CN103068838A - 基于重组蛋白的抗链球菌感染疫苗 - Google Patents
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Abstract
抗原组合物包含源自马链球菌马亚种或兽疫亚种抗原的多种抗原成分,其中至少一种成分为包含两个或更多个该抗原或其片段的融合蛋白或多肽。抗原组合物可用于免疫哺乳动物来抵抗马链球菌马亚种和/或兽疫亚种。还公开了包含抗原组合物作为免疫成分的疫苗组合物。
Description
技术领域
本发明涉及亚单位免疫原性或疫苗组合物及其在用于免疫易受链球菌感染的哺乳动物中的用途。本发明还涉及制备、配制和施用该组合物的方法。
背景技术
马中的链球菌感染主要由各种马链球菌(Streptococcus equi)引起,马链球菌包括三个亚种,分别命名为马(equi)亚种、兽疫(zooepidemicus)亚种和反刍动物(ruminatorium)亚种,下文仅简称为马链球菌马亚种(S.equi)、马链球菌兽疫亚种(S.zooepidemicus)和马链球菌反刍动物亚种(S.ruminatorium)(参考文献15、24、40)。
实际上局限于马的马链球菌马亚种为腺疫(strangle)的病原体,腺疫为世界上广泛分布且高度感染性的马科上呼吸道的严重疾病。腺疫为世界范围内最经常报告的马科疾病之一,其特征在于发热、流涕以及在咽后和下颌淋巴结形成脓肿。在一些病例中所述疾病表现为体内新陈代谢病程,即通常所说的“假腺疫(bastard strangle)”。所述疾病具有世界范围内的分布并引起巨大的经济损失(参考文献39)。
马链球菌兽疫亚种被认为是在健康马上呼吸道中经常发生的机会性共生体。然而,在应激或病毒感染后,其可引起产生腺疫样症状的继发感染。另外,马链球菌兽疫亚种不仅感染马,而且还感染许多其他动物,诸如猪、山羊、狗、猫和牛。甚至已报道了由兽疫亚种引起的人类感染病例(参考文献5)。该亚种已被怀疑为病症例如子宫内膜炎、宫颈炎、流产、乳腺炎、肺炎、脓肿和关节感染中的原发性病原体。
已从患有乳腺炎的绵羊和山羊的乳分离了马链球菌反刍动物亚种(参考文献10)。
酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)为引起各种疾病例如脓疱病、咽炎、坏死性筋膜炎和中毒性休克综合症的重要人类病原体。
虽然可以用抗生素例如青霉素、四环素或庆大霉素(gentamicin)来治疗和治愈这些链球菌感染,但将期望能够预防该感染的爆发以及消除或降低与抗生素治疗相关的抗性株发展风险的有效预防剂。
相关技术说明
然而,虽然已进行了许多努力以开发预防剂例如抗马链球菌的疫苗,但对于马亚种、兽疫亚种和反刍动物亚种或酿脓链球菌(S.pyogenes),目前市场上仍没有可获得的有效和安全的疫苗。
现存抗腺疫疫苗基于马链球菌马亚种的失活,例如马链球菌马亚种的热杀死株或减毒株或者为富含由马链球菌马亚种产生的M-蛋白(即免疫原性蛋白质)的酸提取物/变溶菌素。基于M样蛋白的抗马链球菌兽疫亚种的疫苗公开于US-A-5,583,014。在WO 87/00436、参考文献17和WO 2009/093014A2中公开了将马链球菌马亚种的减毒株用作抵抗由马链球菌马亚种引起的感染的疫苗。
商业抗腺疫疫苗,Equilis StrepE(来自Intervet,UK)发售于2004年。然而,该疫苗基于马链球菌马亚种的减毒(活、缺失突变的)菌株,该疫苗的安全性和效力受到怀疑(参考文献23、35)。
由于以前开发的基于活或失活细菌的疫苗或免疫制品受到副作用的影响,并且可能提供的保护不够,因此存在对于保护以抵抗马链球菌马亚种感染和/或预防其传播而不引起不期望的副作用的、有效和安全的预防剂,例如疫苗的需求。
近年来,已鉴定和表征了与宿主细胞的细胞外基质(ECM)或血浆蛋白的不同成分相互作用和/或结合的链球菌表面蛋白。已表征的马链球菌马亚种和马链球菌兽疫亚种的胞外表面蛋白的实例为FNZ(参考文献29)、EAG(参考文献27)、胶原样蛋白(SclC、SclD、SclE、SclF、SclG、SclH和SclI)(参考文献21、22)、CNE(还称为Sec)(参考文献25)、ZAG(参考文献18和WO95/07296)。此外,被认为释放到周围培养基的马链球菌马亚种胞外蛋白的实例为SFS(参考文献28)、IdeE和IdeZ(参考文献26)、IdeE2和IdeZ2(参考文献16)。这些类型的蛋白为用作免疫目的的活性成分的潜在候选者。
该类型蛋白作为保护马抵抗腺疫的潜在疫苗的成分的用途被公开于WO 2004/032957A1、WO 00/37496、WO2007/115059A2、WO 98/01561和WO 2009/075646A1。
Flock,M.等人(2004)(参考文献11)报道了在马腺疫的小鼠模型中,使用分别命名为FNZ、SFS和EAG的蛋白的部分来免疫小鼠。FNZ和EAG被认为是用于开发安全并有效的抗腺疫疫苗的期望候选者。
Timoney等人(2007)(参考文献42)报道了重组DNA产生的马亚种的胞外蛋白作为疫苗成分是无效的。推测在早期报道的结果中,对于通过重组DNA技术产生的、在小鼠实验中显示保护的一些马链球菌马亚种蛋白不适用于马。因此,重组体形式的胞外定位的马链球菌马亚种蛋白作为疫苗成分必然有功能并不是显而易见的。
参考文献45中,报道了使用来自马链球菌马亚种的重组抗原EAG、CNE和SclC接种马以抵抗腺疫。在该研究中,接种的马在用马链球菌马亚种激发(challenge)后显示细菌收率显著减少和流涕水平显著降低。
虽然为开发有效的疫苗已进行了许多努力,并且在参考文献14和15、WO 2004/032957A1、WO 2009/075646A1中提供的一些免疫成分是用于保护以抵抗马链球菌马亚种感染的疫苗的期望候选者,但仍期望开发安全的、具有高度免疫原性和显示有限副作用或没有副作用的疫苗。
人类病原体酿脓链球菌还表达与ECM和/或宿主血液成分相互作用的许多胞外蛋白(参考文献6、7、9、33)。其中之一为称作EndoS的内切糖苷酶,其能够水解人免疫球蛋白G(IgG)上天冬酰胺-连接的聚糖的壳二糖核心(参考文献8)。EndoS在一系列文章中被进一步表征,描述了例如酶性质、特异性等(参考文献1、2、3、4、34)。EndoS在治疗或预防由IgG抗体介导的疾病例如自身免疫病中的用途公开于WO/2008/071418A2,和EndoS在分离和分析IgG中的活体外的用途公开于WO 2009/033670A2。马链球菌马亚种的EndoSe和马链球菌兽疫亚种的EndoSz或其片段作为抗细菌感染或引起免疫原应答(immunogenic response)或保护性免疫应答的疫苗的用途公开于WO 2011/059385A1(将其全部公开内容引入本文以作参考)。
发明内容
本发明基于抗原性的、适合的免疫原性的、包含含有源自在马链球菌马亚种和马链球菌兽疫亚种之一或两者中存在的蛋白的至少一种抗原表位或抗原决定簇的多种抗原、适合的免疫原的组合物及其在免疫非人类哺乳动物抵抗马链球菌马亚种和/或马链球菌兽疫亚种中的用途。根据本发明,组合物的至少一种成分为包含两个或多个抗原或其片段的融合蛋白或多肽。
本发明还涉及亚单位免疫原或疫苗组合物,其包含上述抗原组合物作为免疫成分;涉及制备所述抗原性的、适合的免疫原性组合物或疫苗组合物的方法;涉及在非人类哺乳动物中诱导抗马链球菌马亚种和/或马链球菌兽疫亚种的免疫应答的方法;以及涉及在非人类哺乳动物中预防性或治疗性处理马链球菌马亚种和/或马链球菌兽疫亚种感染的方法。
本发明还涉及特异性抗原融合多肽本身。
根据适合的实施方案,本发明涉及保护马科例如马抵抗由马链球菌马亚种引起的疾病,例如腺疫、上呼吸道感染、创伤感染和子宫内膜炎的疫苗。词语“保护”是包括完全保护和降低感染严重性之间的任何情况的泛称。可用各种方式测量保护程度,关于例如马链球菌马亚种在马中的感染,疫苗的效果可以是降低临诊症状和降低临床疾病,其中可观察到温度升高幅度的降低、淋巴结(lympnodes)肿胀的降低和细菌从被感染动物的传播降低等。如何测量免疫组合物在激发后的效力的方法和步骤可从例如参考文献14和WO 2009/075646A1中获得。
出于各种原因,在马中进行接种和激发实验之前,在小型动物模型中研究疫苗中待使用的新抗原的评价。关于由马亚种引起的上呼吸道感染,已描述了优选和良好建立的接种和实验感染模型(参考文献11、12、13、14、16、43、WO 2004/032957A1、WO 2009/075646A1)。该模型以高度的可靠性被用于筛选和评价在马中具有引发保护性免疫原应答潜能的马链球菌马亚种抗原(参考文献13、14)。
在由马链球菌马亚种引起的感染的情形中,“非人类哺乳动物”的表述主要指属于马科的由马、驴和斑马及其杂种如马骡和驴骡组成的动物。骆驼和单峰驼(dromedarie)也包含于其中。
关于由马链球菌兽疫亚种引起的感染,“非人类哺乳动物”的表述另外还指其它哺乳动物例如牛、猪、狗和猫。
本发明的上述各方面及其优选实施方案定义于所附权利要求书中。
在特定实施方案中,本发明使用选自氨基酸序列SEQ IDNOS:22、24、26、28、30、32、34、38、42的一种或多种多肽和选自核苷酸序列SEQ ID NO S:21、23、25、27、29、31、33、37、41的一种或多种核苷酸序列。
除非另有陈述,否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的微生物学、重组DNA技术和分子生物学及免疫学的常规技术。该技术说明于文献例如Sambrook等人(2001)MolecularCloning:A laboratory manual,第三版,Cold Spring HarbourPress。除非另有定义,否则本文所使用的所有科技术语与由本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同。
分子例如蛋白质或核酸的“片段”意思是指氨基酸或核苷酸序列的部分。
术语“类似物”指与参考序列具有80%以上、尤其是90%以上序列同源性(“同一性”)的核酸或氨基酸序列的变体。通常,“同一性”指两个多核苷酸或多肽序列各自准确的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的对应性。确定核酸序列同一性的技术在本领域中是熟知的,并且用于计算序列之间同一性的软件程序是可获得的。
许多马链球菌马亚种蛋白在各种报道中具有不同的命名。为了便于阅读,将本申请及以前报道/专利申请文献和选择性命名示于下表1中。
表1
附图说明
图1A为示出在研究I中用Strangvacc2、Strangvacc3/4或安慰剂(对应于组A、B和C)接种的矮种马(pony)中直肠温度相对于激发后天数的图。
图1B为示出在研究II中用Strangvacc3/4、5或7(对应于组D、E和F)接种的矮种马中直肠温度相对于激发后天数的图。
图1C为示出在研究II中用Strangvacc 8或安慰剂(对应于G和H)接种矮种马中直肠温度相对于激发后天数的图。
图2为示出在研究I和II中对于单独的接种矮种马的死后累积值(accumulated post mortem values)的图。
图3为示出用Strangvacc 1(包含单个抗原)或Strangvacc2和3/4(数据彼此组合)(包含融合蛋白)接种的矮种马中的抗体水平的图。上图(组)显示抗CNE抗体,和下图(组)显示抗Eq5(SEQ0256)抗体。
图4A为示出抗Eq54(n=10)和Eq27的抗体滴度的图。显示了在来自用Eq54或Eq27免疫、或剩余未接种的小鼠的血清中的IgG滴度。显示了ELISA中为了得到1.5的吸光度所要求稀释的log值的平均值和标准误差。包括来自未接种小鼠的值。
图4B为示出被感染小鼠的重量损失的图。显示了用马链球菌马亚种感染的小鼠随时间的平均重量损失。如表明的那样小鼠(n=3×10)以前已接种有抗原。示出了平均值和标准误差。
图4C为示出被感染的小鼠的鼻部定植(nasal colonisation)的图。显示出马链球菌马亚种随时间在用马链球菌马亚种感染的小鼠的鼻部生长。如表明的那样小鼠(n=3×10)以前已接种有抗原。示出了平均值和标准误差。
具体实施方式
如上所述,本发明通常涉及当施用到哺乳动物时能够引起免疫原应答的马链球菌马亚种或马链球菌兽疫亚种的多肽或蛋白的鉴定;和涉及编码这些多肽或蛋白的多核苷酸或基因的鉴定。
本发明还涉及所述多肽或蛋白或者所述多核苷酸或基因的片段或类似物。
更具体地,本发明公开如何能够通过基因融合技术将编码各种胞外蛋白的马链球菌马亚种或马链球菌兽疫亚种的基因片段组合,在适当的宿主中表达并用作哺乳动物中的抗链球菌感染疫苗的抗原。虽然基于该研究,但本发明不局限于公开的特定组合。基本上,在各融合蛋白中表示的单独的抗原可以各种数量、顺序或组合来排列。原则上,抗原的顺序可例如为N端-A-B-C-D-E-C端,但各单独抗原的位置可以改变并且其数量是变化的。另外,本发明还公开如何能够将融合蛋白与非融合蛋白组合于疫苗以获得有效的疫苗组合物。
下文中,将参考各种专利和参考文献,将其相关的公开内容引入本文以作参考。
根据一个实施方案,本发明涉及包含若干抗原的抗原组合物,其中各抗原包含马链球菌马亚种或马链球菌兽疫亚种的蛋白或多肽的至少一部分,和所述蛋白或多肽的所述至少一部分包含马链球菌马亚种或马链球菌兽疫亚种的至少一种抗原表位或抗原决定簇,和其中所述蛋白或多肽的至少一部分选自包括以下的组:
命名为Eq85并具有如SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为CCE并具有如SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为IdeE并具有如SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为CNEEAG并具有如SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为IE5并具有如SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为EndoSe并具有如SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为CPCE并具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为Eq54并具有如SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为Eq27并具有如SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
及其片段和类似物;
其中至少一种抗原为融合蛋白或多肽。
