CN102026658A

CN102026658A - 改进的免疫组合物

Info

Publication number: CN102026658A
Application number: CN2008801269094A
Authority: CN
Inventors: B·古斯; J-I·弗洛克; L·弗里克伯格; M·弗洛克
Original assignee: Intervacc AB
Current assignee: Intervacc AB
Priority date: 2007-12-13
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2011-04-20
Also published as: EP2227249A1; EP2227249B1; US20110020403A1; US9987342B2; NZ586367A; AU2008336295A1; WO2009075646A1; EP2227249A4; AU2008336295B2; CA2708260A1; US20140220064A1; JP2011506433A

Abstract

本发明涉及一种抗原组合物及其用于使非人类哺乳动物对马链球菌马亚种和/或兽疫亚种免疫的用途，所述抗原组合物包含至少一种抗原，所述抗原包含至少一种抗原表位或抗原决定簇，所述抗原表位或抗原决定簇衍生自马链球菌马亚种和兽疫亚种之一或两者中存在的蛋白。本发明还公开了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含作为免疫组分的上述抗原组合物。

Description

改进的免疫组合物

发明背景

1.发明领域

本发明总体涉及抗原或免疫原组合物及其用于使非人类哺乳动物如马对马链球菌免疫的用途。

2.发明背景

马内链球菌感染主要由马链球菌(Streptococcus equi)引起，所述马链球菌分类为兰氏C族链球菌并包含分别命名马亚种(subsp.equi)和兽疫亚种(subsp.Zooepidemicus)的两个亚种。

马链球菌马亚种，实质上限于马，是窒息病(strangles)的病原体，所述窒息病是遍及全球且高度传染的马科动物上呼吸道严重疾病。窒息病是全球报道最频繁的马科疾病之一，其特征在于发热、流鼻涕及在咽后和颚淋巴结内形成脓肿。一些情况下，这种疾病表现出体内转移过程，即所谓的“联合窒息病”。这种疾病遍及全球且导致巨大经济损失。此外，由于窒息病是高度传染的疾病，不仅受感染的动物而且例如患病马群的所有其它成员必须被隔离长达三个月之久。

马链球菌兽疫亚种被认为是在健康马上呼吸道内经常产生的机会致病性共生体。然而，在压力或病毒感染后，它能引起继发感染，这会产生窒息病样症状。此外，兽疫亚种不仅感染马还感染大量的其它动物，如猪、狗、猫和牛。甚至还报道了人由于兽疫亚种而感染的病例。这种亚种还被暗示为如子宫内膜炎、子宫颈炎、流产、乳腺炎、肺炎、脓肿和关节感染等病症的原发病源体。

尽管采用抗生素如青霉素、四环素或庆大霉素可能治疗和治愈这些链球菌感染，仍希望有一种能防止这种感染爆发并避免或减少与抗生素治疗有关的抗性株形成风险的有效预防剂。

3.相关技术描述

然而，尽管进行了大量努力来开发预防剂如抵抗马链球菌的疫苗，目前既没有针对马亚种也没有针对兽疫亚种的有效疫苗或免疫制剂。

抵抗窒息病的现有疫苗是基于马链球菌马亚种的灭活株如加热灭活株或减毒株或马链球菌产生的富M-蛋白即免疫原蛋白的酸提取物/变溶菌素。以M样蛋白为基础的抗马链球菌兽疫亚种疫苗已在US-A-5,583,014中描述。WO87/00436中，公开了用作抗马链球菌疫苗的马链球菌的无毒株，所述疫苗在给药至马后刺激鼻咽粘膜内的抗体应答。

最近，在英国(2004年11月)推出了一种抗窒息病疫苗商品，产自IntervetVET，UK的Equilis StrepE，所述疫苗也在全欧洲、南非和南美广泛使用。然而，这种疫苗(其以马链球菌马亚种的减毒(活的、缺失突变)株为基础)的安全性和有效性可受到质疑。

由于已开发的疫苗或免疫制剂受到副作用的阻碍，此外，提供的保护不够，所以需要抵抗马链球菌感染和/或预防其传播而不产生不需要的副作用的有效且安全的预防剂如疫苗。

众所周知，附着到真核细胞表面是细菌性病源体感染和建群的必需步骤。从而，与宿主细胞的胞外基质(ECM)或血浆蛋白的不同组分相互作用和/或结合到其上的链球菌表面蛋白是免疫用活性组分的潜在候选对象。

这通过以上述M样蛋白为基础的疫苗或文献例如WO 98/01561中公开的疫苗得以说明。纤维蛋白原和补体因子H结合到M-蛋白对链球菌抵抗吞噬作用的能力被认为很重要。

链球菌附着到宿主细胞所用的另一机理包括与ECM组分纤连蛋白(Fn)结合(参考文献21，22)。Fn-结合细菌细胞表面蛋白和固定化Fn之间的结合促进上皮细胞将链球菌内化(参考文献2，23，24)。纤连蛋白是在血浆和胞外基质中发现的二聚糖蛋白，当在胞外基质中时为纤维状。Fn的主要作用是介导真核细胞的底物粘附，所述粘附包括特定的细胞表面受体与Fn分子的某些结构域结合。此外，它还与几种其它大分子如DNA、肝素、纤维蛋白和胶原蛋白相互作用。

因此，之前已对不同链球菌种的Fn-结合蛋白进行克隆和测序。例如，对马链球菌的一种Fn-结合蛋白进行了克隆和表征，所述Fn-结合蛋白是兽疫亚种的Fn-结合细胞表面蛋白，已命名为FNZ(Lindmark等人，1996，参考文献9)。Lindmark和Guss已对马链球菌马亚种的另一结合蛋白进行了克隆和表征(1999)(参考文献12)。该命名为SFS的后述蛋白及其在用于保护马抵抗窒息病的疫苗中作为活性组分的潜在用途已在WO 00/37496中公开。

Jonsson等人(1995)(参考文献8)中，对马链球菌兽疫亚种的命名为ZAG的蛋白进行了克隆和表征，其介导与血浆蛋白酶抑制剂α₂M的结合。其中推测这种蛋白在功能上类似于链球菌M蛋白。这种ZAG蛋白也已在WO 95/07296中公开，其中指出了它的α₂M-结合特性。然而，其中未公开其免疫原特性或其在用于保护例如马抵抗窒息病的疫苗中作为活性组分的潜在用途。编码ZAG的基因zag也已在这些文献中公开。

Lindmark等人(1999)(参考文献11)和Lindmark(1999)(参考文献13)已对类似于上述马链球菌兽疫亚种的zag基因但存在于马亚种中的基因进行描述。这种基因在下文中称为eag并编码命名为EAG的蛋白。

WO 2004/032957 A1公开了抗原组合物，所述抗原组合物包含至少一种来源于命名为EAG蛋白的抗原，所述蛋白存在于马链球菌中，且所述组合物合适地包含至少一种选自存在于马链球菌中并分别命名为FNZ、SFS、SEC和ScIC的一组蛋白的其它抗原。

WO 2007/115059 A2公开了免疫原或疫苗组合物亚单位，所述组合物包含至少一种马链球菌多肽或其类似物或其片段，所述多肽具有所述公开物所附序列表中所示的特定氨基酸序列，所述片段是所述多肽的一部分并包含至少一个表位。然而，该文件中没有提供任何关于免疫马抵抗窒息病的结果。

Lannergard，J.，Frykberg，L.和Guss，B.(2003)FEMS Microbiol Lett 222：69-74，(参考文献28)报道的研究中，分离了一种命名为cne的新基因并对相应的蛋白CNE进行了表征。

Flock，M.，Jacobsson，K.，Frykberg，L.，Hirst，T.，R.，Franklin，A.，Guss，B.和Flock，J.-I.(2004)Infect Immun 72：3228-3236(参考文献5)中报道：马窒息病的小鼠模型中，采用分别命名为FNZ、SFS和EAG的蛋白的部分来使小鼠免疫。FNZ和EAG被认为是开发安全而有效的抗窒息病疫苗的有希望的候选物。

Lannergard，J.和Guss，B.(2006)FEMS Microbiol Lett 262：230-235，(参考文献26)中对分别来自马链球菌马亚种和兽疫亚种的两种新蛋白IdeE和IdeZ的酶活性进行了表征。

Vaccine(Timoney等人；2007)中报道：马链球菌的大量重组胞外蛋白，包括CNE(也称为SEC)和Se 44.2(也称为IdeE2)作为疫苗组分是无效的。其中推测在小鼠上获得的SEC/CNE早期结果不适用于马。因此，表面蛋白的重组体并不必需是疫苗组分的可能候选物。

Waller，A.，Flock，M.，Smith，K.，Robinson，C，Mitchell，Z.，Karlstróm，A.，Lannergard，J.，Bergman，R.，Guss，B.和Flock，J.-I.(2007)Vaccine 25：3629-3635，(参考文献27)中，报道了采用马链球菌马亚种的重组抗原EAG、CNE和ScIC对马进行抗窒息病接种。该研究中，接种的马在用马链球菌马亚种进行攻击后表现出显著降低的细菌恢复能力和明显较低的鼻滴水平。

尽管已经进行大量努力来开发有效的疫苗且WO 2004/032957 A1的一些免疫组分是用于抵抗马链球菌感染的疫苗中的有希望的候选物，仍然希望开发具有高度免疫原性并展示有限的副作用或无副作用的安全疫苗。

