CN114437235A

CN114437235A - 马链球菌马亚种8种蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用

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Publication number: CN114437235A
Application number: CN202210002017.5A
Authority: CN
Inventors: 郭巍; 王晓钧; 杜承; 胡哲
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2022-01-04
Filing date: 2022-01-04
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2042-01-04
Also published as: CN114437235B

Abstract

本发明公开了一种马链球菌马亚种8种蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用。所述的重组融合蛋白是由马链球菌马亚种的cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE 8种蛋白依次以蛋白接头Gly‑Gly‑Gly连接后得到。其中，优选的，所述的重组融合蛋白命名为SE8，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。实验证明，本发明制备的重组融合蛋白SE8具有良好的抗原性和免疫原性，免疫小鼠能够有效诱导机体产生高水平的特异性抗体，并对S.equi感染小鼠起到保护作用。此外，该重组融合蛋白是通过大肠杆菌纯化制得的菌体蛋白，不含其它成分，具有较高的安全性，避免了感染发病的现象。

Description

马链球菌马亚种8种蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种重组融合蛋白及其制备方法和应用，特别涉及由马链球菌马亚种8种蛋白构成的重组融合蛋白及其制备方法和在作为亚单位疫苗预防马链球菌马亚种中的应用。本发明属于兽药技术领域。

背景技术

马腺疫是马、驴常见传染病，是我国规定的三类动物疫病，该病的病原体为马链球菌马亚种。目前有国外多家公司生产的无细胞菌苗正在投入使用，包括Strepvax II(德国勃林格殷格翰公司生产)、Equivac S(新西兰Zoetis公司生产)、Strepguard(MSDAnimalHealth公司生产)等。这些疫苗通过肌肉免疫，但目前这类疫苗的有效性仍不能确定。

seM蛋白是马链球菌马亚种的一个重要的毒力蛋白(G B A,R S C,MICHAELA K,etal.2009a.Factors associated with likelihood of horses having a high serumStreptococcus equi SeM-specific antibody titer.Journal of the AmericanVeterinary Medical Association[J],235.)，因此很多疫苗研究都从该蛋白入手，一项seM提取物疫苗的研究结果显示，三次免疫后第二周攻毒，免疫组的发病率只有29％，对照组的发病率达到71％，三次免疫后第6周攻毒，免疫组的发病率为53％，对照组的发病率为48％，该结果说明这种针对seM蛋白的疫苗并不能提供很高的免疫保护力(M H A,R S H,FP J,et al.1991.Field evaluation of a commercial M-protein vaccine againstStreptococcus equi infection in foals.American journal ofveterinary research[J],52.)。

根据之前的研究结果，灭活疫苗并不能为马匹提供很好的免疫保护力，因此弱毒疫苗的研究逐渐开始。EquilisStrepE是由MSD Animal Health公司生产的弱毒疫苗，目前主要在欧洲使用，该弱毒疫苗是由1990年荷兰某分离株制得，该毒株缺失aroA(CHARLOTTEK,MAXINE B,CARL R,et al.2006.Sequence variation ofthe SeM geneofStreptococcus equi allows discrimination ofthe source of stranglesoutbreaks.Journal of clinical microbiology[J],44.)经过免疫实验，结果表明EquilisStrepE弱毒疫苗有一定的免疫保护效果，但同时有一定的不良反应，肌肉注射部位会出现肿胀。由于该疫苗株与野毒株具有相同的遗传物质，会造成临床检测的假阳性。因此，在临床上对于腺疫的确诊则需要其他的方法，增加了腺疫检测的难度。

Pinnacle IN疫苗弱毒苗是由Zoetis公司生产的，免疫方式为鼻腔免疫，主要在美国等国家使用。Pinnacle IN弱毒苗由纽约分离株CF32制得，通过亚硝基胍致弱的方式制备的，该疫苗肌肉注射会产生不良反应。研究结果表明，免疫1岁以下的幼驹，则会导致腺疫临床症状的出现，幼驹在免疫一个月后向体外排毒，马驹对该疫苗的敏感性不断增强，同时也可能是该致弱菌株的毒力回归的结果(BB L,K P S,SARASWATHI L,etal.2011.Evaluation of a commercially available modified-live Streptococcusequi subsp equi vaccine in ponies.American journal of veterinary research[J],72.)。

由于灭活疫苗、弱毒疫苗在免疫之后，往往在免疫部位会有一定不良反应以及发热症状，而亚单位疫苗的出现，不但能够提供很好的免疫效果，同时能够减少免疫后不良反应的发生。亚单位疫苗是通过大肠杆菌纯化制得的菌体蛋白，不含其它成分，具有较高的安全性，避免了感染发病的现象。

发明内容

本发明的目的在于提供一种由马链球菌马亚种的cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE 8种蛋白构成的重组融合蛋白及其制备方法和在作为亚单位疫苗预防马链球菌马亚种中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种马链球菌马亚种8种蛋白的重组融合蛋白，所述的重组融合蛋白是由马链球菌马亚种的cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE 8种蛋白依次以蛋白接头Gly-Gly-Gly连接后得到。

其中，优选的，编码cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE 8种蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3-10所示。

其中，优选的，所述的重组融合蛋白命名为SE8，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码所述的重组融合蛋白的多核苷酸以及含有所述的多核苷酸的表达载体也在本发明的保护范围之内，优选的，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，本发明还提出了一种制备所述的重组融合蛋白的方法，其包括以下步骤：

(1)目的基因的扩增

以马链球菌马亚种基因组为模板，分别以cneSEco(6p-1)F-cneSXho(6p-1)R、eagSEco(6p-1)F-eagSXho(6p-1)R、SclFsEco(6p-1)F-SclFsXho(6p-1)R、SclIsEco(6p-1)F-SclIsXho(6p-1)R、SclCsEco(6p-1)F-SclCsXho(6p-1)R、eq8sEco(6p-1)F-eq8sXho(6p-1)R、eq5sEco(6p-1)F-eq5sXho(6p-1)R、ideEsEco(6p-1)F-ideEXho R为引物，通过PCR扩增cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8、ideE基因；测序正确后，将目的基因与pGex-6p-1连接，转化至大肠杆菌DH5α，得到重组质粒分别命名为pGex-6p-1-cne，pGex-6p-1-eag，pGex-6p-1-SclC，pGex-6p-1-SclI，pGex-6p-1-SclF，pGex-6p-1-eq5，pGex-6p-1-eq8，pGex-6p-1-ideE；

引物的核苷酸序列如下：

(2)重组载体的构建

通过同源重组将8个不同的S.equi基因片段cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE无缝连接，构建8个不同的S.equi基因的融合载体，具体方法如下：

