의 색이 유지되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 약독화 활주세균 균주(TM-NOV), 예를 들어 상기 균주는 marine broth에서 25℃의 온도에서 배양 시, 대수기에서 균체량이 2배가 되는 시간(doubling time)이 3 내지 5시간, 바람직하게는 3 내지 4.5시간인 것일 수 있다. 또한, 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)는 활주세균 야생주(TM-WT) 및 대조군(Passage control) 대비 성장이 느리고, 균체 밀도는 야생주 대비 약 50% 감소함을 확인하였다. 또한, 대수기(6 내지 12시간)를 기준으로 활주세균 야생주(TM-WT)의 경우 균주량이 2배가 되는 시간이 2.5시간인 반면, 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 경우 4시간 소요되는 것을 확인하였다(도 3 및 표 3).
또한, 본 발명의 균주는 marine broth에서 25℃의 온도에서 배양 시 균주의 생장 주기인 지체기(Lag phase), 대수기(Logarithmic growth phase), 정체기(stationary phase) 및 사멸기(death phase) 중에서, 균주의 증식 속도와 사멸 속도가 동일하거나 휴지상태가 되어 균주량이 일정하게 최대로 유지되는 시기인 정체기에서, 활주세균 야생주(TM-WT) OD600값에 대한 본 발명의 약독화 활주세균 균주(TM-NOV) OD600 값의 비율이 0.3 내지 0.8, 0.45 내지 0.65, 또는 0.5 내지 0.65일 수 있다.
상기 marine broth는 통상의 알려진 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들면 DifcoTM Marine Broth 2216(cat. No. 279110) 등을 사용할 수 있다. 해수의 주요 미네랄과 유사하게 구성되어 있고, 영양분을 위해 peptone과 yeast extract이 첨가되어 있으며, 구체적 조성은 증류수 1L당 함량은 하기 표와 같으며, 최종 pH는 7.6±0.2 일 수 있다.
Peptone 5.0 g
Yeast Extract 1.0 g
Ferric Citrate 0.1 g
Sodium Chloride 19.45 g
Magnesium Chloride 5.9 g
Magnesium Sulfate . 3.24 g
Calcium Chloride 1.8 g
Potassium Chloride 0.55 g
Sodium Bicarbonate 0.16 g
Potassium Bromide 0.08 g
Strontium Chloride 34.0 mg
Boric Acid 22.0 mg
Sodium Silicate 4.0 mg
Sodium Fluoride 2.4 mg
Ammonium Nitrate 1.6 mg
Disodium Phosphate 8.0 mg
본 명세서에서 균체량은 균체 수(total count), 건조 균체량, 습윤 균체량, 미생물 세포 내 성분을 측정한 값(원심분리 후 균체의 질소/단백질/ATP/엽록소 함량), 원심분리 침전량(Packed cell volume), 비탁법(turbidimetry)에 의한 측정된 균체량, 분광광도계(단위, OD600 또는 OD660)를 이용하여 측정된 균체량 등을 의미할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예로서, 본 발명은 약독화 활주세균 균체(TM-NOV)를 유효성분으로 포함하는, 어류의 질병 예방용 백신 조성물, 바람직하게는 약독화 균주를 포함하는 생백신을 제공한다. 사백신은 균을 불활성화시킨 백신으로서 생백신에비해 면역반응이 약하게 나타나므로 여러 번 접종해야 하는 단점이 있으므로, 생백신이 더욱 바람직하다.
상기 균주에 관한 사항은 백신 조성물에 동일하게 적용될 수 있다. 본 발명의 균주는 어류에 감염 시, 활주세균에 의해 유발되는 어류 질병, 예를 들어 활주세균병을 유발하지 않으며, 상기 백신의 투여 경로는 예를 들어 복강 주사 또는 침지법으로 투여될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 어류는 넙치, 감성돔, 도미, 방어, 돌돔, 터봇, 무지개 송어, 및 연어로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 이에 한정되는 것응 아니다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 넙치 1마리당 무게가 8g이하 또는 길이가 10cm 이하의 넙치에 사용할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 어류에 투여되어 어류 질병, 예를 들어 활주세균병에 의해 유발되는 어류 질병 백신 효과가 현저히 우수하다. 구체적으로 상기 약독화 활주세균 균주는 1x108 CFU/fish 농도로 넙치에 투여하고 4주후 야생주를 5 x 107 CFU/fish 내지 1x108 CFU/fish 농도로 공격실험한 경우, 넙치에 복강투여시 약독화 균주의 상대생존률은 50 내지 100%이거나, 넙치에 침지투여 시 약독화 균주의 상대생존률은 10 내지 80%, 또는 15 내지 70%인 특성을 갖는다. 상대생존률(RPS)은 아래 수학식 1의 방법으로 결정한다.
