CN106008680A

CN106008680A - 一种链球菌保护性抗原sap及其制备方法

Info

Publication number: CN106008680A
Application number: CN201610359571.3A
Authority: CN
Inventors: 付强; 魏子贡; 马春全; 王爱富; 李桂珍; 罗惠娜
Original assignee: Foshan University
Current assignee: Foshan University
Priority date: 2016-05-27
Filing date: 2016-05-27
Publication date: 2016-10-12

Abstract

本发明提供一种链球菌保护性抗原SAP及其制备方法，所述抗原SAP为SEZ的SAP重组蛋白。所述抗原的制备方法为：首先通过PCR技术获得目的基因，连接到载体上并转化大肠杆菌，对大肠杆菌诱导的表达产物，进行纯化，最终得到目的重组蛋白。所述链球菌保护性抗原SAP具有高度保守性，采用该蛋白制备的疫苗的特异性强，经过一系列生物工程技术和小鼠实验实验分析证实，SAP免疫后可以提供较高的保护效力，anti‑SAP小鼠二免血清对小鼠有明显的被动免疫保护，SAP免疫后的小鼠血清中表现高水平的抗体滴度。SAP基因在SEZ感染的小鼠体内的转录水平高于体外培养的转录水平，SAP抗体可以诱导高水平的杀菌能力。

Description

一种链球菌保护性抗原SAP及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物制品领域，尤其涉及一种链球菌保护性抗原SAP及其制备方法。

背景技术

猪链球菌病是当今危害养猪业的一种细菌性疾病，严重危害着我国乃至世界养猪业的发展。研究人员通过对我国的2912个猪呼吸道疾病样本进行细菌分离鉴定，确定猪链球菌的分离率最高，表明猪链球菌病位于我国猪细菌性疾病的首位。猪链球菌病不仅严重危害养殖畜牧业的发展，而且在全球范围也引发了不容忽视的公共卫生问题。我国猪链球菌病的病原主要包括猪链球菌2型（SS2，Streptococcus suis）和马链球菌兽疫亚种（SEZ，即Streptococcus zooepidemicus）。

SEZ主要引起猪败血症、脑膜炎、关节炎，肺炎以及突发性死亡等症状。我国对SEZ的研究较少，SEZ可以导致败血症、脑膜炎、化脓性关节炎、心内膜炎，还有马、猪、羊、牛等哺乳动物的乳房炎。SEZ还是一种传播人畜共患传染病病毒的重要介质，人们通过接触病患，挤牛奶或者其它日常工作而感染。由于对SEZ毒力因素和保护性抗原一直都缺乏全面了解，从而很难有效控制SEZ的感染。目前，还没有有效的抗原用于开发用于防治SEZ的疫苗。

因此，现有技术还有待于进一步改进。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明在于提供一种链球菌保护性抗原SAP及其制备方法，旨在解决目前没有有效的抗原，用于开发防治SEZ的疫苗。

本发明的技术方案如下：

一种链球菌保护性抗原SAP，其中，所述抗原SAP为SEZ的SAP重组蛋白，具有高度保守性。

进一步地，所述的链球菌保护性抗原SAP，由424个氨基酸残基组成，分子量为47.17kDa，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种如上所述的链球菌保护性抗原SAP的制备方法，其中，所述制备方法为：

