KR102441787B1

KR102441787B1 - 어류의 질병 예방을 위한 5가 백신 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102441787B1
Application number: KR1020200082368A
Authority: KR
Inventors: 이제희; 완창; 이성도; 권혁재; 손한창; 강봉조
Original assignee: 제주대학교 산학협력단; 제주특별자치도(제주특별자치도해양수산연구원장)
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2022-09-08
Also published as: KR20220004479A

Abstract

본 발명은 어류의 기생충성 및 세균성 질병의 예방을 위한 침지법으로 접종이 가능한 다가 백신 조성물 및 상기 백신 조성물의 제조 방법에 관한 것으로서, 스쿠티카증, 비브리오병, 및/또는 활주세균병을 예방하고 상기 감염성 질병에 대한 넙치의 폐사율을 감소시키며, 상대생존율을 증가시킬 수 있다.

Description

어류의 질병 예방을 위한 5가 백신 조성물 및 이의 제조방법 {Pentavalent vaccine composition for preventing disease in fish and manufacturing method thereof}

본 발명은 어류용 백신 조성물, 더욱 자세하게는 어류의 기생충 및 병원균에 대한 예방용 백신 조성물 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

어류는 여러 가지 질병에 감염될 가능성이 높은데, 특히 어류의 양식산업에서 가장 문제가 되고 있는 대표적인 질병으로, M. avidus에 의한 기생충성 질병인 스쿠티카증 및 T. maritimum 감염에 의한 세균성 질병인 활주세균증, 비브리오(Vivrio) 균 감염에 의한 비브리오증 등이 있다.

구체적으로 상기 스쿠티카증을 일으키는 것으로 섬모충류(ciliate)로서 수족관의 놀래기에 감염되는 Uronema marinum, 대서양의 연어에 기생하는 Tetrahymena sp., 호주에서 양식하는 Southern bluefin tuna에 기생하는 U. nigricans, 지중해 연안의 농어와 스페인 북부 연안에서 양식하는 터봇에 기생하는 Miamiensis avidus 등 다양한 어종에 많은 종류의 스쿠티카 감염사례가 보고되고 있다. 스쿠티카증은 양식어류의 치어에서부터 성어에 이르기까지 광범위하게 발생하며, 일단 스쿠티카증이 발생하면 곧바로 대량 폐사를 유발할 뿐 아니라 각종 주요 세균성 질병을 간접적으로 유도함으로써 양식어류의 생산성에 심각한 피해를 초래하는 섬모충성 질병이다. 일단 스쿠티카증이 발생하면 곧바로 대량 폐사를 유발할 뿐 아니라 각종 주요 세균성 질병을 간접적으로 유도함으로써 양식어류의 생산성에 심각한 피해를 초래한다.

활주세균증은 돔류, 넙치 및 복어와 가자미 치어 등에 발생함으로써 해산어 종묘생산장에서 중요한 세균성 질병 원인으로 알려져있다. 원인체인 Tenacibaculum maritimum은 초기 Flexibacter maritimus로 알려졌으며, 그람 음성 장간균으로 증식적정온도는 15~20

정도이다. 활주세균증에 감염되면 넙치의 체표면이 회색으로 변하거나 원형의 상처, 궤양이 관찰되며 지느러미가 부식되면서 골격만이 남는다. 아가미가 부식된 넙치는 체색이 검어지고 힘없이 떠다니는 현상을 보인다.

비브리오증은 그람 음성 단간균인 비브리오균에 의해 발병하며 감염 시에 외부적으로는 체색흑화, 부분적인 발적 및 궤양 형성 입주위에 출혈, 아가미 손상, 지느러미 기저부에 출혈, 결손, 붕괴 현상이 나타나며 내부적 증상으로는 간이 충혈되고 퇴색하며 복수가 고이고 장에 점상 출혈이 나타난다.

국내 양식넙치에서 다양한 세균성 질병이 성장단계별, 계절별로 지속적으로 발병하여 높은 폐사율을 보여 계획적인 생산이 어렵고 양식어가의 경영합리화에 문제점을 주고 있다.

상기 세균성 질병을 치료하기 위하여 항생제를 투여하여 치료하여 왔으나, 이러한 방법은 병원균이 장관 내에 정착하여 증식하고 반복적으로 발생하여 치료가 잘 되지 않으며, 다양한 항생제의 사용은 다제내성을 가진 병원체를 양산할 위험이 있는 단점이 있다.

상기 어류의 질병과 관련하여 지금까지 항생제와 항균제의 과도한 사용은 원인균의 내성 획득으로 이어져, 질병의 구제를 점차 어렵게 만들고 있으며, 어류 내에 화학물질이 축적되어 인체에도 악영향을 미치고, 환경오염까지 초래하게 되는 문제점이 있다.

한편, 양식어류에 발병하는 기생충성 질병에 대해서는 화학약제 및 올리고키토산 등이 사용되고 있으나 이러한 약제의 반복적인 사용은 어류의 스트레스로 이어져 성장을 더디게 만들며 기생충 구제에 대한 효과도 극히 낮지만 이를 대체할 방법이 없는 실정이다

위에 제시된 문제점을 해결하기 위하여 어류에서 발생하는 세균성 또는 기생충 질병 병원체의 불활성화 균체를 유효성분으로 포함하는 5가 백신을 개발하려 한다.

본 발명은 어류용 백신 조성물로서, 어류 병원성 기생충 및 세균의 불활성화 균체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물, 이의 제조방법을 제공한다. 상기 백신 조성물은 어류의 기생충, 어류의 감염성 세균, 또는 이들 모두에 대하여 감염 예방 및/또는 상기 기생충 및/또는 세균에 의한 질병의 예방 효과를 갖는 것일 수 있다.

본 발명은 또한 어류의 기생충성 및/또는 세균성 감염성 질환의 예방용 약학적 조성물 및 상기 약학적 조성물을 이용한 상기 감염성 질환의 예방 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 어류 병원성 기생충 및 세균의 불활성화 균체를 유효성분으로 포함하여, 항원 효과가 우수하며, 침지 백신으로 활용이 가능한 백신 조성물, 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

이에 본 발명자들은 상기 세균성 질병 및 기생충성 질병을 예방하기 위하여 기생충성 및 세균성 병원체의 불활성화 균체 및 불활성화 세균을 유효성분으로 포함하며, 침지법으로 접종이 가능한 5가 복합백신을 개발하였다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는 어류 병원성 기생충 및 어류 병원성 세균의 불활성화 균체를 포함하는 어류의 질병 백신 조성물 및/또는 어류의 질병 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 어류 병원성 기생충 및 세균의 불활성화 균체를 모두 포함하여, 기생충 및/또는 세균에 의해 발생하는 어류의 질병을 모두 예방할 수 있다.

본 명세서에서 "어류 병원성 기생충 및 어류 병원성 세균의 불활성화 균체" 또는 "불활성화 균체"는 병원성 기생충의 불활성화 균체 및 병원성 세균의 불활성화 균체를 모두 포함하며, 상기 불활성화 균체는 병원성 기생충 또는 병원성 세균을 불활성화하기 위한 목적 범위 내에서 자유롭게 불활성화 방법을 선택하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 불활성화 균체는 포르말린 처리 방법, 열처리 방법 또는 동결처리 방법으로 제조될 수 있으며, 일 예에서, 상기 포르말린 처리 방법은 병원성 세균 및/또는 기생충을 0.5 내지 2%(v/v) 포르말린으로 2 내지 10

에서 2시간 이상, 처리하여 수행될 수 있다.

상기 어류 병원성 기생충은, 미아미엔시스 아비두스(Miamiensis avidus)일 수 있으며, 미아미엔시스 아비두스 혈청형 2(serotype 2) 및/또는 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1(serotype 1)일 수 있다.

상기 미아미엔시스 아비두스 병원체는 Cox-1 유전자 서열에서 특징적이며, 예를 들어, 상기 백신 조성물에서 미아미엔시스 아비두스 혈청형 2의 Cox-1 유전자는 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 것이고, 상기 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1의 Cox-1 유전자는 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 것이다.

예를 들어 상기 미아미엔시스 아비두스 혈청형 2는 미아미엔시스 아비두스JJB1403일 수 있으며, 상기 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1은 미아미엔시스 아비두스 JJC1404일 수 있다.