上述一种抗原或多种抗原可进一步与选自包括以下的组的蛋白或多肽的至少一部分组合:
命名为CNE并具有如WO 2004/032957A 1,SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为FNZ并具有如WO 2004/032957A 1,SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为SFS并具有如WO 2004/032957A 1,SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为SclC并具有如WO 2004/032957A 1,SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为EAG并具有如WO 2004/032957A1,SEQ ID NO:1和WO 2009/075646A1,SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为IdeE并具有如WO 2009/075646A 1,SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为IdeE2并具有如WO 2009/075646A 1,SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为Eq5并具有如WO 2009/075646A 1,SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为Eq8并具有如WO 2009/075646A1,SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为IdeZ2并具有如WO 2009/075646A1,SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
命名为Eqz5并具有如WO 2009/075646A1,SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的蛋白或多肽;和
命名为Eqz8并具有如WO 2009/075646A1,SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的蛋白或多肽;
或其类似物或片段。
为了方便起见,通常将具有如上述WO 2009/075646A1和WO 2004/032957A1的序列表中所示的氨基酸序列的多肽分别仅命名为CNE、FNZ、SclC、SFS、EAG、IdeE、IdeE2、Eq5、Eq8、IdeZ2、Eqz5和Eqz8。EAG、IdeE、IdeE2、Eq5和Eq8命名可发现于马链球菌马亚种中的蛋白,IdeZ2、Eqz5和Eqz8命名可发现于马链球菌兽疫亚种中的蛋白。其它实例为M或M样蛋白例如参考文献42中所述的SeM。
可包含于本发明的抗原组合物中的抗原的另外的实例包括SclC蛋白SclD-SclI(genbank acc.nos.DQ158080,DQ158081,DQ158082,DQ158083,DQ158084,DQ158085)、FNE(acc.no.AF360373)、FNEB(acc.no AY898649)、FNEC-FNEF(参考文献24)、SeM(acc.no.U73162,还称为FBP,acc.no.YP002747233)、SzPSe(acc.no.U73162)、seeH(acc.no.AF186180)、seeM(acc.no.AJ583528),seeI(GenBank,Gene ID7697191、SEQ_2037,参考文献15)、seeL(acc.no.AJ583527)、Se51.9(acc.no.AF521601)、Se46.8(acc.no.AF521600)、Se24.3(acc.no.AY137521)、Se75.3(acc.no.AY137528)、Se110.0(acc.no.AY137519)、Se24.3(AY137521)、Se42.0(acc.no AY137521)、Se117.0(acc.no.AY137523)、Se18.9(acc.no.DQ068464)、ZAG(acc.no.U25852),slaA(acc.no.CAW93317)、slaB(acc.no.CAW95519)、sagA(acc.no.ACG61862)、链球菌溶血素S生物合成蛋白(CW92800、CW92802、CW92798)、链球菌溶血素S前体(CW92796)、SpyCEP(acc.no.DQ413032)、SpyCEP类似蛋白SeCEP和SzoCEP(参考文献43)。
然而,可包含于本发明的抗原组合物中的蛋白或多肽片段不局限于上述所列的那些。通常,本发明可原则上与表达于表面上的任何胞外蛋白或其片段或者运输至致病链球菌例如马链球菌的不同亚种或酿脓链球菌的环境的蛋白一起使用。通过这些细菌的基因组DNA序列的分析,例如http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_equi/;http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_zooepidemicus/;http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_pyogenes/,可以鉴定编码胞外蛋白的开放阅读框。通常这些蛋白的特征在于翻译后具有(harboring)负责跨膜运输的N端信号序列。用于疫苗开发的特别感兴趣的蛋白组(group)为除了具有信号序列以外还展示易于识别的C端结构域的蛋白,该C端结构域包含通常定义为例如LPXTG的氨基酸基序,对于将胞外蛋白锚定到细菌细胞壁的肽聚糖结构是重要的(参考文献37)。如何通过生物信息学方法例如计算机程序SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/),(参考文献19、38)鉴定该蛋白是本领域技术人员所熟知的。
本发明的抗原或免疫原组合物的抗原或免疫原可包括所述蛋白或多肽的整个氨基酸序列,或者可包括其片段如其C-端或N-端片段,或其类似物。这些抗原可单独或组合使用。根据本发明,还可通过基因融合技术将它们融合成各种结合体并用作疫苗抗原。此外,这些融合结合体可单独或与其它融合结合体组合和/或与单个抗原组合来使用。
根据本发明,抗原组合物可包含通过重组技术产生的至少一种抗原和/或作为分离或纯化的抗原的至少一种抗原,或其片段,例如由链球菌细菌产生的天然型(或高产突变株(overproducing mutants))。天然型可以从在适当培养基生长而导致相应蛋白高产的细菌的细胞或生长培养基中分离。另外,在发现获得天然蛋白的最佳生长条件(包括生理条件)后,还可以构建高产链球菌菌株。使用本领域技术人员熟知的方法,存在若干产生和分离高产菌株的方式,例如,通过定点诱变、化学诱变、紫外线等方式。从生长培养基纯化和分离胞外蛋白的步骤是本领域技术人员所熟知的。
由上述显而易见的是,本发明的源自马链球菌马亚种或马链球菌兽疫亚种的蛋白的抗原或免疫原包括具有免疫原性的整个蛋白、所述蛋白的片段或所述蛋白的类似物(诸如合成肽等)。因此,本发明不局限于本文所具体公开的蛋白的片段。
本发明的抗原组合物可包含至少一种重组载体和其中插入的至少一种多核苷酸,所述多核苷酸编码所述至少一种蛋白或多肽,和所述载体能够在易感染马链球菌马亚种和/或马链球菌兽疫亚种的非人类哺乳动物中活体内表达所述多肽。
根据本发明的一个实施方案,载体为表达载体,其为质粒或病毒载体,其中所述多核苷酸具有编码本发明的抗原的核苷酸序列。
本发明的应用不局限于使用大肠杆菌和适于该细菌的载体作为运载体(vehicle)和工具来表达重组多肽。其它宿主和载体在本领域内是熟知的并且可WO 2007/115059A2在文献和该文献所引用的文献中找到。此外,本申请的应用不局限于本发明公开的抗原的具体核苷酸序列,这是因为密码子选择(codon usage)必须采用待使用的产生宿主所特定的核苷酸序列。合成和采用密码子选择的技术是本领域技术人员所熟知的。
本发明另外的实施方案涉及保护非人类哺乳动物抵抗马链球菌马亚种感染的疫苗组合物,其包含作为免疫成分的上述抗原组合物,和药物学可接受载体(carrier)。
适当地,本发明的疫苗组合物包含含有一种或多种本发明的抗原或免疫原作为免疫成分的抗原或免疫原组合物。任选地,一种或多种这些抗原或免疫原由所述蛋白的类似物或其片段组成。
疫苗组合物可包含另外的成分,例如佐剂。适当地,所述佐剂强化全身性或粘膜免疫力。这些佐剂在本领域内是熟知的。
根据本发明使用的适当佐剂包括(1)丙烯酸类或甲基丙烯酸类聚合物、马来酸酐和链烯基衍生物聚合物,(2)免疫剌激序列(IS S),(3)水包油乳化液,(4)包含季铵盐的阳离子脂质,(5)细胞因子,(6)氢氧化铝或磷酸铝,(7)皂素或(8)纳米粒子或(9)其任意组合或混合物。适当佐剂的另外的实例还可在WO2007/115059A2所引用的文献中找到。
根据本发明使用的适当佐剂为来自Isconova AB Sweden的佐剂Abisco、Matrix C和Matrix Q。IS COMS的关键成分为源自智利皂树皮树皂树(Quillaia saporinaria Molina)的树皮的皂树皮皂素(Quillaia saponin)。对于皂树皮皂素激活免疫系统的能力是熟知的(参考文献32)。与胆固醇和磷脂在具体计量化学下混合的皂树皮皂素形成被称为ISCOMS的球形开口笼(open cage)样结构。
另外的适当佐剂为人参。人参为由植物人参(Panaxginseng,C.A.Meyer.)的根制备的干提取物。人参包含大量称为人参皂苷(其为一类皂素,化学上为达玛烷(dammaran)系列的三萜苷)的活性物质。人参皂苷具有佐剂性质,和活性最强的佐剂之一为称作Rb1的组分。已证明如用Rb1辅助的疫苗接种后通过测量细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的分泌水平所测定的,组分Rb1引起稳定的Th1和Th2免疫应答。另外人参和组分Rb1激活强烈的抗原特异性抗体应答。
根据适当的实施方案,疫苗组合物为保护易感哺乳动物,适当地如马抵抗由马链球菌马亚种引起的腺疫和抵抗由马链球菌兽疫亚种引起的感染的疫苗。
本发明的疫苗组合物以生理学可施用形式提供。适当地,其可通过肌内、皮下、皮内或鼻内接种来施用。
适当地,本发明的疫苗组合物在易感染马链球菌马亚种和/或马链球菌兽疫亚种的哺乳动物中剌激针对这些细菌抗原的血清、粘膜和/或支气管的抗体应答。
本发明还涉及在本发明的抗原或免疫原组合物中使用的抗原或免疫原的生产方法,所述方法包括以下步骤:
(a)提供编码所述抗原的DNA片段并将所述片段导入表达载体;
(b)将包含所述DNA片段的所述载体导入相容性宿主细胞;
(c)在表达由所述DNA片段编码的产物所需的条件下培养步骤(b)中提供的所述宿主细胞;和
(d)从培养的宿主细胞中分离所表达的产物。
优选地,所述方法进一步包括步骤(e),其中通过例如亲和色谱或本领域内已知的其它色谱方法来纯化来自步骤(d)的分离产物。
因此,本发明的抗原通常根据重组技术来生产。
本发明另外的实施方案涉及制备本发明的疫苗的方法,所述疫苗包含上述公开的抗原或免疫原组合物作为免疫成分,所述方法包括混合所述抗原组合物和药物学可接受载体。
本发明还涉及抗血清的生产方法,所述方法包括将本发明的抗原制品施用到动物宿主以在所述动物宿主中产生抗体并回收包含所述动物宿主中产生的所述抗体的抗血清。
另外,本发明涉及在哺乳动物,适当地如马中预防性或治疗性处理马链球菌马亚种和/或马链球菌兽疫亚种感染的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用免疫有效量的本发明的疫苗或抗血清。
因此,本发明涉及保护马抵抗马链球菌马亚种感染的方法,所述方法包括用本发明的疫苗组合物来皮下、鼻内、皮内、口腔或肌内、或其任意组合接种马从而在所述马中诱导抗马链球菌马亚种的免疫应答。适当地,在所述马中诱导在鼻咽粘液和/或血清中的以IgG和/或IgA和/或IgM抗体形式的免疫应答。
本发明还涉及包含至少一种,和适当地至少两种对本发明的抗原组合物的蛋白或多肽特异的抗体的抗体制品,所述一种抗体/多种抗体为多克隆或单克隆的;或者所述制品包含所述抗体的片段。
可预防性或治疗性使用本发明的抗体制品以抵抗腺疫并且当向易被马链球菌马亚种感染或感染马链球菌马亚种的非人类哺乳动物施用时提供被动免疫。
本发明提供包含一种或多种抗原成分的疫苗组合物,其根据本发明的方法使用大肠杆菌作为宿主细胞来制备。如果开发了其表达和纯化方法,则这些抗原的来源也可以是天然细菌。可选地,本发明的抗原还可根据基于融合策略的方法来产生,在融合策略中重组相应抗原的各部分,产生由来自不同抗原的部分所组成的融合蛋白。该融合策略还可适于导入免疫反应性部分,例如T细胞表位或减毒毒素(或其部分),由此导入适于优化抗原呈递或定位的其它特征。
本发明还可用于其它疫苗或亚单位免疫原组合物,其中本发明可与选自其它病原微生物或病毒的一种或多种免疫原、抗原或表位组合,从而形成多价亚单位免疫原组合物或疫苗。例如,对于马,这样的多价亚单位免疫原组合物或疫苗可包含根据本发明的至少一种多肽和来自WEEV、EEV、VEEV、马流感病毒、EHV-1、EHV-4、EAV、WNV、破伤风、红球菌属(Rhodococcus)的至少一种免疫原、抗原或表位。
本发明还提供测量抗疫苗组合物中所包含的各种蛋白(或其片段)的抗体的诊断方法。例如,这些类型的方法可用于测定免疫之前和/或之后血清中的抗体滴度或者测定被感染哺乳动物中的抗体滴度。所述方法也可被应用到筛选哺乳动物个体以检测马链球菌马亚种和马链球菌兽疫亚种的被感染者或慢性携带者。此外,本发明还提供测定抗疫苗中抗原的具有中和活性的抗体的方法,由此使其可以测量例如免疫操作的效果或鉴定缺乏中和所述抗原的抗体的个体。
实验部分
实施例1.PCR扩增和大肠杆菌克隆的构建