4.发明概述

本发明基于一种抗原组合物，合适地为免疫原组合物及其用于非人类哺乳动物抗马链球菌马亚种和/或兽疫亚种的免疫的用途，所述组合物包含至少一种抗原，合适地为免疫原，所述抗原包含衍生自马链球菌马亚种和兽疫亚种之一或两者中存在的蛋白的至少一个抗原表位或抗原决定簇。

本发明还涉及包含上述抗原组合物作为免疫组分的的疫苗组合物；制备所述抗原组合物，合适地为免疫原组合物或疫苗组合物的方法；诱导非人类哺乳动物内抗马链球菌的免疫应答的方法；和预防性或治疗性治疗非人类哺乳动物内马链球菌感染的方法。通常使用时，术语“马链球菌”是指马亚种和兽疫亚种之一或两者。

根据一个合适的实施方案，本发明涉及保护马科动物如马抵抗窒息病的疫苗。

关于马链球菌马亚种引起的感染的上下文中，术语“非人类哺乳动物”主要指属于由马、驴和斑马组成的马科动物家族的动物及其杂交种如马螺和驴骡。骆驼和单峰骆驼也包含于其中。

关于马链球菌兽疫亚种引起的感染，术语“非人类哺乳动物”还指其它哺乳动物如牛、猪、狗和猫。

附图简述

下面，参考附图对本发明进行更详细描述，其中：

图1显示了马链球菌马亚种1866株实验感染的小鼠在用多肽Eq5和Eq8(空心符号)接种后或未接种(实心符号)的重量减轻；

图2显示了马链球菌马亚种1866株实验感染的小鼠在用多肽Eq5和Eq8(空心符号)接种后或未接种(实心符号)的鼻内增长；

图3显示了马链球菌马亚种1866株实验感染的小鼠在用多肽EAG(实心方框)、多肽EAG+IdeE+IdeE2(空心圆)接种后或未接种对照小鼠(实心圆)的重量减轻；

图4显示了马链球菌马亚种1866株实验感染的小鼠在用多肽EAG(实心方框)、多肽EAG+IdeE+IdeE2(空心圆)接种后或未接种对照小鼠(实心圆)的鼻内增长；

图5a和5b显示了用EAG+CNE+ScIC i.n.(实心方框)、Eq5+Eq8 i.n.(实心圆)和对照物(空心圆)免疫的小鼠的重量减轻和鼻内增长；

图1-5中，显示了平均值和标准误差。

图6显示了攻击接种物(马链球菌马亚种4047株)的增长；

图7显示了接种阶段的小马平均温度；

图8显示了接种阶段的鼻平均评分；

图9显示了接种阶段的淋巴结平均评分；

图10显示了接种阶段洗鼻液中的兽疫亚种链球菌平均计数；

图11显示了攻击后的小马平均温度；

图12显示了攻击阶段的纤维蛋白原平均水平；

图13显示了攻击阶段的中性粒细胞平均水平；

图14显示了攻击阶段的淋巴结平均评分；

图15显示了攻击阶段的鼻内平均评分；

图16显示了攻击阶段的兽疫亚种链球菌平均计数；

图17显示了尸体剖检时的病理学平均评分；和

图18显示了平均组织病理学评分。

图19显示了7匹免疫马的鼻洗出物中IgG抗体的ELISA测定。计算了各单独的鼻洗出物样品在截距1.0处产生吸光率值所需的血浆稀释倍数对数。显示了平均值(n＝7)和标准误差。显示了之前(就在第1天前)和第三次免疫12天后抽取的样品(第86天)。用EAG、CNE和ScIC对马进行免疫。

图20显示了7匹免疫马的血浆中IgG抗体的ELISA测定。计算了各单独的血清样品在截距1.5处产生吸光率值所需的血浆稀释倍数对数。显示了平均值(n＝7)和标准误差。显示了之前(第1天)、V2后(第71)和V3后(第86天)抽取的样品。

图21显示了免疫马(Pentavac)的血浆中IgG抗体的ELISA测定。计算了各单独的血清样品在截距1.5处产生吸光率值所需的血浆稀释倍数对数。显示了平均值(n＝7)和标准误差。显示了之前(第1天)、V2后(第71)和V3后(第86天)抽取的样品和在V3与V4(第270天)之间抽取的样品。

序列表简述

SEQ ID NO 1显示了蛋白IdeE2的氨基酸序列。

SEQ ID NO 2显示了重组蛋白IdeE2的氨基酸序列。

SEQ ID NO 3显示了蛋白Eq5的氨基酸序列。

SEQ ID NO 4显示了重组蛋白Eq5的氨基酸序列。

SEQ ID NO 5显示了蛋白Eq8的氨基酸序列。

SEQ ID NO 6显示了重组蛋白Eq8的氨基酸序列。

SEQ ID NO 7显示了来自兽疫亚种的蛋白IdeZ2的氨基酸序列。

SEQ ID NO 8显示了来自兽疫亚种的蛋白Eqz5的氨基酸序列。

SEQ ID NO 9显示了来自兽疫亚种的蛋白Eqz8的氨基酸序列。

SEQ ID NO 10显示了蛋白IdeE的氨基酸序列。

SEQ ID NO 11显示了来自兽疫亚种的蛋白IdeZ的氨基酸序列。

SEQ ID NO 12和13分别显示了基因eag的核苷酸序列和蛋白EAG4B的氨基酸序列，所述蛋白在本发明中通常称为EAG。

SEQ ID NO 14显示了基因ideE2的核苷酸序列。

SEQ ID NO 15显示了基因eq5的核苷酸序列。

SEQ ID NO 16显示了基因eq8的核苷酸序列。

SEQ ID NO 17显示了来自兽疫亚种的基因ideZ2的核苷酸序列。

SEQ ID NO 18显示了来自兽疫亚种的基因eqz5的核苷酸序列。

SEQ ID NO 19显示了来自兽疫亚种的基因eqz8的核苷酸序列。

SEQ ID NO 20显示了基因ideE的核苷酸序列。

SEQ ID NO 21显示了来自兽疫亚种基因ideZ的核苷酸序列。

SEQ ID NO 22-27显示了寡核苷酸引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO 28显示了蛋白CNE(或SEC 2.16)的氨基酸序列。

SEQ ID NO 29显示了蛋白ScIC的氨基酸序列。

SEQ ID NO 30显示了用于免疫的重组IdeE的氨基酸序列。

SEQ ID NO 31-32显示了引物的核苷酸序列。

发明详述

本发明涉及马链球菌的多肽或蛋白的鉴定，所述多肽或蛋白当给药至非人类哺乳动物时能引起抗原应答，合适地为免疫原应答；并涉及编码这些多肽或蛋白的多核苷酸或基因的鉴定。

本发明还涉及所述多肽或蛋白或所述多核苷酸或基因的片段或类似物。

更具体而言，在疫苗研究中鉴定编码胞外蛋白的马链球菌的基因，并随后表达相应产物并对其进行评价。本发明至少部分以这类研究为基础。

因此，本发明涉及一种抗原组合物，所述抗原组合物包含至少一种抗原，其中所述至少一种抗原包含马链球菌马亚种或兽疫亚种的至少部分蛋白或多肽且所述至少部分蛋白或多肽包含至少一种马链球菌抗原表位或抗原决定簇。

根据一个实施方案，本发明涉及一种抗原组合物，所述抗原组合物包含至少一种抗原，其中所述至少一种抗原包含马链球菌马亚种或兽疫亚种的至少部分蛋白或多肽且所述至少部分蛋白或多肽包含至少一种马链球菌抗原表位或抗原决定簇，且其中所述蛋白或多肽选自如下蛋白或多肽或其类似物或片段：

命名为EAG并具有SEQ ID NO：13中所示氨基酸序列的蛋白或多肽；

命名为IdeE并具有SEQ ID NO：10中所示氨基酸序列的蛋白或多肽；

命名为IdeE2并具有SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的蛋白或多肽；

命名为Eq5并具有SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列的蛋白或多肽；

命名为Eq8并具有SEQ ID NO：5中所示氨基酸序列的蛋白或多肽；

命名为IdeZ2并具有SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列的蛋白或多肽；

命名为Eqz5并具有SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列的蛋白或多肽；和

命名为Eqz8并具有SEQ ID NO：9中所示氨基酸序列的蛋白或多肽；

且其中包含EAG的组合物包含至少一种其它抗原，所述其它抗原选自如下：IdeE、IdeE2、Eq5、Eq8、IdeZ2、Eqz5和Eqz8。

为方便起见，具有序列表中所示氨基酸序列的多肽通常仅分别称为EAG、IdeE、IdeE2、Eq5、Eq8、IdeZ2、Eqz5和Eqz8。EAG、IdeE、IdeE2、Eq5和Eq8是指能在马链球菌马亚种中找到的蛋白，而IdeZ、IdeZ2、Eqz5和Eqz8是指能在马链球菌兽疫亚种中找到的蛋白。

本发明抗原或免疫原组合物的抗原或免疫原可包含所述蛋白或多肽的全长氨基酸序列或可包含其片段，例如C-末端或N-末端片段，或其类似物。例如，本发明各实施方案中使用EAG的N-末端片段。

根据一个实施方案，本发明涉及一种抗原或免疫原组合物，所述组合物包含选自如下的至少2种或3种抗原或免疫原：EAG、IdeE、IdeE2、Eq5、Eq8、IdeZ、IdeZ2、Eqz 5和Eqz 8。

