ES2256514T3 - Vacuna bacterial. - Google Patents
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Abstract
Una célula bacteriana que expresa tres antígenos de superficie (CS) coli. Existe diferentes tipos de CFAs asociados a las cepas virulentas de ETEC, pero los principales tipos son CFA/I, CFA/II y CFA/IV, asociados aproximadamente con el 70% de las cepas clínicas aisladas. El CFA/I es un antígeno fimbrial sencillo, mientras que los CFA/II y CFA/IV son complejos compuestos por dos tipos diferentes de antígenos de superficie (CS) de la bacteria coli. El CFA/II está compuesto por el antígeno CS3, junto con el antígeno CS1 o CS2. El CFA/IV está compuesto por el antígeno CS6, junto con el antígeno CS4 o CS5. La expresión de CFAs en la cepa de ETEC de referencia parece estar limitada, de forma que las cepas nativas de ETEC expresan únicamente un tipo de CFA y un máximo de dos tipos de antígenos CS. De esta manera, las células naturales de ETEC CFA/II generalmente expresan los antígenos CS1/CS3 o CS2/CS3. De forma similar, las células naturales de ETEC CFA/IV generalmente expresan los antígenos CS4/CS6 o CS5/CS6. Los antígenos CS1 y CS2 no han sido hallados en la misma cepa de referencia (34) y, de la misma manera, los antígenos CS4 y CS5 nunca se expresan conjuntamente en cepas que se crean de forma natural (WO92/01703, (34)).
Description
Vacuna bacterial.
La invención hace referencia a células
bacterianas, útiles para las vacunas, en especial vacunas contra la
diarrea.
En general, el objetivo de la vacuna es inducir
una respuesta inmune en el receptor, generando así una protección
contra posteriores ataques de un agente patógeno. Esto puede
lograrse mediante la inoculación de una cepa viva atenuada del
patógeno, es decir, una cepa con una virulencia reducida, de tal
manera que no provoque la enfermedad causada por el patógeno
virulento pero sí estimule una amplia respuesta inmunológica. Las
cepas de E. coli enterotoxigénica (ETEC) son las principales
causantes de la diarrea del viajero y de la morbilidad y mortalidad
de niños en zonas endémicas. La virulencia va asociada a la
expresión del factor de colonización fimbrial (CFA) que interviene
en la adhesión al intestino con segregación de toxinas (toxina
termoestable [ST], toxina termolábil [LT] y toxina EAST),
responsables de la pérdida de líquido característica de esta
enfermedad. La protección contra la enfermedad provocada por la ETEC
se asocia a una neutralización de las toxinas por medio de
anticuerpos y con una respuesta inmunológica humoral contra los
CFAs.
La WO 99/40926 hace referencia a una bacteria
atenuada por una mutación no reversible en cada uno de los
siguientes genes: aroC, ompF y omp C, que puede resultar útil para
la vacuna.
Existe diferentes tipos de CFAs asociados a las
cepas virulentas de ETEC, pero los principales tipos son CFA/I,
CFA/II y CFA/IV, asociados aproximadamente con el 70% de las cepas
clínicas aisladas. El CFA/I es un antígeno fimbrial sencillo,
mientras que los CFA/II y CFA/IV son complejos compuestos por dos
tipos diferentes de antígenos de superficie (CS) de la bacteria
coli. El CFA/II está compuesto por el antígeno CS3, junto
con el antígeno CS1 o CS2. El CFA/IV está compuesto por el antígeno
CS6, junto con el antígeno CS4 o CS5.
La expresión de CFAs en la cepa de ETEC de
referencia parece estar limitada, de forma que las cepas nativas de
ETEC expresan únicamente un tipo de CFA y un máximo de dos tipos de
antígenos CS. De esta manera, las células naturales de ETEC CFA/II
generalmente expresan los antígenos CS1/CS3 o CS2/CS3. De forma
similar, las células naturales de ETEC CFA/IV generalmente expresan
los antígenos CS4/CS6 o CS5/CS6. Los antígenos CS1 y CS2 no han
sido hallados en la misma cepa de referencia (34) y, de la misma
manera, los antígenos CS4 y CS5 nunca se expresan conjuntamente en
cepas que se crean de forma natural (WO92/01703, (34)).
Una vacuna eficaz contra la ETEC debe inmunizar,
como mínimo, contra las cepas CFA/I, CFA/II y CFA/IV. En este
sentido, hasta el momento las vacunas contra la ETEC requerían un
mínimo de 5 cepas bacterianas: una cepa para expresar el CFA/I, una
para expresar los antígenos CS1/CS3, otra cepa para expresar los
antígenos CS2/CS3, una cepa para expresar los antígenos CS4/CS6 y
otra para expresar los antígenos CS5/CS6. No obstante, los
inventores han concebido un método para producir una célula
bacteriana que no sea tan restrictiva en su expresión de antígenos
CS. En consecuencia, esta invención proporciona una célula
bacteriana que expresa tres o más antígenos de superficie coli
(CS). La invención también proporciona un método para fabricar dicha
célula que supone la introducción de un polinucleótido que codifica
un antígeno CS heterólogo en la célula bacteriana.
De conformidad con la invención, es posible
utilizar una célula bacteriana para fabricar una vacuna contra la
enfermedad provocada por la ETEC. En este sentido, la invención
proporciona una vacuna contra la diarrea compuesta por la célula de
la invención y un portador o diluyente farmacológicamente aceptable.
Dado que esta célula elimina las limitaciones anteriores sobre la
expresión celular de antígenos CS, la invención ofrece, por primera
vez, una vacuna contra la diarrea que se compone de células
bacterianas que, conjuntamente, expresan todos los CFA/I, CS1, CS2,
CS3, CS4, CS5 y CS6, teniendo en cuenta que la vacuna incluye menos
de 5 cepas bacterianas. De forma adicional, la invención
proporciona un método para vacunar a mamíferos contra la diarrea
que supone la administración al mamífero de la célula o vacuna de la
invención.
- Ilustración 1A
- Estructura del operón CS4.
- Ilustración 1B
- Mapa del plásmido pACYC184.
- Ilustración 1C
- Mapa del plásmido pACYC-csaA.
- Ilustración 1D
- Mapa del plásmido pACYC-CS4.
- Ilustración 2A
- Análisis SDS-PAGE de la expresión de antígenos CS en las cepas WS-2252A, ACAM2006, ACAM2006-pCS4 y K-pCS4. La coloración se realizó con Simply Blue Safe Stain (Invitrogen).
- Ilustración 2B
- Análisis SDS-PAGE de la expresión de antígenos CS en las cepas WS-2252A, ACAM2006, ACAM2006-pCS4 y K-pCS4, con la utilización de Western Blotting.
- Ilustración 2C
- Análisis SDS-PAGE del efecto de las sales de bilis en la expresión de antígenos CS en las cepas ACAM2006, ACAM2009 y ACAM2006-pCS4. La coloración se realizó con Simply Blue Safe Stain (Invitrogen).
- Ilustración 2C
- Análisis SDS-PAGE del efecto de las sales de bilis en la expresión de antígenos CS en las cepas ACAM2006, ACAM2009 y ACAM2006-pCS4 con la utilización de Western Blotting.
- Ilustración 2E
- Análisis SDS-PAGE de la expresión de antígenos CS en ausencia de sales de bilis en la cepa ACAM2006-pCS4 transformada con pGEM-rns. La coloración se realizó con Simply Blue Safe Stain (Invitrogen).
- Ilustración 3A
- Fases 1 a 5 de la construcción de pJCB12-ompC-CS4-ompC y características de los cebadores utilizados.
- Ilustración 3B
- Características de los cebadores utilizados en la construcción de pJCB12-ompC-CS4-ompC. Los cebadores directos se escriben de 5' a 3' en negrita. Los cebadores inversos se escriben de 3' a 5' en letra normal. Los sitios de restricción aparecen resaltados con recuadros. Los nucleótidos adicionales que introducen una secuencia complementaria para la PCR de extensión por solapamiento (Overlap Extension PCR) aparecen subrayados.
- Ilustración 4
- Análisis SDS-PAGE de la expresión de antígenos CS en las cepas ACAM2006 y ACAM2006-CS4 que muestran los efectos de las sales de bilis.
- \quad
- (A) Coloración con Simply Blue Safe Stain (Invitrogen)
- \quad
- (B) Western Blot
- Ilustración 5A
- Estructura del operón CS1.
- Ilustración 5B
- Mapa del plásmido de pACYC-CS1.
- Ilustración 6
- Análisis SDS-PAGE de la expresión de antígenos CS en las cepas PTL003, ACAM2007 y ACAM2007-pCS1 con la utilización de Western Blotting.
- Ilustración 7A
- Estructura del operón CS5.
- Ilustración 7B
- Construcción del plásmido pACYC-Xmal.
- Ilustración 7C
- Estructura del plásmido pACYC-CS5.
- Ilustración 8A
- Análisis SDS-PAGE de la expresión de antígenos CS en presencia de sales de bilis en las cepas ACAM2009 y ACAM2009-pCS5 con utilización de Western Blotting.
- Ilustración 8C
- Análisis SDS-PAGE del efecto de las sales de bilis en la expresión de antígenos CS en las cepas ACAM2006, ACAM2009 y ACAM2009-pCS5 con la utilización de Western Blotting.
- Ilustración 8
- Análisis SDS-PAGE de la expresión de antígenos CS en las cepas ACAM2009, PTL003 y PTL003-pCS4. La coloración se realizó con Simply Blue Safe Stain (Invitrogen).
- Ilustración 10
- Análisis SDS-PAGE de la expresión del factor CFA/I y de antígenos CS en las cepas WS2252A, ACAM2010 y ACAM2010-pCS4:
- \quad
- (A) Coloración con Simply Blue Safe Stain (Invitrogen).
- \quad
- (B) Western Blot.
- Ilustración 11
- Mapa del plásmido (vector suicida) pDM4. u = secuencia desconocida, longitud desconocida.
- Ilustración 12
- Mapa del plásmido (vector suicida) pJCB 12.
- Ilustración 13
- Diagrama del método utilizado para crear un constructo de deleción de genes específico mediante la técnica Overlap Extension PCR. Paso 1 = Amplificación por PCR de dos fragmentos de ADN. Paso 2 = Overlap Extension PCR utilizando productos de ADN procedentes de la reacción 1 y 2 del paso 1 y amplificación del producto de la técnica Overlap PCR. R y S hacen referencia a los sitios de restricción de las enzimas.
- Ilustración 13
- Diagrama del método utilizado para demostrar la correcta integración del vector suicida en el locus objetivo por PCR de enlace.
ID SEC N.º 1 es la secuencia de nucleótidos que
codifica el gen cooA del operón CS1 según el número de registro
M58550 del GenBank.
ID SEC N.º 2 es la secuencia de nucleótidos que
codifica el gen cooB del operón CS1 según el número de registro
X62495 del GenBank.
ID SEC N.º 3 es la secuencia de nucleótidos que
codifica los genes cooC y cooD del operón CS1 según el número de
registro X76908 del GenBank.
ID SEC N.º 4 es la secuencia de nucleótidos que
codifica el gen cfaD según el número de registro M55609 del
GenBank.
ID SEC N.º 5 es la secuencia de nucleótidos que
codifica los genes cotB, cotA, cotC y cotD del operón CS2 según el
número de registro Z47800 del GenBank.
ID SEC N.º 6 es la secuencia de nucleótidos que
codifica el gen ms según el número de registro J04166 del
GenBank.
ID SEC N.º 7 es la secuencia de nucleótidos del
operón CS3 según el número de registro X16944 del GenBank.
ID SEC N.º 8 es la secuencia de nucleótidos que
codifica los genes csaA, csaB, csaC y IS1 del operón CS4 según el
número de registro AF296132 del GenBank.
ID SEC N.º 9 es la secuencia de nucleótidos que
codifica los genes csfA, csfB, csfC, cfsE, csfF y csfD del operón
CSS según el número de registro AJ224079 del GenBank.
ID SEC N.º 10 es la secuencia de nucleótidos que
codifica el gen csvR según el número de registro X60106 del
GenBank.
ID SEC N.º 11 es la secuencia de nucleótidos que
codifica los genes cssA, cssB y cssD del operón CS6 según el número
de registro U04844 del GenBank.
La célula de la invención puede crearse a partir
de cualquier célula bacteriana que sea capaz de expresar un
antígeno CS de ETEC en su superficie. En general, la célula se crea
a partir de una bacteria que infecta al huésped mamífero por vía
oral. La célula puede crearse a partir de o proceder de una bacteria
que invada y crezca en células eucarióticas y/o colonice cualquier
superficie mucosa. En general, la célula es
gram-negativa, pero en algunas representaciones se
pueden utilizar bacterias gram-positivas. Por lo
general, la bacteria es un patógeno.
La célula bacteriana utilizada puede ser del
género Escherichia, Salmonella, Shigella o
Vibrio. Preferentemente, la célula de la invención será una
célula de E. coli. Esta célula puede crearse a partir de una
cepa enterotoxigénica o no enterotoxigénica de E. coli que,
por sí misma, no expresa ningún antígeno CS de ETEC.
Si es posible, la célula actual se crea a partir
de o desciende de una cepa ETEC que, de forma endógena, expresa un
antígeno CS de ETEC, por ejemplo el CS1, CS2, CS3, CS4, CSS o CS6.
La célula actual puede, por ejemplo, crearse a partir de una cepa
de ETEC de referencia aislada. De forma alternativa, la célula
actual podría crearse a partir de una cepa de ETEC que, a su vez,
haya derivado de una cepa de ETEC de referencia o nativa. Por
ejemplo, la célula actual puede descender de una cepa en la que se
haya producido una mutación o deleción de uno o varios genes de una
toxina o que presente otra mutación atenuante o que exprese un
antígeno heterólogo, tal y como se describe a continuación. Una
cepa de ETEC de referencia puede aislarse de una muestra clínica
humana utilizando técnicas estándar. Un ejemplo de una cepa de ETEC
estándar es la H10407, depositada en la ATCC con el número 35401
del catálogo.
Una célula de la invención puede crearse, por
ejemplo, a partir de una de las cepas de ETEC ACM2005, ACM2002,
ACM2003, ACM2004, ACAM2007, ACAM2008, ACAM 2009 o ACAM2012
reflejadas en las tablas 1 y 2. Cada una de las cepas ha sido
depositada por Acambis Research Limited of Peterhouse Technology
Park, 100 Fulbourn Road, Cambridge, CB1 9PT (Reino Unido) en la
Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), CAMR, Salisbury,
Wiltshire SP4 0JG (Reino Unido), de conformidad con el Tratado de
Budapest. Los números de registro de las cepas depositadas se
indican en las tablas. Los depósitos 01090302 a 01090306 se llevaron
a cabo el 3 de septiembre de 2001. Los depósitos 02082964 a
02082968 se llevaron a cabo el 29 de septiembre de 2002. La tabla 1
ofrece más información sobre las características de la cepa.