使用马链球菌马亚种菌株1866(获自NordvaccAB,Sweden)(WO 2004/032957A1、参考文献25)作为克隆用DNA的来源。制备来自马亚种菌株1866的染色体DNA,并用作模板来扩增下述进一步提供的实施例2-8和16的各种基因片段。用于扩增各种基因片段的引物序列在表2、4和5中列出。引物序列包含限制酶的切割位点。使用质粒载体pGEX-6P-1(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)(可选地,使用pTYB4载体,New England Biolabs)用于克隆和表达。利用以下程序使用引物(20pmol/μl)和FideliTaqTM PCR Master Mix(USB Corporation,Cleveland,Ohio)进行PCR扩增:步骤1,95℃预热1分钟,DNA链分离;步骤2,95℃30秒;步骤3,在低于相应引物结合体熔点5度下退火15秒;和步骤4,72℃延伸2分钟,步骤2-4运行26个循环。在1%琼脂糖凝胶上分析PCR产物,之后使用QIAquick PCR Purification KitTM(Qiagen)纯化。在用限制酶切割后,使用相同的试剂盒额外纯化所述片段一次。纯化后,使用ReadyToGo T4DNA Ligase(GEHealthcare,Upp sala,Sweden)将片段连接到载体。连接后,使用电穿孔将相应样品转化到大肠杆菌菌株TG1的感受态细胞,并涂布到LA-Amp平板(补充有终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素的Luria-Bertani肉汤琼脂(15g/L)平板)上并37℃温育过夜。次日挑选菌落并通过使用各引物结合体的PCR来分析。使具有预期插入片段的克隆生长并制备质粒。还通过DNA测序测定各插入片段的序列。将正确的克隆转化到大肠杆菌菌株BL 21(DE3)pLys的感受态细胞中用于蛋白表达。
表2
引物序列5'-3'
SEQ ID NO:1.CneBam:ggttggatccactaatcttagtgacaacatcac
SEQ ID NO:2.CncSac:TCCAGAGCTCCTTGACAGTAAAGCTGGTATAG
SEQ ID NO:3.EagSac:agtggagctcttagacgcagcaacagtg
SEQ ID NO:4.EagXho:CACCCTCGAGTTATTTGGCTTTGTTGATTAAGGTC
SEQ ID NO:6.Eqc10:GAGGTCTAGAAGGACCTTGTTTGCCATTT
SEQ ID NO:8.Eqc12:GAGGCTGCAGTGGACCTCGGGTACCGCCTT
SEQ ID NO:10.ScSac:TGCAGAGCTCTGGCTTTTGGGCAGCTTCTTC
SEQ ID NO:20.54Xba:TATTTCTAGAAGTTTTATAGGTGAAAACGATAACC
实施例2.表达融合蛋白Eq85的克隆的构建
使用引物对eq8Bam和eq8Nco来PCR扩增eq8的基因片段。扩增和纯化后,用BamHI和NcoI消化片段。另外使用引物对85Nco和eq5C2来PCR扩增eq5的基因片段。扩增和纯化后,用NcoI和XhoI消化片段。将两片段连接到BamHI和XhoI切割的载体pGEX-6P-1。
SEQ ID NO:21.示出插入到pGEX-6P-1载体的编码Eq85的基因融合片段的核苷酸序列。BamHI和XhoI位点以粗体表示和载体序列带下划线。注意粗体且斜体的核苷酸A与在http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_equi/中公布的序列相比在该位置是不同的;
TCTGTTCCAGGGGCCCCTG GCGACTACCCTAGCAGGACAAACAGAAGTACGGGCTGATAATATCTTACGCTTAGATATGACAGATAAAGAAGCAGTTGAAAAATTCGCTAACGAGCTTAAAAATGAAGTCCATAAAAACTATCGTGGTAGTAATACTTGGCAAAAGCTTACCCTTATACTTAATGGTTATCAAAACCTTAGAGAACAAATAGAGACCGAGCTAAAAAATAGTGAACAAAAAGTAAAAGAGCTTAATGATAAGGTTAATAGTGAAACTCAAGGAAAACAAGAGTTACAGAATCAGCTTGAGAAAGAAAAAGAAGAGTTAGAAACACTAAAAAAAGAGCTTGAAGCTGAGAAGGCTAAAGGAACTGGAGAAACAGAGAAGCTTCAAAAGGAAATTGAAGCAAAAAATGCAATGATTTCTGACCTACAAAAACAGCTTGAGGAAACTAAGCAAAGGGTTCAAGAGTTTGAAGCTGAAGTAGGTAAATTAATGGCCGAAAAGGCAGACCTACAAACAAAATTAAATGAACAAGAGCAGCTTAACGCTAAGCTTCAAAAAGAAATTGAAGACTTAAAGGCTCAGATTGAAAAGCTTAAGCACCCATGGGAAACGACTACTGCTAGTGCATTTGAAAATAATGGGACAGGTCAACATCTGAACTGGCACATAGATATTCCACAAGAATATACAGTTGAATTAGGAGAACCAATTACTATCTCAGATCTTATGAGTCAAATTACGGTTACTCGTAAAGGTAGTAATGGGACTGTTAATGATGGAGATACTTTTGACTTTATTTCGAATGGAGATGGTTCAAGAGGAATTGATACCCCTGGAGTAAAAATATGGTTTGACTTTTACAATGCTGCGGGTACTTCCTTTTTAACTGATGAAATGTTAGCTTCGCCTACATATGCTGTACCGGGGGGATCTTATACTATTAAAGCTTGGGTATTCTATGGGAAAAATGATACCAAAAAGCTCTTCACATTTAAACTAAAAAATTCCAACAGCAATAAAACTGAGTTAAGGAAGTCGTTAGAGGAGGCTAAGCTAAAACTCAGCCAGCCTGAAGGAACGTATTCTGATGAATCACTGCAAGCCTTGCAATCAGCGGTTACTTTGGTAAGACCTATTTAAACAGTGACCCTGATCAAAATACAGTAGATCAATCTGTTACTACTATTGATTCCGCTATTACTAGTCTTGTTAATCTTAATGCTTTAAATGAAGCTATTAATCAAGCTACACCTTTTATAACAGATGGCAAAGAGTATCCTAAAGAAGCGTATGACGGTCTTGTGCAAAAGCTTGCAGCGGCAGCTAAGCTTCAAAATTCATTTGGTCCTTCACAAGGAGATGTTGATAAGGCTGCGACTGATTTAACGCAAGCTCTTACGACGCTTAAGACTGCTGTAGCGCATGAAGCCTTAGATCAAGCCTTGGCTAAGCTGTTAGAGCTTTACCGAGAAAATCCAAATCTTGCTTTGACATCAGAGTCTTTGAAGGAATTGTACAATAAGGCCATTGAAGCAGCAGGTACCTTCTATAGAACTGTTAACAAGGATAAAGAGAGAAAAGACATTTCCCTTTATGAGCTAGAGCGCTACACTACAGAAACAAATTCAGTTGTTGATACTATTTTAAAGGTAAAGGCTGCGATTGCCGAAGAAGGAAAGGCAAAATTGCGTTCTGCTTTAGACCAATTAAATGCTCTTATCGGAGAAAATCTAGACCTATCTCCATATACAGCAGCTTCTGCTCAAGCCTATACAGACCAGCTAGCTAAGGCTAAGGAGGTCGCAGCAGCGGGTGAGACAGCTTATGCTCAGGAGACAGAACCGACAGCTATTACTAACAGCTTGGTTAAGGTGTTAAATGCTAAGAAATCCCTCTCAGATGCCAAGGCAGCCTTGGTTGCTAAATAA CGGCCGCATCGTG
SEQ ID NO:22.Eq85融合蛋白。带下划线的氨基酸表示源自载体的序列。*表示剪切蛋白酶(scissor protease)切割位点。注意粗体氨基酸源自融合蛋白的构建作业(construction work),并且如果使用另外的融合策略,则这些氨基酸可以变更甚至缺失。注意粗体且斜体的氨基酸Ile(I)与在http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_equi/中公布的序列相比在该位置是不同的;
LEVLFQ*GPLGSATTLAGQTEVRADNILRLDMTDKEAVEKFANELKNEVHKNYRGSNTWQKLTLILNGYQNLREQIETELKNSEQKVKELNDKVNSETQGKQELQNQLEKEKEELETLKKELEAEKAKGTGETEKLQKEIEAKNAMISDLQKQLEETKQRVQEFEAEVGKLMAEKADLQTKLNEQEQLNAKLQKEIEDLKAQIEKLKHETTTASAFENNGTGQHLNWHIDIPQEYTVELGEPITISDLMSQITVTRKGSNGTVNDGDTFDFISNGDGSRGIDTPGVKIWFDFYNAAGTSFLTDEMLASPTYAVPGGSYTIKAWVFYGKNDTKKLFTFKLKNSNSNKTELRKSLEEAKLKLSQPEGTYSDESLQALQSAVTGKTYLNSDPDQNTVDQSVTTIDSAITSLVNLNALNEAINQATPFITDGKEYPKEAYDGLVQKLAAAAKLQNSFGPSQGDVDKAATDLTQALTTLKTAVAHEALDQALAKLLELYRENPNLALTSESLKELYNKAIEAAGTFYRTVNKDKERKDISLYELERYTTETNSVVDTILKVKAAIAEEGKAKLRSALDQLNALIGENLDLSPYTAASAQAYTDQLAKAKEVAAAGETAYAQETEPTAITNSLVKVLNAKKSLSDAKAALVAK
实施例3.表达融合蛋白C CE的克隆的构建
该基因融合构建体由五个不同的马链球菌马亚种基因片段(cne、eq21、eq36、eq42和eag)组成。首先,使用引物对CneBam和CneSac来PCR扩增cne的基因片段。扩增和纯化后,用BamHI和SacI消化片段。其次,使用引物对EagSac和EagXho来PCR扩增eag的基因片段。扩增和纯化后用SacI和XhoI消化片段。纯化的cne和eag片段连接到BamHI和XhoI切割的载体pGEX-6P-1。转化到大肠杆菌后鉴定正确克隆并表示为pCNEEAG。之后,使用引物对eqc9和eqc10来PCR扩增eq21的基因片段。在扩增和纯化后用SacI和XbaI来消化片段。使用引物对eqc11和eqc12来PCR扩增eq36的基因片段。扩增和纯化后用XbaI和PstI消化片段。使用引物对eqc13和ScSac来PCR扩增eq42的基因片段。扩增和纯化后用PstI和SacI消化片段。将三个切割片段(eq21、eq36和eq42)彼此连接,并使用引物对eqc9和ScSac进行新PCR。用SacI切割所得PCR产物并连接到SacI切割的pCNEEAG,产生具有以下顺序cne-eq21-eq36-eq42-eag的基因片段的pCCE。
SEQ ID NO:23.示出插入pGEX-6P-1载体的cne-eq21-eq36-eq42-eag的基因融合片段的核苷酸序列。BamHI和XhoI位点以粗体表示和载体序列带下划线。
CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTG ACTAATCTTAGTGACAACATCACATCATTGACGGTTGCTTCTTCATCACTCCGAGATGGAGAGAGAACGACGGTAAAGGTTGCGTTTGATGACAAAAAACAGAAAATCAAGGCAGGGGATACGATAGAGGTCACCTGGCCTACAAGTGGTAATGTCTACATTCAGGGCTTTAATAAAACCATACCGCTTAATATTAGAGGGGTAGATGTTGGTACCTTGGAGGTCACGCTAGACAAGGCTGTTTTCACATTCAATCAAAATATTGAAACAATGCATGATGTCTCTGGTTGGGGAGAGTTTGATATTACTGTTAGAAATGTGACACAAACCACCGCTGAAACATCAGGAACGACCACAGTAAAGGTAGGCAATCGCACTGCTACTATCACTGTTACTAAGCCTGAGGCAGGCACTGGTACCAGCTCATTTTATTATAAGACTGGTGATATGCAGCCCAATGATACTGAGCGTGTGAGATGGTTCCTGCTGATTAACAACAACAAGGAATGGGTGGCCAATACTGTTACAGTCGAAGACGATATTCAAGGTGGTCAAACCTTGGATATGAGCAGCTTTGACATCACCGTATCTGGTTATCGTAACGAGCGCTTCGTTGGGGAAAACGCTCTGACAGAGTTTCATACAACATTTCCAAATTCTGTCATTACGGCAACAGATAATCACATTAGTGTGCGGTTAGATCAATATGATGCCTCACAAAACACTGTCAACATTGCTTATAAGACAAAGATAACGGACTTTGACCAAAAAGAATTTGCCAACAACAGTAAAATCTGGTACCAGATTTTATACAAGGATCAGGTATCGGGTCAAGAGTCAAACCACCAAGTAGCCAATATCAATGCTAACGGCGGGGTTGATGGCAGTCGCTATACCAGCTTTACTGTCAAGGAGCTCTCGGAACCCAATCCATATCCAGATGTGAGGCGTTTCCTTGATGAGAAGTACGATGGAGATGTGGATAAATTATCTAAACAACTTCAAGGTTATTTTGGTAGTTTAAGAGAGTATATAGAGTTTGAACTTAAAAATGGCAAACAAGGTCCTTCTAGATTATCTGGTCCGCCAGGATACCCACTTACTCGTGATTTCTCCCGTAACTTCCTAGAAGAAAATACTGCAAAATATTTAGATCAATTAAGAGAACATCTACAGCACAGATTTAGTGAACTTGAGAGCTTAACAAGAAAATTAGAGAAAGAAGGCGGTACCCGAGGTCCACTGCAGGACCAGCCAGCAGCACTAAAATATCCAGAACCTAGAGACTATTTTCTTCATACTCGTGAAGGTGATGTTATTTATGATGAGGATATAAAAAGATATTTTGAGGATTTAGAAGCCTATTTAACAGCTAGACTTGGTGGGATTGATAAAAAAGTAGAAGAAGCTGCCCAAAAGCCAGAGCTCTTAGACGCAGCAACAGTGTTAGAGCCTACAACAGCCTTCATTAGAGAAGCTGTTAGGGAAATCAATCAGCTGAGTGATGACTACGCTGACAATCAAGAGCTTCAGGCTGTTCTTGCTAATGCTGGAGTTGAGGCACTTGCTGCAGATACTGTTGATCAGGCTAAAGCAGCTCTTGACAAAGCAAAGGCAGCTGTTGCTGGTGTTCAGCTTGATGAAGCAAGACGTGAGGCTTACAGAACAATCAATGCCTTAAGTGATCAGCACAAAAGCGATCAAAAGGTTCAGCTAGCTCTAGTTGCTGCAGCAGCTAAGGTGGCAGATGCTGCTTCAGTTGATCAAGTGAATGCAGCCATTAATGATGCTCATACAGCTATTGCGGACATTACAGGAGCAGCCTTGTTGGAGGCTAAAGAAGCTGCTATCAATGAACTAAAGCAGTATGGCATTAGTGATTACTATGTGACCTTAATCAACAAAGCCAAATAA CGGCCGCAT