PCR扩增：以SEZ基因为模板，采用引物进行PCR扩增；

与载体连接：采用限制性内切酶对PCR产物进行酶切，将回收后的PCR酶切产物与pET-32a载体进行连接，得到重组载体；

转化和诱导：将重组载体转化大肠杆菌后，孵育到指数生长期，加入IPTG后继续孵化3h；

纯化：将菌液进行离心，使收集的上清液经过Ni-NTA蛋白纯化层析柱进行纯化，获得纯化的SAP重组蛋白。

所述的链球菌保护性抗原SAP的制备方法，其中，所述引物为：

正向引物：5′- CATGCGGGATCCCAAGTA -3′；

反向引物：5′- AATCTTCTGGTCGACACTT -3′。

所述的链球菌保护性抗原SAP的制备方法，其中，所述正向引物和反向引物分别设有1个限制性内切酶的酶切位点。

所述的链球菌保护性抗原SAP的制备方法，其中，所述正向引物的酶切位点为BamHI酶切位点，反向引物的酶切位点为Sal I酶切位点。

有益效果：本发明提供一种链球菌保护性抗原SAP及其制备方法，所述链球菌保护性抗原SAP具有高度保守性，采用该蛋白制备的疫苗的特异性强，通过克隆、表达、纯化得到的SAP重组蛋白，经过一系列生物工程技术和小鼠实验实验分析证实， SAP免疫后可以提供较高的保护效力，anti-SAP小鼠二免血清对小鼠有明显的被动免疫保护， SAP免疫后的小鼠血清中表现高水平的抗体滴度。SAP基因在SEZ感染的小鼠体内的转录水平高于体外培养的转录水平，SAP抗体可以诱导高水平的杀菌能力。

附图说明

图1.表示SAP在小鼠体内诱导产生的免疫反应结果。（A）免疫组的SAP/IgG水平显著高于阴性对照组的抗体水平。（B）SAP可以诱导一个起主导地位的IgG1反应类型。

图2.（A）表示免疫组、阳性对照组、阴性对照组和空白对照组的小鼠，经SEZ攻毒后，小鼠的存活率。（B）SAP抗体、SEZ灭活疫苗（阳性对照）和正常血清（阴性对照）对小鼠表现显著的保护能力，而正常血清（阴性对照）不能保护小鼠。

图3. 免疫荧光试证实SAP（A和B）与阴性对照（C和D）蛋白的表面分布。

图4. 流式细胞术分析SAP在SEZ的表面分布。（A）未染色的细菌。（B）未染色细菌的平均荧光强度。（C）SEZ经SAP抗体处理的平均荧光强度（空白图），阴影图表示细菌与正常血清孵育染色的平均荧光强度。

图5.显示了定量PCR分析结果，（A）表示Ct值与SAP模板的线性关系；（B）表示小鼠脾脏富集细菌的相对表达量。

图6.表示小鼠全血致死实验结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供一种链球菌保护性抗原SAP，其中，所述抗原SAP为SEZ的SAP重组蛋白，具有高度保守性，由424个氨基酸残基组成，分子量为47.17kDa，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述SAP属于最近鉴定的新蛋白，无同源蛋白或与其他蛋白序列无显著的同源性，因此，该蛋白具有高度的保守性，采用该蛋白制备的疫苗的特异性强，效果好，副作用低。该蛋白具有典型LPXTG的细胞锚定域，是一种细菌表面蛋白，适合用于制备疫苗。

上述链球菌保护性抗原SAP的制备方法如下：

1）PCR扩增：以SEZ MGCS10565基因组（ NCBI Accession：CP001129.1）为模板，采用引物进行PCR扩增，所述引物为：

正向引物（SEQ ID NO.3）：5′- CATGCGGGATCCCAAGTA -3′，划线部分为BamHI 酶切位点；

反向引物（SEQ ID NO.4）：5′- AATCTTCTGGTCGACACTT -3′，划线部分为Sal I酶切位点。

2）与载体连接：采用限制性内切酶对PCR产物进行酶切，将回收后的PCR酶切产物与pET-32a载体进行连接，得到重组载体。

3）转化和诱导：将重组载体转化大肠杆菌后，孵育到指数生长期，加入IPTG后继续孵化3h。

优选地，所述大肠杆菌为BL21感受态细胞；加入的IPTG为1mM。

引物是由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。所述限制性内切酶为BamHI和 EcoRI。

IPTG即异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质。基于这个特性，带有lacZ基因载体（如pET-32a）DNA以lacZ缺失细胞为宿主（如BL21）进行转化时，如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落（或噬菌斑）而方便地挑选出基因重组体。此外，它还可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。

