CN108220183B - 一株马流产沙门氏菌菌株smxj-97及其在马流产沙门氏菌疫苗中的应用 - Google Patents

一株马流产沙门氏菌菌株smxj-97及其在马流产沙门氏菌疫苗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株马流产沙门氏菌（Salmonella abortus equi）SMXJ‑97 CGMCC No.9047，具有序列表1中的16S rRNA基因序列；该菌株分离自新疆地区流产病马,细菌呈直杆状，大小为0.7~1.6μm×2.0~5μm，革兰氏染色阴性。为需氧兼性厌氧型细菌，在普通培养基上就可以生长，生长温度从25℃到40℃，最适温度37℃，pH生长范围5～9，最适PH7.4～7.6。可以发酵甘露醇，分解赖氨酸，不分解尿素，不能利用色氨酸、丙二酸盐、水杨苷，山梨醇。该菌株可用于制备马流产沙门氏菌病灭活疫苗。由该菌株制备的疫苗针对性好，成本低，安全，保护效果好。

Description

一株马流产沙门氏菌菌株SMXJ-97及其在马流产沙门氏菌疫 苗中的应用
技术领域
本发明提供的一株分离自新疆伊犁地区的马流产沙门氏菌(Salmonella abortusequi)SMXJ-97菌株CGMCC No.9047，以及该菌株在马流产沙门氏菌病的防治中制备灭活疫苗的的方法和可能的应用。
技术背景
随着经济全球化，现代马产业已经转变为以赛马、表演展览、骑乘娱乐等形式的庞大产业，这为中国马产业迎来了前所未有的发展机遇。马产业的快速发展，马的饲养日趋规模化和集约化，使马流产沙门氏菌病的危害表现得日趋明显。
马流产沙门氏菌病，又称马副伤寒，是由马流产沙门氏菌(Salmonella abortusequi)引起的一种以孕马流产为主要特征的马属动物传染病。该病极易感染初产母马和幼驹，多数怀孕母马在流产发生前，一般无明显的临床症状，突然发生流产。母马可因改变而长期或终生不妊而淘汰。因马副伤寒流产的胎儿，绝大多数都为死胎，虽然有极少数存活的胎儿，多数在几日内就会死亡，个别幸存者，也会发生关节炎、肺炎、下痢疾等死亡率很高的幼驹副伤寒病。该病感染公马时，会使公马发生睾丸炎，髯甲脓肿。
本病大多表现为散发，有时呈地方性流行。若是本病初次传入某地区，则该地区的马匹各个胎次都可能感染并发病。当存在易感性的育成马群时，发病率可达80％～90％以上，且死亡率也较高。母马由本病引起的流产率一般10％～60％，部分地区传入本病，流产率可高达90％以上。本病常在地区的幼驹有70％左右发生副伤寒病。马群中的慢性病和隐形带菌马，很难净化，随着易感马数量的增加，还可能引起下一次爆发。
该病已对造成严重经济损失，目前仍然困扰着养马业的发展。当前对该病的防治多数情况下以抗生素治疗和控制环境卫生为主，但抗生素治疗常疗效不佳。应用马流产沙门氏菌的疫苗可在一定程度上预防和减少本病的发生。国内在70年代开始用弱毒菌苗进行免疫，农业部兽药监察所在1972年培育的弱毒菌苗可对免疫马提供100％的保护。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所1978年制备的弱毒菌苗对小鼠的保护率可达83.3％，对马匹应用可使本病的年发病率有17.1％～69.3％下降到0.66％～3.2％。近年来国内在马流产沙门氏菌病的商品化的疫苗方面研究和产品极少，远远不能适应马产业快速发展的需求。此外由于不同地区流行的菌株不尽相同,不同流行株之间相互免疫能力也会有一定差异，仅用一种疫苗株很难达到有效控制不同地区该病的发生。随着当前马产业的快速发展，马的饲养日趋规模化和集约化，马流产沙门氏菌病的危害日趋严重，各地在马流产沙门氏菌病防治方面迫切需要安全高效的疫苗。为适应马养殖业的快速发展,尽快净化本病和控制该菌的发生和流行，需要采取马流产沙门氏菌病发病马匹的病料,分离当地的马流产沙门氏菌菌流行株,进行生化和分子鉴定等研究,该菌株可用于制备马流产沙门氏菌病灭活菌苗或减毒活菌苗，实现对当地马流产沙门氏菌病的有效防治。