PTL003 (también denominado ACM2005, n.º de
depósito 01090302) (Ref. 4, 31) se obtuvo de la cepa de ETEC
E1392/75-2A (CS1/CS3, ST menos, LT menos) por
deleción atenuante dirigida de otros tres genes (aroC, ompC y ompF)
(Tabla 1). La PTL003 ya ha sido probada en dos ensayos clínicos y ha
demostrado ser segura e inmunogénica.
La descripción de las cepas con los n.º de
depósito 01090303 y 01090306 está contemplada en la Solicitud de
Patente inglesa n.º 0121998.9. Tanto estas cepas como las cepas con
n.º de depósito 02082964 a 02082968 aparecen descritas en la
solicitud de patente internacional que reclama la prioridad con
respecto a la solicitud de patente inglesa n.º 0121998.9,
presentada por Acambis Research Limited el mismo día que la presente
solicitud internacional. El contenido de dicha solicitud queda
incorporado a este documento por referencia. Cada una de estas
cepas ha pasado a ser toxina negativa por la eliminación específica
de los genes de las toxinas conocidas.
Según la invención, una célula puede expresar
cualquier combinación de antígenos CS de ETEC, siempre que la
célula exprese tres o más antígenos CS de ETEC. Se ha identificado
un gran número de antígenos CS, considerando que los más
importantes son el CS1, CS2, CS3 (los componentes del CFA/II) y el
CS4, CSS y CS6 (los componentes del CFA/IV). Otros antígenos
adicionales incluyen el CS17, CS7, CS9, CS14, CS12, PCFO159,
PCFO166. No obstante, el CFA/I (n.º de registro M55661 del GenBank)
no es un antígeno CS para los fines del presente documento.
Preferentemente, una célula de la invención
expresa al menos un antígeno CS de entre los CS1, CS2, CS3, CS4,
CS5, CS6 de ETEC. Así, en una representación la célula actual puede
expresar tres o más antígenos CS de entre los antígenos CS1, CS2,
CS3, CS4, CSS y CS6. Una célula de estas características puede
expresar tres, cuatro, cinco o seis de los antígenos CS enumerados.
Una célula puede expresar los antígenos CS en cualquier
combinación. La célula de la invención debería expresar
preferentemente una de las siguientes combinaciones de
antígenos:
CS1,CS2 y CS3
CS4, CS5 y CS6
CS4, CS1 y CS3
CS1, CS5 y CS6
De esta manera, una célula de la invención puede
incluir una mezcla de la proteína CFA, por ejemplo, una mezcla de
las proteínas CFA/II y CFA/IV.
De conformidad con la invención, las células
bacterianas incluyen las cepas ACAM
2006-pCS4(CS4, CS5,CS6),
ACAM2006-CS4(CS4, CS5, CS6),
ACAM2012-pCS4 (CS4, CS5, CS6),
ACAM2012-CS4 (CS4, CS5, CS6), ACAM
2007-pCS1 (CS1, CS2, CS3), ACAM
2009-pCS5 (CS4, CS5, CS6),
PTL003-pCS4 (CS1, CS3, CS4) y
ACAM2006-pCS1 (CS1, CS5, CS6).
La cepa ACAM2012-CS4 fue
depositada como ACAM2013 el 29 de agosto de 2002 por el Acambis
Research Limited of Peterhouse Technology Park, 100 Fulbourn Road,
Cambridge, CB1 9PT (Reino Unido) en el Catálogo Europeo de Cultivos
Celulares (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG (Reino
Unido), de conformidad con el Tratado de Budapest. La cepa obtuvo
el número de registro 02082969 (Tabla 2).
En general, de conformidad con la invención, una
célula expresa un antígeno CS sobre su superficie, normalmente
construido en forma de fimbrias en o pilis. Una célula candidata
puede ser sometida a ensayos para comprobar la expresión de un
determinado antígeno CS de ETEC mediante métodos conocidos en el
sector y descritos en los Ejemplos contemplados en este documento.
Por ejemplo, en una representación se calienta y centrifuga una
suspensión de células candidatas para extraer los antígenos CS. A
continuación, se aísla el sobrenadante, se somete a electroforesis
en gel y se analiza por el método Western Blotting utilizando
anticuerpos específicos de ese antígeno o el teñido directo de la
proteína. Normalmente, para fines de comparación se incluye una
cepa de la que se sabe que expresa un antígeno determinado como
control positivo. También es posible incluir un control negativo.
Los métodos adecuados son los métodos conocidos por expertos del
sector. Preferentemente, el nivel de expresión de un antígeno CS en
una célula de la invención debe ser suficiente para inducir una
respuesta inmunológica en un sujeto huésped al que se le ha
administrado la célula, por ejemplo como componente de un compuesto
inmunogénico como puede ser una vacuna.
Normalmente, en una cepa ETEC de referencia, los
antígenos CS se expresan en forma de operones de genes. Por lo
general, un operón incluye genes de una o dos proteínas
estructurales, una chaperona y una proteína de transporte (usher).
Las chaperonas y las proteínas usher suelen facilitar el transporte
de la proteína estructural a la superficie de la bacteria para su
construcción en forma de fimbrias. Un operón puede estar ubicado en
el cromosoma bacteriano (como en el caso de los antígenos CS4 y CS2
de algunas cepas) o en un plásmido con bajo número de copias (como
en el caso de los antígenos CS1, CS3, CS5 y CS6). Además, cada
operón está asociado a un gen regulador, cuyo producto controla la
expresión de los genes del operón. No obstante, este gen regulado
puede estar situado a cierta distancia del propio operón.
El operón CS1 (27) se describe en la Ilustración
5A y está compuesto por cuatro genes cooB, cooA, cooC y cooD
(números M 58550, X62495 y X76908 del GenBank). La principal
proteína pilina la codifica el gen cooA, al mismo tiempo que los
genes cooC y cooD codifican las funciones de transporte. El gen
cooB es necesario para el ensamblaje. La expresión de los
genes que componen el operón está regulada por otro gen, el cfaD
(M55609 del GenBank).
El operón CS2 (17) está compuesto por cuatro
genes: cotA, cotB, cotC y cotD (Z 47800 del GenBank), teniendo en
cuenta que el gen cotA codifica la principal proteína pilina. Las
funciones de transporte las codifican los genes cotC y cotD. La
expresión de estos genes está regulada por otro gen independiente,
el rns (J04166 del GenBank).
La secuencia del operón CS3 (20) puede
encontrarse en el n.º de registro X16944 del GenBank. El operón
incluye el gen cstA, que codifica una proteína chaperona, el gen
cstB que codifica una proteína con una función de transporte
(usher) y el gen cstH que codifica una proteína
estructural.
La estructura del operón CS4, compuesta por
cuatro genes csaA, csaB, csaC, csaE (n.º
AF296132 del GenBank) se muestra en la Ilustración 1A. El gen csaA
codifica la chaperona, el gen csaB codifica una subunidad
protéica mayor, el gen csaC codifica una proteína de transporte y el
gen csaE codifica una proteína fimbrina. La expresión de los
genes CS4 está regulada por el gen cfaD (n.º de registro M55609 del
GenBank).
El operón CS5 (15)(n.º de registro AJ 224079 del
GenBank) está compuesto por seis genes: csfA, csfB,
csfC, csfE, csfF y csfD. El gen
csfA codifica una proteína estructural principal, el gen
csfC codifica una proteína de transporte y el gen csfD
una proteína estructural menor. La Ilustración 7A muestra una
representación del operón. La regulación de los genes del operón CS5
depende de la presencia de las sales de bilis. El gen implicado
puede ser el csvR (n.º de registro X60106 del GenBank).
La secuencia del operón CS6 (33, 35) está
disponible bajo el n.º de registro U04844 del GenBank. El operón
incluye los genes cssA y cssB que codifican las proteínas
estructurales y los genes cssC y cssD que codifican
las proteínas de transporte.
Las secuencias de los operones y genes
anteriormente mencionados, especificadas por sus números de registro
del GenBank, también se presentan en la lista de secuencias que
aparece a continuación, tal y como se describe en la sección
"Breve descripción de las secuencias".
Normalmente, una célula de la invención expresa
suficientes genes, incluidos los genes estructurales, de transporte
y reguladores, como para hacer posible la expresión de un antígeno
CS de ETEC sobre la superficie bacteriana. Por lo general, el
antígeno se construye sobre la superficie en forma de fimbrias o
pilis. Así, para un determinado antígeno CS, la célula actual
expresa uno o varios genes estructurales y, si es necesario, uno o
varios genes cuyos productos ayudarán a transportar correctamente y
a construir la proteína estructural sobre la superficie
bacteriana.
Cualquiera de los genes a los que se ha hecho
referencia anteriormente (a saber: genes estructurales, de
transporte o reguladores) puede resultar útil para esta invención.
En una representación, una proteína estructural, de transporte o
reguladora antigénica expresada por una célula de la invención puede
ser codificada por:
- (i)
- una molécula de ADN que contenga una secuencia nucleótida de un gen especificado anteriormente por su número de registro del GenBank o incluido en la lista de secuencias de este documento;
- (ii)
- una molécula de ADN que hibrida hasta convertirse en el complemento de la secuencia nucleótida mencionada en el punto (a); o
- (iii)
- una molécula de ADN que codifica la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de ADN indicada en los puntos (a) o (b), pero que es una forma deteriorada de la molécula de ADN indicada en los puntos (a) o (b).
Un homólogo de la secuencia polinucleótida
indicada en el punto (a) puede utilizarse en la invención.
Normalmente, un homólogo cuenta con al menos el 40% de la identidad
secuencial de la secuencia especificada, preferentemente al menos
un 60% u 80% y de forma ideal con un al menos el 90%, 95% o 99% de
la identidad secuencial. Dicha identidad secuencial puede existir
sobre una región de al menos 15 nucleótidos contiguos,
preferentemente al menos 30, o al menos 40, 60 u 100 o más
nucleótidos contiguos.
Los métodos para la medición de la homología
polinucleótida son conocidos en el sector. Por ejemplo, el paquete
de software del UWGCG, con el programa BESTFIT, puede utilizarse
para calcular la homología, por ejemplo sobre su configuración por
defecto (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12,
pág. 387-395). Los algoritmos PILEUP y BLAST
también pueden utilizarse para calcular la homología o secuencias de
alineación (normalmente sobre su configuración por defecto), por
ejemplo tal y como se describe en Altschul (1993) J Mol Evol 36:
290-300 o Altschul et al (1990) J Mol Biol
215: 403-10.
Normalmente un homólogo hibrida con la secuencia
especificada correspondiente a un nivel considerablemente superior
al fondo. El nivel de señal generado por la interacción entre el
homólogo y la secuencia especificada es normalmente de al menos 10
veces, preferentemente al menos 100 veces, más intenso que la
hibridación de fondo. La intensidad de la interacción puede
medirse, por ejemplo, mediante el radio marcaje de la sonda, p. ej.
con 32P. La hibridación selectiva se logra utilizando condiciones de
rigurosidad media a alta, por ejemplo, 0,03 m de cloruro sódico y
0,003 m de citrato de sodio a una temperatura de aprox. entre 50ºC y
60ºC.
El homólogo puede diferir de la secuencia
especificada correspondiente en al menos 1, 2, 5, 10 o más
sustituciones, deleciones o inserciones en una región de al menos 30
nucleótidos contiguos del homólogo (o, por ejemplo, al menos 40, 60
o 100 o más nucleótidos contiguos). De esta manera, el homólogo
puede diferir de la secuencia especificada correspondiente en al
menos 1, 2, 5, 10 o más sustituciones, deleciones o inserciones.
Un gen estructural homólogo puede comprobarse
expresando un gen en un huésped adecuado y verificando la
reactividad cruzada con anticuerpos específicos del antígeno en
cuestión. Un gen regulador o de transporte homólogo puede someterse
a ensayos para comprobar su capacidad de complementar la actividad
del gen regulador o de transporte endógeno en una célula
bacteriana.
Un gen de transporte puede ser endógeno del gen o
genes estructurales con el que funciona. En este sentido, la célula
actual puede incluir tanto el gen o genes estructurales y uno o más
genes de transporte en un determinado operón CS. En una
representación ideal, una célula de la invención incluye un operón
completo para un determinado antígeno CS.
En otra representación, una célula de la
invención puede contener algo menos del operón entero para un
determinado antígeno CS. Por ejemplo, una célula de la invención
puede contener el gen o genes estructurales para un determinado
antígeno CS, sin contener uno o más de los genes de transporte
endógenos. En dicha célula, uno o más genes de transporte
heterólogos funcionan para transportar la proteína estructural a la
superficie de la célula. Así, por ejemplo, los productos del gen
estructural CS1 pueden ser transportados a la superficie por la
acción de los genes de transporte CS2 (cot C y cot D)
y viceversa (17). De esta manera, una célula según la invención
puede contener un operón incompleto para un determinado antígeno CS,
siempre que el antígeno se exprese sobre la superficie bacteriana.
Por ejemplo, la célula puede expresar el gen o genes estructurales
de un operón en concreto, acompañados por uno o más genes de
transporte heterólogos, pero complementarios.
Por lo general, es preferible que la célula
actual exprese un antígeno CS de forma estable; una célula que
muestre una expresión antígena estable es una mejor candidata para
una vacuna contra la ETEC. Tal y como se describe más arriba, en
las cepas nativas de ETEC normalmente los operones están situados en
el cromosoma bacteriano y los operones CS1, CS3, CS5 y CS6 son
transportados habitualmente en plásmidos con bajo número de copias.
De esta manera, en ausencia de mecanismos de selección específicos,
por lo general los genes CS endógenos se mantienen y expresan de
forma estable a lo largo de muchas generaciones. Por lo general, la
célula actual contiene uno o más secuencias de polinucleótidos
heterólogos que codifican uno o más antígenos CS. Dichas secuencias
de polinucleótidos heterólogos pueden estar presentes en una célula
o plásmido o puede estar ubicados, como resultado de una inserción,
en el cromosoma bacteriano.
En los casos en los que una secuencia de
polinucleótidos heterólogos se transporta y se expresa desde un
plásmido, éste se mantiene preferentemente estable. El mantenimiento
estable también es deseable para los plásmidos naturales que
contienen antígenos CS de ETEC. Esto puede resultar importante
cuando, por ejemplo, se manipula un plásmido nativo con fines de
atenuación, tal y como se describe más abajo. Los métodos para la
mejora de la estabilidad plasmídica se exponen más abajo.
Lo ideal es que un polinucleótido heterólogo que
codifique un antígeno CS esté situado en el cromosoma bacteriano,
por ejemplo mediante un proceso de recombinación. Por lo general,
una localización cromosómica hace posible una expresión más estable
que una localización plasmídica y, asimismo, tendría como resultado
la presencia de un operón heterólogo con un número de copias similar
al que se produciría en las cepas de referencia. Cuando la célula
se ha obtenido por introducción de un polinucleótido heterólogo que
codifica un antígeno CS en una cepa ETEC que expresa de forma
endógena un antígeno CS, la ubicación cromosómica también ayuda a
evitar la "sobrecarga" con una proteína antigénica adicional,
así como a minimizar la interferencia con la regulación de la
expresión de las proteínas antigénicas endógenas.