Figure 112017126594672-pat00001
본 발명에 따른 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 포함하는 백신 조성물을 특정농도로 투여하고 4주 후에 공격실험으로 활주세균 야생주(TM-WT)를 복강주사로 공격실험을 수행한 경우 생존율을 50 내지 100%이었다. 구체적으로 약독화 활주세균 균주(TM-NOV) 백신 조성물을 1x108 CFU/fish 농도로 넙치 복강에 주사한 후에, 활주세균 야생주(TM-WT)를 1x108 CFU/fish 농도로 복강주사로 공격실험 시 약독화 활주세균 균주의 상대생존율(RPS)이 50%이고, 활주세균 야생주(TM-WT)를 5×107 CFU/fish 농도로 복강주사로 공격실험을 하였을 경우 상대생존율이 100%였다.
약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 5x106 CFU/mL 농도로 2L 해수에 넙치를 침지시킨 후, 활주세균 야생주(TM-WT)를 1x108 CFU/fish 농도로 복강주사로 공격실험한 경우 상대생존률이 15%이고, 활주세균 야생주(TM-WT)를 5x107 CFU/fish 농도로 복강주사로 공격실험 시, 상대생존율이 69%였다.
또한, 어류 피부에 궤양 형성 여부를 평가하고자 활주세균 야생주를 근육주사로 공격실험을 실행하여, 상대감염율(Relative Percentage of Infecion, RPI)을 측정하였다. 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 1 x 108CFU/fish 농도로 넙치 복강에 투여한 군(NOV-IP)은, 백신접종 4주후 활주세균 야생주를 1 x 107 CFU/fish 농도로 근육주사하여, 상대감염율(RPI)이 1 내지 60, 바람직하게는 1 내지 55로 나타났다. 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 5 x 106 CFU/mL 농도로 2L 해수에 넙치를 침지시킨 군(NOV-IMS)은, 백신접종 4주후 활주세균 야생주를 1 x 107 CFU/fish 농도로 근육주사하여, 상대감염율(RPI)이 1 내지 15, 바람직하게는 1 내지 11로 나타났다. 상대감염율(RPI)은 아래 수학식 2의 방법으로 결정하였다.
Figure 112017126594672-pat00002
상기 백신 조성물에 의해 예방 가능한 어류 질병은, 활주세균에 의해 유발되는 어류 질병 또는 감염증일 수 있다. 예를 들어 상기 어류 질병은 세균성 활주세균병일 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물에 포함되는 균주의 약독화 균체의 함량은 적용 대상 어류 및 병원체에 따라 적절히 조절하여 설정할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 부형제 및/또는 안정화제 등의 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들면 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 백신 조성물은 주사 투여 또는 침지법 등 다양한 방법으로투여 가능하며, 바람직하게는 복강 주사 또는 침지법, 더욱 바람직하게는 침지법으로 투여될 수 있다.
본 발명은 야생주 또는 모균주에 Novobiocin을 처리하여 얻어진 활주세균의 약독화 기술 및 상기 변이 균주 그 자체를 약독화 균체로 포함하는 어류 질병의 예방용 백신으로서, 야생주의 불활성화 균체를 사용하는 사백신에 비하여 동일한 농도에서도 우수한 백신 효과가 있어 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 실시예 1에 따라 활주세균 야생주(TM-WT) 및 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 집락 형성 및 PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 2에 따라 활주세균 야생주(TM-WT) 및 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 Scanning Electron Microscopy (SEM) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 2에 따라 계대배양한 야생주(Passage control)와 활주세균 야생주(TM-WT) 및 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 배양 시간 별 OD600값을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 2에 따라 API ZYM kit를 사용하여 활주세균 야생주(TM-WT) 및 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 생화학적 효소 활성을 측정한 결과이다.
도 5는 실시예 2에 따라 활주세균 야생주(TM-WT) 및 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 Western-blot 결과이다.
도 6a는 실시예 3에 따라 활주세균 야생주(TM-WT)와 15회 계대배양한 야생주(Passage control) 및 15회 계대배양한 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 복강 주사한 후 누적 폐사율을 표시한 결과이다.
도 6b는 실시예 3에 따라 활주세균 야생주(TM-WT)와 30회 계대배양한 야생주(Passage control) 및 30회 계대배양한 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 복강 주사한 후 누적 폐사율을 표시한 결과이다.
도 7은 실시예 3에 따라 활주세균 야생주(TM-WT) 및 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 균체를 근육 주사한 결과를 나타내는 넙치 사진이다.
