CN104789587A - 重组真核表达质粒复合物在制备马腺疫链球菌疫苗的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组真核表达质粒复合物在制备马腺疫链球菌疫苗的应用，通过将马腺疫链球菌来源的S蛋白和E蛋白的重组真核质粒PVAX1-S和PVAX1-E以1：1的质量比组合而成重组真核表达质粒复合物，通过在免疫动物试验得知其具有良好的免疫原性，且该重组质粒复合物免疫后的抗体水平、细胞免疫水平和免疫保护效果优于单一抗原单独免疫。通过选择了本地区流行菌株的S蛋白和E蛋白的重组真核表达质粒复合物用于免疫，克服了单一抗原产生的免疫保护效果差的缺点，具有良好的开发应用前景。

Description

重组真核表达质粒复合物在制备马腺疫链球菌疫苗的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说，本发明涉及一种来源马腺疫链球菌的重组真核表达质粒的复合物在制备预防马腺疫链球菌病疫苗中的应用的技术领域。

背景技术

马腺疫(Stangles) 是由马腺疫链球菌引起马属动物的一种急性接触性传染病，主要是在马颈部和头部出现化脓性淋巴管炎。该病俗称喷喉或槽结、喉骨胀，是马腺疫链球菌引起的马属动物的一种急性、热性传染病。其特征是鼻咽等粘膜发生急性、卡他性、化脓性炎症和领下淋巴结的急性、化脓性炎症。该病在养马地区发病率高，呈世界性分布，几乎每年都要流行一次，不仅直接影响马匹的生长发育，还会导致马匹的死亡，已造成严重经济损失, 该病目前仍然困扰着许多国家和地区养马业的发展。当前该病的防治多数情况下以抗生素治疗和环境卫生控制为主，尽管目前抗生素治疗仍然是控制马腺疫的主要手段，但对于目前采用的抗生素疗法还存在着问题,由于长期大量的滥用抗菌药物,致使耐药菌株不断出现,还会造成疫病不断暴发，人们也意识到单靠抗生素并不能从根本上解决马腺疫的感染问题。

马腺疫链球具有多种表面及内部蛋白，成为该菌重要的毒力因子，且具有良好的免疫原性，是该菌的重要保护性抗原。针对这些蛋白的抗体被证明对小鼠具有保护作用。这些表面蛋白往往具有多种生物学功能,能介导链球菌与宿主细胞的粘附作用，能够抑制机体吞噬细胞对链球菌的吞噬,可作为有潜力的免疫原。现有研究结果表明，当以有些种类的马腺疫链球菌的蛋白联合免疫后可以增强其中单一蛋白的免疫强度，其效果好于单一蛋白单独免疫时的效果（Flock M,Jacobsson K, Frykberg L, Hirst TR, Franklin A,Guss B, et al..Infect Immun，2004，72：3228-3236）。蛋白联合免疫后可以增强单一蛋白的免疫强度,但也发现有些蛋白联合免疫后并未出现免疫效果增强的现象（Flock M, Karlstrom A,Lannergard J,Guss B,Flock JI. Vaccine,2006,24,4144-4151）。

目前普遍认为疫苗在马腺疫的控制方面具有重要的作用。由于对马腺疫链球菌的致病和免疫机理仍缺乏足够的认识，国内外迄今亦未有高效的疫苗来防治该病。目前对马腺疫链球菌疫苗使用情况是灭活疫苗免疫效果较低且易引起不良反应, 弱毒疫苗存在安全隐患。随着当前马产业的快速发展，马的饲养日趋规模化和集约化，马腺疫的危害日趋严重，各地在马腺疫防治方面迫切需要安全高效的疫苗。经文献检索可知，因此采用马腺疫链球菌来源的两种蛋白的重组真核表达质粒复合物就成为制备马腺疫链球菌病疫苗的一个技术关键。可见采用S蛋白和E蛋白的重组真核表达质粒复合物及其在马腺疫链球菌病免疫中应用具有现实的意义和作用。

发明内容

针对现有技术未见有关采用S蛋白和E蛋白的重组真核表达质粒复合物及其在马腺疫链球菌病免疫中应用报道的技术现状，本发明旨在提供一种重组真核表达组合质粒在制备马腺疫链球菌病药物的应用，有鉴于此，本发明提供了一种重组真核表达质粒复合物，该复合物是由S蛋白和E蛋白的重组真核表达质粒PVAX1-S和PVAX1-E以1：1的质量比组合而成。本发明的目的之一在于提供一种马腺疫链球菌来源的S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物，其免疫后可诱导实验动物产生特异的体液免疫和细胞免疫，目的之二在于提供所述的S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物的制备方法；目的之三在于提供的免疫保护力实验证明该重组质粒复合物能够提供预防马腺疫感染的疫苗。

为解决上述的技术问题，本发明通过以下技术方案实现。

本发明利用已分离的新疆地区马腺疫链球菌中克隆了S和E蛋白的基因并将隆到真核表达载体PVAX-1中获得这两种抗原的真核重组表达质粒,转化至工程菌中并对该重组质粒提取并纯化，利用S蛋白和E蛋白这2种重组质粒产物PVAX1-S和PVAX1-E以1：1的质量比组合而成制备了预防马腺疫感染的疫苗，通过在实验动物中应用验证得知，其免疫抗体水平、细胞免疫水平和对实验动物小鼠的免疫保护效果好于每种重组质粒单独免疫，克服了单一抗原产生的免疫保护效果差的缺点，证明S和E不同重组质粒的抗原相组合后细胞免疫水平优于单一抗原单独免疫，本发明中组合后免疫保护率达83.3%，优于单一抗原单独免疫（66.7%）的免疫保护率，改善和克服当前前马链球菌疫苗使用过程中灭活疫苗免疫效果较低且易引起不良反应, 克服了弱毒疫苗存在安全隐患，具有现实的作用和意义。