En una cepa de ETEC de referencia la regulación
de la expresión de un operón CS a menudo la lleva a cabo un gen que
se encuentra a cierta distancia del gen o genes estructurales. En la
célula actual, la expresión de un antígeno CS heterólogo puede
regularse mediante un gen regulador natural de la célula, un
homólogo del mismo o por un gen regulador heterólogo. De esta
manera, cuando la célula actual se obtiene por la introducción de
un polinucleótido heterólogo en una cepa E. coli que expresa
de forma endógena un antígeno CS de ETEC, la expresión de la
secuencia heteróloga puede regularse mediante un gen regulador
asociado al operón CS endógeno. Sin querer ir más allá de la
teoría, nuestra suposición es que las proteínas reguladoras
específicas del huésped son capaces de interactuar con los genes que
han sido introducidos de forma artificial y modificados en su modo
de regulación. En este sentido, cuando se introducen genes CS4 en
una cepa E. coli que expresa los antígenos CS5/CS6 y no
contiene el gen regulador CS4 natural cfaD, la expresión de los
genes CS4 puede regularse mediante el gen regulador CS5 endógeno
que depende de la presencia de sales de bilis. No obstante, si se
introduce un regulador rns (un homólogo del gen cfaD)
en esta célula, la expresión del gen CS4 pasa a ser independiente
de la presencia de sales de bilis. A la inversa, cuando se
introducen genes CS5 en una cepa CS4/CS5 que no contiene el gen
regulador natural, la expresión de los genes CS5 puede regularse
mediante el gen regulador CS4 cfaD.
En una representación podría ser preferible que
la expresión del antígeno CS en la célula actual no dependiera de
la presencia de las sales de bilis. Por ejemplo, esto podría ser
beneficioso si la célula de la invención debe ser "precargada"
con antígenos CS, como preparación para su uso como vacuna, dado que
el medio libre de producto animal puede utilizarse para inducir la
expresión del antígeno CS.
Una célula, tal y como se define en la invención,
no se ha aislado en la naturaleza. En consecuencia, la célula
actual se puede obtener generalmente por la introducción de un
polinucleótido (p. ej. ADN) que codifica un antígeno CS de ETEC
heterólogo en una célula bacteriana huésped adecuada.
Las cepas huésped adecuadas (o las cepas
iniciadoras) a partir de las cuales se puede crear la célula actual
han sido descritas anteriormente. Preferentemente, la cepa huésped
es una cepa de ETEC que expresa de forma endógena un antígeno CS de
ETEC. En concreto, la cepa huésped puede expresar el CFA/II
(incluidos los CS1/CS3 y CS2/CS3) o el CFA/IV (incluidos los
CS4/CS6 o CS5/CS6). En una representación, la cepa huésped se elige
de entre las cepas depositadas ACM2005, ACM2003, ACM2002, ACM2004,
ACAM2007, ACAM2008, ACAM2009 o ACAM2012 que aparecen en las tablas
1 y 2 o descendientes de estas células. Un descendiente es cualquier
célula derivada de una célula depositada. Un descendiente puede
contener una célula con una o más mutaciones atenuantes adicionales
como las descritas en este documento. Un descendiente puede contener
una célula diseñada para expresar un antígeno heterólogo, tal y
como se describe en el presente texto.
En general, el polinucleótido introducido en la
cepa huésped contiene uno o más genes estructurales para un
antígeno CS. Preferentemente, el polinucleótido contiene el gen o
genes estructurales de al menos un antígeno seleccionado de entre
los antígenos CS1, CS2, CS3, CS4, CS5 y CS6 de ETEC. Los números de
referencia del GenBank correspondientes a estas secuencias
genéticas aparecen indicados en la tabla 5. Las secuencias
correspondientes a los genes introducidos con números de registro
aparecen indicados en la lista de secuencias de este documento.
El proceso de creación de la célula actual
también puede incluir el paso de introducir en una célula un
polinucleótido que contiene uno o más genes de transporte
(normalmente, chaperonas o genes usher). En una representación
ideal, el método contemplaría la introducción en una célula adecuada
de un polinucleótido que contenga uno o más genes estructurales
para un antígeno CS de ETEC y uno o más genes de transporte
complementarios. De forma alternativa, los genes estructurales y
los genes de transporte podrían estar presentes en polinucleótidos
independientes. Preferentemente, se utiliza un método que contemple
la introducción de un polinucleótido que contenga un operón CS de
ETEC heterólogo. En otra representación, los genes de transporte,
endógenos de una cepa huésped ETEC, podrían actuar sobre un
antígeno, incluidos los antígenos heterólogos, dentro la célula
ayudando así en su progresión hacia la superficie celular.
Tal y como ya se ha explicado, la regulación de
la expresión de un antígeno CS de ETEC heterólogo en la célula
actual puede ser transportado fuera por un gen regulador endógeno de
o al menos presente en la cepa huésped. De forma alternativa o
adicional al método de derivación, la célula actual puede incluir un
paso que se caracteriza por la introducción en una célula de un
polinucleótido que contenga un gen regulador adecuado. Cuando se
introduce un gen regulador de esta manera éste puede estar presente
en el mismo polinucleótido o en un polinucleótido diferente al gen
o genes estructurales y/o a cualquier gen de transporte que esté
siendo introducido. Normalmente, el gen regulador será aquel que
regule la expresión del antígeno CS ETEC en cuestión en una cepa
ETEC natural o un homólogo del mismo. Por lo tanto, en una
representación, el actual proceso contempla la introducción en una
célula adecuada de un polinucleótido que contiene un operón CS de
ETEC heterólogo junto con su gen regulador natural.
Un polinucleótido que vaya a ser introducido en
una célula de conformidad con esta invención podrá adoptar
cualquier forma adecuada. Normalmente, el polinucleótido es un
plásmido vector. En general, el polinucleótido lleva un marcador
seleccionable.
El polinucleótido puede contener uno o más
elementos de control de la expresión, tales como una secuencia
promotora, potenciadora o terminadora de la transcripción, unidas de
forma operativa a un gen o genes que deben ser expresados. Por
ejemplo, se puede utilizar un vector de expresión plasmídica
adecuado. Los vectores adecuados son conocidos en el sector.
Preferentemente, un polinucleótido introducido en
una célula de conformidad con la invención debe ser insertado en el
cromosoma de la célula bacteriana, por ejemplo, por recombinación
homóloga. Los métodos que inducen la inserción cromosómica son
conocidos en el sector. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser
introducido en un vector suicida adecuado. Se puede utilizar, por
ejemplo, el vector suicida pJCB12 descrito en este documento.
Los métodos de introducción de ADN extraño en
células procarióticas son conocidos en el sector. Entre los métodos
apropiados se encuentran, por ejemplo, la conjugación y la
electroporación. Las colonias de transformantes se pueden someter a
ensayos y seleccionar para la incorporación del ácido nucléico
heterólogo utilizando procedimientos de muestreo y selección
estándar. Los transformantes pueden ser sometidos a ensayos de
expresión superficial de un determinado antígeno CS de ETEC
utilizando los procedimientos de muestreo descritos
anteriormente.
En una representación ideal, el presente método
incluye:
- (i)
- la introducción de un polinucleótido que codifica el antígeno CS4 ETEC en una célula CS5/CS6 ETEC; o
- (ii)
- la introducción de un polinucleótido que codifica el antígeno CS1 de ETEC en una célula CS2/CS3 ETEC; o
- (iii)
- la introducción de un polinucleótido que codifica el antígeno CS5 de ETEC en una célula CS4/CS6 ETEC; o
- (iv)
- la introducción de un polinucleótido que codifica el antígeno CS4 de ETEC en una célula CS1/CS3 ETEC.
Por lo general, es preferible que una célula de
la invención esté reducida con respecto a la célula ETEC de
referencia. De esta manera, la célula actual presenta normalmente
una virulencia reducida, de tal manera que no provoca la enfermedad
asociada, por ejemplo la diarrea, pero sí es capaz de estimular una
respuesta inmunológica. Esto es especialmente así cuando la célula
se debe utilizar en una vacuna para combatir enfermedades asociadas
a la ETEC como la diarrea. El uso de una célula atenuada en dicha
vacuna tiene como resultado una menor probabilidad de que el sujeto
vacunado sufra efectos secundarios, tales como los síntomas de la
diarrea.
Una célula de la invención puede atenuarse de
diferentes maneras, generalmente a través de algún tipo de
mutación. Por ejemplo, la toxicidad puede reducirse utilizando una
célula que no exprese las toxinas asociadas a la ETEC o que no
exprese estas toxinas de una forma funcional o tóxica. De forma
alternativa, o adicional, la atenuación puede surgir mediante la
mutación de un gen bacteriano más amplio, lo que normalmente
provocaría su inactivación o delación (p. ej. por sustitución).
La colonización del intestino delgado de un
huésped por parte de las células ETEC viene acompañado de la
secreción de enterotoxinas. Los dos tipos de enterotoxinas
identificados en las cepas de ETEC son la toxina termolábil (LT) y
la toxina termoestable (ST). La LT presenta una estructura altamente
homóloga a la toxina del cólera, una proteína con múltiples
subunidades de la forma AB5. La subunidad A es el componente activo
en la toxina, entre cuyas funciones se encuentra aumentar la
actividad de la adelinato-ciclasa. Ésta es
transportada a las células huésped por las subunidades B, que se
unen a los gangliósidos de la superficie celular. La ST es un
pequeño (19 aminoácidos) polipéptido no inmunogénico que presenta
una actividad de estimulación de la
guanilato-ciclasa. Además, recientemente se ha
demostrado que una gran producción de las cepas de ETEC también
EAST1, una toxina termoestable, similar en tamaño y forma de actuar
a la ST, pero diferente en su secuencia, que fue identificada
originariamente en cepas E. coli enteroagregativas.
Así, en una representación, una célula de la
invención normalmente no expresa toxinas ETEC funcionales, tales
como LT, ST y EAST1. Dicha célula podría denominarse, por ejemplo,
como una cepa de toxina negativa. Los números de registro de estas
toxinas aparecen indicados en la tabla 5.
La atenuación puede surgir porque la célula ha
sido derivada o creada a partir de una célula bacteriana no ETEC
que no expresa natural o endógenamente una o mas toxinas de ETEC. De
forma alternativa, la célula puede derivarse de una célula ETEC que
está atenuada en lo que respecta a las toxinas de ETEC. Dicha cepa
de ETEC puede surgir como resultado de una mutación espontánea, por
ejemplo, en caso de deleción. De forma alternativa, o adicional, es
posible crear una cepa de toxina negativa aplicando técnicas de
ingeniería genética o de biología molecular.
Los aislados clínicos obtenidos en un estudio
epidemiológico a largo plazo llevado a cabo por científicos en las
instalaciones de US NAMRU3 en El Cairo aparecen indicados en la
tabla 3. Algunos de estos aislados son toxinas negativas con
respecto a al menos una de las toxinas mencionadas anteriormente.
Algunos de estos aislados han sido utilizados para obtener otras
cepas atenuadas, tal y como se explica a continuación.
Un ejemplo de una cepa de toxina negativa
espontánea es la E1392/75-2A (CFA/II, ST menos, LT
menos) (10) (Tabla 1). Los ejemplos de cepas de ETEC que han sido
manipuladas para garantizar la eliminación específica de todos los
genes de toxinas conocidas son aquellas con los números de registro
01090304, 1090305, 01090306 (derivadas de las cepas H, E, y J
incluidas en la tabla 3 respectivamente) y 02082964, 02082965,
02082966 y 02082968, tal y como han sido descritas anteriormente y
aparecen indicadas en las tablas 1 y 2. La cepa depositada 01090302
también es una cepa de toxina negativa.
Una célula bacteriana de la invención puede
atenuarse debido a la mutación de otro gen. La atenuación puede
producirse, por ejemplo, mediante la deleción o inactivación de uno
o más de los siguientes genes: aroA, aroC, aroD, aroE, pur,
htrA, ompC, ompF, ompfí, cya, crp, phoP, phoQ, surA, rfaY, dksA,
hupA, invE y dpB. Las combinaciones preferentes de genes
incluyen las siguientes:
- -
- al menos un gen aro (p. ej. aroA, aroC, aroD o aroE) y al menos un gen omp (p. ej. ompC, ompF o ompR);
- -
- al menos un gen aro (p. ej. aroA, aroC, aroD o aroE) y el gen htrA;
- -
- aroC, ompF y ompC.
Por ejemplo, las cepas PTL002 y PTL003 (n.º de
registro 01090302) fueron derivadas de la cepa
E1392/75-2A mencionada anteriormente mediante
mutación de los genes aroC/ompR y aroC/ompC/ompF,
respectivamente.
Además, generalmente lo ideal sería eliminar
cualquier gen resistente a antibióticos de la célula bacteriana de
la invención antes de su uso en la vacuna. Las bacterias aisladas de
la cepa de referencia contienen a menudo genes resistentes a los
antibióticos, tales como genes resistentes a la ampilicina,
estreptomicina, sulfametoxazol, kanamicina, trimtoprima y
tetraciclina. Estos genes pueden eliminarse utilizando un vector
suicida y los métodos descritos en este documento u otros métodos
conocidos por expertos del sector.
Tal y como se ha indicado anteriormente, la
atenuación de la célula bacteriana actual puede surgir de una o
varias mutaciones del genoma bacteriano. Una o varias mutaciones que
impiden la expresión de una enterotoxina u otro gen generalmente
traen consigo la deleción o inactivación del gen. Por lo general, se
produce una eliminación total de la función del gen. Esto se puede
conseguir mediante la supresión total de la síntesis de cualquier
polipéptido del gen o realizando una mutación que resulte en la
síntesis de un polipéptido no funcional. Para suprimir la síntesis
de un polipéptido, ha de borrarse bien el gen entero o su extremo
5'. Los métodos de deleción o inserción dentro de la secuencia de
codificación de un gen pueden utilizarse para crear un gen que
sintetice únicamente polipéptidos no funcionales (p. ej.
polipéptidos que contengan únicamente la secuencia
N-terminal de la proteína de referencia). En el caso
del gen de una toxina, la mutación debería hacer que el producto de
la toxina fuera no tóxico.
Normalmente, las mutaciones son irreversibles. Se
trata de una mutación que básicamente no muestra reversión alguna
al gen de referencia, por ejemplo, cuando la bacteria se utiliza
como vacuna. Estas mutaciones incluyen inserciones y deleciones.
Las inserciones y deleciones deberían ser amplias, partiendo
normalmente de al menos 10 nucleótidos de longitud hasta la
longitud total del gen o la secuencia de codificación, por ejemplo
de 10 a 600 nucleótidos. Lo ideal es la eliminación de la secuencia
de codificación entera o del gen completo.
Normalmente, las mutaciones son dirigidas. Pueden
ser específicas o selectivas para el gen de la toxina o cualquier
otro gen. Por ejemplo, en el caso de la deleción o inactivación del
gen ST en una cepa CFA/I o CS5/CS6, la mutación debe ir dirigida de
forma específica al gen ST, sin borrar o desactivar el gen CFA/I,
el gen CS5 o el gen CS6 (unidos estrechamente).
