DE60207278T2

DE60207278T2 - Attenuierte bakterien verwendbar als impfstoff

Info

Publication number: DE60207278T2
Application number: DE60207278T
Authority: DE
Inventors: Arthur K. Turner; Judith Greenwood; Jonathan C. Stephens; Juliet C. Beavis; Michael J. Darsley
Original assignee: Acambis Research Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Holding Ltd
Priority date: 2001-09-11
Filing date: 2002-09-11
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2022-09-12
Also published as: ATE308992T1; EP1425037B1; EP1425038B1; US8318148B2; DE60207277D1; ATE308991T1; EP1425037A2; WO2003022307A1; AU2002321644B2; CA2459586A1; DK1425038T3; DK1425038T4; DK1425037T3; US20040253710A1; DE60207278D1; ES2256515T3; US7943122B2; CA2460025A1; US20050054075A1; EP1425038B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft abgeschwächte Bakterien, die in Vakzinen nützlich sind.
Hintergrund der Erfindung
Das Prinzip, das hinter einer Impfung steht, ist das Herbeiführen einer Immunreaktion in dem Rezipienten, wodurch ein Schutz gegen eine darauffolgende Herausforderung durch ein Pathogen bereitgestellt wird. Dies kann durch Inokulierung mit einem lebenden abgeschwächten Stamm eines Pathogens erreicht werden, d. h. mit einem Stamm, der eine reduzierte Virulenz aufweist, so dass er keine Krankheit auslöst, die durch das virulente Pathogen verursacht wird, während er dennoch eine breite Immunreaktion stimuliert.
Mit Hilfe moderner Gentechniken ist es heute möglich, positionsgerichtete abgeschwächte bakterielle Stämme zu konstruieren, in denen stabile abschwächende Deletionen geschaffen worden sind. Eine Anzahl von positionsgerichteten Mutanten von Salmonella wurden mit Hilfe dieser Art der Technologie erzeugt (2, 7, 9, 14, 19, 35, 36, 37). Über Mutationen in einer großen Anzahl von Genen wurde berichtet, dass sie abschwächend wirken, dazu zählen die aro-Gene (z. B. aroA, aroC, aroD und aroE (15, 18)), pur, htrA (4), ompR, ompF, ompC (2), galE (14), cya, crp (7), phoP (13, 19), rfaY (48), dksA (48), hupA (48), sipC (48) und clpB (48).
Eine Bakteriumsklasse, die mit Hilfe dieser modernen Gentechniken abgeschwächt wurde, ist enterotoxigenes Escherichia coli (ETEC), das Diarrhoe hervorruft. Die Virulenz von (ETEC) Stämmen hängt von ihrer Expression von fimbrialen Kolonisationsfaktorantigenen (CFAs) ab, welche ihnen ermöglichen, sich an die Schleimhautoberfläche des Dünndarms ihrer Wirtsspezien zu heften und diese zu kolonisieren. Humane angepasste ETEC-Stämme exprimieren eine Reihe von CFAs, wobei am häufigsten CFA/I, CFA/II (umfassend CS3, das entweder mit CS1 oder CS2 exprimiert wird) und CFA/IV (umfassend CS6, das alleine oder entweder mit CS4 oder CS5 exprimiert wird) auftreten. In Abhängigkeit von der geographischen Lage machen CFA/I, CFA/II und CFA/IV zwischen 50 und 80 % der ETEC-Stämme aus. Viele andere CFAs wurden beschrieben, wobei man diese jedoch jeweils nur in einem kleinen Anteil von ETEC-Stämmen (33) findet. Es gibt Beweise dafür, dass Anti-CFA-Immunreaktionen für den Schutz vor einer ETEC-Erkrankung (6, 24, 28, 29, 30) wichtig sind.
Die Kolonisierung des Dünndarms wird durch die Sekretion von Enterotoxinen begleitet. Zwei Arten von Enterotoxinen wurden bei ETEC-Stämmen identifiziert, das hitzelabile Toxin (LT) und das hitzestabile Toxin (ST). LT ist strukturmäßig zum Cholera-Toxin, einem Multi-Untereinheiten-Protein der Form AB₅, homolog. Die A-Untereinheit ist die aktive Komponente des Toxins, welche bewirkt, dass die Aktivität der Adenylatcyclase verstärkt wird. Diese wird in die Wirtszellen durch die B-Untereinheiten geliefert, welche an Ganglioside auf der Zelloberfläche binden. ST ist ein kleines (19 Aminosäure) nicht-immunogenes Polypeptid, das eine Guanylatcyclase stimulierende Aktivität aufweist. Zudem wurde vor kurzem nachgewiesen, dass ein großer Anteil von ETEC-Stämmen auch EAST1 produziert, ein hitzestabiles Toxin, das eine ähnliche Größe und eine ähnliche Wirkungsweise wie ST aufweist, jedoch eine andere Sequenz hat und das ursprünglich in enteroaggregativen E.coli-Stämmen (34) identifiziert wurde.