SEQ ID NO:24.CCE融合蛋白。带下划线的氨基酸表示源自载体的序列。*表示剪切蛋白酶切割位点。注意粗体氨基酸源自融合蛋白的构建作业,并且如果使用另外的融合策略,则这些氨基酸可以变更甚至缺失。
LEVLFQ*GPLGSTNLSDNITSLTVASSSLRDGERTTVKVAFDDKKQKIKAGDTIEVTWPTSGNVYIQGFNKTIPLNIRGVDVGTLEVTLDKAVFTFNQNIETMHDVSGWGEFDITVRNVTQTTAETSGTTTVKVGNRTATITVTKPEAGTGTSSFYYKTGDMQPNDTERVRWFLLINNNKEWVANTVTVEDDIQGGQTLDMSSFDITVSGYRNERFVGENALTEFHTTFPNSVITATDNHISVRLDQYDASQNTVNIAYKTKITDFDQKEFANNSKIWYQILYKDQVSGQESNHQVANINANGGVDGSRYTSFTVKSEPNPYPDVRRFLDEKYDGDVDKLSKQLQGYFGSLREYIEFELKNGKQGPLSGPPGYPLTRDFSRNFLEENTAKYLDQLREHLQHRFSELESLTRKLEKEGGTRGPDQPAALKYPEPRDYFLHTREGDVIYDEDIKRYFEDLEAYLTARLGGIDKKVEEAAQKPLDAATVLEPTTAFIREAVREINQLSDDYADNQELQAVLANAGVEALAADTVDQAKAALDKAKAAVAGVQLDEARREAYRTINALSDQHKSDQKVQLALVAAAAKVADAASVDQVNAAINDAHTAIADITGAALLEAKEAAINELKQYGISDYYVTLINKAK
实施例4.表达IdeE的克隆的构建
使用引物对IdEG1和IdEG2来PCR扩增ideE基因的基因片段。扩增和纯化后用BamHI和XhoI消化片段并连接到BamHI和XhoI切割的载体pGEX-6P-1。
SEQ ID NO:25.插入pGEX-6P-1载体的ideE基因的核苷酸序列。BamHI和XhoI位点以粗体表示和载体序列带下划线。
CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTG GACGATTACCAAAGGAATGCTACGGAAGCTTATGCCAAAGAAGTACCACATCAGATCACTTCTGTATGGACCAAAGGTGTTACACCACTAACACCCGAGCAGTTTCGATATAATAACGAAGATGTGATCCATGCGCCATATCTTGCTCATCAAGGCTGGTACGATATCACCAAGGCCTTCGATGGGAAGGATAATCTCTTGTGTGGCGCAGCAACGGCAGGTAATATGCTGCATTGGTGGTTTGATCAAAATAAAACAGAGATTGAAGCCTATTTAAGTAAACACCCTGAAAAGCAAAAAATCATTTTTAACAACCAAGAGCTATTTGATTTGAAAGCTGCTATCGATACCAAGGACAGTCAAACCAATAGTCAGCTTTTTAATTATTTTAGAGATAAAGCCTTTCCAAATCTATCAGCACGTCAACTCGGGGTTATGCCTGATCTTGTTCTAGACATGTTTATCAATGGTTACTACTTAAATGTGTTTAAAACACAGTCTACTGATGTCAATCGACCTTATCAGGACAAGGACAAACGAGGTGGTATTTTCGATGCTGTTTTCACCAGAGGAGATCAGACAACGCTCTTGACAGCTCGTCATGATTTAAAAAATAAAGGACTAAATGACATCAGCACCATTATCAAGCAAGAACTGACTGAAGGAAGAGCCCTTGCTTTATCACATACCTACGCCAATGTTAGCATTAGCCATGTGATTAACTTGTGGGGAGCTGATTTTAATGCTGAAGGAAACCTTGAGGCCATCTATGTCACAGACTCAGATGCTAATGCGTCTATTGGTATGAAAAAATATTTTGTCGGCATTAATGCTCATAGACATGTCGCCATTTCTGCCAAGAAAATAGAAGGAGAAAACATTGGCGCTCAAGTATTAGGCTTATTTACGCTTTCCAGTGGCAAGGACATATGGCAGAAACTGAGCTAA CGGCCGCAT
SEQ ID NO:26.IdeE蛋白。带下划线的氨基酸表示源自载体的序列。*表示剪切蛋白酶切割位点。
LEVLFQ*GPLGSDDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINIWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHRHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
实施例5.表达融合蛋白CNEEAG的克隆的构建
使用引物对CneBam和CneSac来PCR扩增cne的基因片段。扩增和纯化后用BamHI和SacI消化片段。另外使用引物对EagSac和EagXho来PCR扩增eag的基因片段。扩增和纯化后使用SacI和XhoI消化片段。将两个片段连接到BamHI和XhoI切割的载体pGEX-6P-1。
SEQ ID NO:27.示出插入pGEX-6P-1载体的编码CNEEAG的基因融合片段cne-eag的核苷酸序列。BamHI和XhoI位点以粗体表示和载体序列带下划线。
CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTG ACTAATCTTAGTGACAACATCACATCATTGACGGTTGCTTCTTCATCACTCCGAGATGGAGAGAGAACGACGGTAAAGGTTGCGTTTGATGACAAAAAACAGAAAATCAAGGCAGGGGATACGATAGAGGTCACCTGGCCTACAAGTGGTAATGTCTACATTCAGGGCTTTAATAAAACCATACCGCTTAATATTAGAGGGGTAGATGTTGGTACCTTGGAGGTCACGCTAGACAAGGCTGTTTTCACATTCAATCAAAATATTGAAACAATGCATGATGTCTCTGGTTGGGGAGAGTTTGATATTACTGTTAGAAATGTGACACAAACCACCGCTGAAACATCAGGAACGACCACAGTAAAGGTAGGCAATCGCACTGCTACTATCACTGTTACTAAGCCTGAGGCAGGCACTGGTACCAGCTCATTTTATTATAAGACTGGTGATATGCAGCCCAATGATACTGAGCGTGTGAGATGGTTCCTGCTGATTAACAACAACAAGGAATGGGTGGCCAATACTGTTACAGTCGAAGACGATATTCAAGGTGGTCAAACCTTGGATATGAGCAGCTTTGACATCACCGTATCTGGTTATCGTAACGAGCGCTTCGTTGGGGAAAACGCTCTGACAGAGTTTCATACAACATTTCCAAATTCTGTCATTACGGCAACAGATAATCACATTAGTGTGCGGTTAGATCAATATGATGCCTCACAAAACACTGTCAACATTGCTTATAAGACAAAGATAACGGACTTTGACCAAAAAGAATTTGCCAACAACAGTAAAATCTGGTACCAGATTTTATACAAGGATCAGGTATCGGGTCAAGAGTCAAACCACCAAGTAGCCAATATCAATGCTAACGGCGGGGTTGATGGCAGTCGCTATACCAGCTTTACTGTCAAGGAGCTCTTAGACGCAGCAACAGTGTTAGAGCCTACAACAGCCTTCATTAGAGAAGCTGTTAGGGAAATCAATCAGCTGAGTGATGACTACGCTGACAATCAAGAGCTTCAGGCTGTTCTTGCTAATGCTGGAGTTGAGGCACTTGCTGCAGATACTGTTGATCAGGCTAAAGCAGCTCTTGACAAAGCAAAGGCAGCTGTTGCTGGTGTTCAGCTTGATGAAGCAAGACGTGAGGCTTACAGAACAATCAATGCCTTAAGTGATCAGCACAAAAGCGATCAAAAGGTTCAGCTAGCTCTAGTTGCTGCAGCAGCTAAGGTGGCAGATGCTGCTTCAGTTGATCAAGTGAATGCAGCCATTAATGATGCTCATACAGCTATTGCGGACATTACAGGAGCAGCCTTGTTGGAGGCTAAAGAAGCTGCTATCAATGAACTAAAGCAGTATGGCATTAGTGATTACTATGTGACCTTAATCAACAAAGCCAAATAA CGGCCGCAT
SEQ ID NO:28.CNEEAG融合蛋白。带下划线的氨基酸表示源自载体的序列。*表示剪切蛋白酶切割位点。注意粗体氨基酸源自融合蛋白的构建作业并且如果使用另外的融合策略则这些氨基酸可以变更甚至缺失。
LEVLFQ*GPLGSTNLSDNITSLTVASSSLRDGERTTVKVAFDDKKQKIKAGDTIEVTWPTSGNVYIQGFNKTIPLNIRGVDVGTLEVTLDKAVFTFNQNIETMHDVSGWGEFDITVRNVTQTTAETSGTTTVKVGNRTATITVTKPEAGTGTSSFYYKTGDMQPNDTERVRWFLLINNNKEWVANTVTVEDDIQGGQTLDMSSFDITVSGYRNERFVGENALTEFHTTFPNSVITATDNHISVRLDQYDASQNTVNIAYKTKITDFDQKEFANNSKIWYQILYKDQVSGQESNHQVANINANGGVDGSRYTSFTVKLDAATVLEPTTAFIREAVREINQLSDDYADNQELQAVLANAGVEALAADTVDQAKAALDKAKAAVAGVQLDEARREAYRTINALSDQHKSDQKVQLALVAAAAKVADAASVDQVNAAINDAHTAIADITGAALLEAKEAAINELKQYGISDYYVTLINKAK
实施例6.表达融合蛋白IE5的克隆的构建
使用引物对IdE G1和IENco来PCR扩增ideE基因的基因片段。扩增和纯化后用B amHI和NcoI消化片段。另外使用引物对85Nco和eq 5C2来PCR扩增eq 5的基因片段。扩增和纯化后用NcoI和XhoI消化片段。将两个片段连接到BamHI和XhoI切割的载体pGEX-6P-1。
SEQ ID NO:29.插入pGEX-6P-1载体的ideE-eq5融合体的核苷酸序列。BamHI和XhoI位点以粗体表示和载体序列带下划线。
CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTC GACGATTACCAAAGGAATGCTACGGAAGCTTATGCCAAAGAAGTACCACATCAGATCACTTCTGTATGGACCAAAGGTGTTACACCACTAACACCCGAGCAGTTTCGATATAATAACGAAGATGTGATCCATGCGCCATATCTTGCTCATCAAGGCTGGTACGATATCACCAAGGCCTTCGATGGGAAGGATAATCTCTTGTGTGGCGCAGCAACGGCAGGTAATATGCTGCATTGGTGGTTTGATCAAAATAAAACAGAGATTGAAGCCTATTTAAGTAAACACCCTGAAAAGCAAAAAATCATTTTTAACAACCAAGAGCTATTTGATTTGAAAGCTGCTATCGATACCAAGGACAGTCAAACCAATAGTCAGCTTTTTAATTATTTTAGAGATAAAGCCTTTCCAAATCTATCAGCACGTCAACTCGGGGTTATGCCTGATCTTGTTCTAGACATGTTTATCAATGGTTACTACTTAAATGTGTTTAAAACACAGTCTACTGATGTCAATCGACCTTATCAGGACAAGGACAAACGAGGTGGTATTTTCGATGCTGTTTTCACCAGAGGAGATCAGACAACGCTCTTGACAGCTCGTCATGATTTAAAAAATAAAGGACTAAATGACATCAGCACCATTATCAAGCAAGAACTGACTGAAGGAAGAGCCCTTGCTTTATCACATACCTACGCCAATGTTAGCATTAGCCATGTGATTAACTTGTGGGGAGCTGATTTTAATGCTGAAGGAAACCTTGAGGCCATCTATGTCACAGACTCAGATGCTAATGCGTCTATTGGTATGAAAAAATATTTTGTCGGCATTAATGCTCATAGACATGTCGCCATTTCTGCCAAGAAAATAGAAGGAGAAAACATTGGCGCTCAAGTATTAGGCTTATTTACGCTTTCCAGTGGCAAGGACATATGGCAGAAACTGAGCCCATGGGAAACGACTACTGCTAGTGCATTTGAAAATAATGGGACAGGTCAACATCTGAACTGGCACATAGATATTCCACAAGAATATACAGTTGAATTAGGAGAACCAATTACTATCTCAGATCTTATGAGTCAAATTACGGTTACTCGTAAAGGTAGTAATGGGACTGTTAATGATGGAGATACTTTTGACTTTATTTCGAATGGAGATGGTTCAAGAGGAATTGATACCCCTGGAGTAAAAATATGGTTTGACTTTTACAATGCTGCGGGTACTTCCTTTTTAACTGATGAAATGTTAGCTTCGCCTACATATGCTGTACCGGGGGGATCTTATACTATTAAAGCTTGGGTATTCTATGGGAAAAATGATACCAAAAAGCTCTTCACATTTAAACTAAAAAATTCCAACAGCAATAAAACTGAGTTAAGGAAGTCGTTAGAGGAGGCTAAGCTAAAACTCAGCCAGCCTGAAGGAACGTATTCTGATGAATCACTGCAAGCCTTGCAATCAGCGGTTACTATTGGTAAGACCTATTTAAACAGTGACCCTGATCAAAATACAGTAGATCAATCTGTTACTACTATTGATTCCGCTATTACTAGTCTTGTTAATCTTAATGCTTTAAATGAAGCTATTAATCAAGCTACACCTTTTATAACAGATGGCAAAGAGTATCCTAAAGAAGCGTATGACGGTCTTGTGCAAAAGCTTGCAGCGGCAGCTAAGCTTCAAAATTCATTTGGTCCTTCACAAGGAGATGTTGATAAGGCTGCGACTGATTTAACGCAAGCTCTTACGACGCTTAAGACTGCTGTAGCGCATGAAGCCTTAGATCAAGCCTTGGCTAAGCTGTTAGAGCTTTACCGAGAAAATCCAAATCTTGCTTTGACATCAGAGTCTTTGAAGGAATTGTACAATAAGGCCATTGAAGCAGCAGGTACCTTCTATAGAACTGTTAACAAGGATAAAGAGAGAAAAGACATTTCCCTTTATGAGCTAGAGCGCTACACTACAGAAACAAATTCAGTTGTTGATACTATTTTAAAGGTAAAGGCTGCGATTGCCGAAGAAGGAAAGGCAAAATTGCGTTCTGCTTTAGACCAATTAAATGCTCTTATCGGAGAAAATCTAGACCTATCTCCATATACAGCAGCTTCTGCTCAAGCCTATACAGACCAGCTAGCTAAGGCTAAGGAGGTCGCAGCAGCGGGTGAGACAGCTTATGCTCAGGAGACAGAACCGACAGCTATTACTAACAGCTTGGTTAAGGTGTTAAATGCTAAGAAATCCCTCTCAGATGCCAAGGCAGCCTTGGTTGCTAAATAA CGGCCGCAT
SEQ ID NO:30.IE5融合蛋白。带下划线的氨基酸表示源自载体的序列。*表示剪切蛋白酶切割位点。注意粗体氨基酸源自融合蛋白的构建作业,并且如果使用另外的融合策略,则这些氨基酸可以变更甚至缺失。
注意在该位置的粗体且斜体的氨基酸Ile(I)与在http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_equi/中公布的序列相比是不同的;
LEVLFQ*GPLGSDDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHRHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLSETTTASAFENNGTGQHLNWHIDIPQEYTVELGEPITISDLMSQITVTRKGSNGTVNDGDTFDFISNGDGSRGIDTPGVKIWFDFYNAAGTSFLTDEMLASPTYAVPGGSYTIKAWVFYGKNDTKKLFTFKLKNSNSNKTELRKSLEEAKLKLSQPEGTYSDESLQALQSAVTGKTYLNSDPDQNTVDQSVTTIDSAITSLVNLNALNEAINQATPFITDGKEYPKEAYDGLVQKLAAAAKLQNSFGPSQGDVDKAATDLTQALTTLKTAVAHEALDQALAKLLELYRENPNLALTSESLKELYNKAIEAASTFYRTVNKDKERKDISLYELERYTTETNSVVDTILKVKAAIAEEGKAKLRSALDQLNALIGENLDLSPYTAASAQAYTDQLAKAKEVAAAGETAYAQETEPTAITNSLVKVLNAKKSLSDAKAALVAK
实施例7.表达EndoSe的克隆的构建
使用引物对eq61p1和eq61p6来PCR扩增endoSe基因的基因片段。扩增和纯化后用BamHI和XhoI消化片段并连接到BamHI和XhoI切割的载体pGEX-6p-1。
SEQ ID NO:31插入pGEX-6P-1载体的endoSe基因的核苷酸序列。BamHI和XhoI位点以粗体表示和载体序列带下划线。
CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTG GAGGATAAGGTTGTGCAAACTAGTCCATCAGTCTCTGCTATTGATGACCTACATTACCTGTCGGAAAACAGTAAAAAAGAATTTAAGGAGGGGTTATCAAAGGCAGGAGAAGTACCTGAAAAGCTAAAGGATATTTTATCCAAGGCACAGCAGGCAGATAAGCAGGCAAAGGTTCTTGCAGAAATGAAGGTTCCTGAAAAAATAGCCATGAAGCCTTTAAAGGGGCCTCTTTATGGTGGCTATTTTAGGACTTGGCATGATAAAACATCAGATCCGGCTGAAAAGGATAAGGTTAATTCTATGGGAGAATTGCCTAAGGAGGTTGACTTAGCCTTTGTTTTCCATGATTGGACCAAGGATTATAGCTTTTTCTGGCAAGAATTGGCGACCAAGCATGTGCCAACGCTGAACAAGCAGGGAACACGTGTGATTCGTACCATTCCATGGCGGTTCCTTGCAGGCGGTGATCATAGTGGTATTGCTGAAGATACGCAAAAATACCCAAATACTCCAGAGGGAAATAAGGCCTTGGCAAAGGCTATTGTAGATGAATACGTTTATAAATATAATCTTGATGGTTTAGATGTTGATATTGAGCGGGATAGCATTCCAAAAGTAAATGGAAAAGAGAGTAACGAAAATATTCAGCGCTCTATTGCTGTTTTTGAAGAAATTGGCAAGCTTATTGGGCCAAAGGGCGCTGACAAGTCACGTTTGTTCATTATGGATAGCACCTACATGGCTGACAAGAACCCATTGATTGAGCGCGGTGCCCAATATATTGATTTGCTGCTTGTGCAGGTTTATGGCACTCAAGGTGAGAAGGGAGATTGGGATCCAGTCGCTAGAAAACCTGAAAAGACAATGGAGGAACGTTGGGAATCGTATAGCAAATACATTCGTCCTGAGCAGTACATGGTTGGTTTTTCTTTCTATGAGGAATATGCGGGCAGTGGTAACCTCTGGTATGATATTAATGAGAGGAAAGATGATCATAATCCGTTAAATTCAGAGATAGCTGGTACTCGTGCTGAGCGTTATGCAAAATGGCAGCCTAAGACAGGTGGTGTCAAGGGAGGGATTTTCTCTTATGCGATTGATCGCGATGGTGTAGCGCATCAACCTAAAAAAGTCTCAGATGATGAGAAAAGAACTAACAAGGCTATAAAGGATATAACAGATGGTATTGTCAAATCAGATTATAAGGTTTCTAAGGCCTTGAAGAAGGTTATGGAAAATGACAAATCCTATGAGCTGATTGATCAGAAAGATTTTCCAGACAAGGCTTTGCGAGAAGCAGTTATTGCACAGGTTGGAAGCAGAAGAGGGGATTTAGAGCGGTTCAATGGAACCCTGCGCTTAGACAATCCGGATATCAAGAGTTTAGAAGGCCTGAATAAGCTTAAAAAACTAGCTAAGCTAGAGCTAATCGGTCTATCACAAATCACAAAGCTGGATAGCTTAGTCCTACCTGCAAATGCTAAGCCGACCAAGGATACGCTGGCCAATGTTCTTGAAGCCTACGACAGCGCTAAGAAGGAAGAGACTAAGGCGATTCCACAGGTGGCTCTGACCATTTCTGGTCTAACTGGCTTGAAGGAATTAAATCTTGCTGGCTTTGATCGTGATAGCTTGGCTGGAATTGACGCAGCTAGCCTAACCTCTCTTGAAAAGGTGGATCTCTCTAGTAATAAGCTGGACTTAGCAGCTGGTACGGAAAATCGTCAGATTCTTGATACCATGCTGGCAACAGTGACTAAGCATGGCGGTGTTAGCGAAAAGACGTTTGTATTTGATCATCAAAAGCCTACTGGTCTTTATCCTGATACTTATGGCACTAAGAGCCTTCAGTTACCAGTAGCAAATGATACAATTGATTTGCAGGCTAAGCTTTTATTTGGAACAGTTACCAATCAGGGCACGCTAATCAATAGCGAAGCTGACTATAAGGCTTATCAGGAGCAGGAAATAGCAGGTCACCGTTTTGTTGATTCAAGCTATGATTACAAAGCCTTTGCAGTGACCTACAAGGACTATAAGATCAAGGTGACTGACTCAACCTTAGGTGTCACTGATCACAAGGACTTATCCACTAGCAAGGAGGAGACCTACAAGGTTGAATTCTTTAGCCCTACTAATAGCACTAAGCCTGTGCATGAGGCTAAGGTTGTCGTTGGTGCGGAAAAAACCATGATGGTTAACCTAGCAGAGGGAGCAACTGTGATTGGTGGTGATGCAGATCCAACAAATGCAAAAAAAGTGTTTGATGGTTTGCTCAATAATGATACAACAATTCTGTCAACTAGCAATAAAGCTTCTATCATTTTTGAACTTAAAGAGCCTGGCTTAGTCAAGTATTGGCGTTTCTTTAATGACAGCAAAATTAGTAAAGCTGACTGTATTAAGGAGGCCAAGCTTGAAGCCTTTGTTGGCCATCTTGAAGCTGGCTCAAAGGTAAAGGATAGCTTGGAAAAATCATCAAAATGGGTAACAGTTTCAGATTATTCAGGAGAGGACCAAGAGTTTAGCCAGCCGTTAAACAACATTGGTGCCAAATATTGGAGAATAACAGTTGATACTAAGGGAGGACGTTACAATTGGCCATCACTTCCTGAGCTTCAAATCATTGGTTATCAATTACCGGCTGCGGATCTTGTGATGGCAATGCTAGCTACTGCAGAGGAGCTATCTCAGCAAAAAGACAAGTTCTCTCAAGAGCAGCTTAAGGAGCTCGAAGTCAAAATAGCTGCCTTAAAGGCTGCTTTAGATAGTAAGATGTTTAATGCCGATGCTATTAACGCTAGTACTGCTGATCTGAAGGCTTATGTTGATAAGCTTTTAGCTGATAGAACTGATCAGGAAAAAGTAGCTAAAGCAGCTAAAGTTGAGCAGCCTGTGGCTACTGACATAAAAGAAAATACTGAGCCAGAAAATCCAAAGACAGACTAGCTTATCC CGGCC GCAT
SEQ ID NO:32.Endo Se蛋白。带下划线的氨基酸表示源自载体的序列。*表示剪切蛋白酶切割位点。注意粗体且斜体的氨基酸Y与在http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_equi/中公布的序列相比在该位置是不同的;
LEVLFQ*GPLGSEDKVVQTSPSVSAIDDLHYLSENSKKEFKEGLSKAGEVPEKLKDILSKAQQADKQAKVLAEMKVPEKIAMKPLKGPLYGGYFRTWHDKTSDPAEKDKVNSMGELPKEVDLAFVFHDWTKDYSFFWQELATKHVPTLNKQGTRVIRTIPWRFLAGGDHSGIAEDTQKYPNTPEGNKALAKAIVDEYVYKYNLDGLDVDIERDSIPKVNGKESNENIQRSIAVFEEIGKLIGPKGADKSRLFIMDSTYMADKNPLIERGAQYIDLLLVQVYGTQGEKGDWDPVARKPEKTMEERWESYSKYIRPEQYMVGFSFYEEAGSGNLWYDINERKDDHNPLNSEIAGTRAERYAKWQPKTGGVKGGIFSYAIDRDGVAHQPKKVSDDEKRTNKAIKDITDGIVKSDYKVSKALKKVMENDKSYELIDQKDFPDKALREAVIAQVGSRRGDLERFNGTLRLDNPDIKSLEGLNKLKKLAKLELIGLSQITKLDSLVLPANAKPTKDTLANVLEAYDSAKKEETKAIPQVALTISGLTGLKELNLAGFDRDSLAGIDAASLTSLEKVDLSSNKLDLAAGTENRQILDTMLATVTKHGGVSEKTFVFDHQKPTGLYPDTYGTKSLQLPVANDTIDLQAKLLFGTVTNQGTLINSEADYKAYQEQEIAGHRFVDSSYDYKAFAVTYKDYKIKVTDSTLGVTDHKDLSTSKEETYKVEFFSPTNSTKPVHEAKVVVGAEKTMMVNLAEGATVIGGDADPTNAKKVFDGLLNNDTTILSTSNKASIIFELKEPGLVKYWRFFNDSKISKADCIKEAKLEAFVGHLEAGSKVKDSLEKSSKWVTVSDYSGEDQEFSQPLNNIGAKYWRITVDTKGGRYNWPSLPELQIIGYQLPAADLVMAMLATAEELSQQKDKFSQEQLKELEVKIAALKAALDSKMFNADAINASTADLKAYVDKLLADRTDQEKVAKAAKVEQPVATDIKENTEPENPKTD
实施例8.表达融合蛋白CPCE的克隆的构建
该基因融合构建体由五个不同的马链球菌马亚种基因片段(cne、eq54、eq36、eq42和eag)组成。使用引物对54Sac和54XbaI来PCR扩增eq54的基因片段。扩增和纯化后用SacI和XbaI消化片段。通过使用引物对eqc11和ScSac以来自构建体CCE的DNA作为模板的PCR获得eq36-eq42片段。扩增和纯化后用SacI和XbaI消化片段。将两个切割的DNA片段连接到事先用SacI切割的构建体CNEEAG,产生具有以下顺序cne-eq54-eq36-eq42-eag的基因片段的克隆。