Una mutación puede surgir por el uso de un vector
suicida. Concretamente se puede utilizar el vector suicida pJCB 12.
Este vector aparece descrito en la solicitud de patente inglesa n.º
0121998.9 y también en la reclamación de la solicitud de patente
internacional, que reclama la que reclama la prioridad con respecto
a la solicitud de patente inglesa, y presentada por Acambis Research
el mismo día que esta solicitud de patente internacional. El
contenido de dicha solicitud de patente internacional queda
incorporado al presente documento por referencia. El vector permite
una selección de objetivos específica y fiable y, normalmente, tiene
un tamaño inferior a 5 kb (por ejemplo de 2,5 a 5 kb o de 2,5 a 4
kb).
Una mutación atenuada puede introducirse
utilizando un vector suicida o aplicando otros métodos conocidos
por expertos del sector (26). Los métodos conocidos apropiados
incluyen la clonación de la secuencia de ADN del gen de referencia
en un vector, p. ej. un plásmido, y la inserción de una marcador
seleccionable en la secuencia de ADN clonada o la deleción de parte
de la secuencia de ADN, lo que supondría su inactivación. Un
deleción puede introducirse, por ejemplo, cortando la secuencia de
ADN mediante encimas de restricción que corta en dos puntos dentro
o justo fuera de la secuencia de codificación y liga los dos
extremos de la secuencia restante. De forma alternativa, y más
habitual hoy en día, se puede construir un alelo mutante en el que
las regiones flanqueantes de un gen objetivo se amplifican por
separado y se unen directamente en una reacción PCR por
solapamiento, con omisión de la secuencia objetivo interviniente
(31). Un plásmido que lleve una secuencia de ADN mutada puede
transformarse en una bacteria mediante técnicas conocidas, tales
como electroporación y conjugación. Posteriormente, y mediante un
método de selección adecuado, es posible identificar un mutante en
el que la secuencia de ADN desactivada ha sido recombinada en el
cromosoma de la bacteria y la secuencia de ADN de referencia ha
quedado inoperativa por recombinación homóloga.
En otra representación de la invención, la célula
actual expresa asimismo un antígeno que no expresaba la bacteria
nativa (un "antígeno heterólogo"), además del antígeno CS de
ETEC. Esto resulta especialmente útil cuando la célula ha de
utilizarse en una vacuna, dado que la presencia de antígenos
adicionales puede mejorar la respuesta inmunológica generada. En
caso de que la bacteria sea una bacteria de ETEC, el antígeno puede
proceder de otra cepa de ETEC, por lo que la vacuna ofrece
protección contra la otra cepa. Además, la bacteria ha podido ser
modificada mediante ingeniería para que exprese más de uno de estos
antígenos heterólogos, en cuyo caso los antígenos heterólogos puede
proceder de la misma o de diferentes cepas.
El antígeno heterólogo puede ser una proteína
completa, una parte de una proteína que contenga un determinante
antigénico (epitopo) o una proteína de fusión. Entre los antígenos
útiles se encuentran los componentes no tóxicos de la ETEC o los
mutantes no tóxicos de la toxina LT de E.coli (p. ej. la
subunidad B y mutantes de la subunidad A, cuyos números de
referencia aparecen indicados en la tabla 5), y proteínas de fusión
LT-ST (1, 7-9).
La secuencia de ADN que codifica un antígeno
heterólogo puede expresarse desde un promotor que está activo in
vivo. Un promotor puede ser un promotor fuerte, por ejemplo el
promotor tac, o un derivado del mismo. Los promotores que
han demostrado funcionar bien son el promotor nirB (6, 16),
el promotor htrA (16), el promotor pagC (13) y el
promotor ssaH (32). Para la expresión de los derivados de
las toxinas LT, CT o ST se pueden utilizar los promotores de
referencia.
Tal y como se ha indicado ya, lo ideal es que un
plásmido que expresa un antígeno heterólogo se mantenga estable en
la célula actual. Para evitar la pérdida de un plásmido que expresa
un antígeno heterólogo o de un plásmido natural, se puede añadir un
elemento al plásmido que mejora su estabilidad.
Existe una serie de sistemas
"toxina/antitoxina" determinantes de la estabilidad de los
plásmidos: por ejemplo, parDE (25) del plásmido RP4 (2), y
hok/sok (también conocido como parB del plásmido R1 o
pndAB del plásmido R483 (18,19)) que pueden utilizarse para
mejorar la estabilidad del plásmido. Estos sistemas codifican dos
funciones. En primer lugar, una entidad tóxica que podría matar las
células en las que se expresa, y que presenta una vida media
biológica larga, y, en segundo lugar, una entidad antitóxica que
evita esta aniquilación, pero que presenta una vida media biológica
corta. En el caso de que un plásmido que codifica estas funciones
sea segregado durante la división de la célula hija que no contiene
el plásmido, ésta agota sus reservas de antitoxina y muere debido a
la fracción más persistente de la toxina. De esta manera, sólo
aquellas células que continúen albergando el plásmido se mantienen
en la población creciente.
Otro sistema que puede ser utilizado para mejorar
la estabilidad de un plásmido de conformidad con la invención es un
sistema de resolución de multímeros. Los sistemas de resolución de
multímeros confieren estabilidad resolviendo los multímeros de los
plásmidos en copias plasmídicas únicas, disminuyendo así la
posibilidad de que se generen células hijas libres de plásmidos por
segregación aleatoria en la división celular. Se ha identificado
una serie de sistemas de recombinación específicos de sitio que
actúan para resolver los multímeros de los plásmidos en monómeros.
De conformidad con un sistema de este tipo, el plásmido que ha de
ser estabilizado contiene un sitio de reconocimiento para una
recombinasa específica de sitio y la célula huésped contiene una
secuencia de ADN que codifica una recombinasa específica de sitio.
La recombinasa actúa en el sitio de reconocimiento y, de este modo,
dirige la segregación adecuada del plásmido durante la división
celular. La recombinasa puede ser codificada en el plásmido que ha
de estabilizarse o en el cromosoma de la célula huésped.
Por lo general, la recombinasa es una resolvasa.
Entre los ejemplos de resolvasas que pueden ser utilizadas en la
invención se encuentra la recombinasa Cre del plásmido P1, la
proteína XerC (ArgR) de E.coli, la recombinasa de la
proteína D del plásmido F, las recombinasas ParA de los plásmidos
RP4 y RK2, la recombinasa específica de sitio del plásmido R1,
resolvasas codificadas por los elementos genéticos transponible
similares al transposón Tn3 y la resolvasa Rsd del plásmido de
virulencia Salmonella Dublin.
Entre los elementos de reconocimiento que pueden
ser utilizados en esta invención se incluyen aquellos para las
recombinasas anteriormente mencionadas. Se puede utilizar cualquier
elemento de reconocimiento reconocido por la recombinasa específica
del sitio utilizado. Entre los elementos de reconocimiento aptos se
incluyen aquellos sitios reconocidos por la recombinasa específica
de sitio XerC, por ejemplo el sitio cer del plásmido ColE1 y
el sitio ckr similar del plásmido ColK (29), el sitio
psi del plásmido pSC101 y el sitio cer similar del
plásmido pHS-2 de la Shigella flexneri.
Existen otros elementos de reconocimiento que pueden ser utilizados
entre los que se incluyen el sitio crs del plásmido de
virulencia Salmonella Dublin, el sitio loxP del plásmido P1,
el sitio rfs del plásmido F y el sitio res del
elemento genético transponible similar al transposón Tn3.
En una representación ideal de la invención, la
recombinasa es la resolvasa Rsd que actúa a través del elemento de
reconocimiento crs. El sistema Rsd/crs se describe con
detalle en el WO 02/28423.
Una célula creada según las descripciones de la
invención resulta adecuada para su uso en la fabricación de un
compuesto o medicamento para combatir una infección bacteriana.
Por lo general, la bacteria es la ETEC. Por
ejemplo, las composiciones que incluyen la célula actual pueden
utilizarse contra las enfermedades asociadas a la ETEC, tales como
la diarrea. En general, la composición contiene al menos una cepa
de células de la invención y un transportador o diluyente
farmacológicamente aceptable. La composición también puede contener
una o más cepas o componentes bacterianos.
Una célula adecuada para su inclusión en la
composición puede ser cualquiera de las descritas en el presente
documento. En general, la composición es capaz de generar una
respuesta inmunológica en un individuo contra al menos tres o más
antígenos CS expresados en la célula. Esta capacidad puede
verificarse en estudios de inmunización. Por ejemplo, la
composición puede administrarse a un animal, p. ej. un ser humano, y
se pueden realizar pruebas para verificar la generación de
anticuerpos o células T específicas de la respuesta para tres o más
antígenos CS. El antisuero generado tras la administración de una
composición a un animal puede evaluarse por la capacidad de unir
específicamente bien la célula que expresa los antígenos CS o el
antígeno CS purificado. Posteriormente, se puede confrontar al
animal con una cepa de ETEC para valorar si se ha producido una
respuesta inmunológica de protección.
Preferentemente, una composición inmunogénica
puede generar una respuesta inmunológica contra al menos tres
cadenas CFA/I, CFA/II y CFA/IV. En este sentido, la composición
inmunogénica contendrá, preferentemente, una o más cepas
bacterianas según la invención de manera que estén representados
todos y cada uno de los antígenos anteriormente mencionados. La
composición puede contener una o más cepas diferentes. En una
representación, la composición de la invención contiene:
- (i)
- una cepa que expresa los antígenos CS1, CS2 y CS3
- (ii)
- una cepa que expresa los antígenos CS4, CS5 y CS6; y
- (iii)
- una cepa que expresa CFA/l.
Entre las cepas de CFA/l se incluyen la ACM2001 y
la ACAM2010, incluidas en la tabla 2.
En una representación ideal, la composición
inmunogénica es una vacuna. Por ejemplo, una vacuna contra las
enfermedades asociadas a la ETEC, por ejemplo la diarrea. Por lo
general, la vacuna es una vacuna atenuada viva que contiene una o
más cepas bacterianas atenuadas vivas de las cuales al menos una es
una cepa de células creadas según la invención.
Hasta el momento, y debido a la expresión
limitada de los antígenos CS por parte de las células ETEC, una
vacuna eficaz debía incluir un mínimo de 5 cepas bacterianas. No
obstante, gracias a la creación de las células actuales, esta
invención da lugar a una vacuna anti ETEC que puede contener menos
de 5 cepas, por ejemplo 3 o 4.
La actual composición o vacuna puede formularse
utilizando técnicas conocidas para la formulación de composiciones
bacterianas atenuadas o vacunas. La presentación de la composición o
vacuna es apta para su administración oral, por ejemplo en forma de
polvos secos estabilizados para su reconstitución en un tampón
adecuado antes de su administración. La reconstitución se realiza en
forma de tampón con un pH adecuado para garantizar la viabilidad de
la bacteria. Para proteger la bacteria atenuada y la composición o
vacuna frente a la acidez gástrica, se puede administrar un
preparado de bicarbonato sódico junto con cada administración de la
vacuna. De forma alternativa, la composición o vacuna puede
presentarse en forma de producto encapsulado liofilizado.
La composición o vacuna puede utilizarse en el
tratamiento, por ejemplo la vacunación, de huéspedes mamíferos,
especialmente en huéspedes humanos. Una infección provocada por un
microorganismo, especialmente un patógeno, puede, por lo tanto, se
puede combatir o prevenir administrando una dosis efectiva de una
vacuna preparada según la invención. La determinación de dosis
utilizada queda, en última instancia, a discreción del médico, pero
dependerá de varios factores entre los que se incluyen el tamaño y
el peso del huésped y el tipo de composición o vacuna formulada. No
obstante, una dosis de administración oral con una composición de
entre 10^{7} y 10^{11}, p. ej. entre 10^{8} a 10^{10} de
bacterias por dosis puede ser conveniente para un huésped humano de
70 kg de peso.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la
invención.
Salvo indicación en contrario, los métodos
utilizados son técnicas estándar en biología molecular y bioquímica
(2, 26).
Este trabajo se ha llevado a cabo utilizando una
serie de cepas clínicas de ETEC aisladas. La cepa
E1392/75-2A (9) fue proporcionada por la Colección
Nacional de Cultivos Tipo y Hongos Patógenos, Central Public Health
Laboratories, Colindale, Reino Unido. Se trata de una variante
espontánea con pérdida de toxinas de la cepa E1392/75, aislada
originariamente en Hong Kong. En Acambis (Reino Unido), se
introdujeron deleciones atenuantes en los genes aroC, ompC y
ompF para crear la cepa de la vacuna PTL003 (cepa depositada
01090302, tablas 1 y 2) (31). Las otras cepas de referencia fueron
aisladas en la Naval Medical Research Unit 3 (NAMRU3), El Cairo,
Egipto de pacientes con diarrea. De estas cepas se borraron los
genes de las toxinas y se introdujeron deleciones atenuantes en los
genes aroC, ompC y ompF en Acambis, RU
(solicitud de patente inglesa n.º 0121998.9). Las cepas utilizadas
en los ejemplos, sus genotipos/
fenotipos y, si corresponde, los números de registro de las cepas depositadas aparecen indicados en las tablas 1 y 2.
fenotipos y, si corresponde, los números de registro de las cepas depositadas aparecen indicados en las tablas 1 y 2.
En los ejemplos también se utilizaron tres cepas
de E. coli de laboratorio que presentan el gen pir en
el cromosoma. Se trata de las cepas SY327\lambdapir-(23),
SM10\lambdapir (28) y DH5\alpha\lambdapir (P
Barrow, Institute for Animal Health, Compton).
Todos los medios de cultivo utilizados para el
mantenimiento y crecimiento de las cepas durante el desarrollo de
la vacuna fueron realizados a partir de componentes libres de
componentes animales certificados. El medio de cultivo LB básico
estaba compuesto por 10 g/l peptona de soja, 5 g/l de extracto de
levadura y 10 g/l de NaCl. Se añadió agar (15 g/l) y antibióticos
según las necesidades. Se utilizó agar CFA para el análisis de las
cepas de la vacuna. Éste estaba compuesto por 10 g/l de agar, 10 g/l
de peptona de soja, 1,5 g/l de extracto de levadura, 0,005% de
MgSO_{4}, 0,0005% de MnCl_{2} y 0,15% de sales de bilis.
Las cepas se cultivaron durante la noche en el
medio de cultivo LB, con antibióticos según las necesidades, a una
temperatura de 37°C y con agitación del cultivo. Posteriormente, se
extendió una parte alícuota de 10 \mul en una placa de agar CFA
que contenía antibióticos según las necesidades. La placa se incubó
durante la noche a una temperatura de 37ºC hasta que se creó una
extensión confluente. A continuación, se retiraron las bacterias de
la placa a una solución de 0,5 ml de PBS. Se añadieron 10 \mul de
esta suspensión celular a una solución de 1 ml de PBS y se midió la
OD_{600} (OD_{600} de 1 = 1 x 10^{9} células/ml). Una parte
alícuota de suspensión celular que contenía 10^{9} células fue
centrifugada a 13.000 r.p.m. durante 5 min y el pellet fue
resuspendido en 10 \mul de solución PBS. La muestra se calentó a
65°C durante 10 min y, a continuación, se centrifugó a 13.000
r.p.m. durante 5 min. Se conservó el sobrenadante y se añadió a una
muestra tampón 10 \mul 2x Novex Tris-Gly
(Invitrogen) que contenía 2 \mul 1 M DTT. Las muestras se
calentaron a 95ºC durante 5 min. y, a continuación, se analizaron
mediante SDS-PAGE en geles NOVEX
Tris-Gly (Invitrogen) al 14%, seguido de un teñido
directo con Simply Blue Safe Stain (Invitrogen) o por
Immunoblotting.