根据一个具体实施方案，本发明涉及一种抗原或免疫原组合物，所述组合物包含选自如下的至少2种或3种抗原或免疫原：EAG、IdeE、IdeE2、Eq5和Eq8。合适地，该组合物还包含上述抗原ScIC(SEQ ID NO：29)和CNE(SEQ ID NO：28)(也称为SEC，例如SEC 2.16)之一或两者。另一实施方案涉及包含EAG、ScIC、CNE、Eq5和Eq8的抗原组合物。

一种合适的组合物包含2种抗原或免疫原，所述抗原或免疫原分别由Eq5和Eq8组成。根据另一实施方案，本发明涉及包含3种抗原或免疫原的组合物，所述抗原或免疫原合适地由EAG、IdeE和IdeE2组成。本发明还涉及包含IdeE和IdeE2之一或两者的组合物。

本发明还涉及一种抗原组合物，其中所述至少一种蛋白或多肽选自EAG、Eq5和Eq8且所述组合物还包含至少一种抗原，所述抗原选自命名为CNE(或SEC)的蛋白或多肽(其具有SEQ ID NO：28中所示的氨基酸序列)和命名为ScIC的蛋白或多肽(其具有SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列)。合适地，所述至少一种蛋白或多肽选自IdeE和IdeE2。

本发明抗原组合物，所述组合物已显示出可用于疫苗组合物，在一个实施方案中包含抗原EAG、ScIC、CNE(或SEC)、Eq5、Eq8、IdeE和IdeE2，而在另一实施方案中，包含抗原EAG、ScIC、CNE(或SEC)、Eq5和Eq8。

本发明还涉及一种抗原组合物，其中所述至少一种蛋白或多肽选自EAG、Eq8和IdeE2且所述组合物包含选自如下的至少一种其它抗原：IdeE、Eq5、IdeZ2、Eqz5和Eqz8和/或ScIC及CNE(或SEC)。

根据本发明，所述抗原组合物合适地包含至少一种重组制备的抗原和/或至少一种分离或纯化的抗原。

从上所述，显然的是衍生自马链球菌蛋白的本发明抗原或免疫原可包含整个蛋白、所述蛋白的片段或所述蛋白的类似物，所述类似物是抗原或免疫原类似物。因此，本发明不局限于本文中具体公开的蛋白片段。

本发明抗原组合物可包含至少一种重组载体和插入其中的至少一种多核苷酸，所述多核苷酸编码所述至少一种蛋白或多肽，而所述载体能够在易被马链球菌感染的非人类哺乳动物体内表达所述多肽。

根据本发明一个实施方案，所述载体是表达载体，其为质粒或病毒载体，而其中所述多核苷酸具有编码本发明抗原的核苷酸序列。

本发明另一实施方案涉及一种用于保护非人类哺乳动物抵抗马链球菌感染的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含上述抗原组合物作为免疫组分和药学上可接受的载体。

合适地，本发明疫苗组合物包含一种抗原或免疫原组合物，所述抗原或免疫原组合物包含2种、3种或更多种本发明抗原或免疫原作为免疫组分。任选，这些抗原或免疫原的一种或多种由所述蛋白的类似物或其片段，例如N-末端或C-末端片段组成。

所述疫苗组合物可包含其它组分，如佐剂。合适地，所述佐剂刺激系统或粘膜免疫。这种佐剂在本领域中是熟知的。

用于本发明的合适佐剂包括(1)丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、马来酸酐和烯基衍生聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，(3)水包油乳液，(4)包含季铵盐的阳离子脂质，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或(8)纳米颗粒。

用于本发明的合适佐剂为产自Isconova AB，Sweden的佐剂Abisco。ISCOMS的关键组分是来自智利皂荚树皂树皮的皂树皂苷。皂树皂苷由于其激活免疫系统的能力而为人们所熟知。与胆固醇和磷脂在特定化学计量下混合的皂树皂苷形成开口笼状结构，已知为ISCOMS。

另一合适佐剂是人参。人参是从植物人参的根制备的干提取物，CA.Meyer。人参含许多称为人参皂苷的活性物质，所述人参皂苷是一种皂苷，化学上为贝壳杉系列的三萜苷。所述人参皂苷具有辅助性能，一种最有活性的佐剂是称为Rb1的馏分。已经证明：馏分Rb1引起平衡的Th1和Th2免疫应答，这可通过用Rb1辅助疫苗测量细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10分泌免疫后水平来确定。此外，人参和馏分Rb1刺激强的抗原特异性抗体应答。

根据一个合适实施方案，所述疫苗组合物是疫苗，其保护易受感染的哺乳动物，合适地为马，抵抗马链球菌马亚种引起的窒息病。

本发明疫苗组合物以可生理给药的方式提供。合适地，其通过皮下、肌肉内或鼻内接种给药。

合适地，本发明疫苗组合物刺激血清、粘膜和/或支气管灌洗抗体对易受马链球菌感染的哺乳动物，合适地为马，体内马链球菌抗原的应答。

本发明还涉及一种制备用于本发明抗原或免疫原组合物的抗原或免疫原的方法，所述方法包括：

(a)提供编码所述抗原的DNA片段并将所述片段引入表达载体；

(b)将包含所述DNA片段的所述载体引入相容的宿主细胞；

(c)在所述DNA片段编码的产物表达所需的条件下培养步骤(b)中提供的所述宿主细胞；和

(d)从培养的宿主细胞分离表达的产物。

优选地，所述方法还包含步骤(e)，其中例如通过亲和层析法或本领域已知的其它层析方法纯化步骤(d)的分离产物。

因此，本发明抗原通常通过重组技术制备。

本发明另一实施方案涉及制备本发明疫苗的方法，所述疫苗包含作为免疫组分的上述抗原或免疫原组合物，所述方法包括将所述抗原组合物和药学上可接受的载体混合。

本申请还涉及制备抗血清的方法，所述方法包括将本发明抗原制剂给药至动物宿主以在所述动物宿主中产生抗体和回收包含所述动物宿主中产生的抗体的抗血清。

此外，本发明还涉及一种预防性或治疗性治疗非人类哺乳动物，合适地为马，体内马链球菌感染的方法，所述方法包括给药至所述哺乳动物免疫有效量的本发明疫苗或抗血清。

因此，本发明涉及一种用于保护马抵抗马链球菌感染的方法，所述方法包括用本发明疫苗组合物肌肉内、皮下或鼻内或例如皮下和鼻内的组合接种马以在所述马体内诱导抵抗马链球菌的免疫应答。合适地，在所述马体内诱导了形式为鼻咽粘膜内的IgG和/或IgA和/或IgM抗体的免疫应答。

本发明还涉及一种抗体制剂，所述抗体制剂包含针对本发明抗原组合物的蛋白或多肽的至少一种，合适地至少两种特异性抗体，所述抗体是多克隆的或单克隆的；或所述制剂包含所述抗体的片段。

本发明抗体制剂当给药至易受马链球菌感染或已被马链球菌感染的非人类哺乳动物时可用于预防性地或治疗性地抵抗窒息病并提供被动免疫。

本发明描述了包含一种或几种抗原组分的疫苗组合物，所述抗原组分已按照本发明方法采用大肠杆菌作为宿主细胞制备。如果开发一些方法进行表达和纯化，这些抗原源也可以是天然细菌。或者，本发明抗原也可按照以融合策略为基础的方法进行制备，其中各抗原的各部分进行重组，在融合罐(fusion can)中产生由不同抗原的部分组成的蛋白。这种融合策略也适合于引入免疫活性部分，例如T-细胞表位或减弱的毒素(或其部分)，从而引入适合于优化抗原呈递或定位的其它特征。此外，除了大肠杆菌外，用于表达重组抗原的其它宿主也可是其它合适细菌和病毒种属。目前，用于表达异源表达的许多不同系统在分子生物学领域是熟知的。

本发明另一含意在于其可用于设计特定的马链球菌减毒突变体，所述减毒突变体缺少或具有对在宿主中生存重要的灭活基因(即导致代谢途径缺乏的突变)但保留或超量产生本发明抗原。

实验部分

已确定了马链球菌马亚种和兽疫亚种基因组的DNA序列(www.sanqer.ac.uk/)但未对其进行注解。通过筛选开放阅读框，鉴定出编码胞外蛋白的大量基因。在疫苗研究中从这些基因中选择一定量的基因、制备重组蛋白并进行评价。下面对这些基因的克隆和表达进行描述。此外，也将对这些蛋白作为抗原的用途进行描述。

实施例1.从马亚种构建包埋基因ideE、ideE2、eq5和eq8的克隆

采用马链球菌马亚种1866株(PCT/SE03/01587，Lannergard和Guss 2007)的染色体DNA作为模板扩增编码IdeE2、Eq5和Eq8(核苷酸和蛋白序列列于后面序列表中)的潜在基因。为了确定预计的信号序列，采用计算机程序SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。用于扩增基因ideE、ideE2、eq5和eq8或其一部分的引物序列列于引物表中。限制酶NcoI和XhoI的切割位点包含于引物序列中以与质粒载体pTYB4(New England Biolabs)中的克隆位点匹配。用所述引物(20pmol/μl)和ReadyToGo^TM PCR珠(GE Healthcare)采用以下程序进行PCR扩增：步骤1，在95℃预热1分钟，分离DNA链；步骤2，95℃：30秒；步骤3，46℃退火15秒；和步骤4，在72℃延伸2分钟，步骤2-4进行26个循环。在1％琼脂糖凝胶上对PCR产物进行分析，之后采用QIAquick PCR Purification Kit^TM(Qiagen)进行纯化。用限制酶切割过夜，然后采用相同试剂盒将片段再纯化一次。