도 8a는 실시예 5에 따라 활주세균 야생주(TM-WT)의 불활성화 균체 및 활주세균의 약독화 균체(TM-NOV)를 1 x 108 CFU/fish 농도로 복강 주사 및 침지법으로 백신을 투여한 후 활주세균 야생주(TM-WT)를 1 x 108 CFU/fish 농도로 복강주사하여 공격실험을 하였을 경우, 얻어진 백신효과에 따른 어류 폐사량을 나타낸 것이다.
도 8b는 실시예 5에 따라 활주세균 야생주(TM-WT)의 불활성화 균체 및 활주세균의 약독화 균체(TM-NOV)를 1 x 108 CFU/fish 농도로 복강 주사 및 침지법으로 백신을 투여한 후 공격실험으로 T. maritimum 야생주를 5 x 107 CFU/fish 농도로 복강주사 하였을 경우, 얻어진 백신 효과에 따른 어류 폐사량을 나타낸 것이다.
도 9는 활주세균 야생주(TM-WT)의 불활성화 균체 및 활주세균의 약독화 균체(TM-NOV)를 1 x 108 CFU/fish 농도로 복강 주사 및 침지법으로 백신을 투여한 후에 활주세균 야생주(TM-WT)를 1 x 107 CFU/fish 농도로 근육주사하여 공격실험을 하였을 경우, 백신 효과에 따른 어류 피부의 궤양 형성 여부를 실험한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 약독화 활주세균 균주( TM -NOV)의 제조
넙치 피부의 병변으로부터 활주세균(Tenacibaculum maritime m) JJ1309 strain(TM-WT)을 분리한 후 0.25 μg/mL의 Novobiocin이 들어있는 marine broth 10ml에 25 ℃의 온도에서 72시간 동안 200rpm으로 배양하였다. 상기 marine broth은 DifcoTM Marine Broth 2216(cat. No. 279110) 사용하였으며, 최종 pH는 7.6±0.2 이며, 고압습윤멸균기에서 121℃에서 15분간 멸균시킨 후에 사용하였다. 계대배양시마다 marine broth 배지에서 20μL를 marine agar plate에 도말하는데, Novobiocin의 농도를 0.5μg/mL부터 200 μg/mL로 점차 증가시켰다. Novobiocin가 처리된 plate에 집락이 형성되면 무작위로 집락 하나를 선별하는 과정을 반복하여 액체배지에 접종하여 변이주를 선별하였다. Novobiocin의 농도가 200μg/mL 인 배지에서도 집락을 형성하는 균을 선택하여 추가적으로 30회 계대배양을 더 진행하였다.
활주세균 특이적 프라이머(서열번호 1 및 서열번호 2) 를 사용해 PCR을 시행한 결과, 활주세균 야생주(TM-WT)와 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 밴드의 크기가 동일한 것을 확인하였다(도 1). 상기 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)는 glycerol stock으로 만들어 -80 ℃에 보관하였다.
정방향 프라이머(서열번호 1): ATGGCATCGTTTTAAA
역방향 프라이머(서열번호 2): CGCTCTCTGTTGCCAGA
< 실시예 2> 약독화 활주세균 균주( TM -NOV) 분석
2.1. 약독화 활주세균 균주( TM -NOV)의 형태학적 특징
실시예 1의 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 형태적 특징을 살펴보았다. 활주세균 야생주(TM-WT)의 경우 젖은 표면에서 활주운동을 하며 표면은 매끄러웠다. 또한 집락이 노란색을 띄고 배양시간이 길어질수록 갈색으로 집락의 색이 변하였다. 반면, 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)는 집락의 표면이 매마른 듯한 형상을 띄었으며, 옅은 노란색 또는 흰색을 띠는 집락을 형성하였으며, 배양시간이 길어져도 집락의 색이 변하지 않는 것을 확인하였다(도 1).
또한, Scanning Electron Microscopy (SEM)을 사용하여 활주세균 야생주(TM-WT)와 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 형태적 차이를 확인하였다. 4% glutaraldehyde, pH 7.2에 미리 검체를 고정시킨 후, 0.1M PBS에 두 번 세척한 후 1 % Osmium Tetroxide를 사용하여 후고정시키고 ethanol을 사용하여 탈수시켰다. 그 후, 백금으로 코팅한 후, field-emission scanning electron microscope (JEOLJSM-6700F)을 가속전압 10kV로 하여 상을 관찰하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 그 결과, 두 세균의 크기가 다른 것을 확인하였으며, 구체적으로 활주세균 야생주(TM-WT)는 평균길이가 4.776 μm이지만 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 평균길이는 2.732 μm로 활주세균 야생주(TM-WT)보다 길이가 훨씬 짧았다.
