KR101717281B1 - 스쿠티카증에 대한 어류 복합 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미아미엔시스 아비두스(Miamiensis avidus) 혈청형 2 및 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 어류 기생충 병원체의 불활성화 균체; 및 테나시바쿨럼 마리티멈(Tenacibaculum maritimum)을 포함하는 세균성 어류 병원체의 불활성화 균체를 유효성분으로 포함하는 어류의 질병 예방용 백신 조성물로서, 다가 백신으로서 낮은 농도로도 양식 어류의 질병 예방 효과를 높일 수 있다.

Description

스쿠티카증에 대한 어류 복합 백신 조성물 {Composite Vaccine Composition For Preventing Scuticociliatosis in Fish}

본 발명은 어류용 백신 조성물, 더욱 자세하게는 어류 병원균에 대한 예방용 백신 조성물 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

어류는 여러 가지 질병에 감염될 가능성이 높은데, 특히 어류 양식산업에서 가장 문제가 되고 있는 대표적인 질병으로, 스쿠티카증 및 세균성 질병인 연쇄구균증, 비브리오증, 활주세균증 등이 있다. 어류의 질병의 치료에 대하여 종래에는 항생제를 사료와 함께 양식탱크에 투입하여 어류에 경구 투여되도록 함으로써 치료하여왔으나, 이러한 방법은 조기 치료 시에는 효과가 높지만, 병원균이 장관 내에 정착하여 증식하고 반복적으로 발생하여 치료가 잘 되지 않으며, 다양한 항생제의 사용은 대량의 다제내성 병원체를 양산할 가능성이 높은 단점이 있다.

구체적으로 상기 스쿠티카증을 일으키는 것으로 섬모충류(ciliate)로서 수족관의 놀래기에 감염되는 Uronema marinum, 대서양의 연어에 기생하는 Tetrahymena sp., 호주에서 양식하는 Southern bluefin tuna에 기생하는 U. nigricans, 지중해 연안의 농어와 스페인 북부 연안에서 양식하는 터봇에 기생하는 Miamiensis avidus 등 다양한 어종에 많은 종류의 스쿠티카 감염사례가 보고되고 있다. 스쿠티카증은 양식어류의 치어에서부터 성어에 이르기까지 광범위하게 발생하며, 일단 스쿠티카증이 발생하면 곧바로 대량 폐사를 유발할 뿐 아니라 각종 주요 세균성 질병을 간접적으로 유도함으로써 양식어류의 생산성에 심각한 피해를 초래하는 섬모충성 질병이다. 일단 스쿠티카증이 발생하면 곧바로 대량 폐사를 유발할 뿐 아니라 각종 주요 세균성 질병을 간접적으로 유도함으로써 양식어류의 생산성에 심각한 피해를 초래한다.

활주세균증은 돔류, 넙치 및 복어와 가자미 치어 등에 발생함으로써 해산어 종묘생산장에서 중요한 세균성 질병 원인균으로 알려져있다. 원인체인 Tenacibaculum maritimum은 초기 Flexibacter maritimus로 불리웠으며, 그람 음성 장간균으로 증식적정온도는 15~20℃정도이다. 활주세균증에 감염되면 넙치의 체표면이 회색으로 변하거나 원형의 상처, 궤양이 관찰되며 지느러미가 부식되면서 골격만이 남는다. 아가미가 부식된 넙치는 체색이 검어지고 힘없이 떠다니는 현상을 보인다.

국내 양식넙치에서 다양한 세균성 질병이 성장단계별, 계절별로 지속적으로 발병하여 높은 폐사율을 보여 계획적인 생산이 어렵고 양식어가의 경영합리화에 문제점을 주고 있다.

상기 어류의 질병과 관련하여 지금까지 항생제와 항균제의 과도한 사용은 원인균의 내성 획득으로 이어져, 질병의 구제를 점차 어렵게 만들고 있으며, 어류 내에 화학물질이 축적되어 인체에도 악영향을 미치고, 환경오염까지 초래하게 되는 문제점이 있다. 양식어류에 발병하는 기생충성 질병에 대해서는 화학약제 및 올리고키토산 등이 사용되고 있으나 이러한 약제의 반복적인 사용은 어류의 스트레스로 이어져 성장을 더디게 만들며 기생충 구제에 대한 효과도 극히 낮지만 이를 대체할 방법이 없는 실정이다.

본 발명은 어류용 백신 조성물로서, 어류 기생충 병원체로서 미아미엔시스 아비두스(Miamiensis avidus)의 혈청형 특이적 병원체의 불활성화 균체를 유효성분으로 포함하여 혈청형 특이적 백신 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 혈청형 특이적 병원체의 불활성화 균체와 및 테나시바쿨럼 마리티멈(Tenacibaculum maritimum)의 불활성화 균체를 유효성분으로 포함하여, 낮은 농도의 항원을 사용하면서도 항원 효과가 우수한 백신 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

이에 본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위하여, 어류에서 발생하는 세균성 또는 기생충성 질병의 병원체의 불활성화 균체를 유효성분으로 포함하는 다가 백신 조성물을 개발하였다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는 미아미엔시스 아비두스(Miamiensis avidus)의 혈청형 특이적 병원체의 불활성화를 유효성분으로 포함하는, 어류의 질병 예방용 백신 조성물 관한 것이다. 바람직하게는 미아미엔시스 아비두스 혈청형은 미아미엔시스 아비두스 혈청형 2(serotype 2) 및/또는 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1(serotype 1)일 수 있다.

상기 병원체는 Cox-1 유전자 서열에서 특징적이며, 예를 들어, 상기 백신 조성물에서 미아미엔시스 아비두스 혈청형 2의 Cox-1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1의 Cox-1 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이다.

상기 조성물은 유효성분으로서 테나시바쿨럼 마리티멈(Tenacibaculum maritimum)의 불활성화 균체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 테나시바쿨럼 마리티멈의 16S ribosomal RNA 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

예를 들어 상기 미아미엔시스 아비두스 혈청형 2는 미아미엔시스 아비두스JJB1403일 수 있으며, 상기 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1은 미아미엔시스 아비두스 JJC1404일 수 있다.