用引物cne.eag1-cne.eag2、SclC.SclI1-SclC.SclI2、SclF.eq81-SclF.eq82和eq5.ideE1-eq5.ideE2分别对pGex-6p-1-cne、pGex-6p-1-SclC、pGex-6p-1-SclF和pGex-6p-1-eq5进行载体线性化，用引物cne.eag3-cne.eag4、SclC.SclI3-SclC.SclI4、SclF.eq83-SclF.eq84和eq5.ideE3-eq5.ideE4分别从pGex-6p-1-eag、pGex-6p-1-SclI、pGex-6p-1-eq5、pGex-6p-1-ideE扩增出包含同源片段的eag、SclI、eq5和ideE。分别将扩增得到的线性化载体和含有同源片段的基因片段进行重组反应，构建pGex-6p-1-cne-eag、pGex-6p-1-SclC-SclI、pGex-6p-1-SclF-eq8和pGex-6p-1-eq5-ideE；用引物5eag.SclC1-5eag.SclC2和6eq8.eq51-6eq8.eq52分别对pGex-6p-1-cne-eag和pGex-6p-1-SclF-eq8进行载体线性化，用引物5eag.SclC3-5eag.SclC4和6eq8.eq53-6eq8.eq54从pGex-6p-1-SclC-SclI和pGex-6p-1-eq5-ideE分别扩增出含有同源片段的SclC-SclI和eq5-ideE；分别将扩增得到的线性化载体和含有同源片段的基因片段进行重组反应，构建pGex-6p-1-cne-eag-SclC-SclI、pGex-6p-1-SclF-eq8-eq5-ideE；用引物7SclI.SclF1-7SclI.SclF2对pGex-6p-1-cne-eag-SclC-SclI进行载体线性化，引物7SclI.SclF3-7SclI.SclF4从pGex-6p-1-SclF-eq8-eq5-ideE扩增得到含有同源片段的SclF-eq8-eq5-ideE，将扩增得到的线性化载体和含有同源片段的基因片段进行重组反应，构建得到的载体命名为pGex-6p-1-SE8；

设计1对引物28a-8F/R，分别引入EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点，以pGex-6p-1-SE8为模板扩增SE8片段，扩增产物用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，连接至EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切的pET-28a载体，构建得到的载体命名为pET-28a-SE8；

(3)重组蛋白的表达及纯化

将重组质粒pET-28a-SE8转入BL21(DE3)中，阳性菌落接种到含有1％卡那霉素的LB培养基中，37℃150r/min培养2.5h，加终浓度为0.5mM IPTG于16℃诱导表达24h。离心收集菌体，破碎菌体取上清，利用亲和柱层析法对表达蛋白进行纯化。

其中，优选的，通过PCR扩增得到的cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8、ideE基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3-10所示。

更进一步的，本发明还提出了所述的重组融合蛋白在制备抗马链球菌药物中的应用。

其中，优选的，所述的药物为抗马链球菌的亚单位疫苗。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明提出了一种由马链球菌马亚种的cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE 8种蛋白构成的重组融合蛋白及其制备方法。实验证明，本发明制备的重组融合蛋白SE8具有良好的抗原性和免疫原性，免疫小鼠能够有效诱导机体产生高水平的特异性抗体，并对S.equi感染小鼠起到保护作用。此外，该重组融合蛋白是通过大肠杆菌纯化制得的菌体蛋白，不含其它成分，具有较高的安全性，避免了感染发病的现象。

附图说明

图1为cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE基因PCR扩增产物的电泳分析结果；

图2为融合基因SE8 PCR扩增产物的电泳分析结果；

图3为SE8重组蛋白表达及纯化的SDS-PAGE电泳分析结果；

图4为重组蛋白western blotting分析；

图5为免疫小鼠血清的特异性IgG检测；

图6为小鼠的攻毒保护率；

图7为小鼠攻毒后体重变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1重组融合蛋白的表达、纯化及免疫效力实验

材料

马链球菌马亚种(Streptococcus equi subspecies equi,S.equi)HLJ2018D-LX株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所马传染病与慢病毒研究创新团队实验室分离并保存；E.coli BL21(DE3)，DH5α购自天根生化科技(北京)有限公司。pGex-6p-1和pET-28a载体由实验室保存。

方法

1.目的基因的扩增

引物的核苷酸序列见表1。

表1

以s.equi HLJ2018D-LX基因组为模板，分别以cneSEco(6p-1)F-cneSXho(6p-1)R、eagSEco(6p-1)F-eagSXho(6p-1)R、SclFsEco(6p-1)F-SclFsXho(6p-1)R、SclIsEco(6p-1)F-SclIsXho(6p-1)R、SclCsEco(6p-1)F-SclCsXho(6p-1)R、eq8sEco(6p-1)F-eq8sXho(6p-1)R、eq5sEco(6p-1)F-eq5sXho(6p-1)R、ideEsEco(6p-1)F-ideEXho R为引物，通过PCR扩增cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8、ideE基因。测序正确后，将目的基因与pGex-6p-1连接，转化至大肠杆菌DH5α。经PCR鉴定后的重组质粒送吉林库美生物科技有限公司测序。测序成功的重组质粒分别命名为pGex-6p-1-cne，pGex-6p-1-eag，pGex-6p-1-SclC，pGex-6p-1-SclI，pGex-6p-1-SclF，pGex-6p-1-eq5，pGex-6p-1-eq8，pGex-6p-1-ideE。

2.重组载体的构建

通过同源重组将8个不同的S.equi基因片段(cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE)无缝连接，构建SE8基因融合载体。

首先，通过同源重组引物设计原则设计14对引物，并引入蛋白接头Gly-Gly-Gly(见表1)，用引物cne.eag1-cne.eag2、SclC.SclI1-SclC.SclI2、SclF.eq81-SclF.eq82和eq5.ideE1-eq5.ideE2分别对pGex-6p-1-cne、pGex-6p-1-SclC、pGex-6p-1-SclF和pGex-6p-1-eq5进行载体线性化，用引物cne.eag3-cne.eag4、SclC.SclI3-SclC.SclI4、SclF.eq83-SclF.eq84和eq5.ideE3-eq5.ideE4分别从pGex-6p-1-eag、pGex-6p-1-SclI、pGex-6p-1-eq5、pGex-6p-1-ideE扩增出包含同源片段的eag、SclI、eq5和ideE。分别将扩增得到的线性化载体和含有同源片段的基因片段进行重组反应(中美泰和SeamlessAssemblyCloning Kit，C5891)，构建pGex-6p-1-cne-eag、pGex-6p-1-SclC-SclI、pGex-6p-1-SclF-eq8和pGex-6p-1-eq5-ideE。用引物5eag.SclC1-5eag.SclC2和6eq8.eq51-6eq8.eq52分别对pGex-6p-1-cne-eag和pGex-6p-1-SclF-eq8进行载体线性化，用引物5eag.SclC3-5eag.SclC4和6eq8.eq53-6eq8.eq54从pGex-6p-1-SclC-SclI和pGex-6p-1-eq5-ideE分别扩增出含有同源片段的SclC-SclI和eq5-ideE。分别将扩增得到的线性化载体和含有同源片段的基因片段进行重组反应，构建pGex-6p-1-cne-eag-SclC-SclI、pGex-6p-1-SclF-eq8-eq5-ideE。用引物7SclI.SclF1-7SclI.SclF2对pGex-6p-1-cne-eag-SclC-SclI进行载体线性化，引物7SclI.SclF3-7SclI.SclF4从pGex-6p-1-SclF-eq8-eq5-ideE扩增得到含有同源片段的SclF-eq8-eq5-ideE，将扩增得到的线性化载体和含有同源片段的基因片段进行重组反应，构建pGex-6p-1-SE8。