상기 미아미엔시스 아비두스는 스쿠티카증의 원인균으로서, Pseudocohnilembus persalinus, Pseudo-cohnilembus hargisi와 U. marinum에 비하여 넙치 치어에 대해 강한 병원성을 가지고 있으며 아가미, 체표와 지느러미에 기생하여 조직이 붕괴되며, 증상이 진행되면 근육이 노출되고 뇌와 각종 내장 기관에까지 침투하여 조직의 괴사를 일으킬 수 있다.

넙치의 항 혈청에 따른 aggulatination assay 또는 western blot을 통해 스쿠티카의 혈청형(serotype)에 따라 반응하는 항원이 다른 것이 확인되어 Cox-1 type 2는 혈청형 1, Cox-1 type 1은 혈청형 2로서 각기 다른 혈청형을 나타낸다(Song et al., J Fish Dis 32(12) (2009) 1027-34). 미아미엔시스 아비두스 JJB1403 및 미아미엔시스 아비두스 JJC1404는 Cox 유전자 서열에 따라 분류된 strain으로서 Cox-1 type 1을 JJB1403으로, Cox-1 type 2를 JJC1404로 명명한 것이다(Jung, et al., Parasitol Res 108(5) (2011) 1153-61).

미아미엔시스 아비두스의 두 가지 혈청형 1 및 혈청형 2가 병원성이나 모양이 비슷함에도, 교차 방어가 불가능하다는 문제점이 있었으나, 본 발명의 백신 조성물은 미아미엔시스 아비두스 혈청형 2(serotype 2) 및 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1(serotype 1) 모두에 대한 백신 효과가 있어 혈청형 1과 혈청형 2가 약 50:50의 비율 (혈청형 1: 혈청형 2)로 존재하는 양식 현장에서 유용한 백신 조성물로 사용될 수 있다.

본 명세서에서, '스쿠티카충'은 '스쿠티카 섬모충'과 동일한 의미로 혼용되어 사용되었다. 상기 스쿠티카충은 스쿠티코실리아티다목(Scuticociliatids)에 속하는 기생충, 보다 상세하게는 미아미엔시스 아비두스(Miamiensis avidus)를 의미하며, 일 예에서 M. avidus JJB1403 및/또는 M. avidus JJC1404일 수 있다.

상기 어류 병원성 세균은, 테나시바쿨럼 마리티멈 (Tenacibaculum maritimum), 비브리오 하베이이 (Vibrio harveyi), 및 비브리오 앙구일라럼 (Vibrio anguillarum)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상, 2종 이상, 또는 3종의 병원성 세균일 수 있다. 일 예에서, 본 발명이 제공하는 백신 조성물은 상기 3종의 세균 및/또는 상기 세균의 불활성화 균체를 모두 포함할 수 있다.

상기 테나시바쿨럼 마리티멈은 활주세균증의 원인체로서, 초기 Flexibacter maritimus로 불리웠으며, 그람 음성 장간균으로 증식적정온도는 15~20℃정도이다. 활주세균증에 감염되면 넙치의 체표면이 회색으로 변하거나 원형의 상처, 궤양이 관찰되며 지느러미가 부식되면서 골격만이 남는다. 아가미가 부식된 넙치는 체색이 검어지고 힘없이 떠다니는 현상을 보인다.

상기 비브리오 하베이이는 비브리오병의 원인체 중 하나로서 그람 음성 간균으로, 해수에 상존하고 있고 넙치에서 많은 폐사를 일으키는 균이다. 비브리오 하베이에 의한 감염증은 여름철 양식 넙치에서 흔히 발병하는 질병으로, 비브리오 하베이에 감염된 넙치는 복부팽만, 탈장, 지느러미 갈라짐 등의 외부 증상과 출혈성 복수, 간장출혈, 비장 위축 등의 내부증상을 보인다.

상기 비브리오 앙구일라럼은 비브리오병의 원인체로서, 그람 음성 단간균으로 감염 시에 외부적으로는 체색흑화, 부분적인 발적 및 궤양 형성 입주위에 출혈, 아가미 손상, 지느러미 기저부에 출혈, 결손, 붕괴 현상이 나타나며 내부적 증상으로는 간이 충혈되고 퇴색하며 복수가 고이고 장에 점상 출혈이 나타난다.

본 발명의 일 예는 미아미엔시스 아비두스 JJB1403, 미아미엔시스 아비두스 JJC1404, 테나시바쿨럼 마리티멈, 비브리오 하베이이, 및 비브리오 앙구일라럼의 불활성화 균체를 포함하는 백신 조성물이다.

상기 미아미엔시스 아비두스 JJB1403의 불활성화 균체는 1.0X10⁴ 내지 2.5X10⁵ cell/ml, 1.5X10⁴ 내지 7.5X10⁴ cell/ml, 2.0X10⁴ 내지 5.0X10⁴ cell/ml, 또는 2.0X10⁴ 내지 2.5X10⁴ cell/ml의 농도로 투여될 수 있다.

상기 미아미엔시스 아비두스 JJC1404의 불활성화 균체는 1.0X10⁴ 내지 2.5X10⁵ cell/ml, 1.5X10⁴ 내지 7.5X10⁴ cell/ml, 2.0X10⁴ 내지 5.0X10⁴ cell/ml 또는 2.0X10⁴ 내지 2.5X10⁴ cell/ml의 농도로 투여될 수 있다.

상기 테나시바쿨럼 마리티멈의 불활성화 균체는 1X10⁷ 내지 1X10⁹ CFU/ml, 3X10⁷ 내지 5X10⁸ CFU/ml, 5X10⁷ 내지 3X10⁸ CFU/ml 또는 1.0X10⁸ 내지 2.0X10⁸ CFU/ml의 농도로 투여될 수 있다.

상기 비브리오 하베이이의 불활성화 균체는 5X10⁷ 내지 5X10⁸ CFU/ml, 7.5X10⁷ 내지 3X10⁸ CFU/ml, 1X10⁸ 내지 2X10⁸ CFU/ml의 농도로 투여될 수 있다.

상기 비브리오 앙구일라럼의 불활성화 균체는 5X10⁷ 내지 5X10⁸ CFU/ml, 7.5X10⁷ 내지 3X10⁸ CFU/ml, 1X10⁸ 내지 2X10⁸ CFU/ml의 농도로 투여될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 어류의 병원성 기생충 및/또는 세균에 의한 어류의 질병을 동시에 예방할 수 있을 뿐만 아니라, 단독 또는 다른 병원체와의 조합을 갖는 조성 대비 백신 효과가 우수하다. 단독 백신을 종류마다 개별적으로 접종하는 경우, 어체에 스트레스를 줄 뿐만 아니라 많은 노동력과 시간이 소요되나, 다가 백신은 한 번 접종으로 복수의 항원체에 대한 방어능을 형성할 수 있어 시간과 비용이 절약될 수 있다. 또한 본 발명이 제공하는 백신 조성물은 일반적으로 양식 넙치에서 복합적으로 이루어지는 기생충성 감염과 세균성 감염 (복합 감염)에 대한 방어능이 우수하다.

또한 본 발명의 백신 조성물은 각 항원체 사이에서 항체 형성에 대한 간섭 효과가 일어나지 않아, 다가 백신으로서 우수한 효과를 가진다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 백신 조성물을 넙치에 투여하여 PBS를 접종한 대조 그룹과 비교하여 항체 간섭 유무를 확인한 결과, 백신을 접종한 그룹은 모두 대조군에 비해 높은 항체 수치를 보였으며, 백신 접종 2주 후 부스터 백신을 추가 접종한 실험군에서는 대조군에 비해 통계적으로 유의미한 항체 생성량이 확인되었는 바, 간섭 현상이 일어나지 않음을 확인하였다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물을 어류에 투여하는 경우, 상기 백신 조성물을 투여하지 않은 대조군에 비해 병원성 기생충 또는 세균에 노출되었을 때 상대생존율(RPS)이 향상될 수 있다. 상기 상대생존율(RPS)은 하기 수학식 1의 수식을 이용하여 계산된다.