2.2. 약독화 활주세균 균주( TM -NOV)의 염기 서열 분석
상기 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 서열을 확인하기 위해 QIAamp TM DNA Mini kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 Genomic DNA를 추출하였다. 추출한 Genomic DNA는 Insilicogen, Inc (South Korea)에서 PacBio single-molecule real-time (SMRT)를 사용하여 전체 서열을 확인하였다. 서열을 분석하여 활주세균 야생주(TM-WT)와 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 비교한 결과를 아래 표 2에 나타내었다.
Type TM-WT TM-NOV Gene defintion
SNV C A TetR family transcriptional regulator
SNV T C TetR family transcriptional regulator
SNV C T copper transporter
Insertion - T hypothetical protein
Insertion - A
SNV T C hypothetical protein
SNV T C
SNV T A excinuclease ABC subunit A
Deletion C - hypothetical protein [Aquimarina atlantica]
SNV C A 24-dienoyl-CoA reductase
SNV C A hypothetical protein
SNV T A aminopeptidase
SNV A T
SNV G A pseudouridine synthase
SNV A G isocitrate dehydrogenase
SNV C T isocitrate lyase
Deletion A - phosphoesterase
SNV T C 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--
homocysteine methyltransferase
SNV A G restriction endonuclease subunit R
SNV A G DNA-binding protein
SNV A T phosphoglycerate mutase
SNV A T phosphoglycerate mutase
SNV A T alkaline phosphatase
SNV T C 50S ribosomal protein L4
SNV T C
SNV T C portal protein
SNV A G DNA gyrase subunit B
Deletion C - -
SNV T C glycerol kinase
NOV_
large_variant2		 - ACCATCCTGA
TGCCTTGTTGC
(서열번호 3)		 -
NOV_
large_variant1		 ACCTGGCTCCGTTAAACAGTATGCACCAAA
ACGCTCACCC
ATT
(서열번호 4)		 - acyl-CoA dehydrogenase
SNV G A hypothetical protein
SNV C A sterol desaturase
SNV C A
대부분 single nucleotide에 돌연변이가 발생하였고 deletion 또는 insertion 또한 발생하였다. acyl-CoA dehydrogenase 유전자의 서열에서는 43개의 서열이 deletion이 되었다.
전라북도 정읍시 입신길 181에 위치하는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2017.09.04자로 상기 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 기탁하여 수탁번호 KCTC18609P를 부여받았다.
2.3. T. maritimum 변이주의 균주 성장률
분광광도계(Thermo scientificTM)를 사용하여 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 성장률을 확인하였다. 접종시킨 균주의 OD(Optical density, 광학밀도)를 측정하여 1 OD/mL가 되면 100 μL를 marine broth 20ml에 새로 접종 후 25 ℃ 온도에 200 rpm으로 배양시키며, 1, 6, 12, 24, 36, 48, 및 72시간에 성장률을 측정하였다. 상기 측정된 약독화 활주세균 균주(TM-NOV) 및 활주세균 야생주(TM-WT)의 균체 밀도인 OD600 측정치를 하기 표 3에 나타내고 이를 그래프로 도식화하여 도 3에 나타내었다. 하기 표 3에서 OD 비율은 상기 동일 배양조건에서 동일 배양시간에서, 활주세균 야생주(TM-WT) OD값을 분모로 하고, 본 발명에 따른 약독화 활주세균 균주(TM-NOV) OD값을 분자로 하여 계산된 OD값의 비율(=약독화 활주세균 균주(TM-NOV) OD600 값/ 활주세균 야생주(TM-WT) OD600 값)이다.
구분　 0-h 6-h 12-h 24-h 36-h 48-h 72-h
Passage control 0.05 0.15 1.09 1.58 1.72 1.7 1.57
TM-WT 0.05 0.23 1.05 1.53 1.67 1.63 1.58
TM-NOV 0.05 0.07 0.28 0.8 0.96 1.01 0.93
OD 비율 1.00 0.30 0.27 0.52 0.57 0.62 0.59
도 3은 활주세균 야생주(TM-WT) 및 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 배양 시간 별 OD600값을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 3 및 표 3에서 나타낸 바와 같이, 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)는 활주세균 야생주(TM-WT) 및 대조군(Passage control) 대비 성장이 느리고, 균체 밀도는 야생주 대비 약 50% 감소함을 확인하였다. 또한, 대수기(6 내지 12시간)를 기준으로 활주세균 야생주(TM-WT)의 경우 균주량이 2배가 되는 시간이 2.5시간인 반면, 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 경우 4시간 소요되는 것을 확인하였다.