引物表：用于PCR扩增基因ideE、ideE2、eq5和eq8的引物序列。划线的核苷酸对应引入的限制切割位点NcoI和XhoI。

为了克隆和制备大肠杆菌中的重组蛋白，采用了IMPACT^TM蛋白纯化系统(New England Biolabs)。按照厂家说明书培养含pTYB4载体的大肠杆菌ER2566株(New England Biolabs)，采用QIAprep Spin Miniprep(Qiagen)纯化所述载体。采用限制内切核酸酶NcoI和XhoI消化纯化的载体。消化后，用碱性磷酸酶处理所述载体以减少之后连接步骤中的再连接载体背景。为了连接所述载体和各PCR产物，采用ReadyToGo T4DNA连接酶(GE Healthcare)。连接后，采用电穿孔、涂布到LA-Amp板(含有终浓度50μg/ml的氨苄青霉素的Luria-Bertani肉汤琼脂板)上并在37℃将各样品转化成大肠杆菌ER2566株的感应态细胞培养过夜。第二天，计算菌落数目，且每种构建体培养4个菌落并用于进一步试验。为了验证各构建体中插入片段的存在，将质粒纯化并采用各引物组合进行其它PCR分析。还采用载体中杂化的引物(位于所述内含肽编码区内的T7通用正向引物和反向引物)通过DNA序列分析确定各插入片段的序列。

Lannergard和Guss之前已报道了马链球菌马亚种1866株ideE基因的克隆(2006)。ideE的GenBank登录号为DQ508733。采用引物表中列出的引物IdEG1和IdEG2克隆用于获得免疫用的重组IdeE蛋白的基因部分。PCR扩增后，用限制酶BamHI和XhoI消化DNA片段并将其连接到之前已用相同酶消化的载体pGEX6-P-1(GE Healthcare)中。

实施例2.抗原CNE、ScIC、EAG4B、IdeE、IdeE2、Eq5和Eq8的制备

使用的载体是称为IMPACT^TM T7(NEB Inc.)的大肠杆菌表达和纯化系统的一部分。简而言之，按照厂家说明书，37℃下在含有氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的Luria Bertani生长培养基中分别培养表达重组IdeE2、Eq5和Eq8的克隆。在光学密度(OD₆₀₀)～0.6下，用IPTG(终浓度0.4mM)补充生长培养基并将培养温度变到20℃。过夜孵育后，收获细胞并将其重悬浮于缓冲液[20mMTris-HCI(pH 8.0)，500mM NaCI，0.1mM EDTA和0.1％Triton X100]中并通过冻融法裂解。离心后，将上清液无菌过滤并施加到壳多糖柱上。用相同缓冲液充分清洗所述柱，随后用裂解缓冲液[20mM Tris-HCI(pH 8.0)，50mM NaCI，0.1mM EDTA和30mM二硫苏糖醇(DTT)]处理。裂解缓冲液中，还原条件诱导内含肽介导的自我切割，所述自我切割将抗原部分从柱上释放出来而内含肽-壳多糖结合部分仍然结合。在磷酸盐缓冲盐水[PBS；137mM NaCI，2.7mMKCI，10mM Na₂HPO₄，1.4mM KH₂PO₄(pH 7.4)]中透析含抗原的洗提样品并进行浓缩。确定获得的抗原的量并采用SDS-PAGE检测质量。按照厂家(GE Healthcare)推荐的方法采用GST-亲和层析系统制备并纯化重组IdeE蛋白。重组蛋白CNE(SEC)、ScIC和EAG4B抗原制备的描述之前已有说明(WO 2004/032957(PCT/SE03/01587)，Waller等人，2007)。以下实施例中，EAG4B蛋白简称为EAG。

实施例3.重组IdE2切割IgG

IdE已显示为特异性裂解各物种的IgG的蛋白酶(Lannegard和Guss 2006)。为了测试重组IdeE2是否还裂解抗体，在37℃下将人、马和小鼠的IgG在PBS中孵育1小时。纯化的重组IdeE用作阳性对照而阴性对照为纯IgG。裂解后，采用8-25％梯度SDS-PAGE对样品进行分析。结果显示：重组IdeE2裂解马IgG比IdeE更有效。

实施例4.马链球菌兽疫亚种中基因ideE.ideE2.eq5和eq8的存在

之前已报道了兽疫亚种中同源马亚种ideE基因的存在(Lannegard和Guss 2006)。采用链球菌兽疫亚种基因组数据库(www.sanger.ac.uk/)，用BLAST检索分析兽疫亚种中类似于ideE2、eq5和eq8的基因的存在。结果显示：检测到了编码类似蛋白的基因。这些基因的序列称为ideZ2、eqz5和eqz8，与氨基酸序列IdeZ2、Eqz5和Eqz8显示于本说明书实验部分的序列表中。

实施例5.用Eq5和Eq8对小鼠免疫

将重量接近23-25g的小鼠(NMRI)放置在笼中，每个笼中放置5只动物。用12微克各抗原和10微克Abisco 300(Isconova AB，Sweden)鼻下免疫所述小鼠。15只动物用抗原(Eq5和Eq8)免疫而15只动物仅给予Abisco 300佐剂以用作阴性对照。控制总量低于27μl并以30分钟的间隔时间施用到小鼠鼻孔内两次，所述小鼠用Isoflovet(Abbot Laboratories，England)麻醉。在第0天、第13天和第32天进行免疫。

实施例6.用EAG、IdeE和IdeE2对小鼠免疫

用EAG、IdeE和IdeE2进行免疫基本上如Eq5和Eq8一样。然而，将动物分成三组，每组10只小鼠。这些给予EAG+IdeE+IdeE2或仅EAG，而一组仅给予佐剂Abisco 300，作为阴性对照。在第0天、第21天和第53天进行免疫。在第60天进行实验性感染。

实施例7.用马链球菌马亚种进行实验性感染

对于Eq5+Eq8，在第43天(最后一次免疫10天后)进行实验性感染，而对于EAG+/-IdeE+IdeE2，在第60天(最后一次免疫10天后)进行。采用临床窒息病病例的马链球菌马亚种1866株。通过将ca 10⁶CFU接种到麻醉小鼠的鼻孔内使得该株首先通过动物。7天后从小鼠的鼻子回收细菌并在37℃下在5％CO₂中的BG板上培养。37℃下在BG板上培养单个菌落过夜并将之重悬浮于含1％酵母提取物(THY)的Todd Hewitt Broth(THB)。将培养物保存在-80℃的小瓶中，每次实验使用新的瓶子。为了感染小鼠，37℃下在5％CO₂中的BG板中培养细菌过夜，然后接种到THY并不摇晃地培养过夜。接着将培养物以10倍稀释到THY和10％马血清(Sigma)中并在37℃下在5％CO₂中培养4小时。将培养物离心分离并重悬浮于THB中。将10μl含1×10⁶CFU的剂量用于所有小鼠的马链球菌感染。每天跟踪动物。通过将动物的鼻子以可重复的方式轻轻地压到血琼脂板按0至+++的四级标准对细菌的鼻内生长进行评分。然后将鼻内样品涂布到所述板的整个表面上。一个+表示5-100个菌落；两个+表示超过100个而三个+表示汇合生长。每天测定重量并计算重量损失百分率。

实施例8.接种的实验结果

用Eq5和Eq8对小鼠免疫并确定随时间的重量损失百分率。图1显示：接种动物(n＝15)的重量损失比对照动物少(n＝15)。所有这些天，P值＝0.0001(学生t-检验)。也按四级标准每天确定马链球菌的鼻内生长。图2显示：接种动物的鼻内生长比对照组少许多。两组之间在第5天的动物细菌鼻内总定居的频率明显不同(得分2-3)；p＝0.002(Fisher′s精确检验)。

下一个实验中，小鼠用EAG(n＝10)、EAG+IdeE+IdeE2(n＝10)接种或不接种(n＝10)。确定随时间的重量损失百分率。图3显示：用EAG+IdeE+IdeE2接种的动物的重量损失比对照动物少。第3天、第5天和第6天的P值分别为0.0013、0.0008和0.0009(学生t-检验)。仅用EAG接种的动物的重量损失幅度也类似于对照动物。也按四级标准每天确定马链球菌的鼻内生长。图4显示：用EAG+IdeE+IdeE2接种的动物的鼻内生长比对照组少许多。再次，仅用EAG进行接种没有显示出保护作用。

实施例9.Eq5、Eq8和EAG、CNE、ScIC对小鼠进行免疫

如上用鼻内给予Eq5+Eq8和EAG+CNE+ScIC对三组小鼠进行免疫，每组有十只小鼠。一组用Eq5+Eq8，一组用EAG+CNE+ScIC免疫。第三组为用Abisco-300的对照组。在第0天、第14天和第22天进行免疫。在第29天进行攻击。实验结果显示于图5a和图5b中。图5a和b显示出EAG+CNE+ScIC(n＝10)的明显保护。第2天和第5天的P值为0.04和0.09。用Eq5+Eq8进行的保护更显著，其中这些天的p值为0.005和0.009。

序列表

(1)将SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：14结合以在ideE2的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)下面显示出IdeE2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)

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(2)SEQ ID NO：2显示了重组IdeE2蛋白序列。粗体的氨基酸是与pTYB4载体编码的氨基酸对应的那些氨基酸而其余来源于IdeE2蛋白。