设计1对引物28a-8 F/R，分别引入EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点，以pGex-6p-1-SE8为模板扩增SE8片段，扩增产物用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，连接至EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切的pET-28a载体，构建pET-28a-SE8。

3.重组蛋白的表达及纯化

4.重组蛋白免疫小鼠及HLJ2018D-LX感染试验

将24只BALBc雌性小鼠随机分为4组，每组6只，分别为SE8免疫组、佐剂对照组、SE8免疫攻毒组、佐剂对照攻毒组。将纯化后的SE8蛋白与8％终浓度的佐剂混合，经背部皮下分点注射，免疫剂量为100μg/只；14d后以同样的方式和剂量进行加强免疫。

免疫组分别在初次免疫当天(第0天)、第7天、第14天、第21天，第28天，第35天采集血清，间接Elisa检测血清中特异性抗体效价。

加强免疫后14d，分别对SE8免疫攻毒组、佐剂对照攻毒组腹腔注射10MLD(10⁶CFU)S.equi HLJ2018D-LX菌液进行攻毒，观察14d并记录小鼠体重变化情况和存活率。

结果

1.目的基因的扩增

以提取的HLJ2018D-LX基因组DNA为模板，利用设计的针对cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE的特异性引物进行扩增，分别得到912，483，174，168，150，1320，588，948bp的片段，与预期大小相符(图1)。

2.重组载体的构建

将cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE分别克隆入pGex-6p-1原核表达载体中，得到重组表达质粒pGex-6p-1-cne，pGex-6p-1-eag，pGex-6p-1-SclC，pGex-6p-1-SclI，pGex-6p-1-SclF，pGex-6p-1-eq5，pGex-6p-1-eq8，pGex-6p-1-ideE。测序无误，证实构建成功。

通过同源重组技术，依次将cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq8、eq5和ideE基因片段以蛋白接头Gly-Gly-Gly连接，克隆至pGex-6p-1原核表达载体中，得到的SE8融合基因大小为4837bp。经PCR鉴定，SE8与预期大小相符(图2)，测序无误，证实SE8基因融合载体pGex-6p-1-SE8构建成功。

用引物28a-8F、28a-8扩增出SE8融合基因片段，EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶对SE8融合基因片段进行双酶切，将酶切片段连接到EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶双酶切pET-28a载体，测序无误，证实成功构建pET-28a-SE8表达载体。

3.重组蛋白的表达纯化及鉴定

重组蛋白质经SDS-PAGE电泳分析显示，在183kDa附近出现一条明显条带(图3)，蛋白大小和预期大小一致，表明纯化得到目的蛋白。Western blotting分析，诱导表达的蛋白能与S.equi阳性马血清发生特异性反应，结果显示在183kDa处可见明显条带(图4)，表明该蛋白有良好的反应原性。

4.小鼠血清抗体效价检测

对免疫后血清进行各蛋白(SE8、cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE)特异性抗体水平检测(图5)，SE8免疫组在首次免疫后7d即可检测到抗体，抗体滴度分别为1：3200、1：25600、1：51200、1：25600、1:200、1：12800、1：204800、1：25600、1：200，在加强免疫后抗体水平升高，并且直到加强免疫后第3周依然维持着较高水平的抗体效价，在检测时间内，最高抗体滴度分别为1：819200、1：6553600、1：1638400、1：3276800、1：25600、1：102400、1：13107200、1:13107200、1：51200。与佐剂对照组相比，SE8免疫组各蛋白抗体水平显著升高，表明SE8免疫原性良好。

5.小鼠免疫保护试验

加强免疫后14d对SE8免疫组及佐剂对照组小鼠攻毒，腹腔注射10MLD(10⁶CFU)的S.equi HLJ2018D-LX菌液。对攻毒小鼠持续观察了2W，结果显示，对照组小鼠在攻毒后7d内全部死亡，SE8免疫组保护率为100％，显著高于对照组(图6)，对照组小鼠在攻毒后体重SE8免疫组在攻毒后第4天体重开始回升，攻毒后第8天体重恢复正常(图7)，表明SE8免疫能刺激机体产生免疫应答，提高小鼠对S.equi的抵抗力。

结论

成功构建重组蛋白表达质粒pET-28a-SE8并成功表达出相应目的蛋白。制备的SE8蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，免疫小鼠能够有效诱导机体产生高水平的特异性抗体，并对S.equi感染小鼠起到保护作用。