Es wurde vorgeschlagen, dass Derivate von ETEC-Stämmen, welche die Fähigkeit verloren haben, Toxine zu produzieren, wirksame Lebendvakzine gegen virulente Isolate sein können. Ein Derivat eines Wildtyp-ETEC-Stammes, E1392/75, das spontan die ST- und LT-Aktivitäten verloren hat, aber weiterhin CFA/II exprimiert, wurde identifiziert und als E1392/75-2A (5) bezeichnet. In Studien, die mit freiwilligen humanen Probanden durchgeführt wurden, ergab eine orale Impfung mit 2 × 10¹⁰ cfu E1392/75-2A einen 75%-igen Schutz vor einer Herausforderung mit einem toxinexprimierenden ETEC aus einem anderen Serotyp, aber welches dieselbe CFAs (überprüft durch (30)) exprimierte. Bei ungefähr 15 % der Geimpften kam es jedoch zu leichter Diarrhoe als Nebenwirkung der Vakzine. Daraus wurde geschlossen, dass eine weitere Abschwächung des Stammes erforderlich sei, bevor er für eine Verwendung als Lebendvakzine gegen ETEC-Infektionen in Betracht gezogen werden kann.
Zwei Derivate von E1392/75-2A wurden durch gezielte Deletion von potentiellen abschwächenden Genen erzeugt und in klinischen Versuchen (32, 38) evaluiert. Es wurde gezeigt, dass beide Derivate (PTL002, ΔaroC/ΔompR und PTL003, ΔaroC/ΔompC/ ΔompF) im Vergleich zum Mutterstamm abgeschwächt waren und keine klinischen Symptome bei den Freiwilligen hervorriefen, welche bis zu 5 × 10⁹ cfu von frisch geernteten Lebendorganismen aufgenommen haben. Alle Freiwilligen, welche die Maximaldosis dieser Kandidatenvakzine erhielten, erzeugten spezifische Immunreaktionen gegen das CFA/II-Antigen, das durch die Stämme exprimiert wurde.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine wirksame Vakzine gegen ETEC muss mindestens gegen CFA/I, CFA/II und CFA/IV immunisieren, und daher sind abgeschwächte Stämme notwendig, die all diese Antigene exprimieren. Somit ist es erforderlich, dass die Gene, welche die Toxine LT, ST und EAST1 exprimieren, inaktiviert oder aus den Stämmen deletiert werden, welche alle diese CFAs exprimieren. Toxin-Minus-Stämme wurden zuvor als Ausgangspunkt für die Entwicklung einer abgeschwächten Multistamm-Lebendvakzine gegen ETEC (Chatfield, 38) vorgeschlagen. Es findet sich bei Chatfield jedoch keine Erklärung, wie solche Stämme erzeugt werden könnten.
Wir haben nun festgestellt, dass es bestimmte Schwierigkeiten in Zusammenhang mit der Erzeugung eines Stammes gibt, der CFA/I exprimiert, oder eines Stammes, der CS5 und CS6 exprimiert, aus dem die Toxingene, insbesondere das ST-Gen, deletiert worden sind. Wir haben eine neuartige Strategie und einen Suizid-Vektor entwickelt, um diese Schwierigkeiten zu lösen und Toxin-Minus-Formen dieser Stämme herzustellen.
Ohne durch diese Theorie gebunden zu sein, glauben wir, dass der Grund, dass ST-Minus-Formen von Stämmen, welche CFA/I oder CS5 und CS6 exprimieren, schwer zu erzeugen waren, darin lag, dass die CFA/CS-Gene eng mit dem ST-Gen verbunden sind und sich auf demselben Plasmid befinden. In einer globalen Prüfung epidemiologischer Studien, in denen ausreichend Daten gesammelt (33) worden waren, wird darüber berichtet, dass von 204 CFA/I exprimierenden Stämmen alle 204 von diesen ST exprimierten, entweder alleine (149/204) oder in Kombination mit LT (55/204). Ferner haben neuere Studien diese Erkenntnis bestätigt, z. B. Qadri et al (22), wo von 87 CFR/I exprimierenden Stämmen alle über einen Zeitraum von zwei Jahren in Bangladesh isolierten Stämme ST entweder alleine oder in Kombination mit LT exprimierten. Es wurden keine Stämme identifiziert, welche CFA/I und LT alleine exprimierten, was auf eine extrem enge genetische Verbindung zwischen den ST- und CFA/I-Loci hinweist. Zahlreiche wissenschaftliche Arbeiten dokumentieren die enge Verbindung zwischen CFA/I- und ST-Genen in ETEC-Stämmen, so dass, wann immer der Versuch unternommen wurde, einen Stamm zu gewinnen, der einen dieser Loci verloren hat, immer auch der andere gleichzeitig verloren ging. Uns ist kein Fall bekannt, in dem es möglich gewesen ist, die zwei Loci durch Deletion oder Inaktivierung des ST-Gens zu trennen und einen Stamm zu erzeugen, der noch immer CFA/I (42-46) exprimiert.