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(3)将SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：15结合以在eq5基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)下面显示Eq5蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)

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(4)SEQ ID NO：4显示了重组Eq5蛋白序列：粗体的氨基酸是与pTYB4载体编码的氨基酸对应的那些氨基酸而其余来源于Eq5蛋白。

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(5)将SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：16结合以在eq8基因的核苷酸序列(SEQID NO：16)下面显示Eq8蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)

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(6)SEQ ID NO：6显示了重组Eq8蛋白序列：粗体的氨基酸是与pTYB4载体编码的氨基酸对应的那些氨基酸而其余来源于Eq8蛋白。

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(7)将SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：17结合以在马链球菌兽疫亚种的ideZ2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)下面显示IdeZ2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)

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(8)将SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：18结合以在马链球菌兽疫亚种的eqz5基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：18)下面显示Eqz5蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)

atgaagaaattcacgaaacggtgtctt

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A L A V I A C A G Q L A I V S R R K E S

aattaa

N -

(9)将SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：19结合以在马链球菌兽疫亚种的eqz8基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)下面显示Eqz8蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO：9)

atgaacaaaaaatcagca

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F F T P A A I A I M I A A G T I A I P K

cgcaaggaagaagactaa

R K E E D -

(10)将SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：20结合以在ideE基因的核苷酸序列(SEQID NO：20)下面显示IdeE蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)

显示了马链球菌马亚种的ideE基因的核苷酸序列(GenBank DQ508733)和IdeE蛋白的氨基酸序列。

atgaaaacaatagcttatccaaataaacctcactccttatcagctggtctcttaactgct

M K T I A Y P N K P H S L S A G L L T A

atagctatttttagcctggcgagttcaaacattacttatgctgacgattaccaaaggaat

I A I F S L A S S N I T Y A D D Y Q R N

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A T E A Y A K E V P H Q I T S V W T K G

gttacaccactaacacccgagcagtttcgatataataacgaagatgtgatccatgcgcca

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tatcttgctcatcaaggctggtacgatatcaccaaggccttcgatgggaaggataatctc

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K K I E G E N I G A Q V L G L F T L S S

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G K D I W Q K L S -

(11)将SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：21结合以在ideZ基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：21)的下面显示IdeZ蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)。

显示了马链球菌兽疫亚种的ideZ基因的核苷酸序列(Genbank DQ826037)和IdeZ蛋白的氨基酸序列。

atgaaaacaatagcttatccaaataaacctcactccttatcagctggtctcttaactgct

M K T I A Y P N K P H S L S A G L L T A

atagctatttttagcctggcgagttcaaacattacttatgctgacgattaccaaaggaat

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G K D I W Q K L S -

(12)SEQ ID NO：12

eag基因的核苷酸序列

1 aaataattttgtttaactttaagaaggagatataaccatggctctagatg

51 ctacaacggtgttagagcctacaacagccttcattagagaagctgttagg

101 gaaatcaatcagctgagtgatgactacgctgacaatcaagagcttcaggc

151 tgttcttgctaatgctggagttgaggcacttgctgcagatactgttgatc

201 aggctaaagcagctcttgacaaagcaaaggcagctgttgctggtgttcag

251 cttgatgaagcaagacgtgaggcttacagaacaatcaatgccttaagtga

301 tcagcacaaaagcgatcaaaaggttcagctagctctagttgctgcagcag

351 ctaaggtggcagatgctgcttcagttgatcaagtgaatgcagccattaat

401 gatgctcatacagctattgcggacattacaggagcagccttgttggaggc

451 taaagaagctgctatcaatgaactaaagcagtatggcattagtgattact

501 atgtgaccttaatcaacaaagccaaaactgttgaaggtgtcaatgcgctt

551 aaggcaaagattttatcagctctaccgtagctcgagcccgggtgctttgc

(13)SEQ ID NO：13

EAG4B蛋白的氨基酸序列

1 MALDATTVLE PTTAFIREAV REINQLSDDY ADNQELQAVL ANAGVEALAA DTVDQAKAAL

61 DKAKAAVAGV QLDEARREAY RTINALSDQH KSDQKVQLAL VAAAAKVADA ASVDQVNAAI

121 NDAHTAIADI TGAALLEAKE AAINELKQYG ISDYYVTLIN KAKTVEGVNA LKAKILSALP

(14)SEQ ID NO：28

SEC2.16(CNE)的蛋白序列

Met Ala Thr Asn Leu Ser Asp Asn Ile Thr Ser Leu Thr Val Ala Ser

1 5 10 15

Ser Ser Leu Arg Asp Gly Glu Arg Thr Thr Val Lys Val Ala Phe Asp

20 25 30

Asp Lys Lys Gln Lys Ile Lys Ala Gly Asp Thr Ile Glu Val Thr Trp

35 40 45

Pro Thr Ser Gly Asn Val Tyr Ile Gln Gly Phe Asn Lys Thr Ile Pro

50 55 60

Leu Asn Ile Arg Gly Val Asp Val Gly Thr Leu Glu Val Thr Leu Asp

65 70 75 80

Lys Ala Val Phe Thr Phe Asn Gln Asn Ile Glu Thr Met His Asp Val

85 90 95

Ser Gly Trp Gly Glu Phe Asp Ile Thr Val Arg Asn Val Thr Gln Thr

100 105 110

Thr Ala Glu Thr Ser Gly Thr Thr Thr Val Lys Val Gly Asn Arg Thr

115 120 125

Ala Thr Ile Thr Val Thr Lys Pro Glu Ala Gly Thr Gly Thr Ser Ser

130 135 140

Phe Tyr Tyr Lys Thr Gly Asp Ile Gln Pro Asn Asp Thr Glu Arg Val

145 150 155 160

Arg Trp Phe Leu Leu Ile Asn Asn Asn Lys Glu Trp Val Ala Asn Thr

165 170 175

Val Thr Val Glu Asp Asp Ile Gln Gly Gly Gln Thr Leu Asp Met Ser

180 185 190

Ser Phe Asp Ile Thr Val Ser Gly Tyr Arg Asn Glu Arg Phe Val Gly

195 200 205

Glu Asn Ala Leu Thr Glu Phe His Thr Thr Phe Pro Asn Ser Val Ile

210 215 220

Thr Ala Thr Asp Asn His Ile Ser Val Arg Leu Asp Gln Tyr Asp Ala

225 230 235 240

Ser Gln Asn Thr Val Asn Ile Ala Tyr Lys Thr Lys Ile Thr Asp Phe

245 250 255

Asp Gln Lys Glu Phe Ala Asn Asn Ser Lys Ile Trp Tyr Gln Ile Leu

260 265 270

Tyr Lys Asp Gln Val Ser Gly Gln Glu Ser Asn His Gln Val Ala Asn

275 280 285

Ile Asn Ala Asn Gly Gly Val Asp Gly Ser Arg Tyr Thr Ser Phe Thr

290 295 300

Val Lys Lys Ile Trp Asn Asp Lys Glu Asn Gln Asp Gly Lys Arg Pro

305 310 315 320

Lys Thr Ile Thr Val Gln Leu Tyr Ala Asn Asp Gln Lys Val Asn Asp

325 330 335

Lys Thr Ile Glu Leu Ser Asp Thr Asn Ser Trp Gln Ala Ser Phe Gly

340 345 350

Lys Leu Asp Lys Tyr Asp Ser Gln Asn Gln Lys Ile Thr Tyr Ser Val

355 360 365

Lys Glu Val Met Val Pro Val Gly Tyr Gln Ser Gln Val Glu Gly Asp

370 375 380

Ser Gly Val Gly Phe Thr Ile Thr Asn Thr Tyr Thr Pro Glu Val Ile

385 390 395 400

Ser Ile Thr Gly Gln Lys Thr Trp Asp Asp Arg Glu Asn Gln Asp Gly

405 410 415

Lys Arg Pro Lys Glu Ile Thr Val Arg Leu Leu Ala Asn Asp Ala Ala

420 425 430

Thr Asp Lys Val Ala Thr Ala Ser Glu Gln Thr Gly Trp Lys Tyr Thr

435 440 445

Phe Thr Asn Leu Pro Lys Tyr Lys Asp Gly Lys Gln Ile Thr Tyr Thr

450 455 460

Ile Gln Glu Asp Pro Val Ala Asp Tyr Thr Thr Thr Ile Gln Gly Phe

465 470 475 480

Asp Ile Thr Asn His His Glu Val Ala Leu Thr Ser Leu Lys Val Ile

485 490 495

Lys Val Trp Asn Asp Lys Asp Asp Tyr Tyr His Lys Arg Pro Lys Glu

500 505 510

Ile Thr Ile Leu Leu Lys Ala Asp Gly Lys Val Ile Arg Glu His Gln

515 520 525

Met Thr Pro Asp Gln Gln Gly Lys Trp Glu Tyr Thr Phe Asp Gln Leu

530 535 540

Pro Val Tyr Gln Ala Gly Lys Lys Ile Ser Tyr Ser Ile Glu Glu Lys

545 550 555 560

Gln Val Ala Gly Tyr Gln Ala Pro Val Tyr Glu Val Asp Glu Gly Leu

565 570 575

Lys Gln Val Thr Val Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ser Tyr Lys Leu Glu

580 585 590

Pro Gly

(15)SEQ ID NO 29

ScIC的蛋白序列

Met Thr Asn Lys Thr Lys Arg Thr Gly Leu Val Arg Lys Tyr Gly Ala

1 5 10 15

Cys Ser Ala Ala Ile Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ser Leu Gly Ala Gly