序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）

<120> 马链球菌马亚种8种蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用

<130> klpi210735

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4806

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

actaatctta gtgacaacat cacatcattg acggttgctt cttcatcact ccgagatgga 60

gagagaacga cggtaaaggt tgcgtttgat gacaaaaaac agaaaatcaa ggcaggggat 120

acgatagagg tcacctggcc tacaagtggt aatgtctaca ttcagggctt taataaaacc 180

ataccgctta atattagagg ggtagatgtt ggtaccttgg aggtcacgct agacaaggct 240

gttttcacat tcaatcaaaa tattgaaaca atgcatgatg tctctggttg gggagagttt 300

gatattactg ttagaaatgt gacacaaacc accgctgaaa catcaggaac gaccacagta 360

aaggtaggca atcgcactgc tactatcact gttactaagc ctgaggcagg cactggtacc 420

agctcatttt attataagac tggtgatatg cagcccaatg atactgagcg tgtgagatgg 480

ttcctgctga ttaacaacaa caaggaatgg gtggccaata ctgttacagt cgaagacgat 540

attcaaggtg gtcaaacctt ggatatgagc agctttgaca tcaccgtatc tggttatcgt 600

aacgagcgct tcgttgggga aaacgctctg acagagtttc atacaacatt tccaaattct 660

gtcattacgg caacagataa tcacattagt gtgcggttag atcaatatga tgcctcacaa 720

aacactgtca acattgctta taagacaaag ataacggact ttgaccaaaa agaatttgcc 780

aacaacagta aaatctggta ccagatttta tacaaggatc aggtatcggg tcaagagtca 840

aaccaccaag tagccaatat caatgctaac ggcggggttg atggcagtcg ctataccagc 900

tttactgtca agggaggtgg attagacgca gcaacagtgt tagagcctac aacagccttc 960

attagagaag ctgttaggga aatcaatcag ctgagtgatg actacgctga caatcaagag 1020

cttcaggctg ttcttgctaa tgctggagtt gaggcacttg ctgcagatac tgttgatcag 1080

gctaaagcag ctcttgacaa agcaaaggca gctgttgctg gtgttcagct tgatgaagca 1140

agacgtgagg cttacagaac aatcaatgcc ttaagtgatc agcacaaaag cgatcaaaag 1200

gttcagctag ctctagttgc tgcagcagct aaggtggcag atgctgcttc agttgatcaa 1260

gtgaatgcag ccattaatga tgctcataca gctattgcgg acattacagg agcagccttg 1320

ttggaggcta aagaagctgc tatcaatgaa ctaaagcagt atggcattag tgattactat 1380

gtgaccttaa tcaacaaagc caaaggaggt ggagaccagc cagcagcact aaaatatcca 1440

gaacctagag actattttct tcatactcgt gaaggtgatg ttatttatga tgaggatata 1500

aaaagatatt ttgaggattt agaagcctat ttaacagcta gacttggtgg gattgataaa 1560

aaagtagaag aagctgccca aaagccagga ggtggattat ctggtccgcc aggataccca 1620

cttactcgtg atttctcccg taacttccta gaagaaaata ctgcaaaata tttagatcaa 1680

ttaagagaac atctacagca cagatttagt gaacttgaga gcttaacaag aaaattagag 1740

aaagaaggcg gtacccgagg tccaggaggt ggatcggaac ccaatccata tccagatgtg 1800

aggcgtttcc ttgatgagaa gtacgatgga gatgtggata aattatctaa acaacttcaa 1860

ggttattttg gtagtttaag agagtatata gagtttgaac ttaaaaatgg caaacaaggt 1920

cctggaggtg gagcgactac cctagcagga caaacagaag tacgggctga taatatctta 1980

cgcttagata tgacagataa agaagcagtt gaaaaattcg ctaacgagct taaaaatgaa 2040

gtccataaaa actatcgtgg tagtaatact tggcaaaagc ttacccttat acttaatggt 2100

tatcaaaacc ttagagaaca aatagagacc gagctaaaaa atagtgaaca aaaagtaaaa 2160

gagcttaatg ataaggttaa tagtgaaact caaggaaaac aagagttaca gaatcagctt 2220

gagaaagaaa aagaagagtt agaaacacta aaaaaagagc ttgaagctga gaaggctaaa 2280

ggaactggag aaacagagaa gcttcaaaag gaaattgaag caaaaaatgc aatgatttct 2340

gacctacaaa aacagcttga ggaaactaag caaagggttc aagagtttga agctgaagta 2400

ggtaaattaa tggccgaaaa ggcagaccta caaacaaaat taaatgaaca agagcagctt 2460

aacgctaagc ttcaaaaaga aattgaagac ttaaaggctc agattgaaaa gcttaagcac 2520

ggaggtggag aaacgactac tgctagtgca tttgaaaata atgggacagg tcaacatctg 2580

aactggcaca tagatattcc acaagaatat acagttgaat taggagaacc aattactatc 2640

tcagatctta tgagtcaaat tacggttact cgtaaaggta gtaatgggac tgttaatgat 2700

ggagatactt ttgactttat ttcgaatgga gatggttcaa gaggaattga tacccctgga 2760

gtaaaaatat ggtttgactt ttacaatgct gcgggtactt cctttttaac tgatgaaatg 2820

ttagcttcgc ctacatatgc tgtaccgggg ggatcttata ctattaaagc ttgggtattc 2880

tatgggaaaa atgataccaa aaagctcttc acatttaaac taaaaaattc caacagcaat 2940

aaaactgagt taaggaagtc gttagaggag gctaagctaa aactcagcca gcctgaagga 3000

acgtattctg atgaatcact gcaagccttg caatcagcgg ttactcttgg taagacctat 3060

ttaaacagtg accctgatca aaatacagta gatcaatctg ttactactat tgattccgct 3120

attactagtc ttgttaatct taatgcttta aatgaagcta ttaatcaagc tacacctttt 3180

ataacagatg gcaaagagta tcctaaagaa gcgtatgacg gtcttgtgca aaagcttgca 3240

gcggcagcta agcttcaaaa ttcatttggt ccttcacaag gagatgttga taaggctgcg 3300

actgatttaa cgcaagctct tacgacgctt aagactgctg tagcgcatga agccttagat 3360

caagccttgg ctaagctgtt agagctttac cgagaaaatc caaatcttgc tttgacatca 3420

gagtctttga aggaattgta caataaggcc attgaagcag caggtacctt ctatagaact 3480

gttaacaagg ataaagagag aaaagacatt tccctttatg agctagagcg ctacactaca 3540