상기 미아미엔시스 아비두스는 스쿠티카증의 원인균으로서, Pseudocohnilembus persalinus, Pseudo- cohnilembus hargisi와 U. marinum에 비하여 넙치 치어에 대해 강한 병원성을 가지고 있으며 아가미, 체표와 지느러미에 기생하여 조직이 붕괴되며, 증상이 진행되면 근육이 노출되고 뇌와 각종 내장 기관에까지 침투하여 조직의 괴사를 일으킬 수 있다.

넙치의 항 혈청에 따른 aggulatination assay 또는 western blot을 통해 스쿠티카의 혈청형(serotype)에 따라 반응하는 항원이 다른 것이 확인되어 Cox-1 type 2 는 혈청형 1, Cox-1 type 1은 혈청형 2로서 각기 다른 혈청형을 나타낸다(Song et al., J Fish Dis 32(12) (2009) 1027-34). 미아미엔시스 아비두스 JJB1403 및 미아미엔시스 아비두스 JJC1404는 Cox 유전자 서열에 따라 분류된 strain으로서 Cox-1 type 1을 JJB1403으로, Cox-1 type 2를 JJC1404로 명명한 것이다(Jung, et al., Parasitol Res 108(5) (2011) 1153-61). 본 발명은 혈청형 1과 혈청형 2인 스쿠티카에 대한 넙치의 방어능이 다르고, 이는 백신효과에도 영향을 준다는 것을 확인하였다.

상기 테나시바쿨럼 마리티멈는 활주세균증의 원인체로서, 초기 Flexibacter maritimus로 불리웠으며, 그람 음성 장간균으로 증식적정온도는 15~20℃정도이다. 활주세균증에 감염되면 넙치의 체표면이 회색으로 변하거나 원형의 상처, 궤양이 관찰되며 지느러미가 부식되면서 골격만이 남는다. 아가미가 부식된 넙치는 체색이 검어지고 힘없이 떠다니는 현상을 보인다.

본원발명의 백신 조성물은 종래 비브리오 하베이(Vibrio harveyi), 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae), 테나시바쿨럼 마리티멈(Tenacibaculum maritimum), 및 미아미엔시스 아비두스(Miamiensis avidus)의 어류 병원체의 불활성화 균체를 유효성분으로 포함하는 어류 백신 조성물에 비하여 적은 함량 또는 낮은 농도에서도 더욱 우수한 면역원성이 있어 높은 백신 효과가 있다. 또한 미아미엔시스 아비두스의 두가지 혈청형 1 및 혈청형 2가 병원성이나 모양이 비슷하나, 각각 교차 방어가 불가능하다는 문제점이 있으나, 본 발명의 백신 조성물은 미아미엔시스 아비두스 혈청형 2(serotype 2) 및 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1(serotype 1) 모두에 대한 백신 효과가 있어 혈청형 2: 혈청형 1이 약 50:50의 비율로 존재하는 양식 현장에서 유용한 백신 조성물로서 사용될 수 있다.

이에 따라 본 발명에 따른 어류의 질병 예방용 백신 조성물이 적용되는 질병은, 미아미엔시스 아비두스 및 테나시바쿨럼 마리티멈으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상에 의하여 발생하는 것일 수 있다. 상기 질병은 바람직하게는 스쿠티카증 및/또는 활주세균증일 수 있으나, 상기 병원체에 의해 발병할 수 있는 질병이라면 이에 한정되지 않는다. 이에 따라 예를 들어, 상기 조성물은 미아미엔시스 아비두스 혈청형 2에 의해 발생하는 질병을 예방하는 미아미엔시스 아비두스 혈청형 2 특이적 병원체의 불활성화 균체 및 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1에 의해 발생하는 질병을 예방하는 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1 특이적 병원체의 불활성화 균체를 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 효능은 상대생존률(RPS) 및 항체가를 측정하였다. 상기 상대생존률은 아래 식으로 결정하였다:

[수학식 1]

본 발명에 따른 백신 조성물이 적용되는 어류는 넙치, 농어, 송어, 우럭 및 돔류로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 어류일 수 있으며, 바람직하게는 상기 어류는 넙치일 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물에 포함되는 세균성 또는 기생충성 질병의 병원체의 불활성화 균체의 함량은 적용 대상 어류 및 병원체에 따라 적절히 조절하여 설정할 수 있다.

예를 들면, 상기 백신 조성물에서 상기 불활성화 균체가 어류 1 마리당 주입되는 함량은, 미아미엔시스 아비두스 혈청형 2의 불활성화 균체를 1×10⁴ 내지 1×10⁶ /fish, 바람직하게는 1×10⁵ 내지 1×10⁶ CFU/fish 의 농도, 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1의 불활성화 균체를 1×10⁴ 내지 1×10⁶/fish, 바람직하게는 1×10⁵ 내지1×10⁶/fish 의 농도, 또는 테나시바쿨럼 마리티멈의 불활성화 균체를 1×10⁶ 내지 1×10¹⁰CFU/fish, 바람직하게는 1×10⁷ 내지 1×10¹⁰CFU/fish, 더욱 바람직하게는 1×10⁷ 내지 1×10⁹CFU/fish 의 농도로 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 상기 어류에서 발생하는 세균성 또는 기생충성 질병 병원체의 불활성화 균체 및 완충액을 포함할 수 있으며, 불활성화 균체는 포르말린 처리 방법, 열처리 방법 또는 동결처리 방법 등으로 제조될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

아울러, 본 발명의 백신 조성물은 면역 보조제 또는 면역 증강제를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 상기 면역 보조제 또는 면역 증강제는 스쿠알렌 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.

상기 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제, 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르계 비이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제 및 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜계 비이온성 계면활성제로 구성된 그룹으로부터 선택된 1 이상일 수 있다. 예를 들어 상기 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제는 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 80 및 트윈 85로 이루어진 군에서 선택된 1 이상, 바람직하게는 트윈 80일 수 있다. 또한, 상기 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제로서 스판 20, 스판 40, 스판 60, 스판 80 및 스판 85로 이루어진 군에서 선택된 1 이상, 바람직하게는 스판 85일 수 있다.