4）纯化：将菌液进行离心，使收集的上清液经过Ni-NTA蛋白纯化层析柱进行纯化，获得纯化的SAP重组蛋白。

所述纯化是在AKATA FPLC上利用填装有Ni-NTA 树脂的蛋白纯化层析柱纯化重组蛋白SAP。

实验结果： PCR得到1284bp的SAP碱基序列(SEQ ID NO.1)，表达得到的SAP重组蛋白是由424个氨基酸残基构成 (SEQ ID NO.2)，达到预测分子量为47.17kDa。

现结合实施例对本发明保护性抗原SAP的生物学活性作进一步详细描述。

实施例一抗体滴度测定

血清IgG滴度用ELISA测定，将纯化的重组蛋白SAP包被在酶联板上，将二免10天后的小鼠采血分离血清，连续倍比稀释后，各个稀释度取100μL加入酶联板，37°C反应后加入兔抗鼠IgG，用酶标仪读取OD值，取 OD 值大于对照血清平均 OD值+3 倍方差 SD（标准差）的血清最大稀释倍数作为血清抗体。为了推断免疫类型，IgG1和IgG2a分别进一步作为对照用于测定Th2和 Th1的免疫反应。

实验结果：免疫组的IgG滴度的水平显著高于阴性对照组的抗体水平(p < 0.001)（见图1A）。

结果表明SAP可以诱导显著的Th1-/Th2免疫反应，并且IgG1与IgG2在小鼠体内的反应，IgG1占主导地位（见图1B）。

实施例二小鼠免疫接种与攻毒试验

1、40只4周龄BALB/c雌鼠，随机分成4组，每组10只；

2、实验组：50μg纯化的重组SAP蛋白用Marcol 52佐剂乳化后，腹腔注射免疫第1组小鼠， 14天后以同样的方式第二次注射免疫小鼠；

3、阳性对照组：50μg纯化的重组SzP蛋白用Marcol 52佐剂乳化后，腹腔注射免疫第1组小鼠， 14天后以同样的方式第二次注射免疫小鼠；

4、阴性对照组：向第3组小鼠注射Marcol 52佐剂乳化的PBS；

5、空白对照组：向第4组小鼠注射PBS；

6、所有小鼠第二次免疫注射后10天，尾静脉取血分离并保存血清，然后使用SEZC55138菌株（2×10⁵ cfu/mL ）攻毒；

7、观察并记录所有小鼠的生长情况。

实验结果：

1）实验组小鼠在攻毒后表现被毛粗乱、精神萎靡、对刺激反应迟缓等临床症状，但小鼠的存活率达90%。

2）阳性对照组小鼠在攻毒试验中存活下来；

3）阴性对照组小鼠，一半的小鼠在8天内死亡。

4）空白对照组小鼠，3天内死亡3只小鼠，随后几天右陆续死亡4只小鼠（见图2A）。

结果表明SAP可以保护小鼠，抵御SEZ的感染。

实施例三被动保护试验分析

为了证实保护是归功于SAP特殊的刺激免疫反应，用SAP小鼠二免血清被动免疫小鼠，然后再实行攻毒试验。

1、30只6周龄BALB/c雌鼠，随机分成3组，每组10只；

2、实验组：用100μL SAP二免血清静脉注射免疫第1组小鼠；

3、阳性对照组：用SEZ灭活疫苗的二免血清静脉注射免疫第2组小鼠；

4、阴性对照组：用正常血清静脉注射免疫第3组小鼠；

5、免疫24h后，所有小鼠用SEZ C55138攻毒（2×10⁵cfu/mL）；

6、观察并记录所有小鼠的生长情况。

实验结果：1）阳性对照组小鼠在攻毒试验中存活下来；

2）实验组小鼠在攻毒后表现被毛粗乱、精神萎靡、对刺激反应迟缓等临床症状，但小鼠的存活率达100%。

3）阴性对照组小鼠，6天内陆续死亡7只小鼠（见图2B）。

结果表明SAP对小鼠有明显的被动免疫保护能力。

实施例四免疫荧光分析

1、用PBS洗3次并调整细菌为的密度为约为1×10⁸cfu/ml，取5 μl均匀涂在盖玻片上；

2、用100%的甲醇在-20 ℃固定10min；

3、加入相应的血清200 μl，37 ℃孵育1 h；

4、用PBS洗片3次，加入FITC标记的IgG，37 ℃避光孵育1 h；

5、用TBST洗片3次，风干后固定在载玻片上；

6、用PBS洗3次，用荧光显微镜观察。