[수학식 1]

상기 수학식 1에서 control mortality는 백신을 투여하지 않은 대조군이 병원성 기생충 또는 세균에 노출되었을 때의 폐사율을 의미하고, vaccinate mortality는 본원의 5가 백신을 투여한 실험군 어류가 병원성 기생충 또는 세균에 노출되었을 때의 폐사율을 의미한다. 상기 상대생존율은 수산용 동물용의약품 검정 기준에 따라 백신을 투여하지 않는 대조군의 누적폐사율이 60% 이상인 날(이하 "기준일"이라 한다)을 기준으로 하여 계산되는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 기준일은 대조군의 누적폐사율이 60% 이상인 날 중 실험군(백신 투여군)의 상대생존율이 가장 높은 날일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 백신 조성물을 투여한 어류는, 하기와 같은 상대생존율을 가질 수 있다:

미아미엔시스 아비두스 JJB1403 스쿠티카충에 노출되었을 때의 상대생존율(RPS)이 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 10 내지 99%, 20 내지 99%, 30 내지 99%, 40 내지 99%, 45 내지 99%, 10 내지 95%, 20 내지 95%, 30 내지 95%, 40 내지 95%, 45 내지 95%, 10 내지 90%, 20 내지 90%, 30 내지 90%, 40 내지 90%, 45 내지 90%, 10 내지 80%, 20 내지 80%, 30 내지 80%, 40 내지 80%, 45 내지 80%, 10 내지 60%, 20 내지 60%, 30 내지 60%, 40 내지 60%, 또는 45 내지 60%;

미아미엔시스 아비두스 JJC1404 스쿠티카충에 노출되었을 때의 상대생존율(RPS)이 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 10 내지 99%, 20 내지 99%, 30 내지 99%, 40 내지 99%, 10 내지 95%, 20 내지 95%, 30 내지 95%, 40 내지 95%, 10 내지 90%, 20 내지 90%, 30 내지 90%, 40 내지 90%, 10 내지 80%, 20 내지 80%, 30 내지 80%, 40 내지 80%, 10 내지 60%, 20 내지 60%, 30 내지 60%, 또는 40 내지 60%;

테나시바쿨럼 마리티멈에 노출되었을 때의 상대생존율(RPS)이 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 10 내지 99%, 20 내지 99%, 30 내지 99%, 40 내지 99%, 50 내지 99%, 10 내지 95%, 20 내지 95%, 30 내지 95%, 40 내지 95%, 50 내지 95%, 10 내지 90%, 20 내지 90%, 30 내지 90%, 40 내지 90%, 50 내지 90%, 10 내지 80%, 20 내지 80%, 30 내지 80%, 40 내지 80%, 50 내지 80%, 10 내지 60%, 20 내지 60%, 30 내지 60%, 40 내지 60%, 또는 50 내지 60%;

비브리오 하베이이에 노출되었을 때의 상대생존율(RPS)이 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 10 내지 99%, 20 내지 99%, 30 내지 99%, 40 내지 99%, 45 내지 99%, 10 내지 95%, 20 내지 95%, 30 내지 95%, 40 내지 95%, 45 내지 95%, 10 내지 90%, 20 내지 90%, 30 내지 90%, 40 내지 90%, 45 내지 90%, 10 내지 80%, 20 내지 80%, 30 내지 80%, 40 내지 80%, 45 내지 80%, 10 내지 60%, 20 내지 60%, 30 내지 60%, 40 내지 60%, 또는 45 내지 60%;

비브리오 앙구일라럼에 노출되었을 때의 상대생존율이 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 10 내지 99%, 20 내지 99%, 30 내지 99%, 40 내지 99%, 10 내지 95%, 20 내지 95%, 30 내지 95%, 40 내지 95%, 10 내지 90%, 20 내지 90%, 30 내지 90%, 40 내지 90%, 10 내지 80%, 20 내지 80%, 30 내지 80%, 40 내지 80%, 10 내지 60%, 20 내지 60%, 30 내지 60%, 또는 40 내지 60%.

본 발명의 일 실시예에서, 넙치에 5가 백신을 투여한 그룹, 상기 투여일로부터 2주 후 부스터 백신을 추가 접종한 그룹 및 백신 대신 PBS를 투여한 대조 그룹에 대해 최초 백신 투여일로부터 4주 경과 후 각 병원체에 대한 감염 실험을 진행하여 상대생존율(RPS, %)을 상기 수학식 1로 계산하였다. 그 결과, 부스터 백신의 접종 유무에 관계 없이 백신 접종 그룹에서 모두 상대생존율이 40% 이상으로 높게 나타나, 백신 비접종 그룹에 비해 각 병원체에 대한 방어력이 향상되었음을 확인하였다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물의 투여 대상은 어류일 수 있으며, 미아미엔시스 아비두스 JJB1403, 미아미엔시스 아비두스 JJC1404, 테나시바쿨럼 마리티멈, 비브리오 하베이이, 및/또는 비브리오 앙구일라럼의 감염에 의한 폐사를 예방하기 위한 목적 범위에서 제한 없이 이용될 수 있다. 예를 들어, 조피볼락(우럭)류, 넙치류, 참돔류, 돔류, 숭어류, 부세류, 및/또는 농어류를 포함하는 양식어류 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 예에서, 상기 백신의 투여 대상은 넙치류일 수 있으며, 상기 넙치류는 가자미목 넙치과의 양식 대상 어류를 제한 없이 포함할 수 있다. 본 발명의 일 예에서 상기 백신의 투여 대상은 넙치일 수 있다.

본 발명의 백신 조성물이 넙치에 투여되는 경우, 알, 자어, 치어, 약어, 미성어, 또는 성어의 성장 단계에서 투여될 수 있다. 일 예에서, 상기 백신 조성물은 넙치 자어 및/또는 치어에 투여될 수 있다. 일 예에서, 상기 백신 조성물은 부화 후 체장 1 내지 10cm의 넙치에 투여될 수 있다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물은 침지법으로 투여될 수 있어, 10cm 이하의 치어에 대해서도 주사에 의한 스트레스 및 염증의 위험 없이 넙치의 조기 성장 단계에서 세균성 및 기생충성 감염증에 대한 예방이 가능하다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물은 면역보조제 또는 면역증강제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 면역보조제 또는 면역증강제는 부작용을 일으키지 않고 면역 활성을 원하는 정도로 향상시킬 수 있는 목적 범위에서 제한 없이 이용될 수 있으며, 예를 들어, 마그네슘 하이드록사이드, 마그네슘 카보네이트 하이드독사이드 펜타하이드데이트, 티타듐 다이독사이드, 칼슘 카보네이트, 바륨 옥사이드, 바륨 하이이드록사이드, 바륨 퍼옥사이드, 바륨 설페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 파이로포스페이트, 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 옥사이드, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 및 수화된 알루미늄 포타슘 설페이트(Alum)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 금속염, TLR(Toll-like receptor) 작용제, 에멀전, 비이온성 계면활성제를 포함하는 리포솜, 사포닌, 나노입자 면역증강제, 또는 점막 면역증강제일 수 있다. 상기 에멀전은 오일 성분을 포함할 수 있으며, 상기 오일 성분은 스쿠알렌일 수 있다. 상기 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제, 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르계 비이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제 및 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜계 비이온성 계면활성제로 구성된 그룹으로부터 선택된 1 이상일 수 있다. 예를 들어 상기 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제는 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 80 및 트윈 85로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 계면활성제일 수 있다. 또한, 상기 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제는 스판 20, 스판 40, 스판 60, 스판 80 및 스판 85로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 계면활성제일 수 있다.

상기 면역보조제 또는 면역증강제는 비특이적 면역계를 활성화시키는 역할을 수행하여, 특이적 면역을 활성화시키는 백신을 보조하는 역할을 수행하고, 어류 또는 양식어류의 면역력을 향상시키고, 백신의 효능을 보다 증가시킬 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 백신 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 부형제 및/또는 안정화제 등의 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들면 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 백신 조성물은 주사 투여법, 경구투여법 또는 침지법을 이용하여 어류에 투여될 수 있다. 상기 주사 투여법을 이용하는 경우 투여량이 정확하고 소요 백신량이 적으며 면역보조제 또는 면역증강제를 추가로 포함할 수 있는 장점이 있다. 상기 경구투여법은 집단을 대상으로 하는 어류 양식에 이상적이며, 접종이 매우 용이한 장점을 가진다. 상기 침지법은 치어에 투여가 가능하고 대량 처리가 가능한 장점이 있다.