Las muestras fueron sometidas a electroforesis en
geles NOVEX Tris-Gly al 14% a 125 V hasta que la
parte delantera teñida se encontraba a 0,5 cm de la superficie
inferior del gel. Se utilizaron marcadores SeeBlue Plus2
(Invitrogen) como estándares de peso molecular. Se llevó a cabo una
transferencia a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 \mum
(LC2001, Invitrogen) durante 1 h a 25 V según las instrucciones del
fabricante (Manual de instrucciones del XCell II Blot Module El
9051, Invitrogen). Tras la transferencia, la membrana fue bloqueada
durante 1 h utilizando PBST (Sigma P-3813, 0,01 M de
solución salina amortiguadora fosfatada (0,138 M NaCl, 0,0027 M
KCl) con 0,05% Tween pH7.4) y 5% Marvel (leche desnatada en polvo).
A continuación, se lavó la membrana cuatro veces (10 min. cada vez)
en PBST con un 1% de Marvel. El blot se incubó con anticuerpos
primarios en una solución PBST/1% Marvel durante 1 hora y, a
continuación, se lavó cuatro veces, tal y como ya se ha explicado.
El blot se incubó con anticuerpos secundarios (conjugado HRP
antirrabit, Sigma A4914) en una solución PBST/1% Marvel durante 1
hora y, a continuación, se lavó cuatro veces, tal y como ya se ha
explicado, y dos veces sólo en PBST. El blot se desarrolló
utilizando el reactivo Pierce Super Signal West Pico de conformidad
con las instrucciones del fabricante y se expuso a una película de
rayos X durante diferentes periodos de tiempo.
Salvo descripción en contrario, se produjeron dos
tipos de reacciones PCR: reacciones para ampliar los fragmentos de
ADN para su clonación y reacciones para muestreo y análisis de
plásmidos/cepas. Para obtener los fragmentos para clonar se utilizó
la enzima de alta fidelidad Pfu Turbo (Stratagene) según los
protocolos establecidos en el Manual de Instrucciones n.º 039001 b.
Para seleccionar los clones, y clonar el gen rns, se utilizó
la polimerasa Taq (lnvitrogen, n.º de catálogo
10342-020) de conformidad con las instrucciones del
fabricante.
Las secuencias de los oligonucléotidos, por
ejemplo los cebadores, utilizados en los ejemplos aparecen indicadas
en la tabla 4.
La secuencia del operón CS4 ha sido publicada en
el Genbank (n.º de ref. AF296132). El análisis de restricción
asistido por ordenador de esta secuencia (utilizando el programa
VectorNTi, versión 7, Informax) reveló dos sitios Bg/II, uno
(sitio (a)) en el primer gen del operón (csaA) y uno (sitio
(b)) en la parte final del último gen del operón (csaE)
(Ilustración 1A). De esta manera, la mayor parte del operón podría
clonarse por digestión con enzimas de restricción utilizando estos
sitios Bg/II, evitando los errores relacionados con la PCR.
No obstante, resulta necesario clonar la región 5' del operón por
amplificación PCR, dado que no existía ningún sitio de restricción
adecuado que permitiera una clonación directa. Se utilizaron dos
cebadores PCR (cebador 47151 y cebador 47152) para ampliar el gen
csaA hasta el sitio Bg/II inclusive utilizando ADN
cromosómico de la cepa WS2252-A (CS4/CS6, tabla 1)
como plantilla. El cebador directo (cebador 47151) introdujo un
sitio de restricción Sa/l por encima del gen csaA,
mientras el cebador inverso (cebador 47152) introdujo un sitio
Sphl por debajo del sitio Bg/II. Estos sitios se
utilizaron para clonar el producto 723 bp de la PCR en el vector
estable con bajo número de copias pACYC184 ((5); suministrado por
NEB, Ilustración 1B) que también se digirió con Sa/I y
Sph/I. Este vector pasó a denominarse
pACYC-csaA (Ilustración 1C). En este punto, el
sitio (a) de la Ilustración 1A puede conservarse y utilizarse para
clonar el fragmento largo del operón CS4 (situado entre los sitios
(a) y (b)).
De esta manera, otra parte del ADN cromosómico de
la cepa WS2252-A se digirió con Bg/II y se
sometió a una electroforesis en gel de agarosa. Se aislaron
fragmentos de ADN de aprox. 5 kb del gel utilizando un kit de
extracción de gel QIAquick y se unieron al
pACYA-csaA que había sido digerido con Bg/II
y tratado con CIP (fosfatasa alcalina de ternera). La mezcla de
ligación se utilizó para transformar XL10 Gold KanR E. coli
y las colonias transformadas se seleccionaron en placas de agar con
cloramfenicol. Las colonias con plásmidos que contenían la región
3' del operón CS4 en la orientación correcta se detectaros por PCR
utilizando los cebadores 47151 y 47150 que ligan dentro del gen
csaC (Ilustración 1A). Los plásmidos correctos que contenían
el operón CS4 completo fueron denominados pACYC-CSA4
(Ilustración 4D).
El plásmido pACYC-CS4 se utilizó
para transformar dos cepas: La "Cepa K" es un derivado de una
cepa CS4/CS6 que ha perdido de forma espontánea su gen CS4, de
manera que sólo es capaz de expresar el gen CS6; la ACAM2006 es un
derivado atenuado de toxina negativa de la cepa
WS2773-E, una cepa CS5/CS6 de ETEC. Las cepas se
denominaron "Cepa K-pCS4" y
"ACAM2006-pCS4", respectivamente, y fueron
conservadas en cloramfenicol.
Las proteínas CS fueron purificadas por
extracción térmica de la Cepa K-pCS4 y de la cepa
ACAM2006-pCS4, tal y como se describe en la sección
"Materiales y métodos". Para su comparación, la Cepa
WS-2252A, una cepa CS4/CS6, y la cepa ACAM2006
fueron analizadas de forma similar. Tras un calentamiento durante 5
min. a 95ºC, las muestras fueron analizadas por electroforesis en
geles de poliacrilamida Tris-Gly al 14% (NOVEX). Las
bandas se visualizaron mediante teñido con Simply Blue Safe Stain
(Invitrogen) (Ilustración 2A) o mediante Western Blot utilizando
anticuerpos específicos de CS4 (Ilustración 2B), tal y como se
describe en la sección "Materiales y Métodos".
El antígeno CS4 se detectó claramente en la cepa
de control, WS-2252A, y también en la cepa
K-pCS4, lo que indicaba que el operón clonado
estaba intacto y funcionaba. No obstante, el operón CS4 no fue
detectado ni en la cepa ACAM2006 ni en la
ACAM2006-pCS4. Parece posible que esta disparidad se
deba a la presencia de diferentes mecanismos reguladores en las
cepas K y ACAM2006. El producto del gen cfaD, una proteína
presente en la Cepa K, pero no en la ACAM2006, es el que
normalmente regula el operón CS4. La expresión del operón CS5 no se
entendió muy bien. El gen csvR ha sido aislado de otra cepa
CS5/CS6 y es en un 87% homólogo al gen cfaD. El producto de
la proteína es capaz de sustituir, en términos funcionales, la
actividad del gen cfaD para actuar de mediador en la
expresión del CFA/I. No obstante, su papel en la expresión del
operón CS5 resulta dudoso (11, 14). La biosíntesis del operón CS5
también difiere de la expresión de los operones CS1 CS2, CS3, CS4 y
CS6 en el sentido de que las sales de bilis son necesarias para la
fabricación de fimbrias. Se especuló que podía resultar necesario
añadir sales de bilis al agar CFA utilizado para el crecimiento de
la cepa ACAM2006-pCS4 con el fin de estimular la
expresión del operón SC4. Las proteínas CS fueron purificadas por
extracción térmica de las Cepas ACAM2006, ACAM2009 (un derivado
atenuado de la cepa WS2252A) y ACAM2006-pCS4, tal y
como se describe en la sección "Materiales y Métodos". Las
muestras fueron analizadas por electroforesis en geles de
poliacrilamida Tris-Gly al 14% (Invitrogen) y las
bandas se visualizaron mediante teñido con Simply Blue Safe Stain
(Invitrogen) (Ilustración 2A) o mediante Western Blot utilizando
anticuerpos específicos de CFA/IV, tal y como se describe en la
sección "Materiales y Métodos". En presencia de sales de bilis
se detectaron grandes cantidades de CS4 y CS5 en el preparado CFA
de la cepa ACAM2006-pCS4 (Ilustraciones 2C y D), lo
que indicaba que una proteína reguladora presente en la cepa
ACAM2006, posiblemente la csvR, puede activar el operón CS4
e inducir la expresión. El operón CS6 también se detectó en la cepa
ACAM2006-pCS4. Aunque los niveles de este antígeno
eran bajos, eran similares a los niveles observados en las cepas
CS5/CS6, tales como la ACAM2006. Por lo tanto, demostramos que era
posible expresar las tres proteínas CS de CFA/IV dentro de una
única cepa.
La regulación dependiente de las sales de bilis
debería funcionar bien in vivo en una cepa de la vacuna en
la que la expresión de las proteínas CS se espera que imite la vista
en una infección natural. No obstante, quizá sea posible cambiar el
patrón de la regulación introduciendo un regulador diferente, por
ejemplo el rns o cfaD )rns es homólogo a
cfaD). Para investigar esto se aisló un gen rns de la
cepa E1392-2A mediante PCR utilizando los cebadores
RNS-03 y RNS-04. El producto de la
PCR se amplió utilizando la polimerasa Taq que deja un
protuberancia "A" y permite el uso del vector de clonación
pGEM-T Easy (Promega) en la clonación. El
constructo de la PCR se clonó en el vector siguiendo las
indicaciones del proveedor para crear el plásmido pGEM-rns.
Este plásmido se introdujo en la cepa ACAM2006-pCS4
por electroporación y selección en un medio que contenía
amplicilina y cloramfenicol. Las proteínas CS se prepararon a partir
de células que habían crecido en medios CFA sin sales de bilis y se
analizaron muestras mediante SDA-PAGE en geles
Tris-Gly (NOVEX) al 14% teñidas con Simply Blue Safe
Stain (Invitrogen). Se observó la expresión de los operones CS4,
CS5 y CS6 que no dependía de la presencia de sales de bilis
(Ilustración 2E) No obstante, la cantidad de CS5 en las células
tuvo un efecto deletéreo sobre el nivel de CS4 de la célula en
comparación con la inducción de sales de bilis en ausencia de rns
(tal y como se puede observar en las Ilustraciones 2C y 2D). La
utilización de un plásmido con bajo número de copias para la
expresión de rns podría haber reducido este efecto. Así, la
regulación de las proteínas CS en las cepas de la vacuna podría
verse alterada por la introducción de proteínas reguladoras
diferentes.
Normalmente, los operones CS4 y CS2 se encuentran
en el cromosoma de las cepas de referencia y los otros operones CS
están ubicados en plásmidos con bajo número de copias. Para superar
los problemas de estabilidad de los plásmidos y crear una cepa
adecuada para ser utilizada como vacuna, sería deseable insertar el
operón CS4 en el cromosoma de la cepa ACAM2006. Esto tendría como
resultado la presencia del operón en un número de copias similar al
observado en las cepas de referencia y se espera que esto evite una
"sobrecarga" con proteínas CS adicionales. Una expresión
excesiva de la proteína CS4 podría provocar la atenuación de la
cepa y/o la interferencia con la expresión de las proteínas CS
endógenas.
La estrategia de clonación para la inserción
cromosómica se describe en detalle en la Ilustración 3. El vector
suicida pJCB 12 (Ilustración 12) se utilizó para introducir el
operón en el cromosoma. Este plásmido contiene el R6K original y
sólo puede propagarse en cepas que contengan Xp/r (21). En este
caso, el vector suicida pJCB12, y sus derivados, se propagaron en
la cepa DH5\alpha\lambdapir de E. coli. Se decidió
insertar el operón en el locus ompC de la cepa ACAM2006.
Dado que el propio gen ompC ya había sido borrado de esta cepa, sus
regiones flanqueantes 5' y 3' se utilizaron para dirigir el operón
CS4 al sitio correcto.
La primera fase de la estrategia de clonación
suponía la amplificación individual de las regiones flanqueantes 5'
y 3' del gen ompC y el gen csaA mediante PCR (fase 1,
Ilustración 3A). Se utilizaron los cebadores 47173 y 47174 para
ampliar la región flanqueante superior del gen ompC y los
cebadores 47177 y 47178 se utilizaron para ampliar la región
inferior del gen ompC. El ADN cromosómico de la cepa ACAM2006 se
utilizó como plantilla. Se amplió un fragmento de 721bp, incluida la
región 5' del operón CS4, hasta el sitio Bg/II inclusive en
el gen csaA utilizando los cebadores 47175 y 47176 y el ADN
cromosómico de la cepa WS-2252A como plantilla. Los
cebadores 47174 y 47175 contenían secuencias ampliadas tales que la
secuencia 3' de la región flanqueante superior del gen ompC
del producto de la PCR y el extremo 5' del gen csaA del
producto de la PCR contenían secuencias complementarias. Esto
permitió unir los dos fragmentos por el método Overlap Extension
PCR utilizando los cebadores 47173 y 47176 (fase 2, Ilustración 3A).
De forma similar, los cebadores 47176 y 47177 contenían secuencias
ampliadas tales que la secuencia 3' del gen csaA del
producto de la PCR y la secuencia 5' de la región flanqueante
inferior del gen ompC del producto de la PCR contenían secuencias
complementarias. Esto permitió fusionar el fragmento
ompC-cscrA con la región flanqueante del gen
ompC por el método Overlap Extension PCR utilizando los
cebadores 47173 y 47178 (fase 3, Ilustración 3A).
El fragmento
ompC-csaA-ompC contenido en
los sitios BamHI en los extremos 5' y 3' fue introducido por
los cebadores 47173 y 47178. Estos sitios fueron utilizados para
clonar el fragmento
ompC-csaA-ompC en el sitio
Bg/II del vector suicida pJCB12, destruyendo las secuencias
de reconocimiento BamHI y Bg/II (fase 4, Ilustración
3A). Este plásmido se denominó
pJCB12-ompC-csaA-ompC. Esto
significaba que el sitio Bg/II del gen csaA era ahora
único y podía utilizarse para clonar el resto del operón CS4. Por
lo tanto, la región 3' restante del operón CS4 fue extraída del
plásmido pACYC-CS4 por digestión con el sitio
Bg/II e insertado en el sitio de restricción Bg/II
dentro del gen csaA (fase 5, Ilustración 3A). En un muestreo
PCR con oligos 4105 y RGK01 se identificaron plásmidos recombinantes
con el fragmento csaBCE en la orientación correcta. Esta
construcción final del vector suicida para dirigir el operón CS4 al
locus ompC y del plásmido se denominó
pJCB12-ompC-CS4-ompC.