实验结果：SAP的抗体染色后可以见到细菌表面具有特异性的绿色荧光，而阴性鼠血清染色后未发现明显的绿色荧光。结果表明SAP是免疫原性蛋白且分布于细菌的表面（见图3）。

实施例五流式细胞术分析

1、用PBS重悬细菌，取菌液200 μl；

2、加入相应的血清200 μl，室温孵育45 min；

3、5000 rpm离心3min，收集细菌；

4、用PBS洗3次，加入抗体200µl，室温孵育45min；

5、用PBS 洗3次，用500 µl的PBS重悬，加入到流式管中，通过流式细胞仪检测。

实验结果：未染色的细菌与正常血清孵育后染色的细菌的平均荧光强度基本一致，而经SAP抗体处理细菌的平均荧光强度显著升高，表明SAP蛋白分布于SEZ的表面（见图4）。

实施例六定量PCR分析

收集数生长期的SEZ作为体外培养细菌及感染小鼠体内细菌SEZ。使用TRIzol试剂提取体内富集细菌和体外培养细菌的RNA，以Dnase Ⅰ去除DNA，反转录试剂盒进行反转录。以回收的SAP和16S rRNA扩增产物作为标准品，测定其浓度，换算浓度（ng/μL）至拷贝数/μL。对标准品做10倍梯度稀释，稀释的浓度分别为1×107，1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，1×101拷贝数/μL，以其作为模板绘制标准曲线。PCR反应体系(总体积为25 μL)：上、下游引物各 0.5 μL，10×SYBR Green Real-time PCR Master Mix 12.5 μL，双蒸水 11 μL，cDNA 样品 0.5 μL。每个样品做3个重复。PCR扩增条件：95预变性 ℃ 30 s；95 ℃，5 s； 55℃，30 s，共40个循环。整个反应过程中的荧光信号的变化由LightCycler 480 (Roche)实时荧光定量PCR仪检测。按照2-∆∆Ct方法对荧光定量PCR数据进行统计分析。

本实验中，采用下述引物来定量分析Sap基因：

正向引物（SEQ ID NO.5）：5’- CCCTGGCGATGAAGAATA -3’；

反向引物（SEQ ID NO.6）：5’- CTGCGAGCCACTTGTTGT -3’。

采用下述引物来定量分析Sap基因：

正向引物（SEQ ID NO.7）：5’-ATCCGAACTGAGATTGGC-3’；

正向引物（SEQ ID NO.8）：5’-CCCTTATGACCTGGGCTA-3’。

结果表明，SAP基因在小鼠体内有较高的转录水平，并且该转录水平量高于体外培养的转录水平（见图5）。

实施例七全血致死量分析

为了测定SAP抗体的杀菌活性，把小鼠血液肝素化后，使用抗SAP血清或对照血清与血液中存活的SEZ孵育后进行评估。

1、SEZ C55138菌株培养到指数生长中期，用PBS调整细菌浓度为10⁴ cfu/mL；

2、实验组：900 μL健康小鼠血液，与100μL小鼠抗SAP血清混合；

3、阳性对照组：900 μL健康小鼠血液，与100μL SEZ灭活疫苗免疫血清混合；

4、阴性对照组：900 μL健康小鼠血液，与100μl正常小鼠血清混合；

5、分别向各混合液中加入100μL SEZ菌液，37°C 旋转培养 90 min；

6、每组取3份样品，每份100μL，并接种于TSA培养基中，计算孵化前和孵化后存活的细菌量；

7、存活率计算为剩下细菌量相对于开始时细菌量的百分比。

实验结果：阴性对照组杀菌率仅为7.73±2.2%；阳性对照组杀菌率高达86.18±13.23%；实验组的杀菌率为54.45±10.01%（见图6）。

结果表明：SAP抗体可以诱发高水平的杀菌能力。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110> 佛山科学技术学院