2.4. 약독화 활주세균 균주( TM -NOV)의 생화학 특성
약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 생화학적 효소활성을 측정하기 위해 API ZYM kit를 사용하였다. 검체의 배지를 제거하여 1 x PBS에 재부유시킨 후 McFarland No. 5의 농도가 되도록 만든다. 검체 1mL은 차가운 상태에서 5분 동안 sonication을 진행한 다음 각 cupule에 40 μL씩 넣는다. API ZYM 스트립은 4시간 동안 37 ℃에 보관한 후, 20 μL의 Fresh colour 시약을 넣고 암실에서 5분 동안 반응시켰다.
API ZYM system을 이용하여 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)와 활주세균 야생주(TM-WT)를 비교한 결과를 도 4에 나타내었으며, 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 생화학적 효소활성 측정 결과를 하기 표 4에 나타냈다. 상기 실험결과로부터 두 세균의 생화학적 특성이 크게 다르지 않았음을 확인하였다.
구분 Enzyme name TM-WT TM-Nov
1 Control 0 0
2 Alkaline phosphatase 5 4
3 Esterase (C4) 1 3
4 Esterase (C8) 2 2
5 Lipase (C14) 1 1
6 Leucine arylamidase 5 5
7 Valine arylamidase 5 3
8 Cystine arylamidase 1 1
9 Trypsin 1 1
10 α-Chymotrypsin 1 1
11 Acid phosphatase 4 4
12 Napthol-AS-BI-phosphohydrolase 4 3
13 α-Galactosidase 1 1
14 β-Galactosidase 1 1
15 β-Glucoronidase 1 1
16 α-Glucosidase 0 1
17 β-Glucosidase 1 1
18 N-Acetyl-β-glucosaminidase 1 1
19 A-Mannosidase 1 1
20 A-Fucosidase 2 2
2.5 웨스턴 블랏 (western-blot) 검사
활주세균 야생주(TM-WT)와 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 항원이 변화하였는지 확인하기 위해 Western-blot을 수행하였다.
구체적으로 토끼에 면역하여 항활주세균 polycolonal antibody (영인프런티어)를 사용하여 수행하였다. T. maritimum을 배양한 후 원심분리로 균만 모아 PBS로 두 번 세척하였다. 균에 RIPA lysis buffer를 1시간 동안 처리하였다. 원심분리 후, bovine serum albumin 을 기준으로 상청액에 있는 단백질을 측정하였다. 각 균주는 12% SDS-PAGE로 전기영동을 실시하고, Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad)를 사용하여 단백질(항원)을 20V에서 1시간 동안 PVDF membrane에 옮긴다. 단백질이 옮겨진 membrane은 blocking solution (5% skimmed milk in TTBS)을 처리하여 4℃에서 12시간 반응하고, membrane을 TTBS (0.1% Tween 20 in TBS, pH 7.5)로 4℃에서 5분 처리 후 세척했다. 항활주세균 polycolonal antibody (1:3000)를 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 TTBS로 세 번 세척을 해주고 peroxidase-conjugated secondary antibody(1:3000)를 4℃ 에서 1시간 동안 처하였다. TTBS로 6번 세척해주고 membrane에 ECL detection reagent (Amersham)를 처리한 후, Microchemi 4.2를 사용하여 분석한 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5는 활주세균 야생주(TM-WT) 및 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 Western-blot 결과를 나타내는 사진이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 활주세균 야생주(TM-WT)의 2개의 항원이 각 20kDa과 30kDa 근처에 밴드가 형성된 것에 반해, 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)는 20kDa과 30kDa 근처에 밴드가 사라져, 활주세균 야생주(TM-WT)와 다른 항원을 가지고 있으며, 단백질의 차이가 생겨 항체가 인식하지 못하였다고 추론한다.
< 실시예 3> 약독화 활주세균 균주( TM -NOV) 병원성 확인
실시예 1의 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)가 질병을 유발하는지 확인하기 위해, 평균 8g의 넙치를 사용하였고, 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)와 활주세균 야생주(TM-WT)의 병원성을 비교하기 위해 복강 및 근육 주사로 균체를 투여하였다. 공격실험을 하기 전에 1주일 동안은 순치를 시켰다.
복강 및 근육 주사에 사용된 균체는 활주세균 야생주(TM-WT), 계대배양한 야생주(Passage control) 및 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 사용하였으며, 구체적으로 활주세균 야생주(TM-WT)는 계대배양을 실시하지 않았고, 계대배양한 야생주(Passage control)과 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)는 15회, 30회 계대배양을 실시하여 균체를 제조하였다.