상기 백신 조성물 100(v/v)%를 기준으로 상기 스쿠알렌을 0.1 내지 20(v/v)%, 바람직하게는 1 내지 10(v/v)%로 포함할 수 있다.

또한, 상기 백신 조성물 100(w/v)%를 기준으로 상기 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제를 0.01 내지 10(w/v)%, 바람직하게는 0.1 내지 1 (w/v)%로 포함할 수 있고, 상기 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제를 0.01 내지 10 (w/v)%, 바람직하게는 0.1 내지 1 (w/v)%로 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 특히 상기 면역 보조제를 추가로 포함하여 백신 효과가 우수하며, 특히 면역 효과가 우수한 면역 보조제의 조합을 도출하였다.

본 발명 조성물의 바람직한 예로서, 본 발명은 미아미엔시스 아비두스 혈청형은 미아미엔시스 아비두스 혈청형 2(serotype 2), 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1(serotype 1) 및 테나시바쿨럼 마리티멈의 불활성화 균체 및 면역 보조제로서 스쿠알렌, 트윈 80, 및 스판 85를 포함하는 어류의 질병 예방용 백신 조성물을 포함하며, 바람직하게는 상기 스쿠알렌을 0.1 내지 20 (w/v)%로, 상기 트윈 80을 0.01 내지 10 (w/v)%로, 및 상기 스판 85를 0.01 내지 10 (w/v)%로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 부형제 및/또는 안정화제 등의 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들면 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 백신 조성물은 주사 투여 가능하며, 바람직하게는 복강 주사, 근육주사, 또는 침지법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 어류에 발생하는 질병의 병원체를 항원으로 하는 다가 백신의 제조방법을 제공한다:

L-15 레이보비츠(Leibovitz) 배지에서 자란 Farthead minnow 세포를 사용하여 미아미엔시스 아비두스 혈청형 2 및 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 배양한 후 분리하여 불활성화시키는 단계; 및 테나시바쿨럼 마리티멈의 세균을 배양하고 상기 세균을 불활성화 시키는 단계.

상기 백신 조성물에 관한 사항은 백신 조성물의 제조 방법에 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 백신의 제조방법은, 바람직하게는, 상기 미아미엔시스 아비두스 혈청형 2 및 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 기생충을 배양하는 단계를 수행하기 전에, 기생충 배양용 배지에서 12 내지 24시간 동안 전배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 불활성화 단계는 동결처리 또는 포르말린 처리 방법에 의할 수 있으며, 상기 동결 처리 방법은 -80 내지 0℃에서 수행될 수 있으며, 상기 포르말린 처리 방법은 2%로 4℃에서 2시간 이상 처리할 수 있다.

상기 세균을 배양하는 단계에서 사용되는 세균 배양용 배지는 각 배양 대상 세균에 따라 적절히 선택하여 수행할 수 있으며 구체적 배양 조건은 알려진 배양 조건에서 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 테나시바쿨럼 마리티멈은 Marine medium 의 배지에서 배양할 수 있다.

상기 세균 배양물을 불활성화시키는 단계는, 포르말린 처리 방법 또는 열처리 방법에 의하여 수행될 수 있으며, 바람직하게는 포르말린 처리 방법으로 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 기생충은 동결처리 또는 포르말린 처리 방법에 의하여 불활성화 처리할 수 있으며, 세균은 열처리 또는 포르말린 처리 방법에 의하여 불활성화 처리할 수 있다.

본 발명의 어류의 질병 예방용 백신 조성물은 어류, 특히 넙치에 발생하는 세균성, 기생충성 질병의 병원체를 항원으로 하는 다가 백신으로서, 종래 백신에 비하여 적은 함량 또는 낮은 농도에서도 우수한 백신 효과가 있을 뿐 아니라 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1 및/또는 혈청형 2에 의해 발생하는 질병을 모두 예방할 수 있어 어류 질환 백신으로서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 Miamiensis avidus JJB1403, Miamiensis avidus JJC1404 및 Tenacibaculum maritimum을 PCR한 후 전기영동한 결과이다.
도 2는 Miamiensis avidus JJB1403의 Cox-1 유전자, Miamiensis avidus JJC1404의 Cox-1 유전자 및 Tenacibaculum maritimum의 16S ribosomal RNA 유전자서열에서 특이적인 염기서열을 분석하여 확인한 결과이다.
도 3은 M. avidus JJC1404에 대한 넙치의 항체가 측정결과이다.
도 4는 M. avidus JJB1403에 대한 넙치의 항체가 측정결과이다.
도 5는 T. maritimum에 대한 넙치의 항체가 측정결과이다.
도 6a 및 도 6b는 각각 2회에 걸친 본원발명 백신 조성물의 백신 효능 검증에서 M. avidus JJB1403 감염 실험 결과이다.
도 7a 및 도 7b는 각각 2회에 걸친 본원발명 백신 조성물의 백신 효능 검증에서 M. avidus JJC1404 감염 실험 결과이다.
도 8a 및 도 8b는 각각 2회에 걸친 본원발명 백신 조성물의 백신 효능 검증에서 T. maritimum 감염 실험 결과이다.
도 9a 내지 도 9c는 각각 항원량에 따른 M. avidus JJB1403, M. avidus JJC1404 및 T. maritimum의 감염 실험 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 균주 분리

스쿠티카 Miamiensis avidus JJB1403 및 Miamiensis avidus JJC1404 섬모충은 2014년 제주도 내 지역 양식장으로부터 얻은 감염된 넙치의 뇌 조직으로부터 무균상태에서 분리하였다. 스쿠티카 섬모충은 항생제 용액 (100 units mL-1 of penicillin G, 0.1 mg of streptomycin sulphate; Sigma)과 5% fetal bovine serum (FBS)를 넣은 L-15 Leibovitz 배지에서 충분히 자란 fathead minnow (FHM) 세포를 사용하여 20℃에서 배양하였다.