发明目的
针对目前马业发展中和马病防控中急需解决对马流产沙门氏菌病的防治问题，本发明旨在提供一种针对性强的马流产沙门氏菌病疫苗菌株，该菌株可以被利用来制备马流产沙门氏菌灭活苗。该菌苗成本低，安全，可用于马流产沙门氏菌病的预防。
发明内容
本发明提供的马流产沙门氏菌(Salmonella abortus equi)SMXJ-97菌株，于2014年4月14日，在北京保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.9047。
1.本发明提供的马流产沙门氏菌(Salmonella abortus equi)SMXJ-97菌株CGMCCNo.9047具有以下特征：
(1)菌落特征：在MM固体培养基上长成圆形、表面光滑、突起、边缘整齐、形态大小一致的白色菌落。
(2)细胞形态特征：细菌呈现直杆状，大小为0.7～1.5μm×2.0～5μm，革兰氏染色阴性。
(3)生理生化特征：为需氧兼性厌氧型细菌，在普通培养基上就可以生长，生长温度从25℃到40℃，最适温度37℃，pH生长范围5-9，最适PH7.4～7.6。
(4)16S rRNA基因序列特征见附表1。
参照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》(第二版)，根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16S rRNA基因序列在GenBank中的搜索结果，马流产沙门氏菌(Salmonella abortus equi)SMXJ-97菌株(CGMCC No.9047)被鉴定为马流产沙门氏菌(Salmonella abortus equi)。
本发明提供的CGMCC No.9047菌株的培养基MM的组成：
Figure GDA0002778649570000031
PH＝5.1 121℃20分钟灭菌后制备而成。
2.灭活抗原的制备
将分离菌分别接种于MM培养基中，37℃、180r/min培养18～24h，加0.4％甲醛灭活36～48h。离心去上清。细菌沉淀以灭菌PBS(pH7.2,10mmol)稀释至1×107CFU/mL。与等量氟氏完全佐剂乳化后免疫家兔，3周后以同样浓度的菌与等量氟氏不完全佐剂乳化，制备免疫原。
3.无菌检验将制备的灭活抗原分别接种于绵羊鲜血琼脂平板，37℃培养24～72h，观察有无细菌生长；
4.安全性检验
将制备的灭活抗原皮下注射1.5～2.0kg体重的家兔5只,4mL/只,另取2只皮下注射生理盐水作对照,4mL/只,观察10d。
5.小鼠免疫试验
将分离菌分别接种于加有2％马血清的TM培养基中，37℃、180r/min培养18～24h，加0.4％甲醛灭活36～48h。离心去上清。细菌沉淀以灭菌PBS(pH7.2,10mmol)稀释至1×106CFU/mL。经过无菌检验和安全检验后合格的灭活菌液与等量的氟氏完全佐剂和氟氏不完全佐剂乳化制备免疫原。将制备的灭活抗原皮下注射20g体重的小鼠8只,0.5mL/只,另取相同小鼠8只,皮皮下注射生理盐水作对照,0.5mL/只,各组均在首免后3周后进行第2次免疫，2免后15d用活菌株攻击，攻击剂量为1×105CFU。
5.疫苗效价测定
在相同饲养条件下，随机选择15～20g体重的昆明白小鼠10只,皮下多点注射疫苗0.5mL/只,另取10只皮下注射生理盐水作对照,0.5mL/只,各组均在首免后3周后进行第2次免疫，15、30、45d用菌体作包被抗原，ELISA法检测抗体。
发明效果