본 명세서에서, "침지" 또는 "침지 투여"는 백신을 사육 해수 및/또는 담수에 용해시켜 어류의 체내로 침투시키는 방법을 의미한다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물은 침지법을 이용해 투여가 가능하므로, 기존 주사 투여시 10 cm 이하의 치어기 넙치에 백신을 주사 투여하는 경우, 개체의 크기가 너무 작아 주삿바늘에 의한 어체의 스트레스가 크고, 바늘에 의한 상처를 통해 2차 감염의 위험이 있으며, 이로 인한 폐사가 발생하던 문제점을 해결할 수 있으며, 본 발명이 제공하는 백신 조성물은 침지법으로 투여될 수 있어, 주삿바늘에 의한 스트레스 및 어류의 피해를 최소화할 수 있고, 넙치의 사육 초기에 면역력을 부여할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 백신 조성물 또는 어류의 질병 예방용 약학적 조성물이 침지법으로 투여되는 경우, 각 병원체(항원) 또는 상기 각 병원체의 불활성화 균체가 최종 백신 투여 농도의 2 내지 100배, 5 내지 50배, 10 내지 30배 또는 15 내지 25배의 스톡 용액(stock solution)으로 우선 제조된 후, 침지 전에 사육되는 해수 및/또는 담수에 희석하여 침지에 사용될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 필요에 따라 1회 또는 복수의 횟수로 투여될 수 있으며, 예를 들어 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 1 내지 5회, 1 내지 4회, 1 내지 3회, 1 내지 2회, 2 내지 5회, 2 내지 4회, 2 내지 3회, 3 내지 5회, 또는 3 내지 4회 투여될 수 있다.

상기 백신 투여 횟수가 2 이상인 경우, 각 백신 투여일은 3일 내지 200일, 5일 내지 180일, 7일 내지 60일, 10일 내지 30일, 또는 12일 내지 15일의 간격을 두고 투여될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 백신 투여 횟수가 2 이상인 경우, 각 백신 투여 방법은 첫 번째 투여 방법과 동일 및/또는 상이한 방법이 사용될 수 있다.

상기 백신 투여 횟수가 복수 회인 경우, 어류의 체내 항체 생성량이 증가할 수 있으며, 복수 회 투여로 인한 면역반응에 의해 항체가 재생성되기 때문에 병원체에 특이적인 항체의 체내 지속 시간이 연장될 수 있는 장점이 있다. 또한 이러한 항체 생성량 및 체내 지속 시간의 향상으로 인한 백신의 방어 효과 향상을 기대할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물 또는 어류의 질병 예방용 약학적 조성물이 침지 투여되는 경우, 적절한 침지 투여 시간은 5초 내지 5분, 5초 내지 3분, 5초 내지 1분, 5초 내지 45초, 5초 내지 40초, 10초 내지 5분, 10초 내지 3분, 10초 내지 1분, 10초 내지 410초, 10초 내지 40초, 15초 내지 5분, 15초 내지 3분, 15초 내지 1분, 15초 내지 415초, 15초 내지 40초, 20초 내지 5분, 20초 내지 3분, 20초 내지 1분, 20초 내지 420초, 20초 내지 40초, 예를 들어, 25초 내지 35초이다.

본 발명의 백신 조성물 또는 어류의 질병 예방용 조성물은 상기 어류에서 발생하는 기생충성 또는 세균성 질병의 병원체의 불활성화 균체 및 완충액을 포함할 수 있으며, 불활성화 균체는 포르말린 처리 방법, 열처리 방법 또는 동결처리 방법 등으로 제조될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 어류의 질병 예방 방법으로서, 상기 백신 조성물 및/또는 어류의 질병 예방용 약학적 조성물을 어류에 투여하는 단계를 포함한다.

상기 투여 방법은 주사 투여법, 경구투여법 또는 침지법을 이용하여 어류에 투여될 수 있다. 상기 침지법의 구체적인 방법은 상술한 바와 같다.

상기 어류의 질병은 스쿠티카증, 비브리오증, 및 활주세균증으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상, 2 이상 또는 3종의 질병일 수 있으며, 구체적인 증상은 상술한 바와 같다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 어류에 발생하는 질병의 병원체를 항원으로 하는 다가 백신의 제조 방법으로서, 미아미엔시스 아비두스 JJB1403 및/또는 미아미엔시스 아비두스 JJC1404를 배양한 후 분리하여 불활성화시키는 단계; 테나시바쿨럼 마리티멈, 비브리오 하베이이, 및/또는 비브리오 앙구일라럼을 배양한 후 분리하여 불활성화시키는 단계를 포함한다. 상기 미아미엔시스 아비두스 JJB1403 및/또는 미아미엔시스 아비두스 JJC1404를 배양한 후 분리하여 불활성화시키는 단계; 테나시바쿨럼 마리티멈, 비브리오 하베이이, 및/또는 비브리오 앙구일라럼을 배양한 후 분리하여 불활성화시키는 단계는 동시 또는 순서와 상관없이 순차적으로 수행될 수 있다.

상기 백신 조성물에 관한 사항은 백신 조성물의 제조 방법에 적용될 수 있다.

상기 세균을 배양하는 단계에서 사용되는 세균 배양용 배지는 각 배양 대상 세균에 따라 적절히 선택하여 수행할 수 있으며, 구체적인 배양 조건은 알려진 배양 조건에서 적절히 선택하여 사용할 수 있고, 상기 기생충 또는 세균을 배양하는 단계를 수행하기 전에, 기생충 또는 세균 배양용 배지에서 12 내지 24시간 동안 전배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 불활성화 단계는 포르말린 처리 방법에 의할 수 있으며, 일 예에서, 상기 기생충 및/또는 세균은 포르말린 처리 방법에 의하여 불활성화 처리할 수 있다. 예를 들어, 상기 포르말린 처리 방법은 병원성 기생충 및/또는 세균을 0.5 내지 2%(v/v) 포르말린으로 2 내지 10℃, 또는 4℃에서 2시간 이상, 처리하여 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는, 상기 백신 조성물을 포함하는 어류의 사료 조성물을 제공한다. 사료 조성물은 통상의 어류 양식에 사용되는 배지에, 본 발명에 따른 백신 조성물을 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 어류의 질병 예방용 백신 조성물은 어류에 발생하는 기생충성 및 세균성 질병의 원인이 되는 병원체를 항원으로 하는 다가 백신으로서, 종래 백신에 비하여 적은 함량 또는 낮은 농도에서도 우수한 백신 효과가 있을 뿐 아니라 기생충 및 세균에 의해 발생하는 질병을 모두 예방할 수 있어 어류 질환 백신으로서 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명이 제공하는 백신은 침지백신으로 주사 접종에 비해 백신 접종 방법이 간단하며, 경구 투여법에 비해 항원 요구량이 적고, 치어기 넙치에 적은 스트레스로 백신을 접종할 수 있으며 세균 및 기생충성 질병의 예방이 가능하다.

도 1은 각 백신주의 동정을 위한 PCR 후 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 2a 내지 2e는 각 백신주의 PCR 결과물 시퀀싱 결과 및 해당 서열의 BLAST 분석 결과이다. 2a는 M. avidus JJB1403, 2b는 M. avidus JJC1404, 2c는 T. maritimum, 2d는 V. anguillarum, 및 2e는 V. harveyi 백신주의 결과이다.
도 3a 내지 3e는 각 백신주의 성장 곡선 그래프이다. 3a는 M. avidus JJB1403, 3b는 M. avidus JJC1404, 3c는 T. maritimum, 3d는 V. anguillarum, 및 3e는 V. harveyi 백신주의 성장 곡선이다.
도 4a 내지 4e는 병원성 확인을 위해 각 병원체를 넙치에 감염시킨 후 14일간 시간의 경과에 따른 누적 폐사율을 나타낸 그래프이다. 4a는 M. avidus JJB1403, 4b는 M. avidus JJC1404, 4c는 T. maritimum, 4d는 V. anguillarum, 및 4e는 V. harveyi 접종 결과 누적 폐사율 그래프이다.
도 5a 내지 5e는 항원량 결정을 위해 각 병원체를 농도별로 넙치에 감염시킨 후 14일간 시간의 경과에 따른 누적 폐사율을 확인한 결과 그래프이다. 5a는 M. avidus JJB1403, 5b는 M. avidus JJC1404, 5c는 T. maritimum, 5d는 V. anguillarum, 및 5e는 V. harveyi 접종 결과 누적 폐사율 그래프이다.
도 6a 내지 6e는 항체 형성에 대한 간섭 유무를 확인하기 위해, 백신 미접종 그룹(Control), 시험 백신 접종 그룹(IMS-5V), 및 면역보조제 추가 백신 접종 그룹(IMS-5V (Booster))의 간접적 ELISA(indirect ELISA) 결과 그래프이다. 6a는 M. avidus JJB1403, 6b는 M. avidus JJC1404, 6c는 T. maritimum, 6d는 V. anguillarum, 및 6e는 V. harveyi의 결과 그래프이다.
도 7a 내지 7e는 백신 효과를 확인하기 위해 백신을 투여하지 않은 대조군(Control), 시험 백신을 투여한 그룹(IMS-5V), 및 시험 백신과 면역보조제를 함께 투여한 그룹(IMS-5V(booster))을 침지 후 각 병원균에 대한 감염 실험을 진행한 누적 폐사율과 상대 생존율 그래프이다. 7a는 M. avidus JJB1403, 7b는 M. avidus JJC1404, 7c는 T. maritimum, 7d는 V. anguillarum, 및 7e는 V. harveyi의 결과 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 각 균주 및 기생충의 분리

1-1. 스쿠티카 섬모충의 분리

스쿠티카 섬모충 Miamiensis avidus (strain name: JJB1403, JJC1404)는 2014년 제주도내 지역 양식장으로부터 얻은 스쿠티카 충에 감염된 넙치의 뇌 조직으로부터 무균상태에서 분리하였다.