SEQ ID NO:33.示出插入pGEX-6P-1载体的cne-eq54-eq36-eq42-eag的基因融合片段的核苷酸序列。BamHI和XhoI位点以粗体表示和载体序列带下划线。
CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTG ACTAATCTTAGTGACAACATCACATCATTGACGGTTGCTTCTTCATCACTCCGAGATGGAGAGAGAACGACGGTAAAGGTTGCGTTTGATGACAAAAAACAGAAAATCAAGGCAGGGGATACGATAGAGGTCACCTGGCCTACAAGTGGTAATGTCTACATTCAGGGCTTTAATAAAACCATACCGCTTAATATTAGAGGGGTAGATGTTGGTACCTTGGAGGTCACGCTAGACAAGGCTGTTTTCACATTCAATCAAAATATTGAAACAATGCATGATGTCTCTGGTTGGGGAGAGTTTGATATTACTGTTAGAAATGTGACACAAACCACCGCTGAAACATCAGGAACGACCACAGTAAAGGTAGGCAATCGCACTGCTACTATCACTGTTACTAAGCCTGAGGCAGGCACTGGTACCAGCTCATTTTATTATAAGACTGGTGATATGCAGCCCAATGATACTGAGCGTGTGAGATGGTTCCTGCTGATTAACAACAACAAGGAATGGGTGGCCAATACTGTTACAGTCGAAGACGATATTCAAGGTGGTCAAACCTTGGATATGAGCAGCTTTGACATCACCGTATCTGGTTATCGTAACGAGCGCTTCGTTGGGGAAAACGCTCTGACAGAGTTTCATACAACATTTCCAAATTCTGTCATTACGGCAACAGATAATCACATTAGTGTGCGGTTAGATCAATATGATGCCTCACAAAACACTGTCAACATTGCTTATAAGACAAAGATAACGGACTTTGACCAAAAAGAATTTGCCAACAACAGTAAAATCTGGTACCAGATTTTATACAAGGATCAGGTATCGGGTCAAGAGTCAAACCACCAAGTAGCCAATATCAATGCTAACGGCGGGGTTGATGGCAGTCGCTATACCAGCTTTACTGTCAAGGAGCTCGATACAGCAAGCTATACCATCACTGTTGAGGGAGCTACAGCAGGTCACACCTATGAGGCTTATCAGATTTTCAAGGGTGACTTGTTTGACAGTACCCTATCAAACATCACATGGGGAGGTGGTGTTACACCTTTTGAATTTGATGGTTCAAAAGACGCTGCTAAGATTGCAGAGGGATTGAAGGAAGCAAATGCAGCTGCCTTTGCCAAGGAAGCAGGTAAGCACTTGACAGCAACCATTGCAGGAACAGGAACACATGCAATCACCGTTAACGAGGCTGGCTACTACCTCATCAAGGACAAAAATGATTCTCAAACAGGCAAGCATGACGCCTACACCTCATTTGTCCTGAAGGTTGTTAAAAACACCAGCTTCAAACCAAAATCTGCTATCCCAACAGTCCTTAAAAAGGTCAAGGACCGTAATGACAAGACAGGTCTTGAGACAGGCTGGCAAGATTCAGCTGACTATGACAAAAATGACAAGGTGCCATTCCAGCTAACCGCAACCCTACCGTCAAATTACGATGCCTTTCAAGAATACTACCTTGAATTTGTAGATACCTTATCAAAAGGGCTAAGCTACAACAAAGACGCCAAGGTCTATGTGGTTAATGGAGATACTCGTCAAGATATTACTAATTCATTTACAGTTAGTGAAGATGGTTCATCTTTTAAAATCAATAACCTAAAGGCTGTTCAGGGAGTAACAATAACAGCTACCAGTAAGATCGTTGTCGAATACACTGCTACCCTCAATGACCAAGCGGCCATCGGCAAAAAAGGAAATCCAAACGAAGTTGCTTTGAAATACTCAAACGATCCAAACGCTCTTGGAAAAGGAGAGGAGTCTCCAAAAGGGGAGACACCAAAAGACAAGGTTATCGTTTTCACCTATAAAACTTCTAGATTATCTGGTCCGCCAGGATACCCACTTACTCGTGATTTCTCCCGTAACTTCCTAGAAGAAAATACTGCAAAATATTTAGATCAATTAAGAGAACATCTACAGCACAGATTTAGTGAACTTGAGAGCTTAACAAGAAAATTAGAGAAAGAAGGCGGTACCCGAGGTCCACTGCAGGACCAGCCAGCAGCACTAAAATATCCAGAACCTAGAGACTATTTTCTTCATACTCGTGAAGGTGATGTTATTTATGATGAGGATATAAAAAGATATTTTGAGGATTTAGAAGCCTATTTAACAGCTAGACTTGGTGGGATTGATAAAAAAGTAGAAGAAGCTGCCCAAAAGCCAGAGCTCTTAGACGCAGCAACAGTGTTAGAGCCTACAACAGCCTTCATTAGAGAAGCTGTTAGGGAAATCAATCAGCTGAGTGATGACTACGCTGACAATCAAGAGCTTCAGGCTGTTCTTGCTAATGCTGGAGTTGAGGCACTTGCTGCAGATACTGTTGATCAGGCTAAAGCAGCTCTTGACAAAGCAAAGGCAGCTGTTGCTGGTGTTCAGCTTGATGAAGCAAGACGTGAGGCTTACAGAACAATCAATGCCTTAAGTGATCAGCACAAAAGCGATCAAAAGGTTCAGCTAGCTCTAGTTGCTGCAGCAGCTAAGGTGGCAGATGCTGCTTCAGTTGATCAAGTGAATGCAGCCATTAATGATGCTCATACAGCTATTGCGGACATTACAGGAGCAGCCTTGTTGGAGGCTAAAGAAGCTGCTATCAATGAACTAAAGCAGTATGGCATTAGTGATTACTATGTGACCTTAATCAACAAAGCCAAATAA CGGCCGCAT
SEQ ID NO:34.CPCE融合蛋白。带下划线的氨基酸表示源自载体的序列。*表示剪切蛋白酶切割位点。注意粗体氨基酸源自融合蛋白的构建作业,并且如果使用另外的融合策略,则这些氨基酸可以变更甚至缺失。
LEVLFQ*GPLGSTNLSDNITSLTVASSSLRDGERTTVKVAFDDKKQKIKAGDTIEVTWPTSGNVYIQGFNKTIPLNIRGVDVGTLEVTLDKAVFTFNQNIETMHDVSGWGEFDITVRNVTQTTAETSGTTTVKVGNRTATITVTKPEAGTGTSSFYYKTGDMQPNDTERVRWFLLINNNKEWVANTVTVEDDIQGGQTLDMSSFDITVSGYRNERFVGENALTEFHTTFPNSVITATDNHISVRLDQYDASQNTVNIAYKTKITDFDQKEFANNSKIWYQILYKDQVSGQESNHQVANINANGGVDGSRYTSFTVKDTASYTITVEGATAGHTYEAYQIFKGDLFDSTLSNITWGGGVTPFEFDGSKDAAKIAEGLKEANAAAFAKEAGKHLTATIAGTGTHAITVNEAGYYLIKDKNDSQTGKHDAYTSFVLKVVKNTSFKPKSAIPTVLKKVKDRNDKTGLETGWQDSADYDKNDKVPFQLTATLPSNYDAFQEYYLEFVDTLSKGLSYNKDAKVYVVNGDTRQDITNSFTVSEDGSSFKINNLKAVQGVTITATSKIVVEYTATLNDQAAIGKKGNPNEVALKYSNDPNALGKGEESPKGETPKDKVIVFTYKTLSGPPGYPLTRDFSRNFLEENTAKYLDQLREHLQHRFSELESLTRKLEKEGGTRGPDQPAALKYPEPRDYFLHTREGDVIYDEDIKRYFEDLEAYLTARLGGIDKKVEEAAQKPLDAATVLEPTTAFIREAVREINQLSDDYADNQELQAVLANAGVEALAADTVDQAKAALDKAKAAVAGVQLDEARREAYRTINALSDQHKSDQKVQLALVAAAAKVADAASVDQVNAAINDAHTAIADITGAALLEAKEAAINELKQYGISDYYVTLINKAK
实施例9.重组蛋白的纯化
使用的pGEX-6P-1载体是称为GST-谷胱甘肽亲和系统(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)的大肠杆菌表达和纯化系统的一部分。简而言之,按照制造商的说明书,使编码重组蛋白的克隆在37℃生长于补充有氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的LuriaBertani肉汤培养基。在光学浓度(OD600)为~0.6时,用IPTG(终浓度0.2mM)补充生长培养基,并将生长温度变为15℃。温育过夜后收获大肠杆菌细胞并重悬于补充有终浓度0.1%(v/v)的吐温(Tween)20的PBS磷酸盐缓冲盐水[137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,1.4mM KH2PO4(pH 7.4)](PB ST),并在通过冻融裂解细胞时添加溶菌酶(终浓度50μg/ml)。离心后,无菌过滤上清液,并用Glutathione-SepharoseTM珠分批纯化。用PBST彻底洗涤后使用剪切蛋白酶处理融合蛋白,从而释放重组蛋白。包含抗原的洗出样品用PBS透析并浓缩。最终,使用分光光度计测定所得抗原的量,并通过SDS-PAGE(还原条件下进行)在考马斯亮蓝染色凝胶时分析质量。最终将蛋白存储于-20℃。应注意在该系统中产生的各蛋白(SEQ ID NOS:22、24、26、28、30、32和34)包含源自载体的五个另外的N端氨基酸,Gly-Pro-Leu-Gly-Ser。由于终止密码子被添加到引物序列,所以各蛋白的C末端如上所述。
使用的另外的大肠杆菌表达和纯化系统为来自NewEngland Biolabs的IMPACT系统。之前已描述了使用该系统来生产马链球菌马亚种重组蛋白(例如,参考文献14)。应注意在该系统中生产的各蛋白(SEQ ID NOS:38和42)包含源自载体的五个另外的氨基酸,一个在N端部的Met和四个在C端的Leu-Glu-Pro-Gly。
实施例10.马免疫用Strangvacc疫苗的配制
在实施例中描述的重组蛋白在纯化后(实施例9)混合于以下结合体中。
Strangvacc 1
该七个重组蛋白的结合体(早期称为Septavacc)由蛋白(或其片段)EAG、CNE、SclC、IdeE、IdeE2、SEQ0256(Eq5)、SEQ0402(Eq8)组成,之前描述于WO 2009/075646(A1)和参考文献13和14中。
Strangvacc 2
该结合体由四个重组蛋白IdeE2、IdeE、Eq85和CCE组成,其中两个(Eq85和CCE)为融合蛋白。
Strangvacc 3/4
该结合体由三个重组蛋白IdeE、Eq85和CCE组成,其中两个(Eq85和CCE)为融合蛋白。
Strangvacc 5
该结合体由三个重组蛋白CNEEAG、IE5和EndoSe组成,其中两个(CNEEAG和IE5)为融合蛋白。
Strangvacc 7
该结合体由两个重组融合蛋白CPCE和IE5组成。
Strangvacc 8
该结合体由三个重组蛋白CPCE、IE5和EndoSe组成,其中两个(CPCE和IE5)为融合蛋白。
简而言之,各Strangvacc疫苗(1-8)的配制如下:
对于皮下免疫,每剂量包含与375μg/剂量佐剂Matrix C混合的75μg各蛋白(除了Strangvacc1之外,Strangvacc1每剂量包含50μg各蛋白)。剂量体积为2ml,其为在接近于咽后淋巴结各侧皮下注射1ml+1ml。
对于鼻内免疫,每剂量包含与500μg/剂量佐剂Matrix Q混合的225μg各蛋白(除了Strangvacc1之外,Strangvacc1每剂量包含150μg各蛋白)。剂量体积为4ml,其为在各鼻孔中鼻内注射2ml+2ml。
对于肌内免疫,每剂量包含与375μg/剂量佐剂Matrix C混合的300μg各蛋白。剂量体积为2ml,其为在一个位置的肌内注射。
使用PBS调节各Strangvacc制品中的体积。在安慰剂样品中忽略重组蛋白。Matrix C和Q获自Isconova AB,Uppsala,Sweden。
将马接种三次。第一和第二次接种的间隔时间为七周。第二和第三次接种的间隔时间为两周,并且在最后接种后两周激发马。
实施例11.马中的免疫和激发研究
研究I.该接种和激发研究是在动物保健信托机构(AnimalHealth Trust,Lanwades Park,Kentford,Newmarket,Suffolk,CB87UU,UK,由Intervacc AB,Sweden赞助)(研究认证B009/001)下进行的。研究II(研究认证B009/002)也是在相同的场所进行的。这些研究的目标是测定在用野生型马链球菌马亚种菌株4047鼻内激发威尔士山地矮种马(Welsh Mountain ponies)后,Intervacc的新多成分亚单位疫苗的变体赋予给接种的保护水平。
简而言之,马免疫、实验感染和临床评价的所有操作描述于PLoS Path,Guss等人(2009)(参考文献14)和WO 2009/075646A1。然而,研究II还扩展到包括马的分离组(separate group)(组6),该组仅肌内接种(三次接种)。简而言之,在接种和激发研究中,监视若干参数例如临床症状、直肠温度、注射部位观察和淋巴结的肿胀等。还监视马链球菌马亚种和马链球菌兽疫亚种细菌的数量。另外,还取血样并用于测定例如嗜中性粒细胞和血纤蛋白原水平以及抵抗各疫苗中存在的抗原的抗体应答。在接种/激发研究完成后,使马安乐死并进行死后(PM)实验。
表3:接种组。IN指鼻内免疫。SC指皮下免疫。Matrix为IsconovaAB,Uppsala,Sweden的佐剂。
研究I
研究II
PM=来自死后检查时得到的病理学得分的平均值。
实施例12.