병원성 세균주 (Tenacibaculum maritimum)는 병원성 세균에 감염된 증상을 보이는 넙치의 간과 신장으로부터 Marine broth agar(MA) 배지 백금봉으로 도말하고 25℃에서 배양하였고 단일 집락을 순수분리하였다.

실시예 2. 균주 동정

2-1. 중합효소 연쇄 반응에 의한 균주 동정

상기 균을 동정하기 위해 각각의 병원체에 맞는 하기 표 1의 프라이머 쌍을 사용하여 polymerase chain reaction(PCR)을 통하여 동정하였다. PCR 수행조건은 M. avidus 2종 (strain name: JJB1403, JJC1404)의 경우 95℃ 에서 5분간 변성 후 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 주기로 35회 반복 후 최종 72℃ 에서 7분간 확장하였고 T. maritimum의 경우 95℃에서 5분간 변성 후 95℃에서 30초, 45℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 주기로 35회 반복 후 최종 72℃에서 7분간 확장하여 유전자를 증폭하였다. 이때 사용된 중합효소는 TaKaRa Ex Taq®(TaKaRa, Japan)을 사용하였다. 상기 PCR 결과를 도 1에 나타내었다.

서열번호	명칭	서열	길이(mer)	증폭 산물 크기(bp)
4	M. avidus Cox-1 정방향 프라이머	GGTTCTAAAGATGTGGCTTACCCTAGAC	18	597
5	M. avidus Cox-1 역방향 프라이머	CATACCAGGCATACATAAAGTACGTCTTGT	18	597
6	T. maritimum 16s rRNA MAR1 정방향 프라이머	AATGGCATCGTTTTAAA	20	1088
7	T. maritimum 16s rRNA MAR2 역방향 프라이머	CGCTCTCTGTTGCCAGA	21	1088

2-2. 염기서열 분석에 의한 균주 동정

스쿠티카 strain의 경우 PCR후 전기영동 사진에서는 구별이 불가능하여 Cox-1 유전자의 서열에서 특이적인 염기서열을 통하여 확인하였다.

구체적으로, 증폭된 유전자 산물은 pMD20-T vector(Takara, Japan)에 삽입하여 재조합 DNA를 만든 후 DH5α에 heat shock 방법을 통하여 형질전환하였다. 미국국립생물공학정보센터 (NCBI, National Center for Biotechnology Information)의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)을 사용하여 염기서열을 분석하였고 그후 재조합 DNA를 추출하여 Macrogen사(한국)에 의뢰하여 염기서열을 확인하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었으며, M. avidus JJB1403의 경우 Miamiensis avidus strain Nakajima cytochrome oxidase subunit I gene, partial cds; mitochondrial (Accession NO. EU831226), Miamiensis avidus strain WD4 cytochrome oxidase subunit I gene, partial cds; mitochondrial (Accession NO. EU831213), M. avidus JJC1404의 경우 Miamiensis avidus strain SJF-03B cytochrome oxidase subunit I gene, partial cds; mitochondrial (Accession NO. EU831216), Miamiensis avidus strain Iyo-1 cytochrome oxidase subunit I gene, partial cds; mitochondrial (Accession NO. EU831227), T. maritimum의 경우 Tenacibaculum maritimum strain FL-65 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (Accession NO. KJ651994.1), Tenacibaculum maritimum strain FL-41 16S ribosomal RNA gene, partial sequence(Accession NO. KJ651992.1)로 모두 99%의 identity를 확인할 수 있었다. 또한 아래 표 2와 같이 스쿠티카 M. avidus strain에 따른 Cox-1 유전자 서열상의 특이적인 염기서열을 찾아 확인하였다

Cox-1 유전자 염기서열	JJB1403	JJC1404
117번 염기	Tymine (T)	Cytosine (C)
162번 염기	Tymine (T)	Cytosine (C)
166번 염기	Adenine (A)	Guanine (G)
167번 염기	Cytosine (C)	Tymine (T)
210번 염기	Adenine (A)	Guanine (G)
243번 염기	Guanine (G)	Adenine (A)

실시예 3. 스쿠티카 섬모충 2종(stain name: JJB1403, JJC1404)와 박테리아 및 면역보조제를 포함하는 백신 제조

3-1. 스쿠티카 섬모충의 불활성화

실시예 1의 스쿠티카 섬모충은 항생제 용액 (100 units mL-1 of penicillin G, 0.1 mg of streptomycin sulphate; Sigma)과 5% fetal bovine serum (FBS)를 넣은 L-15 Leibovitz 배지에서 충분히 자란 fathead minnow (FHM) 세포를 사용하여 20℃에서 배양하였다. 성장이 최대가 된 스쿠티카를 포르말린을 최종 농도가 1%가 되도록 넣고 불활성화하였다. 그 후 1000 x g에서 20분간 원심분리하여 불활성화된 스쿠티카를 모았고 인산완충용액(PBS)으로 3회 세척한 후 스쿠티카 섬모충의 수를혈구계산판을 사용하여 측정하고 -80℃에 보관하였다.

3-2 테나시바쿨럼 마리티멈 세균의 불활성화

실시예 1의 테나시바쿨럼 마리티멈 군을 Marine 배지 5ml에서 12~24h까지 교반 배양기를 사용하여 전배양을 하였고 그리고 다시 각각의 균에 Marine 배지 1000ml에서 12~24h까지 교반 배양기를 사용하여 배양하였다. 상기 균을 불활성화 하기 위해서 포르말린을 최종 농도가 0.5~2%가 되도록 넣었고 25℃에서 2시간 배양하고 4℃에서 72시간 보관하였다. 불활성화 후에 균은 4℃에서 4000g, 15분간 원심분리하여 모았고 인산완충용액(PBS)으로 4℃에서 4000×g, 15분간 3번 원심분리하여 세척하였다. 세균의 수는 600nm에서 측정한 광학밀도(optical density, OD)와 colony forming unit (CFU) 비교한 기준 그래프와 600nm에서 측정한 OD값을 통하여 측정하였다. 모든 병원체는 생균수 측정법 (viable count)에 의하여 완벽하게 불활성화된 것을 확인하였고 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

3-3. 백신 조성물 제조

불활성화 후 백신은 항원이 되는 병원성 균체인 실시예 3-1의 Miamiensis avidus JJB1403, Miamiensis avidus JJC1404, 실시예 3-2의 Tenacibaculum maritimum과 면역보조제인 tween80 (Sigma, P1754), span85 (Sigma, S7135), squalene (Sigma, S3626)을 각각의 농도에 맞게 인산완충용액(PBS)로 희석하고 이를 균질화기기를 사용하여 고르게 섞어 제조하였다.