gaaacaaatt cagttgttga tactatttta aaggtaaagg ctgcgattgc cgaagaagga 3600

aaggcaaaat tgcgttctgc tttagaccaa ttaaatgctc ttatcggaga aaatctagac 3660

ctatctccat atacagcagc ttctgctcaa gcctatacag accagctagc taaggctaag 3720

gaggtcgcag cagcgggtga gacagcttat gctcaggaga cagaaccgac agctattact 3780

aacagcttgg ttaaggtgtt aaatgctaag aaatccctct cagatgccaa ggcagccttg 3840

gttgctactg gaggtggaga cgattaccaa aggaatgcta cggaagctta tgccaaagaa 3900

gtaccacatc agatcacttc tgtatggacc aaaggtgtta caccactaac acccgagcag 3960

tttcgatata ataacgaaga tgtgatccat gcgccatatc ttgctcatca aggctggtac 4020

gatatcacca aggccttcga tgggaaggat aatctcttgt gtggcgcagc aacggcaggt 4080

aatatgctgc attggtggtt tgatcaaaat aaaacagaga ttgaagccta tttaagtaaa 4140

caccctgaaa agcaaaaaat catttttaac aaccaagagc tatttgattt gaaagctgct 4200

atcgatacca aggacagtca aaccaatagt cagcttttta attattttag agataaagcc 4260

tttccaaatc tatcagcacg tcaactcggg gttatgcctg atcttgttct agacatgttt 4320

atcaatggtt actacttaaa tgtgtttaaa acacagtcta ctgatgtcaa tcgaccttat 4380

caggacaagg acaaacgagg tggtattttc gatgctgttt tcaccagagg agatcagaca 4440

acgctcttga cagctcgtca tgatttaaaa aataaaggac taaatgacat cagcaccatt 4500

atcaagcaag aactgactga aggaagagcc cttgctttat cacataccta cgccaatgtt 4560

agcattagcc atgtgattaa cttgtgggga gctgatttta atgctgaagg aaaccttgag 4620

gccatctatg tcacagactc agatgctaat gcgtctattg gtatgaaaaa atattttgtc 4680

ggcattaatg ctcatagaca tgtcgccatt tctgccaaga aaatagaagg agaaaacatt 4740

ggcgctcaag tattaggctt atttacgctt tccagtggca aggacatatg gcagaaactg 4800

agctaa 4806

<210> 2

<211> 1603

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 2

Thr Asn Leu Ser Asp Asn Ile Thr Ser Leu Thr Val Ala Ser Ser Ser

1 5 10 15

Leu Arg Asp Gly Glu Arg Thr Thr Val Lys Val Ala Phe Asp Asp Lys

20 25 30

Lys Gln Lys Ile Lys Ala Gly Asp Thr Ile Glu Val Thr Trp Pro Thr

35 40 45

Ser Gly Asn Val Tyr Ile Gln Gly Phe Asn Lys Thr Ile Pro Leu Asn

50 55 60

Ile Arg Gly Val Asp Val Gly Thr Leu Glu Val Thr Leu Asp Lys Ala

65 70 75 80

Val Phe Thr Phe Asn Gln Asn Ile Glu Thr Met His Asp Val Ser Gly

85 90 95

Trp Gly Glu Phe Asp Ile Thr Val Arg Asn Val Thr Gln Thr Thr Ala

100 105 110

Glu Thr Ser Gly Thr Thr Thr Val Lys Val Gly Asn Arg Thr Ala Thr

115 120 125

Ile Thr Val Thr Lys Pro Glu Ala Gly Thr Gly Thr Ser Ser Phe Tyr

130 135 140

Tyr Lys Thr Gly Asp Met Gln Pro Asn Asp Thr Glu Arg Val Arg Trp

145 150 155 160

Phe Leu Leu Ile Asn Asn Asn Lys Glu Trp Val Ala Asn Thr Val Thr

165 170 175

Val Glu Asp Asp Ile Gln Gly Gly Gln Thr Leu Asp Met Ser Ser Phe

180 185 190

Asp Ile Thr Val Ser Gly Tyr Arg Asn Glu Arg Phe Val Gly Glu Asn

195 200 205

Ala Leu Thr Glu Phe His Thr Thr Phe Pro Asn Ser Val Ile Thr Ala

210 215 220

Thr Asp Asn His Ile Ser Val Arg Leu Asp Gln Tyr Asp Ala Ser Gln

225 230 235 240

Asn Thr Val Asn Ile Ala Tyr Lys Thr Lys Ile Thr Asp Phe Asp Gln

245 250 255

Lys Glu Phe Ala Asn Asn Ser Lys Ile Trp Tyr Gln Ile Leu Tyr Lys

260 265 270

Asp Gln Val Ser Gly Gln Glu Ser Asn His Gln Val Ala Asn Ile Asn

275 280 285

Ala Asn Gly Gly Val Asp Gly Ser Arg Tyr Thr Ser Phe Thr Val Lys

290 295 300

Gly Gly Gly Leu Asp Ala Ala Thr Val Leu Glu Pro Thr Thr Ala Phe

305 310 315 320

Ile Arg Glu Ala Val Arg Glu Ile Asn Gln Leu Ser Asp Asp Tyr Ala

325 330 335

Asp Asn Gln Glu Leu Gln Ala Val Leu Ala Asn Ala Gly Val Glu Ala

340 345 350

Leu Ala Ala Asp Thr Val Asp Gln Ala Lys Ala Ala Leu Asp Lys Ala

355 360 365

Lys Ala Ala Val Ala Gly Val Gln Leu Asp Glu Ala Arg Arg Glu Ala

370 375 380

Tyr Arg Thr Ile Asn Ala Leu Ser Asp Gln His Lys Ser Asp Gln Lys

385 390 395 400

Val Gln Leu Ala Leu Val Ala Ala Ala Ala Lys Val Ala Asp Ala Ala

405 410 415

Ser Val Asp Gln Val Asn Ala Ala Ile Asn Asp Ala His Thr Ala Ile

420 425 430

Ala Asp Ile Thr Gly Ala Ala Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Ala Ile

435 440 445

Asn Glu Leu Lys Gln Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Tyr Val Thr Leu Ile

450 455 460

Asn Lys Ala Lys Gly Gly Gly Asp Gln Pro Ala Ala Leu Lys Tyr Pro

465 470 475 480

Glu Pro Arg Asp Tyr Phe Leu His Thr Arg Glu Gly Asp Val Ile Tyr

485 490 495

Asp Glu Asp Ile Lys Arg Tyr Phe Glu Asp Leu Glu Ala Tyr Leu Thr

500 505 510

Ala Arg Leu Gly Gly Ile Asp Lys Lys Val Glu Glu Ala Ala Gln Lys

515 520 525

Pro Gly Gly Gly Leu Ser Gly Pro Pro Gly Tyr Pro Leu Thr Arg Asp

530 535 540

Phe Ser Arg Asn Phe Leu Glu Glu Asn Thr Ala Lys Tyr Leu Asp Gln

545 550 555 560

Leu Arg Glu His Leu Gln His Arg Phe Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr

565 570 575

Arg Lys Leu Glu Lys Glu Gly Gly Thr Arg Gly Pro Gly Gly Gly Ser

580 585 590

Glu Pro Asn Pro Tyr Pro Asp Val Arg Arg Phe Leu Asp Glu Lys Tyr

595 600 605

Asp Gly Asp Val Asp Lys Leu Ser Lys Gln Leu Gln Gly Tyr Phe Gly

610 615 620

Ser Leu Arg Glu Tyr Ile Glu Phe Glu Leu Lys Asn Gly Lys Gln Gly

625 630 635 640

Pro Gly Gly Gly Ala Thr Thr Leu Ala Gly Gln Thr Glu Val Arg Ala

645 650 655

Asp Asn Ile Leu Arg Leu Asp Met Thr Asp Lys Glu Ala Val Glu Lys

660 665 670

Phe Ala Asn Glu Leu Lys Asn Glu Val His Lys Asn Tyr Arg Gly Ser

675 680 685

Asn Thr Trp Gln Lys Leu Thr Leu Ile Leu Asn Gly Tyr Gln Asn Leu

690 695 700

Arg Glu Gln Ile Glu Thr Glu Leu Lys Asn Ser Glu Gln Lys Val Lys

705 710 715 720

Glu Leu Asn Asp Lys Val Asn Ser Glu Thr Gln Gly Lys Gln Glu Leu

725 730 735

Gln Asn Gln Leu Glu Lys Glu Lys Glu Glu Leu Glu Thr Leu Lys Lys

740 745 750

Glu Leu Glu Ala Glu Lys Ala Lys Gly Thr Gly Glu Thr Glu Lys Leu

755 760 765

Gln Lys Glu Ile Glu Ala Lys Asn Ala Met Ile Ser Asp Leu Gln Lys

770 775 780

Gln Leu Glu Glu Thr Lys Gln Arg Val Gln Glu Phe Glu Ala Glu Val

785 790 795 800

Gly Lys Leu Met Ala Glu Lys Ala Asp Leu Gln Thr Lys Leu Asn Glu

805 810 815

Gln Glu Gln Leu Asn Ala Lys Leu Gln Lys Glu Ile Glu Asp Leu Lys

820 825 830

Ala Gln Ile Glu Lys Leu Lys His Gly Gly Gly Glu Thr Thr Thr Ala

835 840 845

Ser Ala Phe Glu Asn Asn Gly Thr Gly Gln His Leu Asn Trp His Ile

850 855 860

Asp Ile Pro Gln Glu Tyr Thr Val Glu Leu Gly Glu Pro Ile Thr Ile

865 870 875 880

Ser Asp Leu Met Ser Gln Ile Thr Val Thr Arg Lys Gly Ser Asn Gly

885 890 895

Thr Val Asn Asp Gly Asp Thr Phe Asp Phe Ile Ser Asn Gly Asp Gly

900 905 910

Ser Arg Gly Ile Asp Thr Pro Gly Val Lys Ile Trp Phe Asp Phe Tyr

915 920 925

Asn Ala Ala Gly Thr Ser Phe Leu Thr Asp Glu Met Leu Ala Ser Pro

930 935 940

Thr Tyr Ala Val Pro Gly Gly Ser Tyr Thr Ile Lys Ala Trp Val Phe

945 950 955 960

Tyr Gly Lys Asn Asp Thr Lys Lys Leu Phe Thr Phe Lys Leu Lys Asn

965 970 975

Ser Asn Ser Asn Lys Thr Glu Leu Arg Lys Ser Leu Glu Glu Ala Lys

980 985 990

Leu Lys Leu Ser Gln Pro Glu Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ser Leu Gln

995 1000 1005

Ala Leu Gln Ser Ala Val Thr Leu Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Ser Asp

1010 1015 1020

Pro Asp Gln Asn Thr Val Asp Gln Ser Val Thr Thr Ile Asp Ser Ala

1025 1030 1035 1040

Ile Thr Ser Leu Val Asn Leu Asn Ala Leu Asn Glu Ala Ile Asn Gln

1045 1050 1055

Ala Thr Pro Phe Ile Thr Asp Gly Lys Glu Tyr Pro Lys Glu Ala Tyr

1060 1065 1070

Asp Gly Leu Val Gln Lys Leu Ala Ala Ala Ala Lys Leu Gln Asn Ser

1075 1080 1085

Phe Gly Pro Ser Gln Gly Asp Val Asp Lys Ala Ala Thr Asp Leu Thr

1090 1095 1100

Gln Ala Leu Thr Thr Leu Lys Thr Ala Val Ala His Glu Ala Leu Asp

1105 1110 1115 1120

Gln Ala Leu Ala Lys Leu Leu Glu Leu Tyr Arg Glu Asn Pro Asn Leu

1125 1130 1135

Ala Leu Thr Ser Glu Ser Leu Lys Glu Leu Tyr Asn Lys Ala Ile Glu

1140 1145 1150

Ala Ala Gly Thr Phe Tyr Arg Thr Val Asn Lys Asp Lys Glu Arg Lys

1155 1160 1165

Asp Ile Ser Leu Tyr Glu Leu Glu Arg Tyr Thr Thr Glu Thr Asn Ser

1170 1175 1180

Val Val Asp Thr Ile Leu Lys Val Lys Ala Ala Ile Ala Glu Glu Gly

1185 1190 1195 1200

Lys Ala Lys Leu Arg Ser Ala Leu Asp Gln Leu Asn Ala Leu Ile Gly

1205 1210 1215

Glu Asn Leu Asp Leu Ser Pro Tyr Thr Ala Ala Ser Ala Gln Ala Tyr

1220 1225 1230

Thr Asp Gln Leu Ala Lys Ala Lys Glu Val Ala Ala Ala Gly Glu Thr

1235 1240 1245

Ala Tyr Ala Gln Glu Thr Glu Pro Thr Ala Ile Thr Asn Ser Leu Val

1250 1255 1260

Lys Val Leu Asn Ala Lys Lys Ser Leu Ser Asp Ala Lys Ala Ala Leu

1265 1270 1275 1280

Val Ala Thr Gly Gly Gly Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala

1285 1290 1295

Tyr Ala Lys Glu Val Pro His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly

1300 1305 1310

Val Thr Pro Leu Thr Pro Glu Gln Phe Arg Tyr Asn Asn Glu Asp Val

1315 1320 1325

Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala His Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys

1330 1335 1340

Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly

1345 1350 1355 1360

Asn Met Glu Thr Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Thr Glu Ile

1365 1370 1375

Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Ile Phe Asn

1380 1385 1390

Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala Ala Ile Asp Thr Lys Asp Ser

1395 1400 1405

Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe Arg Asp Lys Ala Phe Pro

1410 1415 1420

Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met Pro Asp Leu Val Leu Asp

1425 1430 1435 1440

Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val Phe Lys Thr Gln Ser Thr

1445 1450 1455

Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp Lys Arg Gly Gly Ile Phe

1460 1465 1470

Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Thr Thr Leu Leu Thr Ala Arg

1475 1480 1485

His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp Ile Ser Thr Ile Ile Lys

1490 1495 1500

Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu Ala Leu Ser His Thr Tyr Ala