在研究I中用Strangvacc2(n=6)、Strangvacc3/4(n=6)和安慰剂(n=6)接种威尔士山地矮种马。在研究II中,用Strangvacc3/4(n=5)、Strangvacc5(n=6)、Strangvacc7(n=6)、Strangvacc8(n=6)和安慰剂(n=5)接种矮种马。将给予安慰剂的矮种马用作对照并仅给予佐剂。在鼻内和皮下两方面分三次(occasion)进行免疫。使所有矮种马实验感染马链球菌马亚种从而引起腺疫。对矮种马每日进行临床检查,并监视直肠温度。发热为腺疫的典型征兆并且非常良好地与炎症参数,例如血液中血纤蛋白原水平和嗜中性粒细胞计数的升高相关联。马的免疫、实验感染和临床评价的所有操作描述于PLoS Path,Guss等人(2009)。
图1(图1A-C)包括8个组,如各组上部所示分别示出各接种组的矮种马个体的温度。由图表明显可知,不同的制品产生不同的保护水平。作为实例,用Strangvacc3/4的接种在11匹矮种马中仅导致1匹(结合研究I和II)具有病理性发热(定义为超过39℃的温度)。另一方面,Strangvacc8虽然具有保护性,但仍导致6匹矮种马中的3-4匹矮种马发热。
实施例13
在实验的终点对上述实施例12所述接种的矮种马进行死后分析。终点定义为发热3天、明显的遭受感染的临床征兆或在研究的最后(研究I中第21天或研究II中第25天)。如PLoS Path,Guss等人(2009)(参考文献14)所述将得分系统用于各种死后观察。相加分数示于图2中,其中各点表示矮种马个体。用Strangvacc3/4接种的11匹矮种马中,仅3匹显示病理性高分数。最高分数(46)的矮种马与发热矮种马为同一个体。基于死后得分,Strangvacc8使两匹矮种马充分地受到保护以及1匹中等程度地受到保护。将各组与组合的安慰剂组(n=11)相比,使用曼-惠特尼(Mann-Whitney)统计分析得到以下p值:Strangvacc2,0.0019;Strangvacc3/4,0.00027;Strangvacc5,0.0048;Strangvacc7,0.00064;Strangvacc 8,0.078。发现在参数例如发热时间和死后得分之间良好地相关;在具有高死后分数的矮种马中发现短暂的发热。如图明显所示,疫苗中融合蛋白的不同结合体导致不同的保护水平。
实施例14
如PLoS Path,Guss等人(2009)(参考文献14)中所述的那样测定接种的矮种马中的抗体应答。简而言之,使用常规ELISA试验,其中将血清样品以两倍连续(series)稀释。测定各样品为给出1.0的吸光度值所需稀释的log值。分析来自在之前研究中使用疫苗Septavacc(也称为Strangvacc1)免疫的矮种马的血清。Strangvacc1包含作为单个蛋白的七个重组蛋白。还分析来自用各种融合蛋白接种的矮种马的血清。
用任意Strangvacc疫苗接种的所有矮种马均产生免疫应答。抗原为单个抗原的Strangvacc1和具有融合蛋白的其它Strangvacc疫苗两者都是这种情况。
没有由于不利的折叠或暴露到免疫系统而引起使融合蛋白变为非免疫原性的包裹蛋白(encompassed protein)的病例。
图3示出相反在一些病例中通过使用融合蛋白免疫原性得到显著增强。图3的上半部分示出用Strangvacc2和Strangvacc3/4接种的矮种马的抗体比用Strangvacc1接种的矮种马具有明显(p=0.04)更好的抗CNE抗体。在Strangvacc2和3/4中CNE包含于与EAG相同的融合体(fusion)中。在Strangvacc1中,CNE作为单个蛋白包含在内。类似地,图3的下半部分示出抗Eq5(=SEQ0256)的抗体在用融合蛋白接种的矮种马中显著地(p=0.0008)高于用作为单个蛋白的Eq5接种的矮种马。
实施例15.使用Strangvacc8的肌内接种
使用Strangvacc8的肌内接种(研究II中的组6)产生与研究II中的组4类似的保护水平。
实施例16表达将在抗马链球菌马亚种感染的小鼠的接种中用作重组抗原的Eq54和Eq27蛋白片段的克隆的构建
使用引物对Eq54F和Eq54R来PCR扩增eq54基因的基因片段。扩增和纯化后用NcoI和XhoI消化片段,并连接到NcoI和XhoI切割的获自New England Biolabs Inc.,USA(NEB)的载体pTYB4。表4用于克隆eq54基因片段的引物
SEQ ID NO:37.插入pTYB4载体的eq 54基因的核苷酸序列。
NcoI和XhoI位点以粗体表示和载体序列带下划线。ATACAGCAAGCTATACCATCACTGTTGAGGGAGCTACAGCAGGTCACACCTATGAGGCTTATCAGATTTTCAAGGGTGACTTGTTTGACAGTACCCTATCAAACATCACATGGGGAGGTGGTGTTACACCTTTTGAATTTGATGGTTCAAAAGACGCTGCTAAGATTGCAGAGGGATTGAAGGAAGCAAATGCAGCTGCCTTTGCCAAGGAAGCAGGTAAGCACTTGACAGCAACCATTGCAGGAACAGGAACACATGCAATCACCGTTAACGAGGCTGGCTACTACCTCATCAAGGACAAAAATGATTCTCAAACAGGCAAGCATGACGCCTACACCTCATTTGTCCTGAAGGTTGTTAAAAACACCAGCTTCAAACCAAAATCTGCTATCCCAACAGTCCTTAAAAAGGTCAAGGACCGTAATGACAAGACAGGTCTTGAGACAGGCTGGCAAGATTCAGCTGACTATGACAAAAATGACAAGGTGCCATTCCAGCTAACCGCAACCCTACCGTCAAATTACGATGCCTTTCAAGAATACTACCTTGAATTTGTAGATACCTTATCAAAAGGGCTAAGCTACAACAAAGACGCCAAGGTCTATGTGGTTAATGGAGATACTCGTCAAGATATTACTAATTCATTTACAGTTAGTGAAGATGGTTCATCTTTTAAAATCAATAACCTAAAGGCTGTTCAGGGAGTAACAATAACAGCTACCAGTAAGATCGTTGTCGAATACACTGCTACCCTCAATGACCAAGCGGCCATCGGCAAAAAAGGAAATCCAAACGAAGTTGCTTTGAAATACTCAAACGATCCAAACGCTCTTGGAAAAGGAGAGGAGTCTCCAAAAGGGGAGACACCAAAAGACAAGGTTATCGTTTTCACCTATAAAACTATCATCAATAAGGTTGATCAAGATCAAAAAGCCCTAAAAGGTGCAGGCTTTACCCTTTATAAGCTGGTCAAAGGTGATAATGGCGAGGAAAAATATCAAATAGTCCAAGAAATTAAAGCAGGGGATACAACTAGCTTTGAGTTTGTTGGACTTGACGCTGGTGATTACAAGCTCAGCGAAACAACAACACCTGGCGGTTACAACACTATTGCAGATGTCATGTTCAGCATTGTAGCGCAGCATGAAACCGAGTCAGACGATCCTCAGTTGACTAGCCTAACCGTTGACAAAGCAACTGGCTTCACTGCTGATACAGAAGCTGGTACCGTATCCGCAACTATTGTTAATAAAAGGTCTATC CCCGGGTGC
SEQ ID NO:38.使用IMPACTTM-系统(NEB)表达的Eq54蛋白。注意N端氨基酸Met和四个C端氨基酸Leu-Glu-Pro-Gly源自载体。 DTASYTITVEGATAGHTYEAYQIFKGDLFDSTLSNITWGGGVTPFEFDGSKDAAKIAEGLKEANAAAFAKEAGKHLTATIAGTGTHAITVNEAGYYLIKDKNDSQTGKHDAYTSFVLKVVKNTSFKPKSAIPTVLKKVKDRNDKTGLETGWQDSADYDKNDKVPFQLTATLPSNYDAFQEYYLEFVDTLSKGLSYNKDAKVYVVNGDTRQDITNSFTVSEDGSSFKINNLKAVQGVTITATSKIVVEYTATLNDQAAIGKKGNPNEVALKYSNDPNALGKGEESPKGETPKDKVIVFTYKTIINKVDQDQKALKGAGFTLYKLVKGDNGEEKYQIVQEIKAGDTTSFEFVGLDAGDYKLSETTTPGGYNTIADVMFSIVAQHETESDDPQLTSLTVDKATGFTADTEAGTVSATIVNKRSI
还将IMPACT-系统用于克隆和表达Eq27蛋白的片段。使用引物对Eqp271和Eqp272来PCR扩增eq27基因的基因片段。扩增和纯化后用NcoI和XhoI消化片段并连接到NcoI和XhoI切割的获自New England Biolabs Inc.,USA(NEB)的载体pTYB4。
表5.用于克隆eq27基因片段的引物(5'-3')
SEQ ID NO:39.Eqp271:gcagagagtctgacgagtgttga
SEQ ID NO:40.Eqp272:TCACCTCGAGTCCTAGCTCACCGTCATAAGC
SEQ ID NO:41.插入pTYB4载体的eq27基因的核苷酸序列。NcoI和XhoI位点以粗体表示和载体序列带下划线。AGAGTCTGACGAGTGTTGAGCCTGCTGATGGTGCGGTCATGGTCAAGTCAGAGGCTGCTGACCAAGGCTCAAATGAGCTACCAGAAGCTACTGACATTAGTGATATTGCTGGTATTTCTGATGTGACTAAGGTGTCAGCTGCTGTCAATGCTGATACTGTCAAGGAAGTTCAGCCAGTAGCTGTACCTCTTGTAGAGGATCAGGCGCATGAGGAAACTACAGACCAGTCTCAGCCTTCATCATCGATAGTGTCTGTTACGACAGACAGCTCTCTAGAGACACCAGAAGCTACAAGCTCAGAGGAGCCGATAGCGGAGCAGACCTTGCGGCTGCATTTCAAGACCCTGCCAGCTCAAGACCTATCCTCGCTTGGTCTTTGGGTGTGGGACGATGTTGAGACACCATCTGATCAGCTGGGAGGCTGGCCGACTGGGGCTACCAATTTTAGTCTAGCGAAGACAGATGACTATGGCTATTACATGGACGTTAAGCTTTCAGCCAATCAAGCCAATAAGGTTAGCTTTTTGATCAATAACACTAAGGGAGACAATCTGACGGGCGATCGAACCATAGACCTTCTCAGCCCTAAGATGAATGAGGTCTGGATTGATGGCCAGGAGCTGTCTTACTATCGGCCGCTGGCTCAGGGCTATATCCGTATCAATTATTATCGCAGTGATGGCCATTATGACAACAAATCGCTCTGGCTTTGGGGAAGTGCTGATGCGTCAATGACTAGTCAGCAGGGCGCTTGGCCAGATGGTATTGATTTTAAGCAGGTCGGTCGATATGGTGCTTATATAGATGTCAAGCTAGCTGATACCAATGAGCTAGGCTTTCTCTTGCTAGATGAGCGTCAGACAGGTGACGCTGTTAAAATTCAGCCCAATGATTATATTTTTAAAGATTTAAAGAATCACACCCAAATTTTCTTGAAAGACGAGGATCCAACCATTTATACGAACCCTTATTTTGTTAATACAGTTAGATTAATCGGTGCTCAGCAGGTCAGCCCAAGCAGTATTGAGGCGAGCTTTACGACTCTAGCAGATGTGGATAAGGAAAGCCTTTTAAAAGAATTAAAAATCAGCACTGACAGTAAGGAAGCAGTTGCTATTACTGATATCACCTTAGATGAAAAGACTCATAAGGCTGTCATCACAGGTGATTTTAGTCAAGCAGTGGCCACTTATACGGTGACCTTTCATCATGAGAGCTTCCAGGCTAGGCCAAATTGGCAATACAAGGATAGCCTGTATGCTTATGACGGTGAGCTAGGA CCCGGGTGC
SEQ ID NO:42.使用IMPACTTM-系统(NEB)表达的Eq27蛋白片段。注意N端氨基酸Met和四个C端氨基酸Leu-Glu-Pro-Gly源自载体。ESLTSVEPADGAVMVKSEAADQGSNELPEATDISDIAGISDVTKVSAAVNADTVKEVQPVAVPLVEDQAHEETTDQSQPSSSIVSVTTDSSLETPEATSSEEPIAEQTLRLHFKTLPAQDLSSLGLWVWDDVETPSDQLGGWPTGATNFSLAKTDDYGYYMDVKLSANQANKVSFLINNTKGDNLTGDRTIDLLSPKMNEVWIDGQELSYYRPLAQGYIRINYYRSDGHYDNKSLWLWGSADASMTSQQGAWPDGIDFKQVGRYGAYIDVKLADTNELGFLLLDERQTGDAVKIQPNDYIFKDLKNHTQIFLKDEDPTIYTNPYFVNTVRLIGAQQVSPSSIEASFTTLADVDKESLLKELKISTDSKEAVAITDITLDEKTHKAVITGDFSQAVATYTVTFHHESFQARPNWQYKDSLYAYDGELG
在用马链球菌激发之后用Eg54和Eq27鼻内接种
实施例17用Eq54和Eq27免疫小鼠