실험구	기생충 병원체	세균성 병원체	면역보조제
Naive	-	-	-
3V-Vac	M. avidus (JJB1403), M. avidus (JJC1404)	T. maritimum	Squalene, Tween80, Span85

상기 표 3의 조성으로 백신을 제조하였으며 상기 백신에 사용한 항원의 농도는 M. avidus JJB1403 2.5×10⁵/fish, M. avidus JJC404 2.5×10⁵/fish, T. maritimum의 2×10⁸CFU/fish로 하였다.

면역보조제는 백신 조성물 전체 100 (V/V)%을 기준으로 2.5 (V/V)%의 스쿠알렌을 포함하고, 백신 조성물 전체 100 (W/V)%을 기준으로 0.25 (W/V)%의 트윈90 및 0.25(W/V)%의 스판85을 포함하였다.

또한, 비교예로서 국내등록특허 제10-1610914호의 실시예에 기재된 방법으로 제조된 백신 조성물 중 가장 백신 효과가 우수한 것으로 기재된 아래 표 4의 조성의 4가 백신 조성물을 제조하였다.

비교예 1	기생충 병원체	세균성 병원체	면역보조제
4V-Vac	M. avidus (JJB1403),	V. harveyi S. iniae T. maritimum	tween80 aluminum hydroxide gel squalene

상기 4가 백신에 사용한 M. avidus JJB1403의 농도는 5×10⁵/fish이고 T. maritimum의 경우 5×10⁸ CFU/fish, S. iniae의 경우 1×10⁹ CFU/fish, V. harveyi의경우 1×10⁹ CFU/fish로 사용하였으며, 면역 보조제는 각각 0.5 v/v%의 트윈 80, 5 w/v%의 스쿠알렌, 0.5 (w/v)%의 알루미늄 하이드록사이드 겔(stock 용액 농도 2% w/v) 및 0.05 (w/v)%의 키토산(stock 용액 농도 2% w/v)을 사용하였다.

실시예 4. 백신 효능 검증

4-1. 백신 접종

실험에 사용된 넙치는 체장이 평균 13g인 치어로 제주도 내 양식장으로부터 구매를 하였고 평균 수온 20℃의 UV 살균 처리된 지하 해수가 순환되는 수조에서 순치하였고 시판되는 상업용 배합사료를 1일 2회씩 공급하였다.

백신을 주사하기 전에 넙치를 적어도 24시간 동안 절식하였다. 대조구(2수조, 각 수조당 150미)는 백신은 접종하지 않았고 실험구인 3V-Vac의 넙치에 상기 실시예 3-3의 백신을 주사하였다. 주사는 자동 주사기(automatic self-refilling syringe, Socorex, Swiss)를 사용하여 백신을 0.1ml씩 넙치의 복강에 주사하였다.

4-2. 항체가 측정

항체가 측정을 하기 위하여 백신을 접종하지 않은 대조구인 Naive와 백신을 접종한 실험구인 3V-Vac의 넙치의 혈액을 0주, 2주, 4주에 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액은 4℃에서 24시간 보관 후 원심분리(1000g, 10분, 4℃)를 하여 혈청을 분리하였으며 다음 아래와 같이 실험을 진행하였다.

Indirect ELISA 실험을 통한 백신의 항체가 확인 실험은 다음과 같이 진행하였다. 먼저 병원체의 농도를 M. avidus JJB1403의 경우 1×10⁷/ml, M. avidus의 경우 JJC1404 1×10⁷/ml, T. maritimum의 경우 1×10⁸ CFU/ml로 인산완충용액(PBS)을 넣어 맞추었다. 그 후 각 항원은 coating buffer (100mM sodium Bicarbonate/ sodium carbonate, pH 9.6)를 사용하여 10배 희석하고 96-well plate의 각 well에 100ul씩 처리 후 4℃에서 15~16시간 동안 처리한다. 항원이 plate에 고정이 완료되고 coating buffer을 제거하고 TBS-T buffer(20mM Tris, 137mM NaCl, 0.1% tween20, pH7.7)로 1회 세척한다. 세척이 끝나고 2 % skim milk/TBS-T buffer를 200 ㎕씩 첨가하여 4℃ 에서 1시간 동안 반응시켜 비특이적인 신호가 나오지 않도록 blocking을 진행하였다. 그 후 백신이 처리되지 않은 대조구(naive)에서 넙치의 혈청과 백신이 처리된 실험구(3V-Vac)의 혈청을 각각 2 % skim milk/TBS-T buffer에 10배 희석하고 각 well에 100 ul씩 처리하였으며 4℃ 에서 3시간 반응시켰다. 반응이 끝난 96-well plate는 TBS-T buffer로 3번 세척하였다. 다음 mouse anti-flounder IgM monoclonal 항체를 1:3000으로 희석하고 96-well plate의 각 well에 100 ul씩 처리하여 4℃에서 3시간 반응시켰다. 다시 TBS-T buffer로 3번 세척 후, Goat anti-mouse IgG peroxidase-conjugate 항체를 1:3000으로 희석하고 96-well plate의 각 well에 100 ul씩 처리하고 4℃에서 3시간 반응시켰다. 각 well은 TBS-T buffer로 5번 세척하고 tetramethylbenzidine (TMB) 50 ㎕를 첨가한 후, 반응액의 색이 변화가 나타나면 stop solution(1 N H2SO4)을 첨가하여 반응을 종료시키고 450 nm에서 광학밀도 (Optical density, OD) 값을 측정하였다.