각 군에서 10마리의 넙치 복강에 활주세균 야생주(TM-WT), 계대배양한 야생주(Passage control) 및 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 100 μL씩 2가지 농도(1 x 108 또는 1 x 107 CFU/fish)로 주사하였고, 계대배양한 야생주(Passage control) 또는 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)는 15회와 30회로 계대배양을 수행한 균을 사용하였다. 또한 근육주사는 1 x 107 CFU/fish 농도로 하여 활주세균 야생주(TM-WT)와 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 병원성을 비교하였다.
상기 복강주사 및 근육주사한 어류에 대해서, 2주 동안 폐사율을 측정하고 복강주사에 따른 어류 폐사율은 도 6a(계대배양 15회) 및 도 6b(계대배양 30회)에 나타내고, 근육주사 따른 어류 폐사율은 도 7에 나타내었다.
도 6a는 상기 활주세균 야생주(TM-WT)와 15회 계대배양한 야생주(Passage control) 및 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 복강 주사한 후 누적 폐사율을 표시한 결과이고, 도 6b는 활주세균 야생주(TM-WT)와 30회 계대배양한 야생주(Passage control) 및 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 복강 주사한 후 누적 폐사율을 표시한 결과이다.
도 7은 활주세균 야생주(TM-WT) 및 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 근육 주사한 결과를 나타내는 넙치 사진이다. 근육주사는 피부에 궤양을 형성시켰지만 낮은 농도에서는 넙치의 폐사를 일으키기 힘들었다.
따라서, 복강주사를 이용한 공격 실험시 병원성은 약독화 활주세균 균주 (TM-NOV)가 활주세균 야생주(TM-WT)와 계대배양한 야생주(Passage control)보다 낮았다. 근육주사를 이용한 공격 실험시, 활주세균 야생주(TM-WT)를 주사한 넙치는 주사 후 5일째에 피부에서 여러 가지 감염증상이 관찰되었으나 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 주사한 넙치는 어떠한 증상도 보이지 않았다. 결과적으로 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 병원성이 약화됨을 알 수 있다.
< 실시예 4> 백신 조성물의 안전성 실험
약독화 활주세균 균주(TM-NOV) 의 백신 안전성을 확인하기 위해 건강한 넙치의 복강에 3가지 농도(1 x 106, 1 x 107, 및 1 x 108 CFU/fish)의 약독화 활주세균 균주(TM-NOV) 를 주사하여 2주 동안 폐사율을 기록하였다. 복강주사 일주일 후 각 군으로부터 5마리의 넙치에서 간, 신장, 비장을 채취하고 PBS에 균질환시킨 후 Marine 고체 배지에 도말하였다.
고농도의 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)(1 x 108 CFU/fish)를 주사한 군에서도 폐사율이 나타나지 않는 것을 관찰하였다. 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 주사한 넙치의 조직을 plate에 도말하여도 균 집락이 형성되지 않았다. 이는 상기 균이 제한적인 성장률을 가지고, 병원성이 약화되었기 때문에 넙치의 면역체계에서 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)가 제거된 것으로 해석된다.
< 실시예 5> 백신 조성물의 효능 측정
5.1 백신 접종
백신의 실험은 복강주사와 침지법 2가지 방법으로 수행하였다. 평균 8g인 넙치 750마리를 백신을 주사하지 않은 대조군(Naive), 활주세균 야생주를 포르말린 처리하여 복강주사를 한 군(WT-IP), 살아있는 실시예 1의 약독화 활주세균 균주를 복강주사 한 군(NOV-IP), 활주세균 야생주를 포르말린 처리하여 침지법을 한 군(WT-IMS)과 살아있는 실시예 1의 약독화 활주세균 균주를 침지법 수행한 군(NOV-IMS), 이렇게 5개 군으로 나누었다.
복강주사에 사용된 백신은 두 가지 종류로 사용하였으며, 포르말린을 처리하여 얻어진 활주세균 야생주의 불활성화 균체 또는 살아있는 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 균체를 PBS에 희석하여 1 x 108 CFU/fish의 농도로 조성하여 100μL를 주사하였다.
침지법에 사용된 백신은 포르말린을 처리하여 얻어진 활주세균 야생주의 불활성화 균체백신 또는 살아있는 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 균체 백신을 2L 해수에 5 x 106 CFU/mL 농도로 하여 3분간 침지시켰다.