La cepa
pJCB12-ompC-CS4-ompC se
utilizó para transformar la cepa SM10\lambdapir de E.
coli sensible a la tetraciclina y apta para fines de conjugación
(23). La cepa ACAM2006 se hizo resistente a la tetraciclina
mediante la transformación con el plásmido pACYC184(5). La
cepa
SM10\lambdapir-pJCB12-ompC-CS4-ompC
se conjugó con la ACAM2006-TetR por el método del
rayado cruzado en placas de agar LB. Una zona de 2 cm^{2} se rayó
con gran cantidad de una cepa y, a continuación, se realizó un
rayado por encima con otra cepa en dirección perpendicular. Tras su
cultivo durante la noche a 37ºC, las células fueron extraídas y
extendidas sobre placas de agar que contenían cloramfenicol y
tetraciclina. Los transconjugantes en los que la cepa
pJCB12-ompC-CS4-ompC había
sido insertada en el cromosoma de la ACAM2006-TetR
formaron colonias, en las cuales ni las cepas madre fueron capaces
de crecer dentro de esta combinación de antibióticos La
recombinación homóloga del operón CS4 en el sitio correcto (es
decir, el locus ompC) se confirmó mediante PCR
utilizando los oligos 4732 y 47105.
Tras haber dirigido el operón CS4 al locus
ompC, resultaba necesario seleccionar los clones donde se
habían extraído las secuencias vectoriales, pero el operón SC4
permaneció en el cromosoma. El vector suicida pJCB12 contiene el
gen de la sacarosa que confiere toxicidad a las células que crecen
en sacarosa, de ahí que los transconjugantes dirigidos
correctamente se cultivaran en un medio con un 5% de sacarosa con
el objetivo de seleccionar por pérdida del vector suicida. Sólo las
cepas en las que se había extraído el vector suicida pudieron
crecer. La extirpación de la secuencia vectorial significaría que el
gen de resistencia al cloramfenicol también se habría perdido. Por
lo tanto, las colonias resistentes a la sacarosa fueron sometidas a
muestreos para comprobar que eran sensibles al cloramfenicol. Se
realizaron muestreos de colonias resistentes a la sacarosa y
sensibles al cloramfenicol por PCR para identificar los clones en
los que el operón CS4 había permanecido en el locus
ompC (cebadores 4732 y 47150). Se seleccionó una cepa en la
que el operón CS4 había sido insertado correctamente y se denominó
ACAM2006-CS4.
La cepa ACAM2006-CS4 se cultivó
durante la noche en placas de agar LB, agar CFA o agar CFA más un
0,15% de sales de bilis. Las proteínas CS se elaboraron mediante
extracción térmica, tal y como se describe en la sección
"Materiales y Métodos". Se realizaron preparados similares de
la cepa ACAM2006 para fines de comparación. Las muestras fueron
analizadas por SDS-PAGE en geles de poliacrilamida
Tris-Gly al 14% (NOVEX). Las bandas se visualizaron
mediante teñido con Simply Blue Safe Stain (Invitrogen) o mediante
Western Blot (Ilustraciones 4A y B). Los blots se tiñeron con
anticuerpos de conejo específicos de CS4, CS5 y CS6 y un conjugado
HRP antirabbit (Signma A4914), tal y como se describe en la sección
"Materiales y Métodos".
Se detectaron niveles bajos de CS6 en las cepas
ACAM2006 y ACAM2006-CS4 cuando las cepas se
cultivaron con o sin sales de bilis, aunque se detectaron niveles
ligeramente superiores en los casos en los que estaban presentes
las sales de bilis. El CS5 fue detectado tanto en ambas cepas, pero
sólo cuando se añadieron sales de bilis al agar. El CS4 estaba
presente únicamente en la cepa ACAM2006-CS4 y sólo
en presencia de sales de bilis.
De esta manera se había creado una cepa en la que
la expresión de los operones CS4, CS5 y CS6 reflejaba buenos
niveles. Tal y como ya se ha visto con el plásmido
pACYC-CS4, el control de la expresión del operón
CS4 ha cambiado para pasar a depender de la presencia de sales de
bilis, algo similar a lo que se había observado en la expresión
natural del operón CS5. Este tipo de regulación debería funcionar
bien en una cepa de la vacuna en la que las proteínas CS se inducen
in vivo. No obstante, es posible que se pueda cambiar el
patrón de regulación al introducir un regulador diferente, como el
rns o el cfaD (sección 1.2.1).
Las cepas ACAM2006 y ACAM2006-CS4
llevan un genoma bacteriófago similar al P2 en el cromosoma (sección
1.2.1). Una gran parte del genoma fue borrado de las cepas para
mejorar su idoneidad como componentes de una vacuna. Esta deleción
no afectó a la expresión de los operones CS4, CS5 y CS6. La cepa
ACAM2006 carente de naturaleza bacteriófaga es la ACAM2012 (cepa
depositada con n.º de registro 020282968). La cepa
ACAM2012-CS4 (ACAM2013) ha sido depositada con el
n.º de registro 02082969, tal y como se ha indicado
anteriormente.
Los genes del operón CS1 del ETEC han sido
secuenciados (número de registro M58550, X62495, X76908 del
GenBank). Estas secuencias se compilaron creando el operón completo
(cooB, cooA, cooC, cooD) y los sitios de restricción fueron
analizados con el programa VectorNTi, versión 7 (Informax)
(Ilustración 5A). Se identificaron dos sitios aptos para la
clonación del operón intacto por digestión con enzimas de
restricción: parte inferior EcoRV del gen cooB y la
parte inferior Bg/II del gen cooD. El ADN plasmídico
purificado de la cepa CS1/CS3 E1392/75-2A (tabla 1)
se digirió con el EcoRV y el BglII y se sometió a
electroforesis en gel de agarosa. Se aislaron fragmentos de ADN de
aprox. 6,6 kb del gel utilizando un kit de extracción de gel
QIAquick. Este era el tamaño correcto del operón CS1, tal y como se
preveía partiendo de las secuencias compiladas del GenBank. Los
fragmentos de 6,6 kb se ligaron al vector de clonación pACYC 184
((5); suministrado por NEB, Ilustración 1B) que había sido digerido
con EcoRV y BamHI. Las colonias ligadas se utilizaron para
transformar la cepa K12 de E. coli y las colonias se
seleccionaron sobre placas de agar que contenían cloramfenicol. Los
constructos correctos se identificaron por digestión con
HindIII o HindIII/SphI. Este constructo se
denominó pACYC-CS1 (Ilustración 5B).
La cepa ACAM2007, una cepa CS2/CS3 atenuada, se
transformó con pACYC-CS1 mediante electroporación.
Esta cepa pasó a denominarse ACAM2007-pCS1. Las
cepas PTL003 (CS1/CS3), ACAM2007 y ACAM2007-pCS1 se
extendieron sobre placas de agar CFA y se elaboraron proteínas de
CFA mediante extracción térmica, tal y como se describe en la
sección "Materiales y Métodos". Las muestras fueron analizadas
mediante electroforesis en geles de poliacrilamida
Tris-Gly al 14%. Para resolver las proteínas CS2 y
CS3, de aprox. 15,3 y 15,1 kDa respectivamente, se utilizaron geles
(14 cm). Las proteínas CS se detectaron por Western Blot,
(Ilustración 6) teñidas con anticuerpos de conejo específicos de
CFA/ll (que reconocían las proteínas CS1, CS2 y CS3) y se
desarrollaron, tal y como se describe en la sección "Materiales y
Métodos".
En la cepa PTL003 se detectaron las proteínas CS1
y CS3, en la cepa ACAM2007 la CS2 y CS3 y en la cepa
ACAM2007-pCS1, la CS1, CS2 y CS3. Por lo tanto,
quedó demostrado que es posible expresar tres antígenos de CFA/II
en una única cepa.
Una cepa CS2/CS3 que exprese el operón CS1 puede
formar un componente de una vacuna ETEC, incluso cuando el operón
CS1 es transportado en un plásmido estable. No obstante para mejorar
aún más la estabilidad de la cepa sería deseable insertar el operón
CS1 en el cromosoma de la misma. Para ello se puede emplear una
estrategia similar a la descrita en la sección 1.2.2 para las cepas
CS4/CS5/CS6 u otras técnicas conocidas en el sector.
La secuencia del operón CS5 ha sido publicada
(n.º de registro AJ224079 del GenBank). El análisis de restricción
asistido por ordenador de esta secuencia (utilizando el programa
VectorNTi, versión 7, Informax) reveló un sitio AngeI en la
parte superior del primer gen del operón (csfA) y un sitio
XmaI en la parte inferior del último gen del operón
(csfD) (Ilustración 7A). Estos sitios eran aptos para la
clonación del operón intacto por digestión con enzimas de
restricción, evitando los errores relacionados con la PCR. La
"protuberancia" generada por la digestión con el sitio
AngeI es complementario a la protuberancia xmaI, por
lo que el fragmento podría clonarse directamente en el vector de
corte XmaI. No obstante, el vector pACYC184 no contenía el
sitio XmaI, por lo que requería ciertas modificaciones
(Ilustración 7B). Se ampliaron aproximadamente 276 bp del vector
pACYC184 desde sitio BamHl único en la posición 3961 hasta al
sitio SalI único en la posición 4237 con ayuda de los
cebadores 47180 y 47182. Tanto el sitio BamHI como el
SalI se conservaron, y el cebador 47182 también introdujo un
sitio Xmal nuevo a 5' de sitio SalI. El fragmento de
ADN de 295 bp ampliado por PCR se digirió con SalI y
BamHl y se clonó en el pACYC18, que, a su vez, también había
sido digerido con SalI y BamHl, introduciendo así un
sector XmaI nuevo y único en el vector. Este vector se
denominó pACYC-Xmal (Ilustración 7B).
El ADN plasmídico se aisló de la cepa
WS2773-E (CS5/CS6) y una parte del mismo fue
digerida con los sitios Agel y Xmal y sometida a
electroforesis en gel de agarosa. Se aislaron fragmentos de ADN de
aprox. 7 kb del gel utilizando un kit de extracción de gel QIAquick
y, a continuación, se ligaron al pACYC-XmaI que también
había sido digerido con el sitio XmaI y tratado con fosfatasa
alcalina de ternera. La mezcla de ligación se utilizó para
transformar XL10 Gold KanR E. coli y las colonias
transformadas se seleccionaron en placas de agar con cloramfenicol.
Se realizaron muestreos de las colonias por PCR con los cebadores
47168 y 47167 para identificar plásmidos que contuvieran el operón
CS5. La orientación se determinada utilizando los cebadores 47180 y
47168. Un plásmido correcto se denominó pACYC-CS5
(Ilustración 7C).
La cepa ACAM2009, una cepa CS4/CS6 atenuada, fue
transformada con el plásmido pACYC-CS5 mediante
electroporación y la cepa se denominó
ACAM2009-pCS5.
Las cepas ACAM2009 y
ACAM2009-pCS5 fueron extendidas sobre placas de agar
CFA que contenían un 0,15% de sales de bilis y las proteínas de CFA
fueron purificadas, tal y como se describe en la sección
"Materiales y Métodos". Las muestras fueron analizadas por
SDS-PAGE en geles de Tris-Gly al 14%
(NOVEX) y las bandas se visualizaron por Western Blot (Ilustración
8A). Los blots se tiñeron con anticuerpos de conejo específicos de
CFA/IV que detectan proteínas CS4, CS5 y CS6 y un conjugado HRP
antirabbit (Signma A4914). Las tres proteínas CS (CS4, CS5 y CS6)
fueron detectadas en la cepa ACAN2009-pCS5 en
presencia de sales de bilis. Para determinar si las sales de bilis
eran necesarias para la expresión de la proteína CS5 (como en las
cepas CS5/CS6 naturales), se extendieron las cepas ACAM2006,
ACAM2009 y ACAM2009-pCS5 en placas de agar con y sin
sales de bilis y las proteínas de CFA fueron purificadas tal y como
se describe en la sección "Materiales y Métodos". Las muestras
fueron analizadas por SDS-PAGE h, posteriormente,
por Western Blot utilizando anticuerpos específicos de CFA/IV
(Ilustración 8B). Tal y como se esperaba, en la cepa ACAM2006 el
operón CS5 sólo se expresó en presencia de sales de bilis, mientras
que en la cepa ACAM2009 el operón CS4 se expresión tanto en
presencia como en ausencia de sales de bilis en el medio. En la
cepa ACAM2009-pCS5 se detectaron tanto el CS4 como
el CS5, independientemente de la presencia de sales de bilis en la
placa de agar CFA. Parece ser que el regulador cfaD que está
presente en la cepa ACAM2009 y controla la expresión del operón CS4
con independencia de la sal de bilis también es capaz de regular la
expresión del operón CS5.
Una cepa CS4/CS6 que exprese el operón CS5 puede
formar un componente de una vacuna ETEC, incluso cuando el operón
CS5 es transportado en un plásmido estable. No obstante para mejorar
aún más la estabilidad de la cepa sería deseable insertar el operón
CS5 en el cromosoma de la misma. Para ello se puede emplear una
estrategia similar a la descrita en la sección 1.2.2 u otras
técnicas conocidas en el sector.
Queríamos saber si la expresión de las proteínas
CS en las cepas se ve limitada por el tipo de CFA. Por ejemplo,
¿sería posible expresar proteína CFA/II con una cepa de CFA/IV? Para
investigar esto se utilizaron plásmidos que transportaban operones
CS clonados para transformar cepas de ETEC de diferentes tipos de
CFA.
El plásmido pACYC-CS4 (sección
1.1) se utilizó para transformar la cepa PTL003 (una cepa CS1/CS3
atenuada, tabla 1) para crear la cepa PTL003-pCS4.
Las cepas PTL003, PTL003pCS4 y ACAM2009 fueron extendidas sobre
placas de agar CFA y las proteínas de CS fueron purificadas tal y
como se describe en la sección "Materiales y Métodos". Las
muestras fueron analizadas mediante electroforesis en geles de
Tris-Gly al 14% (NOVEX) y las bandas se
visualizaron mediante el teñido con Simply Blue Safe Stain
(Invitrogen) (Ilustración 9). En la cepa PTL003 se detectaron las
proteínas CS1 y CS3 y en la cepa ACAM2009 se detectó la proteína
CS4. En la cepa PTL003-pCS4 se detectaron las
proteínas CS1, CS3 y CS4. Esto indicaba que es posible expresar
antígenos CFA/II y CFA/IV en una única cepa.