그 결과를 도 3 내지 도 5에 나타내었으며, 3가 백신을 접종한 경우 0주에서는 차이가 없지만 2주 및 4주부터 3가 백신을 접종한 실험군에서 OD450 값이 백신을 접종하지 않은 대조군에 비해 증가함을 확인할 수 있었다. 이를 통해서 3가 백신의 각각의 병원체에 특이적인 항체를 생산하는 것으로 확인할 수 있었으며 또한 각각의 병원체의 항체 형성에 있어서 서로 간의 간섭이 일어나지 않은 것으로 판단된다.

4-3. 감염실험

감염실험은 백신 접종 후 적산수온 500 degree-days(1회차 실험) 및 550 degree-days(2회차 실험) 이상이 지나고 수온이 20℃로 유지되는 수조로 이동 후 실험을 진행하였다. 감염실험에서 사용된 병원체는 실시예 3-3의 3가 백신 및 비교예 1의 4가 백신 조성을 사용하였다. L-15 배지에 희석한 스쿠티카 M. avidus JJB1403 (1x10⁶/fish), L-15 배지에 희석한 스쿠티카 M. avidus JJC1404 (1x10⁶/fish), PBS에 희석한 T. maritimum (1×10⁸ CFU/fish)을 넙치의 복강에 주사하였다. 각 감염실험은 실험구 당 20미의 넙치를 무작위 선별하여 진행되었고 폐사에 따른 누적폐사량은 10 내지 13일간 매일 기록하고 최종적인 RPS를 확인하였다. 폐사의 원인을 정확히 파악하기 위해 폐사어 내부 장기로부터 병원체를 분리하여 확인하였다. 상대생존율을 아래 수학식 1의 식으로 결정하였다.

[수학식 1]

실시예 3-3의 조성에 상기 감염 실험을 동일하게 2회 실시(1회차 실험 및 2회차 실험)하였으며, 비교예 1의 4가 백신에는 1회 실시한 후 누적폐사량 결과를 표 5 및 도 6 내지 8에 나타내었다. 스쿠티카 M. avidus JJB1403와 JJC1404에서도 대조군인 Naive 그룹에 비해 50%가 폐사율이 낮고 비교예 1의 조성물 대비 약 2배로 폐사율이 개선된 것으로 확인되었다. T. maritimum에서는 폐사가 일어나지 않은 것을 확인하였다.

또한, 상대생존률 결과는 하기 표 5에 나타내었으며, 모든 병원체에서 상대생존율 80%이상 확인되었다. M. avidus JJB1403의 경우 상대생존율이 84.6%이고 M. avidus JJC1404의 경우 83.3%(1회차 실험) 또는 75%(2회차 실험)로 확인되었다. 또한 어류 주요 병원균인 T. maritimum에서는 100%(1회차 실험) 또는 94%(2회차 실험)로 확인되었고 스쿠티카 strain 2종과 T. maritimum에 대하여 높은 백신효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 특히, 비교예 1 대비 M. avidus 및 T. maritimum 모두에서 상대생존률이 현저히 개선된 것을 확인하였다.

Challenge	Vaccine groups	Mortality		RPS
		1차 실험	2차 실험	1차 실험	2차 실험
M. avidus JJB1403 (1×106/fish)	Naive	65%	65%	-	-
	3V-Vac	10%	10%	84.6%	84.6%
	비교예 1	26.7%		73.3%
M. avidus JJC1404 (1×106/fish)	Naive	60%	80%	-	-
	3V-Vac	10%	20%	83.3%	75%
	비교예 1	-		-
T. maritimum (1×108 CFU/fish)	Naive	85%	85%	-	-
	3V-Vac	0%	5%	100%	94%
	비교예 1	20.0%		80.0%

실시예 5. 농도를 달리한　3가 백신 조성물에 대한 항원성 실험

5-1. 실험 대상 어류 준비

실험에 사용된 넙치는 체장이 평균 12g인 치어로 제주도내 양식장으로부터 구매를 하였고 평균 수온 20℃의 UV 살균 처리된 지하해수가 순환되는 수조에서 순치하였고 시판되는 상업용 배합사료를 1일 2회씩 공급하였다.

5-2. 스쿠티카 섬모충의 불활성화

스쿠티카 섬모충은 항생제 용액 (100 units mL-1 of penicillin G, 0.1 mg of streptomycin sulphate; Sigma)과 5% fetal bovine serum (FBS)를 넣은 L-15 Leibovitz 배지에서 충분히 자란 fathead minnow (FHM) 세포를 사용하여 20℃에서 배양하였다. 성장이 최대가 된 스쿠티카를 포르말린을 최종 농도가 1%가 되도록 넣고 불활성화하였다. 그 후 1000 x g에서 20분간 원심분리하여 불활성화된 스쿠티카를 모았고 인산완충용액(PBS)으로 3회 세척한 후 스쿠티카 섬모충의 수를혈구계산판을 사용하여 측정하고 -80℃에 보관하였다.

5-3. 세균의 불활성화

T. maritimum은 marine 배지 5ml에서 12~24h까지 교반 배양기를 사용하여 전배양을 하였고 그리고 다시 T. maritimum은 marine 배지 1000ml에서 12~24h까지 교반 배양기를 사용하여 배양하였다. 균을 불활성화 하기 위해서 포르말린을 최종 농도가 0.5~2%가 되도록 넣었고 25℃에서 2시간 배양하고 4에서 72시간 보관하였다. 불활성화 후에 균은 4℃에서 4000g, 15분간 원심분리하여 모았고 인산완충용액(PBS)으로 4℃에서 4000g, 15분간 3번 원심분리하여 세척하였다. 세균의 수는 600nm에서 측정한 광학밀도(optical density, OD)와 colony forming unit (CFU) 비교한 기준 그래프와 600nm에서 측정한 OD값을 통하여 측정하였다. 모든 병원체는 생균수 측정법 (viable count)에 의하여 완벽하게 불활성화된 것을 확인하였고 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

5-4. 백신 접종

백신을 주사하기 전에 넙치를 적어도 24시간 동안 절식하였다. M. avidus JJB1403의 경우 대조구는 PBS를 접종하였고 실험구에는 아래 표 6의 항원량을 넙치의 복강에 주사하였다.