本发明具体提供了一种重组真核表达质粒复合物，该复合物是由S蛋白和E蛋白的重组真核表达质粒PVAX1-S和PVAX1-E以1：1的质量比组合而成，该重组真核表达组合质粒的具体制备方法步骤如下：

（1）分别扩增S及E基因，将两个基因均用XhoⅠ和BamHⅠ内切酶酶切并纯化。

（2）再将酶切纯化后的基因片段分别连接到经XhoⅠ和BamHⅠ酶切后的真核表达载体中。

（3）通过上述步骤将PCR扩增得到的SeM基因片段分别用XhoⅠ、BamHⅠ酶切后的后连入经XhoⅠ、BamHⅠ酶切后的真核表达载体PVAX-1, 用 T4DNA 连接酶进行16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中。提取质粒酶切鉴定阳性克隆，构建获得重组真核表达质粒PVAX1-S。

（4）同理，通过上述步骤将PCR扩增得到的E蛋白片段分别用XhoⅠ、BamHⅠ酶切后连入经XhoⅠ、BamHⅠ酶切后的真核表达载体PVAX-1, 用 T4DNA 连接酶进行16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，提取质粒酶切鉴定阳性克隆，构建获得重组真核表达质粒PVAX1-E。

（5）通过上述步骤（3）和（4）分别将获得重组质粒转化至工程菌中并对该重组质粒提取并纯化，利用获得重组真核表达质粒S蛋白和E蛋白以质量比1：1混合而成重组真核质粒复合物。

进一步，本发明详实提供了上述重组真核表达质粒复合物的具体制备方法步骤如下：

（1）分别扩增S蛋白基因及E蛋白基因，将两个基因均用BamHⅠ和XhoⅠ内切酶酶切并纯化，扩增的S蛋白基因及E蛋白基因分别参见附后的基因序列表中的 SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

（2）再将酶切纯化后的基因片段分别连接到经BamHⅠ和XhoⅠ内切酶酶切后的真核表达载体中PVAX-1，该载体具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

（3）通过上述步骤将PCR扩增得到的S基因片段分别用XhoⅠ、BamHⅠ酶切后连入经XhoⅠ、BamHⅠ真核表达载体PVAX-1, 用 T4DNA 连接酶进行16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中。提取质粒酶切鉴定阳性克隆，构建获得重组真核表达质粒PVAX1-S，该重组质粒具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

（4）将PCR扩增得到的E蛋白基因片段分别用XhoⅠ、BamHⅠ酶切后连入经XhoⅠ、BamHⅠ真核表达载体PVAX-1, 用 T4DNA 连接酶进行16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，提取质粒酶切鉴定阳性克隆，构建获得重组真核表达质粒PVAX1-E，该重组质粒具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。

（5）S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物由PVAX1-S和PVAX1-E以质量比1：1混合而成。

（6）所述的S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物的制备方法为：在浓度为0.01mol/L、pH为7.2～7.4的PBS溶液中分别加入提取好的S蛋白和E蛋白重组真核表达质粒，按1：1质量比混合均匀后，即得S蛋白和E蛋白重组真核质粒的复合物，使PVAX1-S和PVAX1-E的终浓度为0.5mg/mL。

同时，本发明提供一种重组真核表达组合质粒在制备马腺疫链球菌病药物的应用，利用上述制备的S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物，将PVAX1-S和PVAX1-E的终浓度为0.5mg/mL在制备马腺疫链球菌疫苗中的应用。

本发明中，上述S蛋白基因及E蛋白基因来源于已分离本地马腺疫链球菌流行菌株马腺疫链球菌(Streptococcus.equi subsp equi)XZ1 CGMCC No.7830，该菌种同样为本申请人已于2013年6 月28 日在北京保藏于北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号中科院微生物研究所“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.7830，并在前面申报专利中给予详细的披露和记载。

通过实施本发明具体的发明内容可以达到以下有益效果：

（1）本发明通过将S和E不同重组质粒的抗原相组合后免疫抗体水平与单一抗原单独免疫对比试验，通过免疫抗体水平检测，证明了S和E不同重组质粒的抗原相组合后免疫抗体水平优于单一抗原单独免疫。

（2）本发明通过将不同重组真核表达质粒S和E的抗原相组合后在淋巴细胞的细胞免疫水平与单一抗原单独免疫进行对比试验，通过SI刺激指数的比较结果，证明了不同重组质粒S和E的抗原相组合后细胞免疫水平优于单一抗原单独免疫。

（3）本发明通过将PVAX1-S和PVAX1-E以质量比1：1混合而成S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物。通过在实验动物中应用验证得知，中将不同抗原S蛋白和E蛋白相组合后免疫保护效果好，免疫保护率高达83.3%，优于单一抗原单独免疫的免疫保护率66.7%。

（4）本发明提供的S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物的制备方法简单，可以用于制备马腺疫预防用疫苗，在马腺疫的预防与控制中有着良好的应用和开发应用前景。

附图说明

图1 显示为构建的S重组质粒电泳结果图。图中，M1为DNA Marker DL5000； 1为重组质粒pVAX1-S 双酶切产物； 2为质粒pVAX1双酶切产物； 3为S蛋白基因PCR扩增产物。

图2 显示为重组质粒PVAX1-S Western-blot鉴定结果图。图中，M为蛋白标准分子量；1为PVAX1-S质粒转染细胞产物；2为PVAX1质粒转染细胞产物；通过重组质粒转染293T细胞后在相对分子质量约41kDa处特异表达了目的条带, 与预期蛋白大小一致。

图3 显示为构建的E蛋白重组质粒电泳结果图。图中，M1为DNA Marker DL5000； 1为重组质粒pVAX1-E 双酶切产物；2为质粒pVAX1空载体双酶切产物；3为E蛋白基因PCR扩增产物。

图4显示为重组质粒PVAX1-E Western-blot鉴定结果图。图中，M为蛋白标准分子量；1为PVAX1-E质粒转染细胞产物；2为PVAX1空载体转染细胞产物；通过重组质粒转染293T细胞后在相对分子质量约26kDa处特异表达了目的条带, 与预期蛋白大小一致。