<120> 一种链球菌保护性抗原SAP及其制备方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1284

<212> DNA

<213> 马链球菌兽疫亚种(Streptococcus zooepidemicus)

<400> 1

catttggaat tccctaagaa ttatcagggt cagcccttga tagccattgc agataatgcc 60

tttagaaatg tcaattttca tgataaaacc ttgcgtaaat acgatctaga aagcgtgacg 120

ttaccatcta ccattcaaaa gattggtgcc tttgcctttc agtcaaataa tctagaaagc 180

tttgaggcca gcgaggactt ggttgagatt ggtcaaggag cctttatgaa taatcgcatt 240

gagattctgg ccttgaatga taagctgaag gtcattggag atgcggcctt tcatatcaat 300

cggatttatg ctattgttat ccctgagtcg gtcgaagtaa ttggcatttc tgcctttagg 360

caaaatggtg ctaaacatgt gatgtttatg ggagataagc taataagtat tggagaaatg 420

gcttttttga gcaatactct ggaggaagtg gatttgagca gcttagcagg gcttaagacc 480

atcgctgttc aagcctttgc agacaatcac ttgagagagc ttaagctgcc agatagtttg 540

atgcgtattg aagcagaagc ttttaaaatt aatagacttc aaagagtgac cgttccagac 600

actgtcatta gcattagctt taatgccttt gatcataata gtgatgacaa ggttgtccta 660

aggaccacca atcacaataa aaacctgcta gctgatggag atggctttat tgtggatcca 720

gacctattaa gtgcggatca atcgactgtt caagcagttt tagaggacct gcggcgctta 780

gatctagcta gtctacgtgc tgatacagca gctcatttta tgacactcat cacaagaggt 840

aagcagctac taaaggaatc tgctgtacgg ttaggttatc agcttaggtt ccttgcagag 900

tcacgatttt tcctagggcg agtgagactg gatcagctga ttaaaactgc tgacataacc 960

ctgtctaacc atcaaaacac acctaatgct aagctgttga tggctaagtt agacaaggcc 1020

aagctgcatt acaataatag cgcaatgact gctcctaaaa taagtcgctt ggaaaaagag 1080

ctcagcctgt taattgatct tgtccaaggg gtaggcgcta tctctaaagc aacaatgact 1140

caaggtgtct ataagcttca gacaacccta cctattccag agtattatat tggggttaat 1200

ctttatactg atgatcaggg gaatatttta tttgtgcttg acatgagtga tacgattggg 1260

cagggacaac ttgtcgacta tggc 1284

<210> 2

<211> 424

<212> PRT

<213> 马链球菌兽疫亚种（Streptococcus zooepidemicus）

<400> 2

Glu Phe Pro Lys Asn Tyr Gln Gly Gln Pro Leu Ile Ala Ile Ala Asp

1 5 10 15

Asn Ala Phe Arg Asn Val Asn Phe His Asp Lys Thr Leu Arg Lys Tyr

20 25 30

Asp Leu Glu Ser Val Thr Leu Pro Ser Thr Ile Gln Lys Ile Gly Ala

35 40 45

Phe Ala Phe Gln Ser Asn Asn Leu Glu Ser Phe Glu Ala Ser Glu Asp

50 55 60

Leu Val Glu Ile Gly Gln Gly Ala Phe Met Asn Asn Arg Ile Glu Ile

65 70 75 80

Leu Ala Leu Asn Asp Lys Leu Lys Val Ile Gly Asp Ala Ala Phe His

85 90 95

Ile Asn Arg Ile Tyr Ala Ile Val Ile Pro Glu Ser Val Glu Val Ile

100 105 110

Gly Ile Ser Ala Phe Arg Gln Asn Gly Ala Lys His Val Met Phe Met

115 120 125

Gly Asp Lys Leu Ile Ser Ile Gly Glu Met Ala Phe Leu Ser Asn Thr

130 135 140