Para verificar si la expresión múltiple de
proteínas CS en una única cepa está limitada por el tipo de CFA se
utilizó el plásmido pACYC-CS4 (sección 1.1) para
transformar la cepa ACAM2010 (una cepa CFA/I atenuada) con el
objetivo de crear la cepa ACAM2010-pCS4. Las cepas
ACAM2010, ACAM201Q-pCS4 y WS-2252A
(CS4/CS6) fueron extendidas sobre placas de agar CFA y las
proteínas de CFA fueron purificadas tal y como se describe en la
sección "Materiales y Métodos". Las muestras fueron analizadas
mediante electroforesis en geles de Tris-Gly al 14%
(NOVEX) y las bandas se visualizaron mediante el teñido con Simply
Blue Safe Stain (Invitrogen) o por Western Blot utilizando la
proteína CS4 y anticuerpos de conejo específicos de CFA/I
(Ilustración 10). En la cepa ACAM2010 se detectó CFA/I y en la cepa
WS-2252A se detectó la proteína CS4. En la cepa
ACAM2010-pCS4 se detectaron tanto CFA/I como la
proteína CS4. Esto indicaba que es posible expresar diferentes tipos
de antígenos de CFA en una única cepa.
Esta sección describe la generación de un
plásmido de vector suicida novel, el pJCB12, y su uso para la
inducción de mutaciones en loci de genes cromosómicos o
codificados por plásmidos. La producción y el uso del vector pJCB12
se describe en la solicitud de patente inglesa n.º 0121998.9 y en la
solicitud de patente internacional que reclama prioridad sobre la
solicitud de patente inglesa n.º 0121998.9, y presentada por
Acambis Research Limited en la misma fecha que esta solicitud de
patente internacional. El contenido de dicha solicitud de patente
internacional queda incorporado al presente documento por
referencia.
Los plásmidos de vector suicida tales como el
pDM4 (24), pJCB12, pCVD442 (12) y otros pueden utilizarse para
introducir constructos genéticos definidos en objetivos específicos
del genoma bacteriano. El plásmido pJCB 12 es un nuevo vector
suicida optimizado basado en el anterior vector suicida pDM4. El
constructo genético definid que se ha de introducir en el genoma
bacteriano puede ser una mutación por deleción de un gen específico
o una estructura más compleja, por ejemplo, una inserción de un gen
dentro de otro y expresado desde un promotor seleccionado dentro
del propio constructo. Por lo general, las extremidades de los
constructos están compuestas por secuencias de nucleótidos
derivados de la región del genoma a la que se ha de dirigir.
Los vectores suicidas pDM4 y pJCB12 poseen una
serie de componentes clave (véanse las ilustraciones 11 y 12):
Un origen de replicación que dirige la
replicación del vector en algunas cepas de bacterias, pero no en
otras, el oriR6K. El oriR6K es el origen de la
replicación derivada del plásmido R6K fabricado de forma natural.
Este origen necesita el gen R6K p/r para la replicación, que se
produce en ausencia de los vectores suicidas. Existen tres cepas de
E. coli de laboratorio disponibles que lleven el gen
pir en su cromosoma, y son la SY327\lambdapir, la
SMI0\lambdapir y la DH5\alpha\lambdapir. Estas
tres cepas se utilizaron para propagar el pDM4, el pJCB12 y sus
derivados.
Un origen de transferencia que dirige la
transferencia conjugativa del vector desde una cepa bacteriana a
otra, el mobPPA. El mobRPA es el origen de
transferencia desde el plásmido RP4 fabricado de forma natural.
Esto hace posible una transferencia conjugativa del pDM4, del pJCB12
y de sus derivados a cepas bacterianas receptoras. Para poder
funcionar, el mobRPA necesita que los genes que codifican las
funciones de transferencia del plásmido RP4 estén presentes en la
célula bacteriana donante. La cepa de laboratorio
SM10\lambdapir de E coli lleva estos genes en sus
cromosomas y, por este motivo, puede ser utilizada como cepa donante
para los vectores pDM4, pJCB12 y sus derivados.
Un gen que codifique un producto que resulte
tóxico para las células bacterianas cuando éstas crecen en
determinadas condiciones, el sacB. El sacB codifica
para levansucrasa, que genera un producto que es tóxico para las
bacterias gram-negativas cuando crecen en
sacarosa.
Un marcador seleccionable, el cat. El
cat codifica para la cloramfenicol acetiltransferasa y confiere
resistencia al cloramfenicol bacteriano.
Un sitio de clonación múltiple (MCS), es decir,
un sitio en el que puedan clonarse constructos genéticos definidos
para su introducción en una célula bacteriana receptora.
El sector suicida pJCB12 es una versión
modificada del vector pDM4 del que se ha extraído la mayor parte
del ADN intergenético y no funcional. Por lo tanto, hay muchas menos
posibilidades de que se produzca una selección incorrecta
utilizando este vector suicida. Mientras que el vector pDM4 tiene
una longitud aproximada de 7 kb, el vector pJCB12 sólo tiene 3 kb,
aunque mantiene todos los componentes clave. Concretamente la región
mobHPA del vector pJCB12 es de tan sólo 0,15 kb, y las
secuencias de nucleótidos similares a IS1 han sido
eliminadas de la región sacB. Estas modificaciones son
especialmente beneficiosas a la hora de manipular cepas de ETEC
que, generalmente, albergan muchos plásmidos que podrían actuar como
objetivos no deseados de recombinación homóloga con componentes del
vector suicida. Además, el tamaño reducido del vector pJCB 12
permite una manipulación y construcción in vitro más
sencilla de los derivados, puesto que las moléculas de ADN se unen
y se transforman en huéspedes de E. coli de forma más eficaz,
aumentando las posibilidades de obtener derivados de la
construcción correcta. El tamaño reducido también hace posible una
mayor eficacia a la hora de introducir los constructos en las
bacterias receptoras por el método de la transformación en
comparación con el de la conjugación.
La cepa de laboratorio SM10\lambdapir de
E. coli puede utilizarse para transferir el vector pJCB12 y
sus derivados a cepas bacterianas receptoras por conjugación, dado
que cuenta con las funciones tra del plásmido RP4
introducido en su cromosoma. No obstante, la cepa SM10\lambdapir
muestra frecuencias de transformación relativamente bajas. Por este
motivo, la cepa DH5\alpha\lambdapir normalmente se utilizaría
para la construcción de derivados del pJCB12 y, una vez
identificados los derivados de la construcción correcta, éstos
serían transferidos a la SM10\alpha\lambdapir para su
introducción en las cepas receptoras por conjugación.
El vector suicida pJCB12 fue construido en varias
sesiones de Overlap Extension PCR (30, Ilustración 13) utilizando
el ADN del plásmido pDM4 como plantilla. Inicialmente, se ampliaron
cuatro fragmentos de pDM4 mediante PCR utilizando la polimerasa de
ADN de alta fidelidad, Pfu Turbo™. Estos fueron el fragmento
oriR6K, amplificado utilizando los oligonucleótidos 4714 y 4715; el
fragmento mobRP4 ampliado utilizando los oligonucleótidos
4716 y 4717; y el gen cat que fue ampliado en dos partes
utilizando los oligonucleótidos 4718 con 4719 y 4720 con 4721. Esto
se realizó con el objetivo de eliminar el sitio de una enzima de
restricción EcoRI con el gen cal. El fragmento
oriR6K y el mobRP4 se unieron posteriormente en una
reacción Overlap Extension PCR utilizando los oligonucleótidos 4714
y 4717. De la misma manera, los fragmentos cat se unieron
utilizando los oligonucleótidos 4718 y 4721. Estos dos fragmentos
resultantes se unieron entonces en una reacción Overlap Extension
PCR utilizando los oligonucleótidos 4717 y 4718. El producto
resultante de la PCR se ligó y transformó en células
SY327\lambdapir y se seleccionaron transformantes en una
placa de agar L complementada con cloramfenicol a 20 mg/ml. Se
obtuvieron transformantes que albergaban los plásmidos del tamaño
correcto y uno de ellos, denominado pDM4A7, se seleccionó para su
posterior manipulación.
En esta fase, los componentes oriR6K y cat
del plásmido pDM4A7 son claramente funcionales. No obstante, con el
objetivo de confirmar que el locus mobRP4 era
funcional se transformó el plásmido pDM4A7 en la cepa SM1
SM10\lambdapir. Estos transformantes se seleccionaron de
una placa de agar L complementada con cloramfenicol a 15 mg/ml y
ácido nalidíxico a 5 mg/ml. Esta placa de agar L se rayó con células
de la cepa SY327\lambdapir. Mientras el cloramfenicol
selecciona aquellas células bacterianas que albergan el plásmido
pDM4A7, el ácido nalidíxico selecciona para
SY327\lambdapir. Tras su incubación durante la noche, en
las zonas de la placa donde se habían cruzado las cepas habían
crecido muchas colonias, aunque éstas no crecieron en ninguna otra
parte de la placa, lo que confirma que el plásmido pDM4A7 se
moviliza de la cepa SM101pir y que el locus
mobHPA es funcional.
Posteriormente, el plásmido pDM4A7 fue digerido
con EcoRI, tratado con la polimerasa de ADN Pfu
Turbo™ y ligado con el objetivo de eliminar el sitio de la enzima de
restricción EcoRI para generar el plásmido
pDM4A7DEcoRI. A continuación, se ligó un fragmento
HindIII corto del pDM4, que incluye el sitio de clonación
múltiple, al
pDM4A7DEcoRI digerido con HindIII. La reacción de ligación se transformó en SY327\lambdapir y, posteriormente, se seleccionaron los transformantes de una placa de agar L complementada con 20 mg/ml de cloramfenicol.
pDM4A7DEcoRI digerido con HindIII. La reacción de ligación se transformó en SY327\lambdapir y, posteriormente, se seleccionaron los transformantes de una placa de agar L complementada con 20 mg/ml de cloramfenicol.
El oligonucleótido R6K-01 hibrida
dentro del fragmento HindIII corto del plásmido pDM4 que
incluye un sitio de clonación múltiple. Por este motivo, se realizó
un muestreo de los transformantes por PCR utilizando los
oligonucleótidos R6K-01 y 4720 con el objetivo de
identificar aquellos que albergan el constructo del plásmido
deseado. Se identificaron una serie de transformantes y, uno de
ellos, denominado pDM4A7DE, se seleccionó para su posterior
manipulación.
El plásmido pDM4A7DE cuenta con tres sitios
EcoRI muy situados muy cerca unos de otros en el fragmento
HindIII corto del plásmido pDM4 que incluye un sitio de
clonación múltiple. Los dos fragmentos EcoRI muy cortos del
plásmido pDM4A7DE se transformaron por digestión con el EcoRI
seguida de una ligación. Esto tuvo como resultado un derivado del
plásmido pDMA47DE que posee únicamente un sitio EcoRI que se
denominó pJCB10. La región del pJCB10 que incluye el oriR6K y el MCS
se amplió utilizando los oligonucleótidos 4715 y 4917 y las
determinaciones de las secuencias de nucleótidos de parte de este
fragmento se realizaron con ayuda del oligonucleótido 4917. Esto
arrojó como resultado una secuencia de nucleótidos en el MCS
desconocida para nosotros.
El gen sacB se amplió posteriormente con
ayuda de la polimerasa Puf y los oligonucleótidos 4722 y
4723. El producto de 1,6 kb se ligó con el vector de plásmido
pPCR-Script™ (Stratagene) y se transformó en
células XL10 Gold™ E. coli (Stratagene). Se obtuvieron
transformantes y se confirmó la funcionalidad del gen sacB
colocando los clones en placas de agar L y de agar de sacarosa al
5%. Un constructo mostró un buen crecimiento sobre la placa de agar
L, pero ningún crecimiento sobre la placa de agar de sacarosa al
5%, por lo que fue seleccionada como el origen del gen sacB.
A continuación se procedió a digerir el gen sacB de este
clon utilizando la enzima de restricción PstI, para lo que se
incorporaron sitios en los oligonucleótidos 4722 y 4723 y,
posteriormente se ligó con el pJCB10, digerido a su vez con la
PstI. La comprobación de las colonias se realizó mediante
PCR con los oligonucleótidos 4716 y 4766, lo que generó un producto
del tamaño esperado (\sim1700 bp). Una vez más se confirmó la
funcionalidad del gen colocando los clones en placas de agar L y de
agar de sacarosa al 5%. Un constructo creció sobre la placa de agar
L, pero no sobre la de agar de sacarosa al 5%. La secuenciación de
este constructo realizada con los oligonucleótidos 4716 y 4766,
respectivamente, nos indicó la orientación del gen sacB. Este
constructo pasó a llamarse pJCB12.
Una vez ligado una constructo genético definido
al pJCB12 para obtener un derivado del vector pJCB12, el plásmido
es transferido a una cepa receptora, por ejemplo una cepa de ETEC.
Esto puede llevarse a cabo aplicando métodos conocidos en el
sector, bien por conjugación de la cepa SM10\lambdapir
huésped del pJCB12 o por transformación del derivado de la pJCB12
purificado directamente en la cepa receptora.
En un medio de cultivo bacteriológico
complementado con cloramfenicol antibiótico se seleccionaron
transconjugantes o transformantes. Dado que el vector suicida pJCB12
no es capaz de replicarse en ausencia del gen pir, cualquier
transconjugante o transformante que crezca habrá sido, por lo
general, el resultado de la fusión del derivado del pJCB12 con otro
replicón mediante recombinación homóloga.
Para optimizar al máximo el proceso de mutación
definido, se puede aplicar un planteamiento novedoso a la
realización del muestreo de los transformantes o transconjugantes
utilizando PCR con el objetivo de identificar aquellos en los que
el derivado del pJCB12 se ha dirigido a la región deseada del
genoma. Para esto, se ha diseñado un oligonucleótido que hibrida
dentro de las secuencias de nucleótidos del pJCB12 adyacentes al MCS
donde se ha insertado el constructo genético definido. El otro
oligonucleótido ha sido diseñado para hibridar a la región del
genoma que debe dirigirse y que adyacente al constructo genético
definido pero se encuentra fuera de ella. Los transformantes o
transconjugantes que son positivos en la PCR contarán con el
derivado del pJCB12 dirigido a la región correcta del genoma (véase
la Ilustración 14).
Una vez identificados los recombinantes
correctos, será necesario aislar los derivados en los que se ha
perdido el vector pJCB 12. Dichos derivados pueden ser seleccionados
añadiendo al medio de cultivo bacteriológico un 5% de sacarosa.
Esta selección por sacarosa puede llevarse a cabo de una manera más
eficaz en un medio L modificado en el que esté ausente el
ingrediente NaCl y al que se añada sacarosa al 5%. En estas
condiciones, el gen sacB del vector pJCB12 es tóxico, por lo que
sólo crecerán aquellos derivados que hayan perdido el gen
sacB. Esto se produce, una vez más, por recombinación
homóloga y arroja una serie de resultados. En primer lugar, un caso
de reversión tendrá como resultado que la región objetivo permanezca
como está. En segundo lugar, la recombinación homóloga puede tener
como resultado el cambio del constructo genética definido con la
región objetivo, lo que acabaría provocando la incorporación del
constructo definido a la región objetivo. Además, si la región
objetivo forma parte de un plásmido, como muchos de los genes de
toxinas de las cepas de ETEC, es posible que se produzcan dos casos
adicionales. Estos son: en tercer lugar, un caso de deleción
espontánea no definida, cuyo resultado será la pérdida de una parte
de la región objetivo que podría extenderse más allá de los límites
del constructo genético definido y, en cuarto lugar, la pérdida del
plásmido completo, lo que podría denominarse "eliminación
específica de plásmidos".