图5显示为实验动物免疫后体液免疫的检测图。

图6 显示为实验动物免疫后细胞免疫的检测图。图中通过SI刺激指数体现。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指m/m 质量百分比，份比按照重量份比核计。

本发明中涉及的设备和材料：

DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ, La-Taq DNA聚合酶，T4链接酶购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA公司；Blue Plus II Protein Marker购自北京全式金生物技术公司；卡那霉素(Kan)、DAB显色液、胰蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清、DMEM培养基、细胞培养板购于Thermo Fisher公司；转染试剂VigoFect购于威格拉斯生物技术(北京)有限公司；细胞总蛋白抽提试剂购于武汉博士德生物工程有限公司；脑心浸液培养基(BHI)购于杭州天和微生物微生物试剂有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉购于北京奥博星生物技术有限公司。三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸、二甲基亚砜(DMSO)购于Amersco公司；硝酸纤维素膜(NC膜)购于Milipo公司。

LDZX自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；PL303电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；DK-600A电热恒温水箱：上海一恒科技有限公司；LT-1005台式低温恒温槽：杭州汇尔仪器设备有限公司；THZ-D台式恒温震荡器；江苏太仓实验设备厂；DG-70D电热恒温培养箱：宁波莱福科技有限公司；SW-CJ-1F超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；Tgradient 1PCR扩增仪：Biometre公司 ；JS-780凝胶成像系统：培清科技 ；DYY-6C电泳仪：北京市六一仪器厂；5415R高速冷冻离心机：eppendorf ；BioPhotometer核酸蛋白测定仪：eppendorf公司，Trans-Blot Cell：Bio-Rad公司。

实验动物：5−7周龄雌性SPF级昆明白小鼠(18−20 g)， 购自新疆医科大学实验动物中心。

本发明中选用的所有试剂、仪器、原辅材料都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：重组真核表达质粒复合物的制备

重组真核表达质粒复合物是由S蛋白和E蛋白的重组真核表达质粒PVAX1-S和PVAX1-E以1：1的质量比组合而成，该重组真核表达组合质粒的具体制备方法步骤如下：

（1）分别扩增S及E蛋白基因，将两个基因均用BamHⅠ和XhoⅠ内切酶酶切并纯化。

（2）再将酶切纯化后的基因片段分别连接到经BamHⅠ和XhoⅠ内切酶酶切后的真核表达载体中。

（3）通过上述步骤将PCR扩增得到的SeM基因片段分别用XhoⅠ、BamHⅠ酶切后连入经XhoⅠ、BamH Ⅰ真核表达载体PVAX-1, 用 T4DNA 连接酶进行16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中。提取质粒酶切鉴定阳性克隆，构建获得重组真核表达质粒PVAX1-S。

（4）同理，通过上述步骤将PCR扩增得到的E蛋白基因片段分别用XhoⅠ、BamHⅠ酶切后连入经XhoⅠ、BamHⅠ真核表达载体PVAX-1, 用 T4DNA 连接酶进行16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，提取质粒酶切鉴定阳性克隆，构建获得重组真核表达质粒PVAX1-E。

（5）通过上述步骤（3）和（4）分别将获得重组质粒转化至工程菌中并对该重组质粒提取并纯化，利用获得重组真核表达质粒S蛋白和E蛋白以质量比1：1混合而成重组真核质粒复合物。

实施例二：重组真核表达质粒复合物的制备

本发明详实提供了上述重组真核表达质粒复合物的具体制备方法步骤如下：

（1）分别扩增S蛋白基因及E蛋白基因，将两个基因均用BamHⅠ和XhoⅠ内切酶酶切并纯化，扩增的S蛋白基因及E蛋白基因分别参见附后的基因序列表中的 SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

（2）再将酶切纯化后的基因片段分别连接到经BamHⅠ和XhoⅠ内切酶酶切后的真核表达载体中PVAX-1，该载体具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

（3）通过上述步骤将PCR扩增得到的S基因片段分别用XhoⅠ、BamHⅠ酶切后连入经、BamHⅠ真核表达载体PVAX-1, 用 T4DNA 连接酶进行16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中。提取质粒酶切鉴定阳性克隆，构建获得重组真核表达质粒PVAX1-S，该重组质粒具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

（4）将PCR扩增得到的E蛋白基因片段分别用XhoⅠ、BamHⅠ酶切后连入经XhoⅠ、BamHⅠ真核表达载体PVAX-1, 用 T4DNA 连接酶进行16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，提取质粒酶切鉴定阳性克隆，构建获得重组真核表达质粒PVAX1-E，该重组质粒具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。

（5）S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物由PVAX1-S和PVAX1-E以质量比1：1混合而成。

（6）所述的S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物的制备方法为：在浓度为0.01mol/L、pH为7.2～7.4的PBS溶液中分别加入提取好的S蛋白和E蛋白重组真核表达质粒，按1：1质量比混合均匀后，即得S蛋白和E蛋白重组真核质粒的复合物，使PVAX1-S和PVAX1-E的终浓度为0.5mg/mL。

实施例三：重组真核表达质粒 PVAX1-S 的构建

获取马腺疫链球菌S蛋白抗原表位编码的基因

马腺疫链球菌本地流行菌株(Streptococcus.equi subsp equi)XZ1 CGMCC No.7830，该菌种为本申请人已于2013年分离获得，并于2013年6月28日由“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.7830。挑取绵羊血琼脂平板上XZ1株单菌落接种至含5％犊牛血清（购自杭州四季青）的Todd-Hewitt broth(THB) 肉汤中，37℃静置培养过夜，取0.5mL 菌液离心，提取染色体DNA，溶于PH8.0 TE缓冲液中，冻存备用。