(1)该菌株可以被利用来生产各种不同类型的马流产沙门氏菌病疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗及亚单位疫苗。该菌制备的灭活菌苗免疫免疫小鼠后的就检测结果表，经两次免疫后的血清抗体效价为1:4.9×104。
(2)本发明提供了一株分离自新疆地区的马流产沙门氏菌病病马中的马流产沙门氏菌，该菌苗用甲醛彻底灭活，用其制备的灭活菌苗安全性好，无散毒危险，且对小鼠的免疫保护率可达80％。
(3)本发明提供了一株分离自新疆地区马流产沙门氏菌优势流行株，对于有效预防当地流行菌株引起的马流产有重要价值。用其制备的灭活菌苗生产成本低，产品附加值高，市场需求高，有很好的市场前景。
附图说明
图1是提取的马流产沙门氏菌的基因组DNA在1％琼脂糖凝胶中的电泳结果图。M：DNA Marker DL10000，1、2、3：马流产沙门氏菌基因组DNA提取结果。
图2是马流产沙门氏菌16S rRNA PCR扩增产物的电泳结果图。M：DL2000 DNAMarker，1、2、3：分离菌株的16S rDNA的PCR扩增结果，4：阴性对照。
具体实施方案
为了更好地理解本发明，通过以下实施实例予以进一步说明，但并非对本发明的限定。
实施例1：马流产沙门氏菌菌株SMXJ-97CGMCC No.9047的培养及生物学特征。
马流产沙门氏菌菌株SMXJ-97CGMCC No.9047分离自流产马的胎儿，接种于MM培养基中，于37℃培养,12-15h。该菌具有以下特征：(1)菌落特征：在MM培养基上长成圆形、表面光滑、突起、边缘整齐、形态大小一致的白色菌落。(2)细胞形态特征：：细菌呈直杆状，大小为0.7～1.5μm×2.0～5μm，革兰氏染色阴性。(3)生理生化特征：为需氧兼性厌氧型细菌，在普通培养基上就可以生长，生长温度从25℃到40℃，最适温度37℃，pH生长范围5-9，最适PH7.4～7.6。可以发酵甘露醇，分解赖氨酸，不分解尿素，不能利用色氨酸、丙二酸盐、水杨素，山梨醇。
参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》(第二版)，根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16S rRNA基因序列在GenBank中的搜索结果，菌株SMXJ-97CGMCC No.9047被鉴定为马流产沙门氏菌菌株(Salmonella abortus equi)。
实施例2：马流产沙门氏菌菌株SMXJ-97CGMCC No.9047的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定
马流产沙门氏菌菌株SMXJ-97CGMCC No.9047接种于液体培养基，将生长至对数晚期的发酵液离心(5000rpm/min，5min)去除上清液，用TE(50mM Tris，50mM EDTA-Na2)溶液洗2遍；用0.5mL TES溶液将菌体混匀，加入适量溶菌酶，37℃保温2h；加入0.2mL 20％SDS，60℃保温10min；加入0.3mL 5M NaClO4，混匀；加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，轻轻摇匀5分钟左右，离心(5000转/分钟，5分钟)，吸取上清液，再用酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)处理一遍；然后依次用氯仿-异戊醇(24:1，v/v)处理两遍，直到没有蛋白膜出现；上清液加入20μL 0.2％RNA酶37℃保温30min，氯仿-异戊醇(24:1，v/v)处理三遍；上清液用2倍体积冰乙醇沉淀，70％冰乙醇溶液浸泡5min。晾干后溶于TE溶液中作为模板。
用于16S rRNA基因扩增的PCR反应的正向引物为：
5’-TGGAACGCACAGATGATAC-3’，反向引物为：
5’-GACTTCGGGTGTTACAAAC-3’。