구체적으로, 기생충 감염증 증상을 보이는 넙치의 뇌 조직을 분리하여, 단계 희석법을 통해 분리하였다. 상기 분리된 스쿠티카 섬모충은 항생제 용액 (100 units/mL of penicillin G, 0.1 mg of streptomycin sulphate; Sigma)과 5%(v/v) fetal bovine serum (FBS)를 넣은 L-15 Leibovitz 배지에서 충분히 자란 fathead minnow (FHM) 세포를 사용하여 20℃에서 배양하였다.

1-2. 병원성 세균의 분리

Tenacibaculum maritimum, Vibrio harveyi, Vibrio anguillarum은 각 병원균에 감염된 증상을 보이는 넙치의 간과 신장을 분리하여 blood 고체배지에 도말하여 분리하였다.

구체적으로, T. maritimum 균은 감염 증상을 보이는 넙치의 간과 신장을 분리한 후, blood 고체배지에 접종하여 25℃에서 배양하여 단일 콜로니를 순수 분리하였다.

V. harveyi 및 V. anguillarum은 비브리오증 증상을 보이는 넙치의 간과 신장을 분리한 후, blood 고체 배지에 접종하여 25℃에서 12시간 배양한 후, 단일 콜로니를 순수 분리하였다.

실시예 2. 중합효소 연쇄 반응 및 서열분석에 의한 각 균주 및 기생충의 동정

상기 실시예 1-1의 방법으로 분리 및 배양된 스쿠티카 섬모충의 동정을 위해, M. avidus JJB1403 및 M. avidus JJC1404는 Cox-1 유전자의 특이적인 프라이머 쌍을 사용하여 Polymerase chain reaction(PCR)을 수행하여 PCR 산물의 크기를 확인하였다. 상기 Cox-1 유전자 특이적 프라이머 쌍은 하기 표 1에 나타내었다.

또한 병원성 세균을 동정하기 위해 각 세균에 특이적인 프라이머 쌍(표 1)을 사용하여 Polymerase chain reaction(PCR)을 수행하여 PCR 산물의 크기를 확인하였다.

서열 번호	Name	염기서열 (5'> 3')	PCR산물 크기 (bp)
1	M. avidus Cox-1 forward	GGTTCTAAAGATGTGGCTTACCCTAGAC	597
2	M. avidus Cox-1 reverse	CATACCAGGCATACATAAAGTACGTCTTGT	597
3	T. maritimum 16s rRNA MAR1 forward	AATGGCATCGTTTTAAA	1088
4	T. maritimum 16s rRNA MAR2 reverse	CGCTCTCTGTTGCCAGA	1088
5	V. harveyi toxR AY247418 forward	TTCTGAAGCAGCACTCAC	390
6	V. harveyi toxR AY247418 reverse	TCGACTGGTGAAGACTCA	390
7	V. anguillarum groESL forward	TATCACTGTTGAAGAAGGTCAAGCACTG	195
8	V. anguillarum groESL reverse	CGCTTCAAGTGCAGGAAGCAG	195

도 1에 스쿠티카 섬모충 및 각 병원성 세균의 PCR 후 전기영동을 수행한 결과를 나타내었다. 전기영동 확인 결과 예상크기에 맞는 밴드를 확인 하였고 NCBI에서 nucleotide BLAST 분석을 통하여 M. avidus임을 확인하였다. 또한 Cox-1 유전자의 JJB1403, JJC1404가 가지고 있는 특이적인 서열을 확인하여 JJB1403와 JJC1404를 구별하였다.

도 2a 내지 도 2b에 상기 JJB1403 및 JJC1404 균주의 Cox-1 유전자의 특이적 서열 부위 시퀀싱 결과 및 BLAST 결과를 나타내었다. 상기 JJB1403 및 JJC1404 균주의 Cox-1 유전자에서 각 균주에서 특이적으로 나타난 염기 서열은 별도로 괄호로 표시하였다.

Tenacibaculum maritimum, Vibrio harveyi, Vibrio anguillarum 은 각각 표 1의 특이적인 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 실시하였다. 전기영동 확인 결과 예상 크기에 맞는 밴드를 확인하였고 상기 증폭 산물을 시퀀싱 후(서열번호 11 내지 13) NCBI에서 nucleotide BLAST 분석을 통하여 각각의 균이 Tenacibaculum maritimum, Vibrio harveyi, 및 Vibrio anguillarum 임을 확인하였다.

도 2c 내지 도 2e에 상기 Tenacibaculum maritimum, Vibrio harveyi, 및 Vibrio anguillarum의 시퀀싱 결과 및 BLAST 결과를 나타내었다.

실시예 3. 병원성 시험 및 공격 접종량의 결정

3-1. 병원성 기생충 및 균주의 배양 방법

M. avidus JJB1403 및 JJC1404 기생충은 자체 개발한 MGL-MA medium을 이용하여 20℃의 온도에서 배양하였다. 상기 MGL-MA medium은 L-15 배지 분말 11.5g, 펩톤(Peptone) 1g, NaCl 4g 및 MgCl₂ 2g을 증류수 1000ml에 녹여 제작하였다.

도 3a 내지 도 3b에 상기 배양 조건에 따른 JJB1403 혈청형 기생충 및 JJC1404 혈청형 기생충의 성장 곡선(growth curve) 그래프를 각각 나타내었다.

Tenacibaculum maritimum, Vibrio harveyi, 및 Vibrio anguillarum는 하기 표 2와 같이 병원성 균주의 성장에 최적화 된 배양 배지와 온도에서 균주를 배양하였다. 구체적으로, 각각의 병원균을 고체 배지에 도말하여 단일 콜로니(colony)를 얻어내고 이 단일 콜로니를 하기 표에 따른 배지 5ml에서 12 내지 24 h까지 교반 배양기를 사용하여 전 배양하였다. 전배양을 마친 후 다시 각각의 균에 적절한 배지에서 12 내지 24 h까지 교반 배양기를 사용하여 배양하였다.

도 3c 내지 도 3e에 Tenacibaculum maritimum, Vibrio harveyi, 및 Vibrio anguillarum 균주의 생장 곡선 그래프를 각각 나타내었다.

병원체	배지	배양 온도
Miamiensis avidus　JJB1403	MGL-MA medium (자체개발)	20 ℃
Miamiensis avidus　JJC1404	MGL-MA medium (자체개발)	20 ℃
Tenacibaculum maritimum	MGL-TM medium (자체개발)	25 ℃
Vibrio harveyi	Brain heart infusion (BHI) (최종농도 1.5 %(w/v) NaCl)
Vibrio anguillarum	Luria-Bertani (LB) medium

3-2. 각 병원체의 정량 방법

각 병원체(세균 및 기생충)의 정량은 기생충의 경우 혈구계산판을 이용하여 수행되었으며, 세균의 경우 광학 밀도(optical density, OD)와 colony forming unit(CFU)을 비교한 기준 그래프를 이용해 600nm의 파장에서 측정한 OD 값을 이용해 수행되었다. 하기 표 3에 각 병원성 세균의 OD600이 1일 때 CFU 수치를 나타내었다.

병원성 세균	OD600수치가 1일 때 CFU/ml 수치
Tenacibaculum maritimum	2Ⅹ10⁸
Vibrio harveyi	2Ⅹ10⁹
Vibrio anguillarum	2Ⅹ10⁹

3-3. 기생충의 병원성 시험

M. avidus의 병원성을 확인하기 위해, 평균 체장과 무게가 각각 10 cm 및 8 g인 건강한 넙치 20 마리에 M. avidus JJB1403를 2X10⁵/fish의 농도로, 상기 넙치와 동일한 조건의 건강한 넙치 20 마리에 M. avidus JJC1404를 2X10⁵/fish의 농도로 접종하였다.