20 25 30

Lys Ala Val Lys Ala Asp Gln Pro Ala Ala Leu Lys Tyr Pro Glu Pro

35 40 45

Arg Asp Tyr Phe Leu His Thr Arg Glu Gly Asp Val Ile Tyr Asp Glu

50 55 60

Asp Ile Lys Arg Tyr Phe Glu Asp Leu Glu Ala Tyr Leu Thr Ala Arg

65 70 75 80

Leu Gly Gly Ile Asp Lys Lys Val Glu Glu Ala Ala Gln Lys Pro Gly

85 90 95

Ile Pro Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Asp

100 105 110

Pro Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Asp Thr

115 120 125

Gly Glu Ala Gly Pro Arg Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Gln Ala Gly

130 135 140

Glu Arg Gly Pro Lys Gly Asp Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly Glu

145 150 155 160

Lys Gly Asp Thr Gly Ala Val Gly Pro Lys Gly Glu Lys Gly Asp Thr

165 170 175

Gly Ala Thr Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu Arg Gly Glu Lys Gly

180 155 190

Glu Gln Gly Gln Arg Gly Glu Lys Gly Glu Gln Gly Gln Arg Gly Glu

195 200 205

Lys Gly Glu Gln Lys Pro Lys Gly Asp Gln Gly Lys Asp Thr Lys Pro

210 215 220

Ser Ala Pro Lys Ala Pro Glu Lys Ala Pro Ala Pro Lys Ala Pro Lys

225 230 235 240

Ala Ser Glu Gln Ser Ser Asn Pro Lys Ala Pro Ala Pro Lys Ser Ala

245 250 255

Pro Ser Lys Ser Ala Ala Pro Thr Gly Gln Lys Ala Ala Leu Pro Ala

260 265 270

Thr Gly Glu Ile Asn His Pro Phe Phe Thr Leu Ala Ala Leu Ser Val

275 280 285

Ile Ala Ser Val Gly Val Leu Thr Leu Lys Gly Lys Lys Asp

290 295 300

(16)SEQ ID NO 30.重组蛋白IdeE

GPLGSDDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYL

A

HQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKII

FNNQELF

DLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVF

KTQSTD

VNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRA

LALSH

TYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHRHVAI

SAKKI

EGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

粗体氨基酸来源于载体

实施例10.接种研究

本研究的目的是确定用Intervacc的新型多组分亚单位疫苗接种然后用野生型马链球菌4047株在威尔士山地小型马体内进行鼻内攻击后赋予的保护水平。Animal Health Trust，UK已进行了此研究。本文中所用的疫苗，命名为Nordostrep Septavac或Nordostrep Pentavac A(或仅Septavac或Pentavac)讨论如下。

方法

在接种期首先将所述小马随机分成3组。

表1：接种组

组	疫苗	每组的数目	路径
				1	Nordostrep Septavac	7	IN+SC
2	Nordostrep Pentavac A	7	IN+SC
				3	空白对照剂	7	IN+SC

第一次试验中，攻击第1组和第3组。(第9节中描述了第二次试验第2组(Pentavac A)的攻击)。Intervacc在攻击前一周攻击作出攻击哪一接种组的决定。Nordostrep Pentavac A制剂

Pentavac疫苗由以下五种马链球菌重组蛋白组成：EAG、ScIC、CNE、Eq5和Eq8。对于皮下接种，在PBS中将所述五种蛋白混合(各蛋白为50μg/ml)，等分成1ml，装在小瓶中并在-20℃下储存。就在接种前，将小瓶解冻并与1ml佐剂(Abisco 200，375μg/剂，Isconova AB，Sweden)混合。对于鼻内接种，在PBS中将所述五种蛋白混合(各蛋白为150μg/ml)，等分成2ml，装在小瓶中并在-20℃下储存。就在接种前，将小瓶解冻并与2ml佐剂(Abisco 300，500μg/剂，Isconova AB，Sweden)混合。空白对照制剂中，省略了马链球菌蛋白。因此，皮下接种用的空白对照剂仅包含PBS和Abisco 200，375μg/剂，而就鼻内接种而言，空白对照剂包含仅PBS和Abisco 300，500μg/剂。

Nordostrep Septavac制剂

Septavac疫苗由以下七种马链球菌重组蛋白组成：EAG、ScIC、CNE、Eq5、Eq8、IdeE和IdeE2。对于皮下接种，在PBS中将所述七种蛋白混合(各蛋白为50μg/ml)，等分成1ml，装在小瓶中并在-20℃下储存。就在接种前，将小瓶解冻并与1ml佐剂(Abisco 200，375μg/剂，Isconova AB，Sweden)混合。对于鼻内接种，在PBS中将所述七种蛋白混合(各蛋白为150μg/ml)，等分成2ml，装在小瓶中并在-20℃下储存。就在接种前，将小瓶解冻并与2ml佐剂(Abisco 300，500μg/剂，Isconova AB，Sweden)混合。空白对照制剂中，省略了马链球菌蛋白。因此，皮下接种用的空白对照剂仅包含PBS和Abisco 200，375μg/剂，而就鼻内接种而言，其仅包含PBS和Abisco 300，500μg/剂。

这些制剂中，EAG由片段EAG4B组成，而CNE是命名为2.16的片段。

结果简述

本研究评价了新型多组分亚单位疫苗预防窒息病的功效。在第一次和第二次接种后1天，Septavac疫苗在小马体内引起了发热。然而，没有其它副反应，这种疫苗似乎有非常好的耐受性。

用相同剂量的1×10⁸cfu马链球菌4047株攻击所有小马，将其分开并通过两个鼻孔给予。所有七匹对照小马有发热和多淋巴结脓肿(100％)。仅一匹接种小型马有发热(这可能是由于正在进行中的链球菌兽疫亚种感染)，且仅一匹形成淋巴结脓肿(14％)。从统计学上说，接种的小马明显地被保护抵抗马链球菌侵害，正如温度、死后评分和纤维蛋白原和中性粒细胞水平所确定的。

总之，Septavac疫苗是一种预防窒息病的安全、有效疫苗。然而，本发明不局限于本实施例中已研究的Septavac和Pentavac疫苗，本发明抗原/免疫原的多种组合物是用于预防窒息病用疫苗组合物中的可能候选物。

1步骤

两个早期研究(WO 2004/032957 A1和参考文献27)表明：Intervacc疫苗赋予一些抵抗马链球菌攻击的保护。经过该两个研究的所有四个接种组表现出咽鼓管囊积脓减少。本研究旨在比较两种Nordvacc疫苗的免疫原性：一种包含五种马链球菌蛋白(Pentavac)，一种包含七种马链球菌蛋白(Septavac)。

按照试验方案进行血液和鼻洗出物样品取样以确定疫苗亚单位的马免疫应答。根据免疫原性数据，攻击一个免疫组以量化赋予的保护水平。

各小马受到总攻击剂量为1×10⁸cfu的马链球菌4047株，通过将含5×10⁷cfu的2ml培养物喷雾到两鼻孔内给药。据信此剂量方案使得感染速率最佳化同时避免压制宿主免疫应答。

攻击后三个星期内通过常规检查、每日身体检查、监控体温、取血浆确定血清转变和取鼻洗出物进行细菌学分析来仔细监控小马的疾病临床症状发作。所有小马在脓肿或在攻击后三周达到研究终点之后经过尸检以按照AHT建立的评分系统确定疾病病理学的严重度。采用从此研究小马中回收的组织的组织病理学检测确定马链球菌感染的早期症状，所述早期症状在尸检(PM)时不明显。

评价：

NW＝鼻洗出物

BL＝血液样品

1.在所有三种情况下在两鼻孔内的滴鼻免疫(各鼻孔内2×2ml＝4ml/接种)

2.靠近下颌下淋巴结的皮下免疫(1ml)

3.将对两组7匹马进行接种和7匹未接种/对照

4.通过Intervacc AS分析的血清中的IgG；通过AHT(7种抗原)分析的NW中IgG

2.1疫苗

马用Nordostrep疫苗

第1组：7匹马用Nordostrep Pentavac A接种

2ml皮下注射(头部每侧1ml)

4ml鼻内注射(各鼻孔2ml)

第4天；第60天；第74天

第2组：7匹马用Nordostrep Septavac接种

2ml皮下注射(头部每侧1ml)

4ml鼻内注射(各鼻孔2ml)

第4天；第60天；第74天

第3组：7匹马用空白对照剂接种

2ml皮下注射(头部每侧1ml)

4ml鼻内注射(各鼻孔2ml)

第4天；第60天；第74天

在第一次接种前，通过AHT接收疫苗瓶并将其储存在号码为EQ No.2305的-20℃冰箱内直至使用。将空白对照剂(不含抗原)和佐剂瓶储存在编号为EQNo.44的4℃冰箱内直至使用。