PCR反应体系(50μL)为：10×buffer 5μL:、25mmol/L MgCl2 4μL、10mmol/L dNTPs1μL、20pmol/L引物各1μL、ddH2O 36μL、Taq DNA酶1μL、模板1μL。PCR反应条件为：95℃10min，95℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min，4℃保存。16S rRNA基因序列长度为1375bp。其16S rRNA基因的核苷酸序列如序列表1所示。
实施例3：灭活抗原的制备
将分离菌分别接种于加有2％马血清的MM培养基中，37℃、180r/min培养18～24h，加0.4％甲醛灭活36～48h。灭活彻底后，7000rpm/min离心15min去上清。细菌沉淀以灭菌PBS(pH7.2,10mmol)稀释至1×107CFU/mL。与等量氟氏完全佐剂乳化后免疫家兔，3周后以同样浓度的菌与等量氟氏不完全佐剂乳化，菌苗充分振荡混匀后进行无菌检验和安全性检验。
实施例4：无菌检验
将制备的灭活抗原分别接种于绵羊鲜血琼脂平板，37℃培养24～72h，观察有无细菌生长。培养后结果均不见有菌生长，表明灭活效果良好，操作规范无污染。
实施例5：安全性检验
将制备的灭活抗原皮下注射1.5～2.0kg体重的家兔5只,4mL/只,另取2只皮下注射生理盐水作对照,4mL/只,观察10d。接种家兔无1例死亡，说明疫苗安全性较好；检查接种局部和全身的反应，结果除1只接种部位有轻微炎症反应外其余接种的家兔无明显的局部和全身反应，精神、体温、食欲、呼吸和脉搏正常。
实施例6：小鼠免疫试验
将分离菌接种于加有5％马血清的TM培养基中，37℃、180rpm/min培养18～24h，加0.4％甲醛灭活36～48h。离心去上清。细菌沉淀以灭菌PBS(pH7.2,10mmol)稀释至1×106CFU/mL。经过无菌检验和安全检验后合格的灭活菌液与等量的氟氏完全佐剂和氟氏不完全佐剂乳化制备免疫原。将制备的灭活抗原皮下注射20g体重的小鼠20只,0.5mL/只,另取相同小鼠20只,皮下注射生理盐水作对照,0.5mL/只,各组均在首免后3周后进行第2次免疫，2免后15d用致死剂量的活菌培养物攻击，每组腹腔接种攻击菌的剂量为5×105CFU，观察一周。结果对照组全部死亡，免疫组的死亡4只，免疫组的免疫保护力可达80％。
实施例7：疫苗效价测定
在相同饲养条件下，随机选择15～20g体重的昆明白小鼠10只,皮下多点注射疫苗0.5mL/只,另取5只皮下注射生理盐水作对照,0.5mL/只,各组均在首免后3周后进行第2次免疫，45d用108CFU菌体作包被抗原，ELISA法检测抗体。检测结果表明家兔经两次免疫后45d的抗体效价为1:4.9×104。
CGGGGACGCCTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTACTTGG

Claims (2)

1.一株制备马流产沙门氏菌病疫苗的马流产沙门氏菌(Salmonella abortus equi)SMXJ-97，其保藏号为CGMCC No.9047。
2.权利要求1所述的马流产沙门氏菌SMXJ-97制备马流产沙门氏菌灭活疫苗的方法，包括将权利要求1所述的马流产沙门氏菌SMXJ-97接种于MM培养基，42℃、180r/min培养18～24h，加0.4％甲醛灭活，离心后的沉淀以灭菌PBS稀释至1×108CFU/mL,经无菌检验和安全检验合格的灭活菌液与等量的佐剂乳化制备成灭活菌苗,马流产沙门氏菌使用的培养基MM：
Figure FDA0002778649560000011
PH＝5.1加水至1000mL 121℃ 20分钟灭菌后制备而成。
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