提取马腺疫链球菌XZ1株基因组DNA的步骤如下：分别挑取绵羊血平板上XZ1菌落接种到Todd-Hewit 肉汤，37℃静止培养过夜；取0.5mL 菌液离心沉淀，TE 缓冲液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，pH7.4) 洗涤菌体；以冷丙酮悬浮菌体6000g 离心5min，并干燥；37℃用溶菌酶(2mg/mL)200uL 处理菌体1h，加TESN 裂解液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，1％ Sarkosyl，6mol/LNaI，pH7.4) 裂解；加等体积异丙醇沉淀DNA，10000g 离心10min ；沉淀悬浮于200uL 40％异丙醇中，离心洗涤；70％乙醇洗涤沉淀；干燥的沉淀溶于100uL TE缓冲液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，pH8.0)，4℃备用。

采用聚合酶链反应(PCR) 方法自马腺疫链球菌XZ1株染色体DNA 中分离S蛋白基因。引物P1 与P2 两端分别添加BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，采用的引物序列分别是：

S基因的上游引物P1 ：5′ G GAT CCC GGC CCC GCC ACA ATG GGC AAG TGG GTA ACC TTT GTT TCC CTT CTC 3′ (SEQ ID NO ：1)

S基因的下游引物P2 ：5′ CTCGAG TCAGAACATTCTGCCCAG

3′ (SEQ ID NO ：2)。

所述PCR 操作程序是：在一200μL 微量离心管中加入下列试剂：

模板DNA 2μL

10x PCR buffer 10μL

25mM MgCl2 8μL

2.5mM dNTPs 8μL

引物 各 0.5μL

ddH2O 18μL

Taq 酶 3μL

混匀后，立即进行PCR 反应。PCR 循环参数：94℃变性4min 后，进入循环，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，共30 个循环，最后72℃延伸10min。

目的片断的回收和纯化：PCR 产物经1％琼脂糖电泳后，切下目的条带，用DNA 快速纯化试剂盒提取凝胶中目的片段，具体步骤按试剂盒说明书进行操作。即：琼脂糖电泳后割下含DNA 的琼脂糖块，使体积尽可能小，放入1.5mL eppendorf 管中；按每100mg 琼脂糖块加入300μL 结合缓冲液的比例加入结合缓冲液，将eppendorf管涡旋振荡15～30s，置50℃水浴10min，使琼脂块完全溶化，每2～3min 涡旋振荡一次；按每100mg 琼脂糖块加入150μL 异戊醇的比例加入异戊醇，涡旋振荡彻底混匀；将溶化后的溶液移入吸附柱中，12000g、15～25℃离心1min，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中；在吸附柱中加入500μL 洗脱缓冲液，2000g、15～25℃离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；在吸附柱中再次加入200μL 洗脱缓冲液，静置1min 后，12000g、15～25℃离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；12000rpm、15～25℃离心1min，彻底除去吸附柱中的洗脱液；将吸附柱放入一只干净的1.5mL eppendorf管中，在吸附膜中央加入50～100μL 溶解缓冲液，静置1min 后，12000g、15～25℃离心1min，回收产物即为纯化的目的片段，回收产物-20℃冻存备用。

S基因的酶切与回收：将回收的S基因片段用BamHⅠ、XhoⅠ进行酶切，37℃过夜酶切，酶切后产物经凝胶纯化试剂盒回收后，-20℃保存备用。

在0.5mL 的eppendorf 管依次加入：

S基因片段 8μL

10X buffer 1 2μL

BamHI 1μL

XhoⅠ 1μL

ddH2O 8μL

混匀，37℃水浴酶切2h，65℃ 15min 终止反应。

按Roche DNA 快速回收试剂盒说明书回收酶切产物。

PVAX1载体片段的酶切与回收：挑取含有pVAX1质粒的单菌落，于LB(50 μg/mL kan)培养基中培养，200 rpm、37 ℃培养12 h，提取质粒。质粒提取步骤同上。

将提取的pVAX1质粒以BamHⅠ、XhoⅠ进行酶切，37℃过夜酶切，回收片段。

在0.5mL 的eppendorf 管依次加入：

PVAX1 载体片段 18μL

10X buffer 1 2μL

BamHI 1μL

XhoⅠ 1μL

ddH2O 8μL

混匀，37℃水浴酶切2h，65℃ 15min 终止反应。按Roche DNA 快速回收试剂盒说明书回收酶切产物。

PVAX1 载体与外源DNA片段的连接反应

将酶切后的S基因与酶切后的载体pVAX1，在T4 DNA 连接酶作用下16 ℃过夜连接。

0.5mL eppendorff 管中依次加入：

载体DNA 0.5μL

S基因酶切回收产物 4μL

10X 连接buffer 2μL

T4DNA 连接酶 1μL

dd H2O 12.5μL

16℃连接过夜。

感受态细胞的制备和转化：从新鲜LB 平板挑取单菌落的DH5α 接种10mLLB 肉汤，37℃剧烈摇振培养3 ～ 4h后，冰上放置10min ；4℃、6000rpm 离心4min，以冰预冷的0.1mol/mL CaCl2 悬浮沉淀，置冰浴10min ；4℃、6000rpm 离心4min，加400μL 冰预冷的0.1mol/mL CaCl2 重新悬浮沉淀，4℃放置待用；取200μL 感受态细胞至eppendorf 管中，加入10μL 的连接产物，立即混匀，冰上放置30min ；42℃热休克90s，迅速转移至冰浴2min，然后加入800μL 37℃预热的LB 培养基，37℃缓慢摇振2h ；取100μL 培养液涂布LB 平板( 含Amp 100μg/mL)37℃培养14 ～16h。

将含S基因的的重组质粒转化大肠杆菌Dh5α，感受态购自天为公司，用限制性内切酶酶切的方法及重组质粒测序的方法鉴定重组克隆。酶切结果参见附图1，泳道3中构建的重组质粒pVAX1-S经BamHⅠ与XhoⅠ双酶切后，可以获得与目的片段大小一致的基因片段。而泳道2中的对照则没有该片段。

重组质粒冰冻保存于-20℃，重组菌在含20～50％甘油培养液中保存于-20℃或-70℃。 融合基因的序列测定采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行测序。测序结果表明，所得到的基因序列与设计的完全一致。以上参见附图2可知。