5.2. 복강 주사에 의한 공격 실험
실시예 5.1의 백신 접종 4주 후 각 그룹에서 20마리의 넙치의 복강에 활주세균 야생주를 1 x 108 과 5 x 107 CFU/fish 두 가지 농도로 주사하였다. 상기 백신이 투여된 넙치에 대해 폐사량을 14일 동안 관찰하였고 PBS를 주사한 대조군과 비교하여 백신의 효능을 평가하고 결과를 도 8a, 도 8b, 및 표 5 에 나타내었다. 상대생존률(RPS)은 아래 수학식 1의 방법으로 결정하였다.
[수학식 1]
Figure 112017126594672-pat00003
백신종류 공격실험의
투여농도		 폐사량(%) 상대생존률(%)
대조군(Naive) 1x108 CFU/fish 100 -
야생주-복강 (WT-IP) 1x108CFU/fish 55 45
변이주-복강 (NOV-IP) 1x108 CFU/fish 50 50
야생주-침지 (WT-IMS) 1x108 CFU/fish 95 5
변이주-침지 (NOV-IMS) 1x108 CFU/fish 85 15
대조군(naive) 5x107 CFU/fish 65 -
야생주-복강 (WT-IP) 5x107 CFU/fish 15 77
변이주-복강 (NOV-IP) 5x107 CFU/fish 0 100
야생주-침지 (WT-IMS) 5x107 CFU/fish 35 46
변이주-침지 (NOV-IMS) 5x107 CFU/fish 20 69
도 8a와 도 8b는 불활성화 야생주 백신과 약독화 변이주 백신으로 복강 및 침지 방법으로 백신을 처리한 후에, 활주세균 야생주(TM-WT)를 두 가지 농도로 복강 주사하여 공격시험을 하였을 경우, 불활성화 야생주 백신과 약독화 변이주 백신의 어류의 폐사량과 상대생존률(%)을 측정한 결과이다.
도 8a는 활주세균 야생주(TM-WT)의 불활성화 균체 또는 활주세균 균주의 약독화 균체(TM-NOV)를 1 x 108 CFU/fish 농도로 조성한 백신을 복강 주사(WT-IP 또는 NOV-IP) 및 침지법(WT-IMS or NOV-IMS)을 시행한 후 활주세균 야생주(TM-WT)을 1 x 108 CFU/fish 농도로 공격실험을 진행하여 얻어진 어류 폐사량을 나타낸 것이다. 도 8b는 야생주(TM-WT)의 불활성화 균체 또는 활주세균 균주의 약독화 균체(TM-NOV)를 1 x 108 CFU/fish 농도로 조성한 백신을 복강 주사(WT-IP or NOV-IP) 및 침지법(WT-IMS or NOV-IMS)을 시행한 후 활주세균 야생주를 5 x 107 CFU/fish 농도로 공격실험을 진행하여 얻어진 어류 폐사량을 나타낸 것이다.
복강주사로 공격실험을 하는 동안, 백신을 주입하지 아니한 대조군(Naive)과 비교하였을 때 백신을 주입한 군에서 효과적인 방어능력을 보여주었고, 특히 공격실험의 균주 농도가 5 x 107 CFU/fish인 경우 폐사량이 현저히 낮아진 것을 확인하였다. 또한, 복강주사와 침지의 두 가지 경로 모두에서 불활성화 야생주(TM-WT) 백신 대비, 약독화 변이주 균주(TM-NOV)가 백신 효능이 더욱 우수한 것을 확인하였다. 투여 경로에 따른 효과로서는 복강 투여가 침지법에 비해서 낮은 폐사량과 높은 상대생존율을 나타냈다.
5.3. 근육 주사에 의한 공격 실험 (피부 궤양 측정)
실시예 5.1의 백신 접종 4주 후 각 그룹에서 10마리의 넙치의 근육에 활주세균 야생주를 1 x 107 CFU/fish 농도로 주사를 하였다. 상기 백신이 투여된 넙치에 대한 질병의 증상은 14일 동안 관찰하였고 PBS를 주사한 대조군과 비교하여 백신의 효능을 평가하고 결과를 도 9 및 표 6에 나타내었다.
도 9는 불활성화 야생주 백신을 1 x 108 CFU/fish 농도로 복강 주사(WT-IP) 및 침지법(WT-IMS)을 시행하고 약독화 변이주 백신을 1 x 108 CFU/fish 농도로 복강 주사(NOV-IP) 및 침지(NOV-IMS)한 후에, 4주 후활주세균 야생주(TM-WT)를 1 x 107 CFU/fish 농도로 근육주사하여 공격실험을 수행한 경우, 어류 피부에 궤양 형성 여부를 실험한 결과이다. 상대감염율(RPI)은 아래 수학식 2의 방법으로 결정하였다.