실험구	M. avidus JJB1403의 항원량
PBS	-
JJB1403 1+E6	1×106fish
JJB1403 5+E5	5×105/fish
JJB1403 2.5+E5	2.5×105/fish

또한 M . avidus JJC1404의 경우에도 마찬가지로 넙치의 복상에 아래 표 7의 항원량을 주사하였다.

실험구	M. avidus JJC1404의 항원량
PBS	-
JJC1404 1+E6	1×106/fish
JJC1404 5+E5	5×105/fish
JJC1404 2.5+E5	2.5×105/fish

마지막으로 T. maritimum의 경우 위와 같이 대조구는 PBS를 접종하였고 실험구에는 아래 표 8의 항원량을 넙치의 복강에 주사하였다.

실험구	T. maritimum의 항원량
PBS	-
T. maritimum 8+E8	8×108/fish
T. maritimum 2+E8	2×108/fish
T. maritimum 5+E7	5×107/fish

5-5. 감염실험

감염실험은 백신 접종후 적산수온 500 degree-days 이상이 지나고 수온이 20℃로 유지되는 수조로 이동 후 실험을 진행하였다. 감염실험에서 사용된 M. avidus JJB1403와 M. avidus JJC1404의 준비는 다음과 같이 하였다. M. avidus JJB1403 (4x10⁵/fish) 와 M. avidus JJC1404 (3x10⁵/fish)은 L-15배지에 희석하여 준비하였고 T. maritimum (2x10⁸CFU/fish)는 PBS에 희석하여 준비하였다. 준비된 병원체는 넙치의 복강에 주사하여 인위감염시켰다. 각 감염실험은 실험구 당 20미의 넙치를 무작위 선별하여 진행되었고 폐사에 따른 누적폐사량은 12일간 매일 기록하고 최종적인 RPS를 확인하였다 폐사의 원인을 정확히 파악하기 위해 폐사어 내부 장기로부터 병원체를 분리하여 확인하였다. 상대생존율은 상기 실시예 4-3의 방법으로 결정하였다.

그 결과를 도 9a 내지 9c 및 표 9에 나타내었으며, 스쿠티카 M. avidus JJB1403의 경우 PBS그룹에 비해 50%가 폐사율이 낮은 것으로 확인되었고, 항원량에 따른 상대생존율이 65%이상으로 확인되어, 이 중 2.5×10⁵/fish 의 항원량이 RPS에 따른 항원량을 고려하여 최소 항원량으로서 적합한 것으로 판단되었다. 스쿠티카 M.avidus JJC1404는 PBS그룹에 비해 50%가 폐사율이 낮고 항원량에 따른 상대생존율이 65%이상으로 2.5×10⁵/fish이 RPS 를 고려한 최소 항원량인 것으로 판단되었다. T. maritimum의 경우 PBS그룹에 비해 50%가 폐사율이 낮으며, 상대생존률이 65% 이상으로, RPS를 고려할 때 2×10⁸CFU/fish가 최소 항원량으로서 우수한 백신 효과를 나타내는 것으로 확인하였다.

감염실험	Group	Mortality(%)	RPS(%)
M. avidus JJB1403	PBS	80.0	-
	1+E6	20.0	75.0
	5+E5	25.0	68.8
	2.5+E5	20.0	75.0
M. avidus JJC1404	PBS	60.0	-
	1+E6	15.0	75.0
	5+E5	20.0	66.7
	2.5+E5	17.5	70.8
T. maritimum	PBS	85.0	-
	8+E8	7.5	91.2
	2+E8	10.0	88.2
	5+E7	32.5	61.8