实施例四：重组真核表达质粒 PVAX1-E 的构建

马腺疫链球菌本地流行菌株(Streptococcus.equi subsp equi)XZ1 CGMCC No.7830，该菌种为本申请人已于2013年分离获得，并于2013年6月28日由“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.7830。挑取绵羊血琼脂平板上XZ1株单菌落接种至含5％犊牛血清（购自杭州四季青）的Todd-Hewitt broth(THB) 肉汤中，37℃静置培养过夜，取0.5mL 菌液离心，提取染色体DNA，溶于PH8.0 TE缓冲液中，冻存备用。

提取马腺疫链球菌XZ1株基因组DNA的步骤如下：分别挑取绵羊血平板上XZ1菌落接种到Todd-Hewit 肉汤，37℃静止培养过夜；取0.5mL 菌液离心沉淀，TE 缓冲液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，pH7.4) 洗涤菌体；以冷丙酮悬浮菌体6000g 离心5min，并干燥；37℃用溶菌酶(2mg/mL)200uL 处理菌体1h，加TESN 裂解液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，1％ Sarkosyl，6mol/LNaI，pH7.4) 裂解；加等体积异丙醇沉淀DNA，10000g 离心10min ；沉淀悬浮于200uL 40％异丙醇中，离心洗涤；70％乙醇洗涤沉淀；干燥的沉淀溶于100uL TE缓冲液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，pH8.0)，4℃备用。

采用聚合酶链反应(PCR) 方法自马腺疫链球菌XZ1株染色体DNA 中分离E蛋白基因。引物P1 与P2 两端分别添加BamHⅠ和 XhoⅠ酶切位点和保护性碱基，采用的引物序列分别是：

E基因的上游引物P1 ：5′ G GAT CCC GGC CCC GCC ACA ATG GGC AAG TGG GTA ACC TTT GTT TCC CTT CTC

3′ (SEQ ID NO ：3)

E基因的下游引物P2 ：5′CTCGAG TCAGAACAGGCTGCCCAGGGG CTT 3′ (SEQ ID NO ：4)。

所述PCR 操作程序是：在一200μL 微量离心管中加入下列试剂：

模板DNA 2μL

10x PCR buffer 10μL

25mM MgCl2 8μL

2.5mM dNTPs 8μL

引物 各 0.5μL

ddH2O 18μL

Taq 酶 3μL

混匀后，立即进行PCR 反应。PCR 循环参数：94℃变性4min 后，进入循环，94℃ 30s，53℃ 35s，72℃ 45s，共30 个循环，最后72℃延伸10min。

目的片断的回收和纯化：PCR 产物经1％琼脂糖电泳后，切下目的条带，用DNA 快速纯化试剂盒提取凝胶中目的片段，具体步骤按试剂盒说明书进行操作。即：琼脂糖电泳后割下含DNA 的琼脂糖块，使体积尽可能小，放入1.5mL eppendorf 管中；按每100mg 琼脂糖加入300μL 结合缓冲液的比例加入结合缓冲液，将eppendorf管涡旋振荡15～30s，置50℃水浴10min，使琼脂块完全溶化，每2～3min 涡旋振荡一次；按每100mg 琼脂糖块加入150μL 异戊醇的比例加入异戊醇，涡旋振荡彻底混匀；将溶化后的溶液移入吸附柱中，12000g、15～25℃离心1min，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中；在吸附柱中加入500μL 洗脱缓冲液，2000g、15～25℃离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；在吸附柱中再次加入200μL 洗脱缓冲液，静置1min 后，12000g、15～25℃离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；12000rpm、15～25℃离心1min，彻底除去吸附柱中的洗脱液；将吸附柱放入一只干净的1.5mL eppendorf管中，在吸附膜中央加入50～100μL 溶解缓冲液，静置1min 后，12000g、15～25℃离心1min，回收产物即为纯化的目的片段，回收产物-20℃冻存备用。

S基因的酶切与回收：将回收的E基因片段用BamHⅠ、XhoⅠ进行酶切，37℃过夜酶切，酶切后产物经凝胶纯化试剂盒回收后(方法同上)，-20℃保存备用。

在0.5mL 的eppendorf 管依次加入：

S基因片段 8μL

10X buffer 1 2μL

BamHI 1μL

XhoⅠ 1μL

ddH2O 8μL

混匀，37℃水浴酶切2h，65℃ 15min 终止反应。

按Roche DNA 快速回收试剂盒说明书回收酶切产物。

PVAX1载体片段的酶切与回收：挑取含有pVAX1质粒的单菌落，于LB(50 μg/mL kan)培养基中培养，200 rpm、37 ℃培养12 h，提取质粒。质粒提取步骤同上。

将提取的pVAX1质粒以BamHⅠ、XhoⅠ进行酶切，37℃过夜酶切，回收片段。

在0.5mL 的eppendorf 管依次加入：

PVAX1 载体片段 18μL

10X buffer 1 2μL

BamHI 1μL

XhoⅠ 1μL

ddH2O 8μL

混匀，37℃水浴酶切2h，65℃ 15min 终止反应。按Roche DNA 快速回收试剂盒说明书回收酶切产物。

PVAX1 载体与外源DNA片段的连接反应

将酶切后的S基因与酶切后的载体pVAX1，在T4 DNA 连接酶作用下16 ℃过夜连接。

0.5mL eppendorf 管中依次加入：

载体DNA 0.5μL

S基因酶切回收产物 4μL

10X 连接buffer 2μL

T4DNA 连接酶 1μL

dd H2O 12.5μL

16℃连接过夜。

感受态细胞的制备和转化：从新鲜LB 平板挑取单菌落的DH5α接种10mL LB 肉汤，37℃剧烈摇振培养3～4h后，冰上放置10min ；4℃、6000rpm 离心4min，以冰预冷的0.1mol/mL CaCl₂ 悬浮沉淀，置冰浴10min ；4℃、6000rpm 离心4min，加400μL 冰预冷的0.1mol/mL CaCl₂ 重新悬浮沉淀，4℃放置待用；取200μL 感受态细胞至eppendorf 管中，加入10μL 的连接产物，立即混匀，冰上放置30min ；42℃热休克90s，迅速转移至冰浴2min，然后加入800μL 37℃预热的LB 培养基，37℃缓慢摇振2h ；取100μL 培养液涂布LB 平板( 含Amp 100μg/mL)37℃培养14 ～16h。