接种时，由AHT的A Waller、L Prowse或C Robinson按照实验方案中所述现场混合疫苗和佐剂。

2.2攻击菌

如SOP/BACT/25中所述采用新鲜板制备马链球菌4047株。

所述细菌如所预计生长，当OD_600nm达到0.3时收获1∶40的稀释培养物。图6中显示了攻击接种物的生长。获得以下结果。

平板培养结果：1/10⁵稀释 37个菌落

35个菌落

33个菌落

32个菌落

平均值＝34.25/100μl

因此每匹小马的实际剂量＝4×34.25×10⁵×10＝1.37×10⁸cfu/剂

3动物管理

3.1供应

采用了原本由Mr Beedies，Shropshire，UK提供的21匹威尔士山地小马。第一次接种时小马约8个月大。

3.2识别/分配

通过颈内的微芯片识别小马。将所述21匹小马随机分配成接种组(表3)。

表3：接种组和小马芯片ID

组	疫苗	小马芯片ID
			1	Septavac	00012、00159、00833、00976、99123、99668、99794
2	Pentavac	01298、01605、01724、99223、99229、99773、99919
			3	空白对照剂	00173、00427、01635、02078、99549、99776、99886

3.3养殖

在攻击之前，将小马在Lanwades Park，Kentford，UK和Kirtling，Newmarket，UK的草原牧场上喂养。内政部已经批准这些地方用于这种工作。饮用水可随意使用。

在攻击前3天将第1组和第3组的小马转移到ACVS(Allen Centre)以让其适应。根据接种组将小马分开到两个动物房间内，使得每个接种组的小型马在一起。

4方法

4.1接种

按照AHT SOP/EQU/03靠近咽后淋巴结通过皮下注射或按照AHTSOP/EQU/07通过鼻内喷雾进行接种。

4.1.2初步临床检查

在第一次接种、V2(由于链球菌兽疫亚种感染)和V3之前，兽医临床检查所有小马。仅良好临床条件下的健康小马包含于本研究中(SOP/EQU/08)。

4.1.3接种

小马按照表4接受接种。除了小马9229由于正在进行的链球菌兽疫亚种感染在2008年2月14日发热以外。该小马在周末痊愈并在2008年4月18日进行接种。

表4：接种路径和日期

组	疫苗	V1	V2^*	V3^*
					A	Septavac	14/2/08	10/4/08	24/4/08
B	Pentavac	14/2/08	10/4/08	24/4/08
					C	空白对照剂	14/2/08	10/4/08	24/4/08

^*由于链球菌兽疫亚种感染延迟7天。

4.1.4接种处周围的临床观察

接种后每天进行临床观察。如果发生副反应，那么根据需要进行其它检查。

4.2用马链球菌4047进行实验性攻击

4.2.1初步临床检查

在转移到ACVS之前，兽医临床检查接受攻击的马。仅在良好临床条件下的健康小马接受攻击。

4.2.2攻击

第3次接种后两周(08/05/08)，按照AHT SOP/BACT32采用柔性管和喷嘴将2ml新鲜马链球菌4047培养物通过鼻内给药至两鼻孔内来攻击各小马。这种攻击剂量预计包含总共1×10⁸cfu马链球菌4047。

攻击剂量的给药过程中没有遇到困难。剩下的接种体用于确定实际给予的攻击剂量，发现为1.37×10⁸cfu/剂。

4.3攻击后监控

4.3.1临床检查

按照AHT SOP/EQU/02检查小马。在攻击日、接下来21天的每一天临床检查各小马与马链球菌感染相关症状(举止、鼻涕、淋巴结肿胀和脓肿、咳嗽、难以吞咽和进食，和眼部症状)的出现。

4.3.2直肠温度

在攻击日到攻击后第21天的上午9点测量各小马的直肠温度。

4.4血液取样

按照AHT SOP/EQU/01并根据本研究实验方案日程从颈静脉采取血液样品。按照AHT SOP/EQU/01制备血清并在-20℃或以下冰冻储存待用。

4.5血液样品的处理

在Animal Health Trust的Andrew Waller负责下，由Leah Prowse进行血液样品的处理。

4.6鼻洗出物样品的处理

根据本研究实验方案日程中所述按照AHT SOP/EQU/02收集各小马的鼻洗出物。

在取样时现场将500μl鼻洗出物样品加到500μl Todd-Hewitt Broth中，以转移到实验室来按照AHT SOP/BACT/02确定每ml中的β-溶血型链球菌数目。将剩余的鼻洗出物样品离心分离，并将上清液轻轻倒入干净的5ml聚丙烯管中，在-70℃储存待用以定量粘膜抗体。

4.7尸检

准备以在由于脓肿或攻击21天后达到研究终点时无痛致死之后由Animal Health Trust对所有小马进行完整的尸检。

将组织样品保存在磷酸盐缓冲的福尔马林中并按照标准技术进行显微镜检查，提供完整的正式报告。取得组织拭子，记录结果并用于评价马链球菌感染的水平。从实验方案所述的各区域取得木炭拭子并在COBA链球菌选择板上进行处理以确定马链球菌的存在。

采用表5中的系统进行窒息病病理学评分。

表5：病理学评分系统

病理学	得分
		咽后或下颌下淋巴结脓肿	15
咽后或下颌下淋巴结微脓肿	10
		咽鼓管囊积脓	5
咽鼓管囊瘢痕	5
		肿大淋巴结	1
咽鼓管囊滤泡增生	1

4.8组织病理学检查

将尸检时从小马取得的组织样品固定于福尔马林中，切成多个切片并送到Royal Veterinary College的Ken Smith教授处进行分析。Smith教授对来自各小马的样品作报告并按照表6对其观察进行评分。

表6：组织病理学评分系统

组织病理学	评分
		鼻炎	1
淋巴结炎	1
		咽炎	1
淋巴结脓肿	5
		咽鼓管囊积脓	5

偏差

按照研究实验方案08.C001P及随后的修改进行本研究，与协商一致的研究实验方案有如下偏差：

·小马9229由于正在进行的链球菌兽疫亚种感染而在2008年2月14日发热。该小型马在周末痊愈并在2008年4月18日接种。

·由于45％小马发生链球菌兽疫亚种感染而将V2日期延迟7天。这对V3和攻击产生连锁反应效果，它们也延迟了7天。

·由于人员不足，对小马进行取样延迟了一天。应在第85天取样的小马实际上在第86天取样。

·在第86天采集了20ml EDTA血液而不是10ml以使纯化小马的DNA存档。

·Nordvacc决定保留未攻击的Pentavac组(2)6个月以监控抗体应答的持续时间。

6研究结束时小马的命运

将第1组和第3组的所有小马无痛致死并进行尸检。保留第2组中的小马6个月以监控抗体应答的持续时间。

7存档

Animal Health Trust，Lanwades Park，Kentford，Newmarket，Suffolk，CB87UU将原始数据存档。

8结果总结

8.1第一次和第二次接种后的应答

8.1.1临床应答

所有小马对第一次接种作出了很好的应答。所有组中没有观察到注射部位反应。然而，接种组中观察到直肠温度升高(图7)。这在Septavac组中最明显，7匹中的4匹在V1一天后产生发热(温度＞38.9℃)，7匹中的5匹在V2一天后产生发热。相比之下，V1后Pentavac组的7匹中的2匹发热，对照组中没有小马发热，而Pentavac组的3匹小马在V2后发热且对照组中没有。有趣的是，仅1匹Septavac、2匹Pentavac和1匹对照小型马在V3后形成发热。这可能是由于V2后引起的高水平抗体，其可能已经更有效地中和了疫苗中的抗原。

除了具有正在进行的、对这个年龄小马典型的链球菌兽疫亚种感染的有些小马外，接种阶段研究组之间的鼻内评分(图8)、淋巴结评分(图9)或链球菌兽疫亚种计数(图10)没有明显差异。这导致最初V2日(03/04/08)左右的平均直肠温度提高，如图7中所示。让小马的这种链球菌兽疫亚种感染痊愈并在10/04/08对所有小马进行接种。

8.2攻击后的应答

两种攻击的准备和进行都进展非常顺利，所有小马在8/5/08都无意外地接受了所需剂量的马链球菌。

最早的发热是对照小马2078在攻击后第4天。另外两匹小马在第5天发热，另一匹在第6天和第7天发热，最后对照小马在第10天发热(图11)。对照小马发热的平均天数为4.2天，而接种小马为0.7天(表7)。然而，应该注意在攻击后第8天在安静地面上将对照小马无痛致死，攻击后第13天所有对照小马都已无痛致死。这对对照小马的平均温度、观察评分、纤维蛋白原和中性粒细胞水平和观察得分产生连锁反应影响，这些由于受到马链球菌感染的小马被无痛致死而下降。

总之，攻击后第5天至第11天两组的平均温度存在明显差异(图11)。其中Septavac小马中，仅小马0976在第8天发热(表7)。然而，这个可能是由于在该小马体内明显的、正在进行的链球菌兽疫亚种感染。

攻击后第6天、第8天和第11天两研究组之间的纤维蛋白原水平明显不同(图12)。所有对照小马都产生了较高的纤维蛋白原水平，但仅2匹接种小马(小型马0976和9794)具有较高水平。

攻击后第6天、第8天和第11天时两研究组之间的中性粒细胞水平也明显不同(图13)。所有对照小马产生较高的中性粒细胞水平，但仅1匹接种小马(小型马9794)具有较高水平。

对照小马的下颌下淋巴结肿胀水平升高，尽管这没有达到统计学显著(图14)。研究组之间的鼻排出物(图15)或链球菌兽疫亚种计数(图16)没有差异。

尸检时，发现所有对照小马具有多个淋巴结脓肿，而仅一匹接种小马9794具有淋巴结脓肿(表8和9)。整体而言，对照小型马和的平均病理学评分分别为和11.7，表明Septavac疫苗诱导出显著的保护水平(图17)。从所有对照小马的淋巴结都分离出了马链球菌，但仅从2匹接种小马(0976和9794)的淋巴结分离出马链球菌(表10)。这些发现得到组织病理学检查的加强，所述检查证实了仅一匹Septavac小马在至少两个淋巴结中产生脓肿(表11和图18)。