도 4a 및 도 4b에 JJB1403 및 JJC1404의 접종 후 날짜 경과에 따른 누적 폐사량 그래프를 나타내었다.

M. avidus JJB1403를 2X10⁵/fish의 농도로 건강한 넙치에 주사 후 병원성을 확인한 결과 주사 후 5일부터 폐사가 발생하였고 주사 후 14일 후에는 80%의 누적 폐사율을 확인하였다. 또한 상기 JJB1403 기생충이 감염된 넙치에서 복부 팽만 및 체색 흑화와 같은 감염 증상이 나타났으며, 폐사 넙치의 복수를 현미경으로 검사한 결과, 스쿠티카충이 확인되었다. 따라서 M. avidus JJB1403의 병원성이 확인되었다.

M. avidus JJC1404를 2X10⁵/fish의 농도로 건강한 넙치에 주사 후 병원성을 확인한 결과, 감염 후 3일째부터 폐사가 발생하였고, 주사 후 14일 후에는 누적 폐사율이 80%로 확인되었다. 또한 넙치에서 스쿠티카 M. avidus JJC1404에 감염된 증상, 구체적으로 복부 팽만과 체색 흑화와 같은 증상이 확인되었으며, 폐사 넙치의 복수를 현미경으로 검사하여 스쿠티카 충을 확인하였다. 따라서 M. avidus JJC1404의 병원성이 확인되었다.

3-4. 각 균주의 병원성 시험

각 병원균마다 균 체장과 무게가 각각 10 cm, 8 g인 건강한 넙치 20 마리를 병원성 시험에 이용하였다.

구체적으로, T. maritimum 균주는 5X10⁷ CFU/fish의 농도로 평균 체장과 무게가 각각 10 cm, 8 g인 건강한 넙치에 주사되었다. V. anguillarum은 1X10⁶ CFU/fish의 농도로 건강한 넙치에 복강 주사하였으며, V. harveyi는 2X10⁸ CFU/fish의 농도로 복강 주사되었다.

도 4c 내지 도 4e에 상기 병원성 균주들을 복강주사한 후 날짜의 변화에 따른 누적 폐사율 그래프를 나타내었다.

T. maritimum 균주가 투여된 경우, 주사 후 4일째부터 폐사가 발생하기 시작하여 6일 째에는 누적 폐사율 80%를 보였고, T. maritimum 균주가 투여된 넙치 개체에서는 복부 팽만과 같은 감염 증상이 나타났으며, 간 및 심장 조직을 분리하여 PCR을 이용해 확인한 결과 T. maritimum 균에 의한 감염이 확인되었다.

V. anguillarum이 투여된 경우, 주사 후 2일 째부터 폐사가 발생하였고, 이후 폐사가 급격히 증가하여 주사 후 5일 째 되는 날 100%의 누적 폐사율을 보였다. 감염된 넙치는 복부 팽만 증상을 나타내었고, 간과 신장 조직에서 V. anguillarum의 감염이 확인되었다.

V. harveyi를 감염시킨 경우에는 주사 후 3일 째부터 폐사가 발생하고, 7일이 되는 날 누적폐사율이 80%에 달해 급격한 누적폐사율의 증가를 보였으며, 복부 팽만 증상이 확인되었다. 또한 감염 개체에서 간과 신장 조직을 분리하여 PCR을 이용해 확인한 결과, V. harveyi가 감염된 것으로 확인되었다.

따라서 상기 3종의 병원성 세균이 넙치에 대해 병원성이 있음을 확인하였다.

실시예 4. 백신의 항원량 결정

항원량 결정을 위해, 2종의 기생충 및 3종의 병원성 세균을 각각 농도별로 넙치에 주사(접종)하고, 접종 1달 경과 후 각 대응하는 병원체를 복강 주사(감염)하여 감염일로부터 날짜의 경과에 따른 누적폐사율과 상대생존율을 확인하였다. 비교를 위한 대조군(대조 그룹)에는 동량의 인산완충용액(PBS)을 접종하였다.

상기 상대생존율(RPS, %)은 하기 수학식 1의 방법으로 계산되었다.

[수학식 1]

도 5a 내지 5e에 각 항원의 접종 항원량에 따른 누적폐사율 그래프를 나타내었으며, 하기 표 4에 각 항원의 농도와 각 농도에 따른 폐사율 및 상대생존율(RPS, %)을 나타내었다. 상기 상대 생존율은 수산용 동물용의약품 검정 기준에 따라 대조군의 폐사율이 60% 이상일 때 상기 수학식 1에 따라 계산되었다.

항원 종류	감염 항원 농도	접종 농도	상대생존율(%)	최종 결정
M. avidus JJB1403	1X10⁵cell/fish	대조군 (PBS)	-	-
		2.5X10⁴ cell/ml	46	O
		7.5X10⁴ cell/ml	15	-
		2.5X10⁵ cell/ml	46	-
M. avidus JJC1404	2X10⁵cell/fish	대조군 (PBS)	-	-
		2.5X10⁴ cell/ml	50	O
		7.5X10⁴ cell/ml	17	-
		2.5X10⁵ cell/ml	0	-
T. maritimum	4X10⁷CFU/fish	대조군 (PBS)	-	-
		1X10⁷ CFU/ml	14	-
		3X10⁷ CFU/ml	36	-
		1X10⁸ CFU/ml	57	O
V. harveyi	5X10⁸CFU/fish	대조군 (PBS)	-	-
		5X10⁷ CFU/ml	26	-
		1.5X10⁸ CFU/ml	45	O
		5X10⁸ CFU/ml	37	-
V. anguillarum	2X10⁶CFU/fish	대조군 (PBS)	-	-
		5X10⁷ CFU/ml	80	O
		1.5X10⁸ CFU/ml	67	-
		5X10⁸ CFU/ml	80	-

M. avidus JJB1403은 감염주사 3일 후 폐사가 발생하였으며 대조 그룹과 비교를 하였을 때 폐사량은 감소하였고 상대생존율(RPS)도 46%를 확인할 수 있었다.

M. avidus JJC1404은 감염주사 4일 후 폐사가 발생하였으며 대조 그룹과 비교를 하였을 때 폐사량은 감소하였고 상대생존율(RPS)도 50%이상을 확인할 수 있었다.

T. maritimum은 감염 후 2일부터 폐사가 발생하였으며 대조 그룹과 비교를 하였을 때 폐사량은 감소하였고 상대생존율(RPS)도 50%이상을 확인할 수 있었다.

V. harveyi는 감염 후 2일부터 폐사가 발생하였으며 대조 그룹과 비교를 하였을 때 폐사량은 감소하였고 상대생존율(RPS)도 50%이상으로 확인할 수 있었다.

V. anguillarum은 감염 후 2일부터 폐사가 발생하였으며 대조 그룹과 비교를 하였을 때 폐사량은 감소하였고 상대생존율(RPS)도 80%이상으로 확인할 수 있었다.

상기 결과를 통해, M. avidus JJB1403의 항원량은 2.5X10⁴cells/ml, M. avidus JJC1404의 항원량은 2.5X10⁴cells/ml, T. maritimum의 항원량은 1X10⁸ CFU/ml, V. harveyi의 항원량은 1.5X10⁸ CFU/ml, 및 V. anguillarum의 항원량은 5X10⁷ CFU/ml로 결정하였다.

실시예 5. 시험 백신의 효력 시험

5-1. 시험 백신의 제조 및 침지

5가 침지 백신의 시험 백신의 최종 농도는, M. avidus JJB1403 2.5X10⁴ cell/ml, M. avidus JJC1404 2.5X10⁴ cell/ml, T. maritimum 1X10⁸ CFU/ml, V. harveyi 1.5X10⁸ CFU/ml, 및 V. anguillarum 5X10⁷ CFU/ml로 구성되었으며, 면역보조제로서 시판중인 Montanide?? IMS 1312 VG(SPPIC 사)를 최종 농도 1%(v/v)가 되도록 첨가하였다.

상기 병원성 기생충 및 병원성 세균은 모두 불활성화하여 이용되었다. 구체적으로, 스쿠티카 섬모충은 실시예 3-1과 실질적으로 동일한 방법으로 배양 후, 성장이 최대가 된 스쿠티카충(M. avidus JJB1403 및 M. avidus JJC1404)에 포르말린을 최종 농도가 1%(v/v)가 되도록 넣고 불활성화하였다. 그 후 1000 x g에서 20분간 원심분리하여 불활성화된 스쿠티카충을 수집하여, 인산완충용액(PBS)으로 3회 세척한 후 스쿠티카 섬모충의 수를 혈구계산판을 사용하여 측정하고 -80

에 보관하였다.