1505 1510 1515 1520

Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asn

1525 1530 1535

Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ala Asn

1540 1545 1550

Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Ile Asn Ala His Arg

1555 1560 1565

His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly Glu Asn Ile Gly Ala

1570 1575 1580

Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly Lys Asp Ile Trp Gln

1585 1590 1595 1600

Lys Leu Ser

<210> 3

<211> 920

<212> DNA

<213> cne

<400> 3

aattcactaa tcttagtgac aacatcacat cattgacggt tgcttcttca tcactccgag 60

atggagagag aacgacggta aaggttgcgt ttgatgacaa aaaacagaaa atcaaggcag 120

gggatacgat agaggtcacc tggcctacaa gtggtaatgt ctacattcag ggctttaata 180

aaaccatacc gcttaatatt agaggggtag atgttggtac cttggaggtc acgctagaca 240

aggctgtttt cacattcaat caaaatattg aaacaatgca tgatgtctct ggttggggag 300

agtttgatat tactgttaga aatgtgacac aaaccaccgc tgaaacatca ggaacgacca 360

cagtaaaggt aggcaatcgc actgctacta tcactgttac taagcctgag gcaggcactg 420

gtaccagctc attttattat aagactggtg atatgcagcc caatgatact gagcgtgtga 480

gatggttcct gctgattaac aacaacaagg aatgggtggc caatactgtt acagtcgaag 540

acgatattca aggtggtcaa accttggata tgagcagctt tgacatcacc gtatctggtt 600

atcgtaacga gcgcttcgtt ggggaaaacg ctctgacaga gtttcataca acatttccaa 660

attctgtcat tacggcaaca gataatcaca ttagtgtgcg gttagatcaa tatgatgcct 720

cacaaaacac tgtcaacatt gcttataaga caaagataac ggactttgac caaaaagaat 780

ttgccaacaa cagtaaaatc tggtaccaga ttttatacaa ggatcaggta tcgggtcaag 840

agtcaaacca ccaagtagcc aatatcaatg ctaacggcgg ggttgatggc agtcgctata 900

ccagctttac tgtcaagtaa 920

<210> 4

<211> 492

<212> DNA

<213> eag

<400> 4

gaattcttag acgcagcaac agtgttagag cctacaacag ccttcattag agaagctgtt 60

agggaaatca atcagctgag tgatgactac gctgacaatc aagagcttca ggctgttctt 120

gctaatgctg gagttgaggc acttgctgca gatactgttg atcaggctaa agcagctctt 180

gacaaagcaa aggcagctgt tgctggtgtt cagcttgatg aagcaagacg tgaggcttac 240

agaacaatca atgccttaag tgatcagcac aaaagcgatc aaaaggttca gctagctcta 300

gttgctgcag cagctaaggt ggcagatgct gcttcagttg atcaagtgaa tgcagccatt 360

aatgatgctc atacagctat tgcggacatt acaggagcag ccttgttgga ggctaaagaa 420

gctgctatca atgaactaaa gcagtatggc attagtgatt actatgtgac cttaatcaac 480

aaagccaaat aa 492

<210> 5

<211> 1318

<212> DNA

<213> eq5

<400> 5

gaaacgacta ctgctagtgc atttgaaaat aatgggacag gtcaacatct gaactggcac 60

atagatattc cacaagaata tacagttgaa ttaggagaac caattactat ctcagatctt 120

atgagtcaaa ttacggttac tcgtaaaggt agtaatggga ctgttaatga tggagatact 180

tttgacttta tttcgaatgg agatggttca agaggaattg atacccctgg agtaaaaata 240

tggtttgact tttacaatgc tgcgggtact tcctttttaa ctgatgaaat gttagcttcg 300

cctacatatg ctgtaccggg gggatcttat actattaaag cttgggtatt ctatgggaaa 360

aatgatacca aaaagctctt cacatttaaa ctaaaaaatt ccaacagcaa taaaactgag 420

ttaaggaagt cgttagagga ggctaagcta aaactcagcc agcctgaagg aacgtattct 480

gatgaatcac tgcaagcctt gcaatcagcg gttactcttg gtaagaccta tttaaacagt 540

gaccctgatc aaaatacagt agatcaatct gttactacta ttgattccgc tattactagt 600

cttgttaatc ttaatgcttt aaatgaagct attaatcaag ctacaccttt tataacagat 660

ggcaaagagt atcctaaaga agcgtatgac ggtcttgtgc aaaagcttgc agcggcagct 720

aagcttcaaa attcatttgg tccttcacaa ggagatgttg ataaggctgc gactgattta 780

acgcaagctc ttacgacgct taagactgct gtagcgcatg aagccttaga tcaagccttg 840

gctaagctgt tagagcttta ccgagaaaat ccaaatcttg ctttgacatc agagtctttg 900

aaggaattgt acaataaggc cattgaagca gcaggtacct tctatagaac tgttaacaag 960

gataaagaga gaaaagacat ttccctttat gagctagagc gctacactac agaaacaaat 1020

tcagttgttg atactatttt aaaggtaaag gctgcgattg ccgaagaagg aaaggcaaaa 1080

ttgcgttctg ctttagacca attaaatgct cttatcggag aaaatctaga cctatctcca 1140

tatacagcag cttctgctca agcctataca gaccagctag ctaaggctaa ggaggtcgca 1200

gcagcgggtg agacagctta tgctcaggag acagaaccga cagctattac taacagcttg 1260

gttaaggtgt taaatgctaa gaaatccctc tcagatgcca aggcagcctt ggttgcta 1318

<210> 6

<211> 600

<212> DNA

<213> eq8

<400> 6

gaattcttag cgactaccct agcaggacaa acagaagtac gggctgataa tatcttacgc 60

ttagatatga cagataaaga agcagttgaa aaattcgcta acgagcttaa aaatgaagtc 120

cataaaaact atcgtggtag taatacttgg caaaagctta cccttatact taatggttat 180

caaaacctta gagaacaaat agagaccgag ctaaaaaata gtgaacaaaa agtaaaagag 240

cttaatgata aggttaatag tgaaactcaa ggaaaacaag agttacagaa tcagcttgag 300

aaagaaaaag aagagttaga aacactaaaa aaagagcttg aagctgagaa ggctaaagga 360

actggagaaa cagagaagct tcaaaaggaa attgaagcaa aaaatgcaat gatttctgac 420

ctacaaaaac agcttgagga aactaagcaa agggttcaag agtttgaagc tgaagtaggt 480

aaattaatgg ccgaaaaggc agacctacaa acaaaattaa atgaacaaga gcagcttaac 540

gctaagcttc aaaaagaaat tgaagactta aaggctcaga ttgaaaagct taagcactaa 600

<210> 7

<211> 179

<212> DNA

<213> sclc

<400> 7

ttagaccagc cagcagcact aaaatatcca gaacctagag actattttct tcatactcgt 60

gaaggtgatg ttatttatga tgaggatata aaaagatatt ttgaggattt agaagcctat 120

ttaacagcta gacttggtgg gattgataaa aaagtagaag aagctgccca aaagccata 179

<210> 8

<211> 159

<212> DNA

<213> sclf

<400> 8

gaattctcgg aacccaatcc atatccagat gtgaggcgtt tccttgatga gaagtacgat 60

ggagatgtgg ataaattatc taaacaactt caaggttatt ttggtagttt aagagagtat 120