此外，采用ELISA测定了septavac组鼻洗出物和血清样品中的IgG水平(图19和20)，表明该抗原产生了粘膜和血清抗体。

表7：攻击后发热天数

组	小马ID	天数
			Septavac	0012	0
Septavac	0159	0
			Septavac	0833	0
Septavac	0976	5
			Septavac	9123	0
Septavac	9668	0
			Septavac	9794	0
对照	0173	2
			对照	0427	4
对照	1635	5
			对照	2078	4
对照	9549	4

对照	9776	5
			对照	9886	6

Septavac组平均＝0.7天

对照组平均＝4.2天^*

^*所有对照小马在攻击后第13天被无痛致死，但大多数在草地上被无痛致死之前继续具有较高温度。

表8：攻击后尸检分析

组	小马ID	总尸检评分
			Septavac	0012	6
Septavac	0159	3
			Septavac	0833	5
Septavac	0976	6
			Septavac	9123	4
Septavac	9668	1
			Septavac	9794	57
对照	0173	42
			对照	0427	53
对照	1635	66
			对照	2078	49
对照	9549	57
			对照	9776	43
对照	9886	42

表9：死后脓肿数目与位置

SMLN-下颌下淋巴结

RPLN-咽后淋巴结

√＝脓肿

表10：死后在淋巴结中发现的马链球菌计数

除了淋巴结外，小马0833和0159在其它区域显示了稀疏的马链球菌。小马0012、9123和9668没有显示马链球菌。

Con-汇合

SMLN-下颌下淋巴结

RPLN-咽后淋巴结

9.Pentavac A接种研究

在第二次试验中，将第三次接种V3(表4)后的第2组7匹马(3.2节，表3)供养在草原牧场上，常规采集血样以在ELISA中测定抵抗Pentavac A制剂中存在的五种抗原的IgG抗体滴度(图21)。在第270天(2008年11月6日)，按照4.1节中所述的步骤给予Pentavac A加强剂。在攻击前，将所述组转移到ACVS并在攻击剂量14天后，如4.2节中所述用马链球菌4047试实验性攻击所述组并如4.3节中所述进行基本监控。

9.1Pentavac A接种研究简述

Pentavac A研究揭示：接种后，抵抗各抗原的明显抗体应答保持了至少六个月(图21)。

Pentavac A疫苗延迟了马链球菌攻击后感染的发作，该组中一匹小马没有发展成窒息病。

其它应用

本发明的一个启示是降解免疫球蛋白的酶可用作疫苗中的抗原来保护目标动物抵抗感染。因此，本发明的一个实施方案是：关于人致病性A链球菌群(GAS)，可能构建一种疫苗组合物，所述疫苗组合物保护人类抵抗这种细菌引起的感染。GAS毒株中有几种已报道的胞外免疫球蛋白降解蛋白(称为Sib35、IdeS或Mac蛋白)，它们具有与IdeE和IdeE2同源的氨基酸序列，因此，根据本发明，可进行纯化并单独或与A群毒株的其它纯化的胞外蛋白(如M蛋白或M样蛋白或其片段)组合用作疫苗中的抗原。正如本发明中所述，另一启示是本发明可用于开发特异性抗血清、多克隆或单克隆抗体以用于诊断目的或用于目标动物包括人的被动免疫。

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30.WO 2007/115059

Claims

1.一种抗原组合物，所述抗原组合物包含至少一种抗原，其中所述至少一种抗原包含马链球菌(Streptococcus equi)马亚种(subsp.equi)或兽疫亚种(subsp.Zooepidemicus)的至少部分蛋白或多肽且所述至少部分蛋白或多肽包含至少一种马链球菌抗原表位或抗原决定簇，且其中所述蛋白或多肽选自如下蛋白或多肽或其类似物或片段：

命名为Eq5并具有SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列的蛋白或多肽；

命名为Eq8并具有SEQ ID NO：5中所示氨基酸序列的蛋白或多肽；

且其中包含EAG的组合物包含至少一种其它抗原，所述其它抗原为选自如下的蛋白或多肽：IdeE、IdeE2、Eq5、Eq8、IdeZ2、Eqz5和Eqz8。

2.权利要求1所述的抗原组合物，其中所述至少一种蛋白或多肽选自IdeE和IdeE2，且其中包含IdeE2的组合物包含至少一种其它抗原。

3.权利要求1或2所述的抗原组合物，其中所述至少一种蛋白或多肽选自Eq5和Eq8。

4.权利要求1所述的抗原组合物，其中所述至少一种蛋白或多肽选自EAG、Eq5和Eq8且所述组合物还包含至少一种抗原，所述抗原选自：命名为CNE(或SEC)、具有SEQ ID NO：28中所示的氨基酸序列的蛋白或多肽；和命名为ScIC、具有SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列的蛋白或多肽。

5.权利要求4所述的抗原组合物，其中所述至少一种蛋白或多肽选自IdeE和IdeE2。

6.权利要求1所述的抗原组合物，所述抗原组合物包含抗原EAG、ScIC、CNE(或SEC)、Eq5、Eq8、IdeE和IdeE2，或所述组合物包含抗原EAG、ScIC、CNE(或SEC)、Eq5和Eq8。

7.权利要求1所述的抗原组合物，其中所述至少一种蛋白或多肽选自EAG、Eq8和IdeE2且所述组合物包含至少一种其它抗原，所述其它抗原选自IdeE、Eq5、IdeZ2、Eqz5和Eqz8。

8.以上权利要求中任一项所述的抗原组合物，其中至少一种抗原是重组制备的。

9.权利要求1-8中任一项所述的抗原组合物，其中至少一种抗原是分离抗原或纯化抗原。

10.以上权利要求中任一项所述的抗原组合物，所述抗原组合物包含至少一种重组载体和插入其中的至少一种多核苷酸，所述多核苷酸编码所述至少一种蛋白或多肽，所述载体能够在易受马链球菌感染的非人类哺乳动物体内表达所述多肽。

11.权利要求10所述的抗原组合物，其中所述载体为表达载体，其为质粒或病毒载体且其中所述多核苷酸具有SEQ ID NOS：12和14-21中所示的核苷酸序列。

12.权利要求1-11中任一项所述的抗原组合物，所述抗原组合物为免疫原组合物。

13.一种用于保护非人类哺乳动物抵抗马链球菌感染的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含权利要求1-12中任一项所述的抗原组合物作为免疫组分和药学上可接受的载体。

14.权利要求13所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物还包含佐剂。

15.权利要求13-14中任一项所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物为保护易患病的哺乳动物，合适地为马，抵抗马链球菌马亚种引起的窒息病的疫苗。

16.权利要求13所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物以生理学可给药的形式提供，合适地，可通过皮下或鼻内接种给药。

17.权利要求15或16所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物刺激血清、粘膜和/或支气管灌洗抗体对易受马链球菌感染的哺乳动物，合适地为马，体内的马链球菌抗原的应答。

18.一种制备权利要求1-12中任一项所述的抗原组合物的抗原或免疫原的方法，所述方法包括：

(a)提供编码所述抗原的DNA片段并将所述片段引入表达载体中；

(b)将包含所述DNA片段的所述载体引入相容的宿主细胞；

(c)在表达所述DNA片段编码的产物所需的条件下培养步骤(b)中提供的所述宿主细胞；和

(d)从培养的宿主细胞分离表达的产物，和，任选地

(e)通过亲和层析法或本领域已知的其它层析方法纯化步骤(d)的分离产物。

19.一种制备权利要求13-17中任一项所述的疫苗组合物的方法，所述疫苗组合物包含权利要求1-12中任一项所述的抗原或免疫原组合物作为免疫组分，所述方法包括将所述抗原或免疫原组合物与药学上可接受的载体混合。

20.权利要求1-12中任一项所述的抗原或免疫原组合物在制备抵抗马链球菌感染包括马体内的马亚种感染引起的窒息病的疫苗中的用途。

21.一种制备抗血清的方法，所述方法包括将权利要求1-12中任一项所述的抗原制剂给药至动物宿主以在所述动物宿主中产生抗体和回收包含在所述动物宿主中产生的抗体的抗血清。

22.一种预防性或治疗性治疗非人类哺乳动物、合适地为马，体内马链球菌感染的方法，所述方法包括给药至所述哺乳动物免疫有效量的权利要求13-17中任一项所述的疫苗组合物或权利要求21制备的抗血清。

23.一种用于保护马抵抗马链球菌感染的方法，所述方法包括用权利要求13-17中任一项所述的疫苗组合物皮下或鼻内接种马以在所述马体内诱导抵抗马链球菌的免疫应答。

24.权利要求23的方法，其中在所述马体内诱导了形式为鼻咽粘膜内的IgG和/或IgA和/或IgM抗体的免疫应答。

25.一种抗体制剂，所述抗体制剂包含特异性针对权利要求1-12中任一项所述的组合物的蛋白或多肽的至少一种，合适地为至少两种抗体，所述抗体是多克隆或单克隆的；或所述制剂包含所述抗体的片段。

26.权利要求25所述的抗体制剂，所述抗体制剂当给药至易受马链球菌感染或被马链球菌感染的非人类哺乳动物时用于预防性地或治疗性地抵抗窒息病并提供被动免疫。