T. maritimum, V. harveyi, 및 V. anguillarum은 실시예 3-1의 방법으로 배양된 후, 각 균을 불활성화 하기 위해서 포르말린을 최종 농도가 1%(v/v)가 되도록 넣었고 25℃에서 2시간 배양하고 4℃에서 72시간 보관하였다. 불활성화 후에 균은 4℃에서 4000g, 15분간 원심분리하여 수집하고, 인산완충용액(PBS)으로 4℃에서 1000g, 15분간 3번 원심분리하여 세척하였다. 세균의 수는 600nm에서 측정한 광학밀도(optical density, OD)와 colony forming unit (CFU) 비교한 기준 그래프와 600nm에서 측정한 OD값을 통하여 측정하였다. 모든 병원체는 생균수 측정법 (viable count)에 의하여 완벽하게 불활성화된 것을 확인하였고 사용할 때까지 -80℃의 온도에서 보관하였다.

상기 시험 백신의 제조에서, 항원은 각각 상기 시험 백신 내 최종 농도의 20배의 농도가 되도록 스톡 용액(stock solution)을 제조한 후, 침지시 사육 해수와 20배로 희석하여 침지하였다.

침지 백신의 접종은 150마리의 물고기당 2L의 침지 백신을 이용하였고, 이후 실험에 따라 30초 산소 폭기 하에 침지하였다.

5-2. 항체 형성에 대한 간섭 유무의 확인

각 항원의 조합에 의한 항체 형성에 대한 간섭 유무를 확인하기 위하여, 상기 실시예 5-1의 방법으로 제조된 시험 백신을 준비하였다.

상기 5가 시험 백신을 침지시킨 그룹과 백신을 접종하지 않고 동량의 PBS를 침지시킨 대조군(Control, 대조 그룹)의 혈청을 시간별로 샘플링하여, 간접적 ELISA(indirect ELISA)를 통해 형성된 항체를 비교하여 간섭의 유무를 확인하였다.

구체적으로 상기 백신을 침지한 그룹은 다시 초기 백신 접종 2주 후 부스터 백신 접종을 실시한 IMS-5V (booster) 그룹과 부스터 백신 접종을 실시하지 않은 IMS-5V (no booster) 그룹으로 나누어졌다. 상기 부스터 백신의 접종은, 상기 시험 백신의 접종 2주 후에 동일한 백신을 동일한 방법으로 재접종하여 수행되었다.

초기 백신 접종 4주 후 실험군 2종 (IMS-5V (booster), IMS-5V (no booster)) 및 대조군으로부터 각각 6마리의 넙치를 무작위로 선별하여 혈액을 채취하고, ELISA법으로 항체가 측정수행하였다.

구체적으로, 96-well plate에 각 항원을 세균성 항원(T. maritimum, V. harveyi, 및 V. anguillarum)의 농도는 1X10⁷ CFU/well, 기생충성 항원(M. avidus JJB1403, M. avidus JJC1404)의 농도는 1X10⁵ cells/well가 되도록 코팅 버퍼 (Coating buffer, bicarbonate/carbonate buffer)로 희석하여 첨가한 후, 4℃에서 24시간 동안 처리하여 96-well plate에 항원을 고정하였다. 이후 TBS-T 버퍼 (20mM Tris, 137mM NaCl, 0.1% tween20, pH7.7)를 이용하여 1회 세척 후 5%(w/v) skim milk/TBS-T 버퍼를 200ul씩 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 블로킹을 진행하여, 비특이적 신호를 차단하였다.

이후 5가 백신을 침지한 실험군 및 백신을 투여하지 않은 대조군 넙치로부터 분리한 혈청을 각각 5%(w/v) skim milk/TBS-T 버퍼에 10배로 희석하고 각 well에 100ul씩 분주하여 25℃에서 3시간 동안 반응을 수행하였다. 반응이 완료된 96-well plate는 TBS-T 버퍼로 3회 세척하였다.

이후 mouse anti-flounder IgM 모노클로날 1:3000으로 희석하여 96-well plate의 각 well에 100ul씩 분주하여 25℃에서 3시간 반응 후 다시 TBS-T 버퍼로 3회 세척하였다. 이후 Goat anti-mouse IgG peroxidase-conjugate 항체를 1:3000으로 희석하여 다시 각 well에 100ul씩 분주하고 25℃에서 2시간 동안 반응을 수행하였다. 2차 항체 반응 이후 TBS-T buffer로 5회 세척 후 테트라메틸벤지딘 (tetramethylbenzidine, TMB) 50ul를 첨가하여 발색 반응이 나타나면 Stop solution (1N H2SO4)을 첨가하여 반응을 종료시키고 450 nm 파장에서 광학 밀도 (Optical density, OD) 값을 측정하였다.

도 6a 내지 6e에 상기 간접적 ELISA 결과를 나타내었다.

PBS로 침지를 수행한 대조군에 비해 IMS-5V (booster) 그룹의 경우 모든 항원에서 항체가가 유의적으로 높았으며, 부스터 백신의 접종을 하지 않은 실험군보다 부스터 백신을 접종한 실험군에서의 항체가 더 높게 나타난 것을 확인하였다.

따라서, 초기 백신 접종 후 부스터 백신을 접종한 넙치에서 모두 높은 항체가를 나타내었는 바, 다가 백신 내에서 문제되는 항원간의 간섭현상 없이 모든 병원체에 대한 항체 형성이 이루어졌음이 확인되었다.

5-3. 약리 작용의 확인

상기 시험 백신의 효과 확인을 위해 상기 실시예 5-1의 방법으로 제조된 시험 백신을 침지하여 넙치에 접종하고, 접종일로부터 1달 후에 각 병원균에 대한 감염 실험을 진행하여, 누적폐사율과 상대생존율(RPS)을 확인하였다.

구체적으로, 실험군 및 대조군으로 평균 체장 4±0.5cm, 체중 약 0.5g인 넙치 450 마리를 이용하였다. 실험군으로는 상기 실시예 5-1의 방법으로 제조된 시험 백신을 투여한 그룹(IMS-5V (no booster)) 및 상기 시험 백신 투여 2주 후 부스터 백신을 추가 접종한 부스터 백신 접종 그룹(IMS-5V (booster))의 두 종류에 대해 시험을 진행하였다. 대조군에는 상기 백신을 투여하지 않고, PBS만을 침지시켜 감염 실험을 진행하였다.

각 병원균의 감염은 백신 또는 PBS의 접종일(부스터 백신을 투여한 그룹의 경우 최초 접종일)로부터 4주 후에 이루어졌으며, M. avidus JJB1403은 1E+5cell/fish, M. avidus JJC1404는 1E+5 cell/fish, T. maritimum은 6E+7 CFU/fih, V. harveyi는 8E+8 CFU/fish, 및 V. anguillarum은 2E+6 CFU/fish 의 농도로 투여해 감염시켰다.

감염일로부터 날짜의 경과에 따른 누적 폐사량을 매일 기록하였으며, 내부 장기(간 및 신장)를 분리하여 병원체를 재분리하여 병원체 감염 여부를 확인하였고, 누적 폐사량으로부터 하기의 수학식 1의 방법으로 상대생존율(RPS, %)을 계산하였다.

[수학식 1]

도 7a 내지 도 7e에 각 병원균 감염에 따른 시험군 및 대조군의 누적 폐사율 그래프를 타내었으며 표 5에 기준일 기준 누적폐사사율 및 상대생존율을 나타내었다. 보다 구체적으로, 상기"기준일"은 수산용 동물용의약품 검정 기준에 따른 상대생존율 산정의 기준이 되는 날짜를 의미하며, "기준일 폐사율"은 각 그룹의 기준일에 측정된 실험군 및 대조군의 폐사율, 기준일 상대생존율은 기준일의 폐사율 수치를 이용하여 계산된 상대 생존율(RPS)이다.