Los ensayos realizados con derivados resistentes
a la sacarosa a través de la PCR pueden identificar los
recombinantes deseados. Para ello se utilizan oligonucleótidos que
hibridan en cada extremo de la región objetivo y fuera del
constructo genético definido. Si el producto de la PCR tiene el
mismo tamaño que antes de su introducción en el constructo del
derivado del pJCB12, entonces se ha producido una reversión. Si, por
ejemplo, el constructo definido genéticamente es una mutación por
deleción, entonces el producto de la PCR debería ser de menor
tamaño que antes y tener un tamaño predecible. Por lo general, la
eliminación específica de plásmidos y la deleción espontánea no
definida tendrán como resultado la falta de productos de la PCR o
la obtención de productos no específicos de tamaño imprevisto en
este tipo de reacciones de PCR.
En resumen, el vector pJCB12 (u otro vector
similar según la invención) puede utilizarse en un método para la
producción de células bacterianas en las que el gen objetivo (p. ej.
un gen de toxina como ST, LT o EAST1 o un gen cromosómico como un
omp o aro) ha sido eliminado, desactivado o
sustituido. Este método implica la transferencia del vector a una
célula bacteriana que contiene el gen objetivo y la selección de
una célula en la que el gen objetivo ha sido eliminado, desactivado
o sustituido. La selección puede llevarse a cabo utilizando un
procedimiento multifase en los siguientes términos:
- -
- Seleccionando una colonia de células que contiene un marcador seleccionable. Si la célula a la que se ha transferido el vector es una que no soporta la replicación del vector desde el origen de la replicación en el vector, la búsqueda de una colonia de células de este tipo identifica células en las que el vector ha sido incorporado al replicón celular.
- -
- Realizando una PCR para seleccionar una célula en la que el vector haya sido dirigido correctamente al gen objetivo, teniendo en cuenta que uno de los cebadores utilizados en la PCR hibrida a la secuencia del vector adyacente al sitio de clonación y el otro hibrida a un sitio en el ADN celular adyacente al gen objetivo. Una PCR positiva indica que el vector ha sido dirigido al gen objetivo.
- -
- Seleccionando una célula en la que se haya perdido la secuencia del vector al cultivarla en condiciones que hacen efectivo el gen que codifica un producto que resulta tóxico para las células cuando se cultivan en determinada condiciones. La supervivencia de una célula indica que la secuencia de ese vector se ha perdido. Cuando el gen que codifica el producto tóxico es el sacB, la célula puede cultivarse en un medio complementado con sacarosa y en que no está presente NaCl. El producto del gen sacB resulta tóxico cuando las células se cultivan en este medio.
- -
- Finalmente, la PCR puede llevarse a cabo utilizando cebadores que hibridan en posiciones situadas fuera y adyacentes a cada extremo del gen objetivo, teniendo en cuenta que un producto de la PCR de menor tamaño que el producto obtenido de una célula de referencia indica una mutación por deleción.
Por ejemplo, en el presente estudio y en términos
generales:
Las conjugaciones bacterianas se crearon
mezclando las cepas donantes y receptoras de ETEC en una placa de
agar L e incubándolas a 37°C durante 3 a 18 horas. El cultivo
bacteriano fue depositado en un caldo L y colocado en placas de
agar L complementadas con cloramfenicol y otro antibiótico apropiado
para seleccionar cepas de ETEC (estreptomicina para la cepa B,
tetraciclina para otras cepas de ETEC) que habían incorporado el
derivado del vector pJCB12. Para la identificación de recombinantes
dirigidos correctamente, los transconjugantes o transformantes
obtenidos por cultivo en placas de agar L complementadas con
cloramfenicol tras la introducción de constructos derivados del
vector pJCB12 fueron analizados por PCR con el objetivo de
identificar aquellos en los que había sido enfocado el locus
genético deseado. Para ello, uno de los oligonucleótidos hibridó
dentro de las secuencias de nucleótidos del pJCB12 adyacentes al
sitio de clonación múltiples (MCS) donde se había insertado el
constructo genético definido. Los otros oligonucleótidos hibridaron
al genoma adyacente pero externo al constructo genético definido.
En una PCR de este tipo, la generación de un fragmento indicaba que
los sitios de enlace para los respectivos oligonucleótidos habían
sido ligados, lo que podría ocurrir si el derivado del pJCB12 está
orientado a la región correcta del genoma.
El vector pJCB12 fue extraído mediante un cultivo
en presencia de un 5% de sacarosa. Los transconjugantes o
transformantes en los que el derivado del pJCB12 estaba dirigido a
la región correcta del genoma fueron extendidos en una placa nueva
de agar L complementada con cloramfenicol y otro antibiótico
apropiado para seleccionar cepas de ETEC (véase el texto anterior)
e incubados a 37ºC para permitir el cultivo de las colonias. Los
cultivos del caldo L inoculados desde estas placas nuevas fueron
cultivados posteriormente. De estos cultivos se cosecharon células
que posteriormente fueron resuspendidas en un caldo de sacarosa al
5%, incubadas durante la noche antes de realizar cultivos en serie
en placas de agar de sacarosa al 5% con el objetivo de seleccionar
recombinantes de los que se hubiera eliminado el derivado del
pJCB12. Las placas de agar de sacarosa inoculadas fueron incubadas
durante la noche y las colonias resultantes fueron sometidas a PCR
utilizando oligonucleótidos adecuados con el objetivo de
identificar mutantes.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
| Cepa | Expresión de antígeno CS | N.º de registro | Fecha de depósito |
| PTL003 o ACM 2005 | CS1, CS3 | 01090302 | 3 de septiembre de 2001 |
| WS-4437A Toxina negativa o ACM 2001 | CFA/I | 01090303 | 3 de septiembre de 2001 |
| WS-3504D Toxina negativa o ACM 2003 | CS2, CS3 | 01090304 | 3 de septiembre de 2001 |
| WS-2773E Toxina negativa o ACM 2002 | CS5, CS6 | 01090305 | 3 de septiembre de 2001 |
| WS-2252A Toxina negativa o ACM 2004 | CS4, CS6 | 01090306 | 3 de septiembre de 2001 |
| ACAM 2007 | CS2, CS3 | 02082964 | 29 de agosto de 2002 |
| ACAM 2008 | CS1, CS3 | 02082965 | 29 de agosto de 2002 |
| ACAM 2009 | CS4, CS6 | 02082966 | 29 de agosto de 2002 |
| ACAM 2010 | CFA/I | 02082967 | 29 de agosto de 2002 |
| ACAM 2012 | CS5, CS6 | 02082968 | 29 de agosto de 2002 |
| ACAM 2013 | CS4, CS5, CS6 | 02082969 | 29 de agosto de 2002 |
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| Cepa | Código | Fenotipo | CFA | LT | ST | EAST1 |
| WS-1858B | A | 071:H- | CFA/I | - | + | + |
| WS-4437A | B | 0128:H12 | CFA/I | - | + | - |
| WS-6117A | C | 0153:H45 | CFA/I | - | + | + |
| WS-2560B | D. | 025:H- | CS4, CS6 | + | + | + |
| WS-2773E | E | 039:H12 | CS5, CS6 | + | + | + |
| WS-4150D | F | 06:H16 | CS2, CS3 | + | - | ? |
| WS-6170A | G | 017:H18 | CS2, CS3 | - | + | ? |
| WS-3504D | H | 0141:H5 | CS2, CS3 | + | + | + |
| WS-3517A | I | 06:H- | CS2, CS3 | - | + | + |
| WS-2252A | J | 015:H18 | CS4, CS6 | + | + | + |
| WS-2511A | K | 04:H- | CS4, CS6 | - | + | + |
| WS-2556A | L | 06:H1 | CS4, CS6 Ninguno | - | + | + |
| WS-4046A | M | 039:H- | Identified | + | - | N.D. |
| N.º de registro del genbank correspondientes a los datos de la secuencia | ||
| EAST1 (astA) | AF143819 | |
| ST (estA) | M18346 | |
| LT-A (eltA) | V00275 | |
| LT-B (eltB) | M17874 | |
| operón CFA/I | M55661 | |
| operón CS1 | M58550 | |
| X62495 | ||
| X76908 | ||
| operón CS2 | Z47800 | |
| operón CS3 | X16944 | |
| operón CS4 | AF296132 | |
| operón CS5 | AJ224079 | |
| operón CS6 | U04844 | |
| cfaD | M55609 | |
| csvR | X60106 | |
| rns | J04166 | |
| parDE RK2 | L05507 | |
| sacB | X02730 | |
| oriR6K | M65025 | |
| mobRP4 | X54459 | |
| cat | V00622 |
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<130> N.84948A
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<150> GB 0121998.9
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
11-09-2001
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<160> 11
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 703
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<212> ADN
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<213> Escherichia coli
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<220>
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<221> gen
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<222> (114)...(629)
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 1714
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<212> ADN
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<213> Escherichia coli
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<220>
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<221> gen
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<222> (1001)...(1714)
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<223> cooB
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 5336
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<212> ADN
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<213> Escherichia coli
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<220>
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<221> gen
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<222> (85)...(2703)
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<223> cooC
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<220>
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<221> gen
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<222> (2700)...(3791)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cooD
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 2116
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<212> ADN
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<213> Escherichia coli
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (559)...(1356)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cfaD
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 5798
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<212> ADN
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<213> Escherichia coli
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<220>
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<221> gen
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<222> (499)...(1215)
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<220>
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<221> gen
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<222> (1255)...(1767)
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<220>
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<220>
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<222> (4451)...(5545)
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<213> Escherichia coli
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<222> (4196)...(5281)
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<221> gen
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<222> (6346)...(6849)
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<213> Escherichia coli
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<222> (1427)...(2038)
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<222> (2096)...(2770)
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<223> csfC
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<220>
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<221> gen
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<222> (5227)...(5838)
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<223> csfE
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<220>
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<221> gen
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<222> (5852)...(6526)
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<223> csF
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
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<222> (6523)...(7644)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> csD
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<400> 9
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<211> 4689
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<212> ADN
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<213> Escherichia coli
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1742)...(2647)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> csvR
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<220>
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<222> (2342)...(4801)
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<223> cssD
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<400> 11
Claims (28)
1. Una célula bacteriana que expresa tres
antígenos de superficie (CS) coli.
2. Una célula según la reivindicación 1 que es
una célula E. coli.
3. Una célula según la reivindicación 2 que es
una célula enterotoxigénica E. coli (ETEC).
4. Una célula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde los antígenos CS son antígenos
CS de ETEC seleccionados de CS1, CS2, CS3, CS4, CS5 y CS6.
5. Una célula según cualquier de las
reivindicaciones anteriores que expresa:
- (a)
- CS1, CS2 y CS3;
- (b)
- CS4, CS5 y CS6; o
- (c)
- CS1, CS3 y CS4.
6. Una célula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores que está atenuada por deleción o
inactivación de un gen.
7. Una célula según la reivindicación 6 que está
atenuada por deleción o inactivación de uno o más genes aroA,
aroC, aroD, aroE, pur, htrA, ompC, ompF, ompR, cya, crp, phoP, phoQ,
surA, rfaY, dksA, hupA, invE y clpB.
8. Una célula según la reivindicación 7 que está
atenuada por deleción o inactivación de:
- (a)
- al menos un gen aro y al menos un gen omp;
- (b)
- al menos un gen aro y el gen htrA; o
- (c)
- cada uno de los genes aroC, ompF y ompC.
9. Una célula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores que no expresa uno o más toxinas
termoestables (ST), toxinas termolábiles (LT) o EAST 1.
10. Una célula según la reivindicación 9 que se
puede obtener:
- (a)
- mediante un método que contempla la deleción de todo parte del gen ST con un vector suicida; o
- (b)
- mediante un método que contempla la deleción o inactivación dirigida de un sitio del gen LT y/o del gen EAST1.
11. Una célula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores que no expresa un gen de resistencia a
antibióticos.
12. Una célula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores que expresa asimismo un antígeno
heterólogo además de tres o más antígenos CS.
13. Una célula según la reivindicación 12 en la
que el antígeno heterólogo es:
- (a)
- un antígeno E. coli; o
- (b)
- un componente o forma no tóxico de la LT.
14. Una célula según la reivindicación 13 en la
que el componente no tóxico de la LT es la subunidad B.
15. Una célula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores que se puede obtener mediante un método
que contempla la introducción de un polinucleótido que codifica un
antígeno CS heterólogo en una célula bacteria-
na.
na.
16. Una célula según la reivindicación 15 en la
que el polinucleótido contiene un el operón del antígeno CS
heterólogo.
17. Una célula según la reivindicación 15 o 16 en
la que el método contempla la introducción de un polinucleótido que
codifica una proteína reguladora en la célula.
18. Una célula cualquiera de las reivindicaciones
15 a 17 en la que la secuencia de codificación del antígeno CS
heterólo es:
- (a)
- transportada en un plásmido estable en la célula; o
- (b)
- es insertado en el cromosoma bacteriano de la célula.
19. Una célula según fue depositada en el ECACC
con el n.º de registro 02082969.
20. Una vacuna contra la diarrea que incluye una
célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y un
transportador o diluyente farmacológicamente aceptable.
21. Una vacuna contra la diarrea que incluye
células bacterianas que conjuntamente expresan todos los CFA/I,
CS1, CS2, CS3, C34, CS5 y CS6, teniendo en cuenta que la vacuna
contiene menos de cinco cepas bacterianas.
22. Una vacuna según la reivindicación 21 que
contiene tres cepas bacterianas.
23. Una vacuna según la reivindicación 22 que
contiene:
- (i)
- una cepa que expresa CS1, CS2 y CS3;
- (ii)
- una cepa que expresa CS4, CS5 y CS6; y
- (iii)
- una vacuna que expresa CFA/I.
24. Una célula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19 o una vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 23 para su uso en un método de vacunación
contra la diarrea.
25. Una célula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19 para la fabricación de un medicamento para
la vacunación contra la diarrea.
26. Un método para la creación de células según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 que contempla la
introducción de un polinucleótido que codifica un antígeno CS
heterólogo en la célula bacteriana.
27. Un método según la reivindicación 26 en el
que el polinucleótido contiene el operón del antígeno CS
heterólogo.
28. Un método según las reivindicaciones 26 o 27
que contempla:
- (i)
- introducción de un polinucleótido que codifica el antígeno CS4 de ETEC en una célula CS5/CS6 ETEC; o
- (ii)
- introducción de un polinucleótido que codifica el antígeno CS1 de ETEC en una célula CS2/CS3 ETEC;
- (iii)
- introducción de un polinucleótido que codifica el antígeno CS5 de ETEC en una célula CS4/CS6 ETEC; o
- (iv)
- introducción de un polinucleótido que codifica el antígeno CS4 de ETEC en una célula CS1/CS3 ETEC.
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