用限制性内切酶酶切的方法及重组质粒测序的方法鉴定重组克隆。

重组质粒冰冻保存于-20℃，重组菌在含20～50％甘油培养液中保存于-20℃或-70℃。酶切结果参见附图3，泳道3中构建的重组质粒pVAX1-E 经BamHⅠ与XhoⅠ双酶切后，可以获得与目的片段大小一致的基因片段。而泳道2中的对照则没有该片段。l连接的E基因的序列测定采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行测序。测序结果表明，所得到的基因序列与设计的完全一致。以上参见附图4可知。

实施例五：重组真核表达质粒 PVAX1-S 和 PVAX1-E 的提取扩增

结合上述实施例三和实施例四。接种含PVAX1-S和PVAX1-E重组真核表达质粒的宿主菌DH5α至LB 肉汤(含50μg/mL kan)中，37℃摇振培养12～14h。按QIAGEN 质粒提取试剂盒说明书进行。

取3mL 菌液至1.5mL eppendorf 管中，4 ℃、8000rpm 离心3min，彻底弃上清；加250μLp1 缓冲液至ependorf 管中，重新溶解菌泥沉淀，混匀；加250μLp2 缓冲液至eppendorf 管中，轻轻颠倒混匀4～6 次，静置4min，可见溶液变澄清；加350μLN3 缓冲液至eppendorf 管中，立即轻轻颠倒混匀4～6 次；4℃、2000rpm 离心10min，将上清吸至QIAprep柱中；4℃、12000rpm 离心1min，甩去离心柱内的弃液；加0.5mL PB 缓冲液至QIAprep 柱中，4℃、12000rpm 离心1min，甩去柱内的弃液；加0.75mLPE缓冲液至柱中，4℃、12000rpm 离心1min，甩去离心柱内的弃液；再次离心1min ；彻底弃去柱内的液体；将离心柱安置干净的1.5mL eppendorf 管中，加入50μL EB 缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.5) 至柱子中央，37℃静置1～2min，4℃、12000rpm 离心1min，收集洗脱液，即为提取的质粒，-20℃冻存备用。

实施例六：重组真核表达质粒 PVAX1-S 和 PVAX1-E 的表达与鉴定

结合上述实施例三、实施例四和实施例五。

将提取扩增的重组真核表达质粒PVAX1-S和PVAX1-E采用VigoFect转染试剂进行转染，参照高效真核转染试剂(威格拉斯)说明书进行。

转染前1d，六孔培养板接种2×10⁵～4×10⁵个293T细胞，至转染时细胞密度达到60%。转染前1h，更换新鲜的完全培养液，置37 ℃，5% CO2培养。 取5 μg DNA，加入稀释液中至总体积为100 μl，轻轻混匀，室温放置。 取VigoFect 2 μl，加入稀释液中至总体积为100 μl，轻轻混匀，室温放置5min。 将稀释的VigoFect逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作液在室温放置15 min。 将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入2 mL培养液中，轻轻混匀培养液，置37 ℃，5% CO₂培养。转染后24～48 h，观察并收取细胞。

采用WesternBlot检测重组质粒是否表达及其抗原性检测。总蛋白抽提试剂对收取细胞进行抽提，作用数分钟，吹打数次后，冰浴2 h即完成。抽提的蛋白加入5×Loading Buffer，95 ℃，10 min，即完成样品制备。

取制备好的样品，加入上样缓冲液，100℃加热3～5 分钟，用质量百分浓度为12％的分离胶、质量百分浓度为5％的积层胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物电转移至NC膜上，用质量百分浓度为5％的脱脂牛奶封膜，加入的一抗分别为1: 1000稀释家兔抗S蛋白多克隆抗血清和抗E蛋白多克隆抗血清，温度37℃孵育1 小时，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，温度37℃孵育1 小时，洗膜，显色 。PVAX1-S的Western-blot 结果见图2，其中1 泳道为PVAX1-S，2 泳道为阴性对照，可见1 泳道有一明显蛋白条带，而2 泳道未见条带。表明转染后的pVAX1-S能够在293T细胞进行正确表达。PVAX1-E的Western-blot 结果见图4，其中1 泳道为PVAX1-E，2 泳道为阴性对照，可见1 泳道有一明显蛋白条带，而2泳道未见条带。表明转染后的pVAX1-E 能够在293T细胞进行正确表达。

实施例七：重组真核表达质粒 PVAX1-S 和 PVAX1-E 复合物的制备

结合上述实施例三至实施例六。

在浓度为0.01mol/L、pH 为7.2～7.4 的PBS(由浓度为137mmol/L 的NaCl、浓度为2.7mmol/L 的KCl、浓度为4.3mmol/L 的Na₂HPO₄ 和浓度为1.4mmol/L 的KH₂PO₄ 组成) 中，按质量比为1∶1 加入纯化的PVAX1-S和PVAX1-E，使PVAX1-S和PVAX1-E在PBS中的浓度均为0.5mg/mL，混合均匀，室温下孵育30 分钟，即得PVAX1-S和PVAX1-E复合物。

实施例八：重组真核表达质粒 PVAX1-S 和 PVAX1-E 复合物对小鼠的免疫保护效力试验

以下试验是基于结合上述实施例一至实施例七展开如下实验。

菌株和质粒：马腺疫链球菌菌株(Streptococcus.equi subsp equi )XZ1 CGMCC No.7830，该菌种为本申请人已于2013年分离获得，并于2013年6月28日由“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.7830。