병원체	접종 백신	기준일 누적폐사율	기준일 상대생존율
M. avidus JJB 1403	Control	70%	-
	IMS-5V (no booster)	55%	21%
	IMS-5V (booster)	35%	50%
M. avidus JJC 1404	Control	70%	-
	IMS-5V (no booster)	55%	21%
	IMS-5V (booster)	40%	43%
T. maritimum	Control	75%	-
	IMS-5V (no booster)	70%	7%
	IMS-5V (booster)	35%	53%
V. harveyi	Control	60%	-
	IMS-5V (no booster)	45%	25%
	IMS-5V (booster)	30%	50%
V. anguillarum	Control	85%	-
	IMS-5V (no booster)	75%	12%
	IMS-5V (booster)	50%	41%

상기 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군의 누적 폐사율이 60% 이상으로 측정된 기준일에서의 접종군의 상대생존율을 비교한 결과, 부스터 백신을 처리한 백신 접종 그룹에서 모두 상대생존율이 40% 이상으로 높게 나타나, 백신 비접종 그룹과 비교해 각 병원체(항원)에 대한 방어력이 상승되었음을 확인하였다. 따라서 상기 시험 백신이 각 항원에 대해 효능을 가짐을 알 수 있다.

<110> Jeju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Pentavalent vaccine composition for preventing disease in fish and manufacturing method thereof <130> DPP20192127KR <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M. avidus Cox-1 forward primer <400> 1 ggttctaaag atgtggctta ccctagac 28 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M. avidus Cox-1 reverse primer <400> 2 cataccaggc atacataaag tacgtcttgt 30 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T. maritimum 16s rRNA MAR1 forward <400> 3 aatggcatcg ttttaaa 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T. maritimum 16s rRNA MAR1 reverse <400> 4 cgctctctgt tgccaga 17 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V. harveyi toxR AY247418 forward primer <400> 5 ttctgaagca gcactcac 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V. harveyi toxR AY247418 reverse primer <400> 6 tcgactggtg aagactca 18 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V. anguillarum groESL forward primer <400> 7 tatcactgtt gaagaaggtc aagcactg 28 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V. anguillarum groESL reverse primer <400> 8 cgcttcaagt gcaggaagca g 21 <210> 9 <211> 597 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M.avidus serotype 2 Cox-1 <400> 9 ggttctaaag atgtggctta ccctagacta aatagtatag gtttttgaat tcaaccttgt 60 ggttttattt tagtatctaa aatagcattt ttaaggccac aatactgaag atactatgat 120 aaagcttctt actattttcc tttacttgat aaaagtaata atagaacatt taacgaattt 180 aataacacta ataacatttt tcagtttaga gcattacaaa ggtatgcttt agacgaacat 240 acgctatttt gaaaacctaa actaacaaat aaatatacaa attatgaaaa ttattctgga 300 attcctttaa aattattatt ttgaaaagat attattaact acccagaatc tttttgatac 360 gttgtaagtc gtattaataa agtacgtaga aaaaaagtat attttactaa atgttctaac 420 agaaccttaa ctacagctgg ttgaactttt attacaccat ttgcatcaaa tgtaaaatat 480 acaggtattg gtgctcaaga tttactatta gtatcagttg tttttgctgg tattagttct 540 acagtatcgt ttacaaattt attaattaca agacgtactt tatgtatgcc tggtatg 597 <210> 10 <211> 598 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M.avidus serotype 1 Cox-1 <400> 10 ggttctaaag atgtggctta ccctagacta aatagtatag gtttttgaat tcaaccttgt 60 ggttttattt tagtatctaa aatagcattt ttaaggccac aatactgaag atactacgat 120 aaagcttctt actattttcc tttacttgat aaaagtaata acagagtatt taacgaattt 180 aataacacta ataacatttt tcagtttagg gcattacaaa ggtatgcttt agacgaacat 240 acactatttt gaaaacctaa actaacaaat aaatatacaa attatgaaaa ttattctgga 300 attcctttaa aattattatt ttgaaaagat attattaact acccagaatc tttttgatac 360 gttgtgagtc gtattaataa agtacgaaga aaaaaagtat actttactaa atgttctaac 420 agaaccttaa ctacagctgg ttgaactttt attacaccat tcgcatcaaa tgtaaaatat 480 acaggtattg gtgctcaaga tttactatta gtatcagttg tttttgctgg tattagttct 540 acagtatcgt tcacaaattt attaattaca aagacgtact ttatgtatgc ctggtatg 598 <210> 11 <211> 1079 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T. maritimum sequencing result <400> 11 aatggcatcg ttttaaagtt aaagatttat cggtagaaga tgactatgcg tcctattagc 60 tagatggtaa ggtaacggct taccatggca acgataggta ggggtcctga gagggagatc 120 cccccccact ggtactgaga cacggaccag actcctacgg gaggcagcag tgaggaatat 180 tgggcaatgg aggcaactct gacccagcca tgccgcgtgc aggaagactg ccctatgggt 240 tgtaaactgc ttttatacag gaagaaacgt acctacgagt aggtatttga cggtactgta 300 agaataagga ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg tccgagcgtt 360 atccggaatc attgggttta aagggtccgc aggcggtcga ttaagtcaga ggtgaaatcc 420 catagcttaa ctatggaact gcctttgata ctggttgact tgagtgatac ggaagtagat 480 agaatatgta gtgtagcggt gaaatgcata gatattacat agaataccga ttgcgaaggc 540 agtctactac gtatttactg acgctcatgg acgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga 600 taccctggta gtccacgccg taaacgatgg acactagttg ttgggaaata tctcagtgac 660 taagcgaaag tgataagtgt cccacctggg gagtacgatc gcaagattga aactcaaagg 720 aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatga tacgcgagga 780 accttaccag ggcttaaatg tggaatgaca gggctagaga tagctttttc 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gtgttaatgc taaccaaccc 240 tgcagaatca caatttcgtc aaattggtga atatcacaac gtgccagtga tgacaccgat 300 caaccaccct caattaaaca attggctgcc gtccattgag caatgcgttc aacgctatgt 360 tgaacaccat gctgctgagt cttcaccagt cga 393

Claims

미아미엔시스 아비두스(Miamiensis avidus) 혈청형 2(serotype 2), 미아미엔시스 아비두스(Miamiensis avidus) 혈청형 1(serotype 1), 테나시바쿨럼 마리티멈 (Tenacibaculum maritimum), 비브리오 하베이이 (Vibrio harveyi) 및 비브리오 앙구일라럼 (Vibrio anguillarum)의 불활성화 균체와 몬타나이드 IMS1312 VG를 포함하고, 5초 내지 3분 동안 침지법으로 2회 차 이상 투여되는 것을 특징으로 하는, 어류의 스쿠티카증, 비브리오병 및 활주세균병으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 예방용 침지 백신 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 스쿠티카증은 미아미엔시스 아비두스(Miamiensis avidus) 혈청형 2(serotype 2) 및 미아미엔시스 아비두스(Miamiensis avidus) 혈청형 1(serotype 1)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 기생충에 의해 발병하는 것인, 침지 백신 조성물.
제1항에 있어서, 상기 비브리오병은 비브리오 하베이이 (Vibrio harveyi), 및 비브리오 앙구일라럼 (Vibrio anguillarum)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세균에 의해 발병하는 것인, 침지 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 미아미엔시스 아비두스 혈청형 2는 1.0X10⁴ 내지 2.5X10⁵ cell/ml;
상기 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1은 1.0X10⁴ 내지 2.5X10⁵ cell/ml;
상기 테나시바쿨럼 마리티멈은, 1X10⁷ 내지 1X10⁹ CFU/ml;
상기 비브리오 하베이이는, 5X10⁷ 내지 5X10⁸ CFU/ml 및
상기 비브리오 앙구일라럼은 5X10⁷ 내지 5X10⁸ CFU/ml의 농도로 포함되는 것인, 침지 백신 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 어류는 조피볼락(우럭)류, 넙치류, 참돔류, 돔류, 숭어류, 부세류, 및 농어류로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 양식어류인, 침지 백신 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 투여된 어류는, 기준일이 대조군의 누적 폐사율이 60% 이상일 때,
미아미엔시스 아비두스 혈청형 2 항원에 대한 상대생존율(RPS)이 50% 이상,
미아미엔시스 아비두스 혈청형 1 항원에 대한 상대생존율(RPS)이 43% 이상,
테나시바쿨럼 마리티멈 항원에 대한 상대생존율(RPS)이 53% 이상,
비브리오 하베이이 항원에 대한 상대생존율(RPS)이 50% 이상, 또는
비브리오 앙구일라럼 항원에 대한 상대생존율(RPS)이 41% 이상이고, 상기 상대생존율(RPS)은 하기의 수학식 1의 방법으로 계산되는 것인, 침지 백신 조성물:
[수학식 1]

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제1항의 침지 백신 조성물을 5초 내지 3분 동안 침지법으로 2회 차 이상 어류에 투여하는 단계를 포함하는, 어류의 스쿠티카증, 비브리오병 및 활주세균병으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 예방 방법.
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