[수학식 2]
Figure 112017126594672-pat00004
백신종류 공격실험의
투여농도		 궤양형성율(%) 상대감염율(%)
대조군(naive) 1 x 107 CFU/fish 90 -
야생주-복강 (WT-IP) 1 x 107CFU/fish 90 100
변이주-복강 (NOV-IP) 1 x 107 CFU/fish 50 55
야생주-침지 (WT-IMS) 1 x 107 CFU/fish 80 88
변이주-침지 (NOV-IMS) 1 x 107 CFU/fish 10 11
백신 효과에 따른 어류의 폐사는 관찰되지 않은 대신, 피부 궤양을 살펴본 결과, 백신을 주입하지 않은 대조군(Naive)에서는 90%의 궤양이 발생하였다. 그에 따른 상대감염율을 평가한 결과, 불활성화 야생주 백신을 복강 주사한 군(WT-IP)에서는 100%, 약독화 변이주 백신을 복강 주사한 군(NOV-IP)에서는 55%, 불활성화 야생주 백신을 침지시킨 군(WT-IMS)에서는 88%, 약독화 변이주 백신을 침지시킨 군(NOV-IMS)에서는 11%의 피부 궤양이 나타났다(도 9). 이러한 결과를 보아, 약독화 변이주 백신(TM-NOV)의 침지 투여가 활주세균 야생주(TM-WT)의 감염으로부터 어류 피부를 강하게 보호하는 작용을 나타낸다고 예측한다.
활주세균 야생주(TM-WT)의 사백신과 비교하여, 본 발명에 따른 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)의 백신 효과는, 복강주사과 침지법 투여에서 더욱 크게 차별화된다. 객관적인 백신으로서 효능을 평가하는 어류에 대한 상대생존률을 보면, 침지법에 비해 복강 주사에서 더 높은 값을 나타냄을 알 수 있다. 그러나 활주세균은 피부와 아가미에 부착하여 궤양을 형성하는 균으로, 복강으로 활주세균을 투여 후 폐사율을 관찰하여 효능을 평가하는 것보다, 근육으로 투여하여 RPI를 평가하는 것이 더 바람직하다고 할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 살아있는 약독화 활주세균 균주(TM-NOV)를 포함하는 백신 조성물은 침지법에서 더욱 우수한 백신 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
한국생명공학연구원 생물자원센터 KCTC18609P 20170904
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Claims (10)

  1. 기탁번호 KCTC18609P를 가지는, 테나시바쿨럼 마리티멈(Tenacibaculum maritimum) 균주의 약독화된 생균체를 유효성분으로 포함하는, 넙치의 활주세균병 예방용 백신 조성물로서,
    상기 약독화된 생균체를 1 x 108 CFU/fish 농도로 넙치에 복강 투여하고 야생주를 1 x 108 CFU/fish 농도로 공격실험한 경우, 약독화된 테나시바쿨럼 마리티멈 균주를 접종한 넙치의 아래 수학식 1으로 산출되는 상대생존률은 50 내지 100%인, 백신 조성물:
    [수학식 1]
    Figure 112018132366914-pat00017
  2. 제1항에 있어서, 상기 약독화된 테나시바쿨럼 마리티멈 균주는 20 μg/mL의 노보바이오신이 첨가된 마린배양액(marine broth)에서 25 ℃의 온도에서 배양 시, 균주 수준이 최대가 되는 정체기에서 OD600 값이 0.3 이상 내지 0.8 인, 백신 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 약독화된 테나시바쿨럼 마리티멈 균주는 노보바이신을 처리하여 약독화된 것인, 백신 조성물:
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 약독화된 테나시바쿨럼 마리티멈 균주는 균주 생장 주기 중 정체기(stationary phase)에서의 균체량이, 야생주 100w/w%를 기준으로 30 내지 80 w/w%인 것인, 백신 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 백신 조성물은 넙치 1마리당 무게가 8g이하 또는 길이가 10cm 이하의 넙치에 사용하는 것인, 백신 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 백신조성물은 넙치에 약독화된 테나시바쿨럼 마리티멈 균주를 침지 투여하고 야생주를 근육주사해 공격실험한 경우, 약독화된 테나시바쿨럼 마리티멈 균주를 접종한 넙치의 아래 수학식 2로 계산한 상대감염율(RPI)이 1 내지 15%인, 백신 조성물:
    [수학식 2]
    Figure 112018132366914-pat00018
  9. 제1항의 백신 조성물을 넙치에 투여하는 단계를 포함하는, 넙치의 활주세균병 예방방법.
  10. 삭제
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