实验动物分组：60只昆明白小鼠平均分为5组，每组12只，分别编号为A组重组质粒pVAX1-S免疫组、B组重组质粒pVAX1-E免疫组、C组pVAX1-S+pVAX1-E对照组、D组pVAX1质粒对照组和E组PBS对照组。

免疫用重组真核表达质粒复合物免疫原的制备及免疫：将质粒、壳聚糖按照1：0.5比例混合，制备成注射浓度为0.5 mg/mL的重组质粒复合物疫苗，采用后肢腿部肌肉注射方法免疫，注射剂量50 μg/只。采用2次免疫，免疫间隔时间为21d，初次免疫后0 d、14 d、35 d各断尾采血1次，分离血清−20 ℃保存用于检测。

实验动物免疫后体液免疫和细胞免疫的检测：免疫前及每次免疫后2周后对免疫小鼠进行断尾采血，分离血清。用间接ELISA方法检测免疫前及各免后血清中抗体滴度。将FnBPA纯化蛋白用PH=9.6的碳酸钠缓冲液4℃进行过夜包被。对鼠血清进行不同浓度稀释：初始100倍稀释，随后倍比稀释。将不同稀释度的血清做一抗37℃温育2h。将羊抗鼠HRP标记的二抗1:4000稀释，37℃温育1h后，洗涤、显色、终止，OD450nm读数。

不同时间的血清经100倍稀释后做一抗分别作ELISA检测，OD450nm读数，以空载体和PBS注射组做对照。结果参见附图5。研究的结果表明1免后（P<0.01）及2免后(P<0.001) 的卡个体检测结果显示PVAX1-S+PVAX1-E组合免疫组比PVAX1-S，PVAX1-E单独免疫组及PBS对照组、空载体对照组诱导的抗体水平高，且与对照组相比差异极显著。

用等量所构建的不同重组质粒免疫小鼠2次，二免90天后，对脾脏T淋巴细胞的MTT实验检测所得的刺激指数（stimulation index，SI）。结果参见附图6所示，MTT实验的结果显示PVAX1-S+PVAX1-E组合免疫组比空载体组和空白对照组更能刺激机体的细胞免疫水平。统计分析表明PVAX1-S+PVAX1-E与空载体组和空白对照组差异显著。

免疫后对小鼠的攻毒保护性试验：60只 昆明白小鼠，体重20g，平均分为5组，每组 12只。以重组质粒单独和组合后的抗原免疫实验小鼠, 皮下注射PVAX-1空载体，PBS分别作对照， 首次免疫将抗原50ug经皮下注射接种。各组均在首免后3周后进行第2次免疫，2免后45d用马腺疫链球菌菌株(Streptococcus.equi subsp equi )XZ1 CGMCC No.7830通过腹腔注射进行攻毒，每只鼠腹腔接种最小致死菌量（1MLD）为5×10⁷CFU，观察一周。记录每组试验鼠的发表，死亡情况，计算免疫保护效率。空白组12只小鼠36h全部死亡，PVAX1空载体组保护率为16.67%，PVAX1-S和PVAX1-E免疫组的保护率分别为66.67%，66.67%， PVAX1-S+PVAX1-E组合免疫组的保护率为83.33%。

SEQ ID NO.1

<110> OrganizationName : 新疆农业大学

<110> LastName : 苏艳

<110> FirstName : 苏艳

<120> Title : 重组真核表达质粒复合物在制备马腺疫链球菌疫苗中的应用

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<213> OrganismName : Streptococcus equi

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<213> OrganismName : Streptococcus equi

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cagctctgct tattccagag attcccaact tcgaaatcta gagaaggaaa aagaacaaga 120

actacaaaaa gctaaagatg agcgtcaagc tcttaccgaa tcattcaaca aaactttatc 180

aagatcaaca aaagagtata ataaactaaa aacagaactt gcaaaagaaa aagaaaaagc 240

agctaagatg actaaggaat tagcagataa gctaagcaat gctgaagcaa gtcgtgataa 300

agcctttgca gtatcaaaag atttagcaga taaactaagt agtgctgaag caagtcgtga 360

taaagctttt gcagtatcaa aagatttagc agataaattg gcagctaaaa cagcagaagc 420

tgaaaagtta atggaaaacg ttggtagtct agaccgcttg gtagagtctg caaaacgtga 480

aatggctcaa aaattagcag aaattgatca attaactgct gataaggcta aggctgatgc 540

agagcttgca gctgcaaatg acaccattgc atcacttcaa acagagctag aaaaagctaa 600

gacagagctt gctgtttcag agcgtttgat tgaatcaggc aaacgtgaaa ttgctgagct 660

acaaaaacaa aaagatgctt ctgataaggc tttagtagaa tcacaagcta atgtagcaga 720

gcttgaaaaa caaaaagcag catcagatgc taaggtagca gagcttgaaa aagaagttga 780

agctgctaaa gctgaggttg cagatcttaa agcacaatta gctaagaaag aagaagagct 840

tgaagccgtt aagaaggaaa aagaagcgct tgaagctaag attgaagagc tcaaaaaagc 900

tcatgctgag gaactttcaa aacttaaaga aatgcttgag aagaaagacc atgcaaatgc 960

agatcttcaa gcagaaatca atcgcttgaa gcaagagcta gctgacagga ttaagtcatt 1020

gtcacaaggt ggtcgtgctt cacaaacaaa cccaggcact acaactgcta aagcaggtca 1080

attgccatct actggtgagt ctgctaaccc agaattctca gccagctcgt ccggcagccc 1140

ctcccccggc cccctgctgc tcctcctggc cctgctgccc ctgggcagcc tgttctgact 1200

cgag 1204

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<213> OrganismName : Streptococcus equi

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aagacgtgag gcttacagaa caatcaatgc cttaagtgat cagcacaaaa gcgatcaaaa 300

ggttcagcta gctctagttg ctgcagcagc taaggtggca gatgctgctt cagttgatca 360

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gttggaggct aaagaagctg ctatcaatga actaaagcag tatggcatta gtgattacta 480

tgtgacctta atcaacaaag ccaaaactgt tgaaggtgtc aatgcgctta aggcagagat 540

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atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240

ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600

ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660

aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720

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ggccgctcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta 840

gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 900

ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 960

attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 1020

gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt tatggacagc 1080

aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc cctgcaaagt 1140

aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa gctctgatca 1200

agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc 1260

ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc 1320

tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga 1380

cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac 1440

gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct 1500

gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa 1560

agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc 1620

attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct 1680

tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc 1740

caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg 1800

cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct 1860

gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct 1920

tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca 1980

gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attattaacg cttacaattt 2040

cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tacaggtggc 2100

acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 2160

atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatagca cgtgctaaaa 2220

cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 2280

atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 2340

tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 2400

ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 2460

ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 2520

cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 2580

gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 2640

gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 2700

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agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 2880

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tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600

ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660

aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720

accgagctcg gatcccggcc ccgccacaat gggcaagtgg gtaacctttg tttcccttct 780

ctttctcttc agctctgctt attccagaga ttcccaactt cgaaatctag agaaggaaaa 840

agaacaagaa ctacaaaaag ctaaagatga gcgtcaagct cttaccgaat cattcaacaa 900

aactttatca agatcaacaa aagagtataa taaactaaaa acagaacttg caaaagaaaa 960

agaaaaagca gctaagatga ctaaggaatt agcagataag ctaagcaatg ctgaagcaag 1020

tcgtgataaa gcctttgcag tatcaaaaga tttagcagat aaactaagta gtgctgaagc 1080

aagtcgtgat aaagcttttg cagtatcaaa agatttagca gataaattgg cagctaaaac 1140

agcagaagct gaaaagttaa tggaaaacgt tggtagtcta gaccgcttgg tagagtctgc 1200

aaaacgtgaa atggctcaaa aattagcaga aattgatcaa ttaactgctg ataaggctaa 1260

ggctgatgca gagcttgcag ctgcaaatga caccattgca tcacttcaaa cagagctaga 1320

aaaagctaag acagagcttg ctgtttcaga gcgtttgatt gaatcaggca aacgtgaaat 1380

tgctgagcta caaaaacaaa aagatgcttc tgataaggct ttagtagaat cacaagctaa 1440

tgtagcagag cttgaaaaac aaaaagcagc atcagatgct aaggtagcag agcttgaaaa 1500

agaagttgaa gctgctaaag ctgaggttgc agatcttaaa gcacaattag ctaagaaaga 1560

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ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag 2700

aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc 2760

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cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc 2880

gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc 2940

tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg 3000

ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag 3060

cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg 3120

cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gaattattaa cgcttacaat 3180

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gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 3300

atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatag cacgtgctaa 3360

aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 3420

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cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 4020

tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 4080

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t 4141

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ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600

ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660

aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720

accgagctcg gatcccggcc ccgccacaat gggcaagtgg gtaacctttg tttcccttct 780

ctttctcttc agctctgctt attccaggga aatcaatcag ctgagtgatg actacgctga 840

caatcaagag cttcaggctg ttcttgctaa tgctggagtt gaggcacttg ctgcagatac 900

tgttgatcag gctaaagcag ctcttgacaa agcaaaggca gctgttgctg gtgttcagct 960

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tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 3240

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gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 3480

gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 3540

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Other Information :

CDSJoin : No

Claims (7)

1.一种重组真核表达质粒的复合物，其特征在于，重组真核表达质粒的复合物由马腺疫链球菌M蛋白的重组真核质粒与E蛋白的重组真核表达质粒以1：1质量比混合而成，所述的马链球菌S蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述的马链球菌E蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

2.一种如权利要求1所述的马腺疫重组真核表达质粒复合物的制备方法，其特征在于，重组真核表达质粒复合物的具体制备方法步骤如下：

（1）分别扩增S蛋白的基因及E蛋白的基因，将两个基因均用BamHⅠ和XhoⅠ内切酶酶切并纯化；

（2）再将酶切纯化后的基因片段分别连接到经BamHⅠ和XhoⅠ内切酶酶切后的真核表达载体PVAX1中；

（3）通过上述步骤将PCR扩增得到的S基因片段分别用XhoⅠ、BamHⅠ酶切后连入经XhoⅠ、BamHⅠ真核表达载体PVAX-1, 用 T4DNA 连接酶进行16℃过夜连接，连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞中；

（4）提取质粒酶切鉴定阳性克隆，获得重组真核表达质粒PVAX1-S；

（5）将PCR扩增得到的E基因片段分别用XhoⅠ、BamHⅠ酶切后连入经XhoⅠ、BamHⅠ酶切后的真核表达载体PVAX-1, 用 T4DNA 连接酶进行16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，提取质粒酶切并测序鉴定阳性克隆，获得重组真核表达质粒PVAX1-E；

（6）S蛋白和E蛋白重组真核表达质粒复合物由PVAX1-S和PVAX1-E以质量比1：1混合而成。

3.一种如权利要求2所述的马腺疫重组真核表达质粒复合物的制备方法，其特征在于，所述的S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物的制备方法为：在浓度为0.01mol/L、pH为7.2～7.4的PBS溶液中分别加入提取好的S蛋白和E蛋白重组真核表达质粒，按1：1质量比混合均匀后，即得S蛋白和E蛋白重组真核质粒的复合物。

4.如权利要求1、2或3任意所述的一种重组真核表达质粒复合物，其特征在于，所述的真核表达载体PVAX-1的序列如SEQ ID No.7所示。

5.如权利要求1、2或3任意所述的一种重组真核表达质粒复合物，其特征在于，所述的重组真核表达质粒PVAX1-S的序列如SEQ ID No.8所示。

6.如权利要求1、2或3任意所述的一种重组真核表达质粒复合物，其特征在于，所述的重组真核表达质粒PVAX1-E的序列如SEQ ID No.9所示。

7.权利要求1、2或3任意所述的一种重组真核表达质粒复合物在制备马腺疫链球菌病药物的应用。