atagagtttg aacttaaaaa tggcaaacaa ggtccttaa 159

<210> 9

<211> 177

<212> DNA

<213> scli

<400> 9

gaattcttat ctggtccgcc aggataccca cttactcgtg atttctcccg taacttccta 60

gaagaaaata ctgcaaaata tttagatcaa ttaagagaac atctacagca cagatttagt 120

gaacttgaga gcttaacaag aaaattagag aaagaaggcg gtacccgagg tccataa 177

<210> 10

<211> 948

<212> DNA

<213> idee

<400> 10

gacgattacc aaaggaatgc tacggaagct tatgccaaag aagtaccaca tcagatcact 60

tctgtatgga ccaaaggtgt tacaccacta acacccgagc agtttcgata taataacgaa 120

gatgtgatcc atgcgccata tcttgctcat caaggctggt acgatatcac caaggccttc 180

gatgggaagg ataatctctt gtgtggcgca gcaacggcag gtaatatgct gcattggtgg 240

tttgatcaaa ataaaacaga gattgaagcc tatttaagta aacaccctga aaagcaaaaa 300

atcattttta acaaccaaga gctatttgat ttgaaagctg ctatcgatac caaggacagt 360

caaaccaata gtcagctttt taattatttt agagataaag cctttccaaa tctatcagca 420

cgtcaactcg gggttatgcc tgatcttgtt ctagacatgt ttatcaatgg ttactactta 480

aatgtgttta aaacacagtc tactgatgtc aatcgacctt atcaggacaa ggacaaacga 540

ggtggtattt tcgatgctgt tttcaccaga ggagatcaga caacgctctt gacagctcgt 600

catgatttaa aaaataaagg actaaatgac atcagcacca ttatcaagca agaactgact 660

gaaggaagag cccttgcttt atcacatacc tacgccaatg ttagcattag ccatgtgatt 720

aacttgtggg gagctgattt taatgctgaa ggaaaccttg aggccatcta tgtcacagac 780

tcagatgcta atgcgtctat tggtatgaaa aaatattttg tcggcattaa tgctcataga 840

catgtcgcca tttctgccaa gaaaatagaa ggagaaaaca ttggcgctca agtattaggc 900

ttatttacgc tttccagtgg caaggacata tggcagaaac tgagctaa 948

Claims

1.马链球菌马亚种8种蛋白的重组融合蛋白，其特征在于，所述的重组融合蛋白是由马链球菌马亚种的cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE 8种蛋白依次以蛋白接头Gly-Gly-Gly连接后得到。

2.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，编码cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE 8种蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3-10所示。

3.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述的重组融合蛋白命名为SE8，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.编码权利要求1-3任一项所述的重组融合蛋白的多核苷酸。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

6.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求4或5所述的多核苷酸。

7.一种制备权利要求1所述的重组融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)目的基因的扩增

引物的核苷酸序列如下：

cneSEco(6p-1)F CCCTGGGATCCCCGGAATTCactaatcttagtgacaacatcacatcattgac

cneSXho(6p-1)R GTCACGATGCGGCCGCTCGAGttacttgacagtaaagctggtatagcgac

eagSEco(6p-1)F CCCTGGGATCCCCGGAATTCttagacgcagcaacagtgttagag

eagSXho(6p-1)R GTCACGATGCGGCCGCTCGAGttatttggctttgttgattaaggtcacatag

SclFsEco(6p-1)F CCCTGGGATCCCCGGAATTCtcggaacccaatccatatccagatg

SclFsXho(6p-1)R GTCACGATGCGGCCGCTCGAGttaaggaccttgtttgccatttttaagttc

SclIsEco(6p-1)F CCCTGGGATCCCCGGAATTCttatctggtccgccaggatacccac

SclIsXho(6p-1)R GTCACGATGCGGCCGCTCGAGttatggacctcgggtaccgcc

SclCsEco(6p-1)F CCCTGGGATCCCCGGAATTCttagaccagccagcagca

SclCsXho(6p-1)R GTCACGATGCGGCCGCTCGAGttatggcttttgggcagcttcttc

eq8sEco(6p-1)F CCCTGGGATCCCCGGAATTCttagcgactaccctagcaggacaaacag

eq8sXho(6p-1)R GTCACGATGCGGCCGCTCGAGttagtgcttaagcttttcaatctgagc

eq5sEco(6p-1)F CCCTGGGATCCCCGGAATTCttagaaacgactactgctagtgcatttg

eq5sXho(6p-1)R TCACGATGCGGCCGCTCGAGtagcaaccaaggctgccttggc

ideEsEco(6p-1)F CCCTGGGATCCCCGGAATTCttagacgattaccaaaggaatgctacgg

ideEXho R GTCACGATGCGGCCGCTCGAGttagctcagtttctgccatatgtccttg

cne.eag1 taatccacctcccttgacagtaaagctggtatagcgac

cne.eag2 aagccaaataaCTCGAGCGGCCGCATC

cne.eag3 aagggaggtggattagacgcagcaacagtgttagag

cne.eag4 TCGAGttatttggctttgttgattaaggtcacatag

SclC.SclI1 taatccacctcctggcttttgggcagcttcttc

SclC.SclI2 gaggtccataaCTCGAGCGGCCGCATC

SclC.SclI3 ccaggaggtggattatctggtccgccaggatacc

SclC.SclI4 TCGAGttatggacctcgggtaccgcc

SclF.eq81 cgCtccacctccaggaccttgtttgccatttttaagttc

SclF.eq82 ttaagcactaaCTCGAGCGGCCGCATC

SclF.eq83 cctggaggtggagcgactaccctagcaggac

SclF.eq84 TCGAGttagtgcttaagcttttcaatctgagcC

eq5.ideE1 gtctccacctccAGtagcaaccaaggctgcc

eq5.ideE2 aactgagctaaCGAGCGGCCGCATCG

eq5.ideE3 aCTggaggtggagacgattaccaaaggaatgctacg

eq5.ideE4 GCTCGttagctcagtttctgccatatgtccttg

5eag.SclC1 gtctccacctcctttggctttgttgattaaggtcacatag

5eag.SclC2 gaggtccataaCTCGAGCGGCCGCATC

5eag.SclC3 aaaggaggtggagaccagccagcagcacTAAAATATC

5eag.SclC4 TCGAGttatggacctcgggtaccgcc

6eq8.eq51 ttctccacctccgtgcttaagcttttcaatctgagcC

6eq8.eq52 aactgagctaaCTCGAGCGGCCGCATC

6eq8.eq53 cacggaggtggagaaacgactactgctagtgcatttg

6eq8.eq54 TCGAGttagctcagtttctgccatatgtccttg

7SclI.SclF1 cgatccacctcctggacctcgggtaccgc

7SclI.SclF2 aactgagctaaCTCGAGCGGCCGCATC

7SclI.SclF3 ccaggaggtggatcggaacccaatccatatccag

7SclI.SclF4 TCGAGttagctcagtttctgccatatgtccttg

28a-8F TGGGATCCCCGGAATTCactaatcttagt

28a-8R TGCGGCCGCTCGAGttagctca

(2)重组载体的构建

设计1对引物28a-8F/R，分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，以pGex-6p-1-SE8为模板扩增SE8片段，扩增产物用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，连接至EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pET-28a载体，构建得到的载体命名为pET-28a-SE8；

(3)重组蛋白的表达及纯化

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，通过PCR扩增得到的cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8、ideE基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3-10所示。

9.权利要求1-3任一项所述的重组融合蛋白在制备抗马链球菌马亚种药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的药物为抗马链球菌马亚种的亚单位疫苗。