<110> Jeju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composite Vaccine Composition for Preventing Scuticociliatosis in Fish <130> DPP20162795KR <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 597 <212> DNA <213> M.avidus serotype 2 Cox-1 <400> 1 ggttctaaag atgtggctta ccctagacta aatagtatag gtttttgaat tcaaccttgt 60 ggttttattt tagtatctaa aatagcattt ttaaggccac aatactgaag atactatgat 120 aaagcttctt actattttcc tttacttgat aaaagtaata atagaacatt taacgaattt 180 aataacacta ataacatttt tcagtttaga gcattacaaa ggtatgcttt agacgaacat 240 acgctatttt gaaaacctaa actaacaaat aaatatacaa attatgaaaa ttattctgga 300 attcctttaa aattattatt ttgaaaagat attattaact acccagaatc tttttgatac 360 gttgtaagtc gtattaataa agtacgtaga aaaaaagtat attttactaa atgttctaac 420 agaaccttaa ctacagctgg ttgaactttt attacaccat ttgcatcaaa tgtaaaatat 480 acaggtattg gtgctcaaga tttactatta gtatcagttg tttttgctgg tattagttct 540 acagtatcgt ttacaaattt attaattaca agacgtactt tatgtatgcc tggtatg 597 <210> 2 <211> 598 <212> DNA <213> M.avidus serotype 1 Cox-1 <400> 2 ggttctaaag atgtggctta ccctagacta aatagtatag gtttttgaat tcaaccttgt 60 ggttttattt tagtatctaa aatagcattt ttaaggccac aatactgaag atactacgat 120 aaagcttctt actattttcc tttacttgat aaaagtaata acagagtatt taacgaattt 180 aataacacta ataacatttt tcagtttagg gcattacaaa ggtatgcttt agacgaacat 240 acactatttt gaaaacctaa actaacaaat aaatatacaa attatgaaaa ttattctgga 300 attcctttaa aattattatt ttgaaaagat attattaact acccagaatc tttttgatac 360 gttgtgagtc gtattaataa agtacgaaga aaaaaagtat actttactaa atgttctaac 420 agaaccttaa ctacagctgg ttgaactttt attacaccat tcgcatcaaa tgtaaaatat 480 acaggtattg gtgctcaaga tttactatta gtatcagttg tttttgctgg tattagttct 540 acagtatcgt tcacaaattt attaattaca aagacgtact ttatgtatgc ctggtatg 598 <210> 3 <211> 1080 <212> DNA <213> T.maritimum 16S ribosomal RNA <400> 3 cgctctctgt tgccagatgg ctgctcattg tccataccat tgtagcacgt gtgtagccca 60 ggacgtaagg gccgtgatga tttgacgtca tccccacctt cctcgcggtt tgcaccggca 120 gtctcgctag agtcctcagc tttacctgct agcaactaac aataggggtt gcgctcgtta 180 taggacttaa cctgacacct cacggcacga gctgacgaca accatgcagc accttgtgaa 240 atgtccgaag aaaaagctat ctctagccct gtcattccac atttaagccc tggtaaggtt 300 cctcgcgtat catcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc 360 ctttgagttt caatcttgcg atcgtactcc ccaggtggga cacttatcac tttcgcttag 420 tcactgagat atttcccaac aactagtgtc catcgtttac ggcgtggact accagggtat 480 ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgtc catgagcgtc agtaaatacg tagtagactg 540 ccttcgcaat cggtattcta tgtaatatct atgcatttca ccgctacact acatattcta 600 tctacttccg tatcactcaa gtcaaccagt atcaaaggca gttccatagt taagctatgg 660 gatttcacct ctgacttaat cgaccgcctg cggacccttt aaacccaatg attccggata 720 acgctcggac cctccgtatt accgcggctg ctggcacgga gttagccggt ccttattctt 780 acagtaccgt caaataccta ctcgtaggta cgtttcttcc tgtataaaag cagtttacaa 840 cccatagggc agtcttcctg cacgcggcat ggctgggtca gagttgcctc cattgcccaa 900 tattcctcac tgctgcctcc cgtaggagtc tggtccgtgt ctcagtacca gtgggggggg 960 atctccctct caggacccct acctatcgtt gccatggtaa gccgttacct taccatctag 1020 ctaataggac gcatagtcat cttctaccga taaatcttta actttaaaac gatgccatta 1080 1080 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> M. avidus Cox-1 primer forward <400> 4 ggttctaaag atgtggctta ccctagac 28 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> M. avidus Cox-1 primer reverse <400> 5 cataccaggc atacataaag tacgtcttgt 30 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> T. maritimum 16s rRNA MAR1 forward primer <400> 6 aatggcatcg ttttaaa 17 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> T. maritimum 16s rRNA MAR2 reverse primer <400> 7 cgctctctgt tgccaga 17

Claims (18)

1. 미아미엔시스 아비두스(Miamiensis avidus)의 혈청형 1(serotype 1) 특이적 병원체의 불활성화 균체 및 미아미엔시스 아비두스의 혈청형 2(serotype 2) 특이적 병원체의 불활성화 균체를 유효성분으로 포함하는, 어류의 질병 예방용 백신 조성물.
2. 제1항에 있어서, 테나시바쿨럼 마리티멈(Tenacibaculum maritimum)의 불활성화 균체를 추가로 포함하는 백신 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 백신 조성물 내
   미아미엔시스 아비두스 혈청형 1의 불활성화 균체가 1×10⁴ 내지 1×10⁶ CFU/fish의 농도 또는
   미아미엔시스 아비두스 혈청형 2의 불활성화 균체가 1×10⁴ 내지 1×10⁶ CFU/fish의 농도로 어류 1 마리당 주입되도록 포함되는 것인, 백신 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 백신 조성물에서 미아미엔시스 아비두스 혈청형 2의Cox-1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1의 Cox-1 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것인, 백신 조성물.
5. 제2항에 있어서, 상기 어류의 질병은 미아미엔시스 아비두스 및 테나시바쿨럼 마리티멈으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상에 의하여 발생하는 것인, 백신 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 어류의 질병은 미아미엔시스 아비두스 혈청형 1 및 미아미엔시스 아비두스 혈청형 2로 이루어진 군에서 선택된 1 이상에 의해 발생하는 질병인 것인, 백신 조성물.
7. 제2항에 있어서, 상기 백신 조성물 내 테나시바쿨럼 마리티멈의 불활성화 균체가 1×10⁷ 내지 1×10¹⁰ CFU/fish의 농도로 어류 1 마리당 주입되도록 포함되는 것인, 백신 조성물.
8. 제1항에 있어서, 완충액 및 면역 보조제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 백신 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 면역 보조제는 스쿠알렌 및 비이온성 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 백신 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제, 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르계 비이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제 및 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜계 비이온성 계면활성제로 구성된 그룹으로부터 선택된 1 이상인 것인, 백신 조성물.
11. 제9항에 있어서, 상기 백신 조성물 100(v/v)%를 기준으로 상기 스쿠알렌을 0.1 내지 20(v/v)%으로 포함하는 것인, 백신 조성물.
12. 제10항에 있어서, 상기 백신 조성물 100(w/v)%를 기준으로
    상기 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제를 0.01 내지 10(w/v)%; 또는 상기 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제를 0.01 내지 10(w/v)%로 포함하는 것인, 백신 조성물.
13. 제12항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제는 트윈 80이고, 상기 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제는 스판 85인, 백신 조성물.
14. 제1항에 있어서, 상기 어류는 넙치, 농어, 송어, 우럭 및 돔류로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 어류인 것인, 백신 조성물.
15. L-15 레이보비츠(Leibovitz) 배지에서 자란 Fathead minnow 세포를 사용하여 미아미엔시스 아비두스의 혈청형 1(serotype 1) 특이적 병원체 및 미아미엔시스 아비두스의 혈청형 2(serotype 2) 특이적 병원체를 배양한 후 분리하여 불활성화시키는 단계를 포함하는, 어류 병원체를 이용한 어류 백신의 제조방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 불활성화된 어류 병원체에 스쿠알렌 및 비이온성 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 면역보조제를 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 면역 보조제는 완충용액를 이용하여 균질화하는 단계를 포함하는 제조방법.
18. 제15항에 있어서, 상기 불활성화시키는 단계는 동결처리 또는 포르말린 처리로 수행되는 것인 방법.

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