将重约23-25g的小鼠(NMRI)圈养于笼内,每个笼内各五只动物。用12μg各抗原和10μg Abisco 300(Isconova AB,Sweden)鼻内免疫小鼠。10只动物用Eq54免疫,10只动物用Eq27免疫以及10只仅给予Abisco 300佐剂作为阴性对照。在第0天、31天和45天给予免疫。
实施例18用马链球菌的实验性感染
在第52天(最后次免疫后7天)给予实验感染。使用来自腺疫临床病例的马链球菌马亚种菌株1866。首先通过将约106CFU接种到麻醉小鼠的鼻孔来使菌株进入(pass through)动物体内。7天后从小鼠的鼻内回收细菌,并于37℃、5%的CO2中生长于BG平板(包含5%绵羊血液,0.01%龙胆紫的琼脂平板)。在BG平板上使单个菌落37℃过夜生长,并重悬于含1%酵母提取物(THY)的Todd Hewitt肉汤(Oxoid,Basingstoke,Hampshire,UnitedKingdom)中。将细菌于-80℃保存在小管中并将新小管用于各实验。为感染小鼠,将细菌在37℃、5%的CO2中生长于BG平板过夜,之后接种到补充有1%酵母提取物(THY)的THB并无振荡地生长过夜。然后将培养物10倍稀释到THY和10%马血清(Sigma),并于37℃、5%的CO2中生长4小时。将培养物离心并重悬于THB中。将10μl中含1×106CFU的剂量用于所有小鼠的马链球菌马亚种感染。每天监视(follow)动物。通过以可重现的方式轻轻地将动物鼻子压到BG平板上,以从0至+++的四等级评分细菌的鼻部生长。然后将鼻部样品涂布到平板的整个表面上。一个+指5-100个菌落;两个+指超过100个和三个+指汇合生长(confluentgrowth)。每天测定重量并计算重量损失百分率。
实施例19用Eq54或Eq27接种的实验结果
用1)Eq54免疫小鼠的组、用2)Eq27免疫小鼠的组和3)其中用PBS替换抗原但仍包含佐剂的未免疫组的三个组(n=3×10)。
用马链球菌马亚种感染的小鼠的典型感染征兆是重量损失。因此测定随时间的重量损失百分率。图4B显示用Eq54或Eq27接种的动物避免了感染,这是通过与对照动物相比重量损失较缓和来反映的。杀死损失超过20重量%的动物。图4B中可以看出,未接种动物比接种动物的重量损失更大。与对照相比,在第2天至第4天,Eq54和Eq27的p<0.05。
用马链球菌马亚种持续感染的小鼠的另外征兆是细菌在上呼吸道气道中定殖。因此每天根据四个等级测定马链球菌马亚种的鼻部生长。图4C显示在2至3天后,未接种的对照动物被细菌严重地定殖。用Eq54或Eq27接种的小鼠与对照组相比在第2天和第3天具有显著(p<0.05)较少的定殖。
实施例20免疫小鼠中抗体水平的测定
如上所述免疫小鼠。最后接种之后5天收集血清样品。使用标准酶联免疫吸附分析(ELISA)来测定特异性定向抗Eq54和Eq27的IgG的水平。简而言之,在室温下用100μl具有9μg/ml任意蛋白的磷酸盐缓冲盐水(PBS)包覆微量滴定板过夜。添加100μl 2%的牛血清白蛋白(37℃,1小时)。用含0.05%吐温的PBS(PBST)洗涤平板。以连续稀释(开始以40倍稀释)添加血清样品(37℃,1小时),随后洗涤。通过添加在兔子中产生的与辣根过氧化物酶共轭的抗小鼠IgG抗体(Sigma Chemical Co,Mo,USA)来监测IgG对抗原的特异性结合;每孔100μl以1000倍稀释。PBST洗涤后,根据由制造商(Dako,Glostrup,Denmark)提供的说明书,通过添加OPD底物来测量共轭物的结合。在标准ELISA分光光度计中测定492nm处的着色。将所得吸光度值作为血清稀释的函数作图。对于各样品,测定为使吸光度值降至1.5所需的稀释的10log值。即,如果样品需要2000倍稀释来给出1.5的吸光度,则指定该样品的值为3.30。图4A示出在用这些抗原免疫的小鼠中抗Eq54和Eq27抗体的滴度。
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Claims (42)
1.一种抗原组合物,其包含源自马链球菌马亚种或兽疫亚种抗原的多个抗原成分,所述抗原成分包含:
(i)第一融合多肽,其包含命名为EAG的蛋白的至少一部分和命名为CNE的蛋白的至少一部分;
和(ii)至少一种另外的多肽,其选自:
(a)第二融合多肽,其包含命名为Eq5的蛋白的至少一部分和命名为Eq8的蛋白的至少一部分,
(b)第三融合多肽,其包含命名为IdeE的蛋白的至少一部分和命名为Eq5的蛋白的至少一部分,
(c)命名为EndoSe的蛋白或命名为EndoSz的蛋白的至少一部分,
(d)命名为IdeE的蛋白的至少一部分,
(e)命名为IdeE2的蛋白的至少一部分,
(f)命名为Eq27的蛋白的至少一部分,
(g)命名为Eq54的蛋白的至少一部分,
(h)命名为Scl的蛋白家族的蛋白的至少一部分,其中各所述蛋白的所述至少一部分包含至少一种抗原表位。
2.根据权利要求1所述的抗原组合物,其中所述第一融合多肽进一步包含命名为Scl的蛋白家族的至少一种蛋白的至少一部分。
3.根据权利要求1或2所述的抗原组合物,其中所述第一融合多肽进一步包含命名为Eq54的蛋白的至少一部分。
4.根据权利要求1至3任一项所述的抗原组合物,其中所述命名为EAG的蛋白的至少一部分包含所述蛋白的N端部分。
5.根据权利要求1至4任一项所述的抗原组合物,其中所述命名为CNE的蛋白的至少一部分包含所述蛋白的N端部分。
6.根据权利要求1至5任一项所述的抗原组合物,其中所述至少一种另外的多肽包含权利要求1中所述的第二融合多肽,和所述命名为IdeE的蛋白的至少一部分。
7.根据权利要求6所述的抗原组合物,其进一步包含所述命名为IdeE2的蛋白的至少一部分。
8.根据权利要求1至5任一项所述的抗原组合物,其中所述至少一种另外的多肽包含权利要求1中所述的第三融合多肽。
9.根据权利要求8所述的抗原组合物,其进一步包含所述命名为EndoSe或EndoSz的蛋白的至少一部分。
10.根据权利要求1至9任一项所述的抗原组合物,其中所述第一融合多肽包含SEQ ID NO:24中所示的,从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
11.根据权利要求1至9任一项所述的抗原组合物,其中所述第一融合多肽包含SEQ ID NO:28中所示的,从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
12.根据权利要求1至9任一项所述的抗原组合物,其中所述第一融合多肽包含SEQ ID NO:34中所示的,从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
13.根据权利要求1至12任一项所述的抗原组合物,其中所述第二融合多肽包含SEQ ID NO:22中所示的,从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
14.根据权利要求1至13任一项所述的抗原组合物,其中所述第三融合多肽包含SEQ ID NO:30中所示的,从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
15.根据权利要求6所述的抗原组合物,其包含(i)含有如SEQ ID NO:22所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的融合多肽,(ii)含有如SEQ ID NO:24所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的融合多肽,和(iii)含有如SEQ ID NO:26所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的多肽。
16.根据权利要求8所述的抗原组合物,其包含(i)含有如SEQ ID NO:28所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的融合多肽,(ii)含有如SEQ ID NO:30所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的融合多肽,和(iii)含有如SEQ ID NO:32所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的多肽。
17.根据权利要求8所述的抗原组合物,其包含(i)含有如SEQ ID NO:34所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的融合多肽,(ii)含有如SEQ ID NO:30所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的融合多肽,和(iii)含有如SEQ ID NO:32所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的多肽。
18.根据权利要求8所述的抗原组合物,其包含(i)含有如SEQ ID NO:34所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的融合多肽,和(ii)含有如SEQ ID NO:30所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的融合多肽。
19.一种抗原融合多肽,其包含SEQ ID NO:22中所示的,从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
20.一种抗原融合多肽,其包含SEQ ID NO:24中所示的,从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
21.一种抗原融合多肽,其包含SEQ ID NO:28中所示的,从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
22.一种抗原融合多肽,其包含SEQ ID NO:30中所示的,从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
23.一种抗原融合多肽,其包含SEQ ID NO:34中所示的,从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
24.一种抗原组合物,其包含权利要求19至23所述的至少一种融合多肽,或其类似物。
25.一种用于保护非人类哺乳动物抵抗马链球菌感染的疫苗组合物,其包含作为免疫成分的权利要求1至18和24任一项所述的抗原组合物,和药物学可接受载体。
26.根据权利要求25所述的疫苗组合物,其进一步包含佐剂。
27.一种用于保护非人类哺乳动物抵抗马链球菌感染的疫苗组合物,其包含至少一种重组载体和多核苷酸,所述多核苷酸插入所述至少一种重组载体中并编码权利要求1至18和24任一项所述的组合物的抗原成分,所述一种载体或多种载体能够在易受马链球菌感染的哺乳动物中活体内表达所述成分。
28.根据权利要求27所述的疫苗组合物,其中所述载体为质粒或病毒载体形式的表达载体。
29.根据权利要求25至28任一项所述的疫苗组合物,其以生理学可施用形式,优选可通过肌内、皮内、皮下或鼻内接种的施用形式来提供。
30.根据权利要求25至28任一项所述的疫苗组合物,其中所述疫苗能够保护易感哺乳动物抵抗马链球菌感染,尤其是保护马抵抗由马链球菌马亚种引起的腺疫。
31.根据权利要求30所述的疫苗组合物,其能够在对马链球菌易感的哺乳动物,尤其是马中刺激定向抵抗马链球菌抗原的血清、粘膜和/或支气管的抗体应答。
32.一种生产根据权利要求1至18和24任一项所述的抗原组合物的抗原的方法,所述方法包括
(a)提供编码所述抗原的DNA片段并将所述片段导入至少一种表达载体;
(b)将包含所述DNA片段的所述至少一种载体导入至少一种相容性宿主细胞;
(c)在表达由所述DNA片段编码的产物所需的条件下培养在步骤(b)中提供的所述至少一种宿主细胞;和
(d)从各培养的宿主细胞中分离表达产物,和任选地,
(e)纯化来自步骤(d)的分离产物,优选通过色谱法来纯化。
33.一种根据权利要求25至28任一项所述的疫苗组合物的制备方法,所述疫苗组合物包含权利要求1至18和24任一项所述的抗原组合物作为免疫成分,其中所述方法包括将抗原组合物与药物学可接受载体混合。
34.根据权利要求1至18和24任一项所述的抗原组合物在制备保护抵抗马链球菌感染,尤其是在马中抵抗由马链球菌马亚种感染引起的腺疫的疫苗中的用途。
35.根据权利要求1至18和24任一项所述的抗原组合物,其用于预防性或治疗性处理由马链球菌引起的感染。
36.一种生产抗血清的方法,所述方法包括将根据权利要求1至18和24任一项所述的抗原组合物施用到非人类哺乳动物宿主从而在所述宿主中产生抗体和回收包含所述宿主中所产生的所述抗体的抗血清。
37.一种在哺乳动物,尤其是马中预防性或治疗性处理马链球菌感染的方法,其包括向所述哺乳动物施用免疫有效量的权利要求25至28任一项所述的疫苗组合物,或根据权利要求36所述生产的抗血清。
38.一种保护马抵抗马链球菌感染的方法,其包括用权利要求25至28任一项所述的疫苗组合物来皮下、皮内、肌内或鼻内接种马,从而在所述马中诱导抵抗马链球菌的免疫应答。
39.根据权利要求38所述的方法,其中在所述马中诱导在血清和/或鼻咽粘液中的IgG和/或IgA和/或IgM抗体形式的免疫应答。
40.一种抗体制品,其包含对根据权利要求1至18和24任一项所述的抗原组合物的抗原特异的至少一种,和优选至少两种单克隆或多克隆抗体,或抗体片段。
41.根据权利要求40所述的抗体制品,当施用到易被马链球菌感染的哺乳动物时,其用于预防性或治疗性提供被动免疫。
42.一种被动免疫的方法,其包括向哺乳动物施用权利要求40或41所述的抗体制品。
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