Leu Glu Glu Val Asp Leu Ser Ser Leu Ala Gly Leu Lys Thr Ile Ala

145 150 155 160

Val Gln Ala Phe Ala Asp Asn His Leu Arg Glu Leu Lys Leu Pro Asp

165 170 175

Ser Leu Met Arg Ile Glu Ala Glu Ala Phe Lys Ile Asn Arg Leu Gln

180 185 190

Arg Val Thr Val Pro Asp Thr Val Ile Ser Ile Ser Phe Asn Ala Phe

195 200 205

Asp His Asn Ser Asp Asp Lys Val Val Leu Arg Thr Thr Asn His Asn

210 215 220

Lys Asn Leu Leu Ala Asp Gly Asp Gly Phe Ile Val Asp Pro Asp Leu

225 230 235 240

Leu Ser Ala Asp Gln Ser Thr Val Gln Ala Val Leu Glu Asp Leu Arg

245 250 255

Arg Leu Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ala Asp Thr Ala Ala His Phe Met

260 265 270

Thr Leu Ile Thr Arg Gly Lys Gln Leu Leu Lys Glu Ser Ala Val Arg

275 280 285

Leu Gly Tyr Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Ser Arg Phe Phe Leu Gly

290 295 300

Arg Val Arg Leu Asp Gln Leu Ile Lys Thr Ala Asp Ile Thr Leu Ser

305 310 315 320

Asn His Gln Asn Thr Pro Asn Ala Lys Leu Leu Met Ala Lys Leu Asp

325 330 335

Lys Ala Lys Leu His Tyr Asn Asn Ser Ala Met Thr Ala Pro Lys Ile

340 345 350

Ser Arg Leu Glu Lys Glu Leu Ser Leu Leu Ile Asp Leu Val Gln Gly

355 360 365

Val Gly Ala Ile Ser Lys Ala Thr Met Thr Gln Gly Val Tyr Lys Leu

370 375 380

Gln Thr Thr Leu Pro Ile Pro Glu Tyr Tyr Ile Gly Val Asn Leu Tyr

385 390 395 400

Thr Asp Asp Gln Gly Asn Ile Leu Phe Val Leu Asp Met Ser Asp Thr

405 410 415

Ile Gly Gln Gly Gln Leu Val Asp

420

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列primer11

<400> 3

catgcgggat cccaagta 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列primer12

<400> 4

aatcttctgg tcgacactt 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列primer21

<400> 5

ccctggcgat gaagaata 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列primer22

<400> 6

ctgcgagcca cttgttgt 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列primer31

<400> 7

atccgaactg agattggc 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列primer32

<400> 8

cccttatgac ctgggcta 18

Claims

1.一种链球菌保护性抗原SAP，其特征在于，所述抗原SAP为SEZ的SAP重组蛋白。

2.根据权利要求1所述的链球菌保护性抗原SAP，其特征在于，由424个氨基酸残基组成，分子量为47.17kDa，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种如权利要求1-2中任一项所述的链球菌保护性抗原SAP的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：

PCR扩增：以SEZ基因为模板，采用引物进行PCR扩增；

4.根据权利要求3所述的链球菌保护性抗原SAP的制备方法，其特征在于，所述正向引物的酶切位点为BamHI酶切位点，反向引物的酶切位点为Sal I酶切位点。

5.根据权利要求4所述的链球菌保护性抗原SAP的制备方法，其特征在于，所述引物为：

正向引物：5′- CATGCGGGATCCCAAGTA -3′；

反向引物：5′- AATCTTCTGGTCGACACTT -3′。