Die Erfindung stellt eine bakterielle Zelle bereit, welche Kolonisationsfaktorantigen CFA/I von einem nativen Plasmid exprimiert, jedoch nicht hitzestabiles Toxin (ST} exprimiert. Ferner stellt die Erfindung eine bakterielle Zelle bereit, welche Kolonisationsfaktorantigen CS5 von einem nativen Plasmid und/oder Kolonisationsfaktorantigen CS6 von einem nativen Plasmid exprimiert, jedoch nicht hitzestabiles Toxin (ST) exprimiert. Das LT-Gen und das EAST1-Gen können in den Zellen der Erfindung auch deletiert oder inaktiviert werden. Die Zellen enthalten im Allgemeinen außerdem abschwächende Mutationen, wie Mutationen in jedem von aroC-, ompF- und ompC-Genen, um sie für die Verwendung in Vakzinen geeignet zu machen.
Die Zellen der Erfindung können gentechnisch hergestellt werden, um ein heterologes Antigen zu exprimieren, beispielsweise eine nicht-toxische Komponente oder Form von LT, oder ein Kolonisationsfaktorantigen (CFA). Solche Zellen führen eine Immunreaktion gegen das heterologe Antigen sowie die nativen Antigene herbei und verbessern somit den durch die Vakzine bereitgestellten Schutz.
Die Erfindung enthält eine Vakzine gegen Diarrhoe, welche die Zellen der Erfindung enthält. Vorzugsweise enthält die Vakzine eine Mischung aus verschiedenen Zellen, die untereinander alle die häufigsten CFAs tragen, nämlich CFA/I, CFA/II und CFA/IV.
Ferner stellt die Erfindung einen Suizid-Vektor und ein Verfahren bereit, das eine verlässliche und schnelle Isolierung der Zellen der Erfindung und anderer bakterieller Zellen ermöglicht, die deletierte, inaktivierte oder ersetzte Gene enthalten. Der Vektor stellt insofern eine Verbesserung gegenüber bekannten Suizid-Vektoren dar, als dass er ein spezifischeres und verlässlicheres Targeting als bekannte Vektoren ermöglicht. Der Vektor weist eine Größe von weniger als 5 kb auf (z. B. von 2,5 bis 5 kb oder von 2,5 bis 4 kb) und umfasst die sacB-Region, die für ein Produkt codiert, das für Bakterien toxisch ist, wenn auf Sucrose gezüchtet, in welcher Region die IS1-Insertionssequenz deletiert oder inaktiviert ist. Die geringe Größe des Vektors und die Abwesenheit der IS1-Insertionssequenz helfen, zu vermeiden, dass der Vektor die falsche Stelle in der zellulären DNA targetiert.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Für die Erfindung nützliche Bakterien
Die bakteriellen Zellen der Erfindung werden im Allgemeinen aus enterotoxigenen E. coli (ETEC)-Zellen durch Deletion oder Inaktivierung des ST-Gens und wahlweise anderer Toxin-Gene gewonnen. Wie oben erwähnt, handelt es sich bei ETEC um eine Klasse von E.coli, die Diarrhoe auslöst. Sie kolonisieren den Dünndarm. Sie können von humanen klinischen Proben isoliert werden, typischer Weise von Stuhlproben, die erzeugt werden, während die Diarrhoe andauert. Ein standardmäßiger ETEC-Stamm ist H10407, hinterlegt bei ATCC unter der Katalognummer #35401.
ETEC-Infektionen sind die häufigste Einzelursache von Reisediarrhoe, wobei pro Jahr unter Besuchern von Entwicklungsländern drei bis neun Millionen Fälle auftreten. In endemischen Gebieten sind ETEC-Infektionen eine bedeutende Ursache für dehydrierende Diarrhoe bei Säuglingen und Kleinkindern und verursachen bis zu 400.000 Todesfälle pro Jahr, vorwiegend in der genannten Altersgruppe. In Entwicklungsländern nimmt die Inzidenz von ETEC-Infektionen, die zu klinischen Erkrankungen führen, mit dem Alter ab, was darauf hinweist, dass eine Immunität gegenüber einer ETEC-Infektion erreicht werden kann. Naive Erwachsene aus Industrieländern hingegen, welche endemische Gebiete besuchen, sind für ETEC-Infektionen hoch anfällig. Durch längere oder wiederholte Besuche in endemischen Gebieten nimmt die Anfälligkeit für ETEC-Infektionen jedoch ab, was darauf hinweist, dass sich ein Ansatz mit einer abgeschwächten Lebendvakzine in Form einer ETEC-Impfung als erfolgreich erweisen kann.
Eine Vakzine zum Schutz vor ETEC-Diarrhoe in Menschen muss einen Schutz vor den sieben Hauptkolonisationsfaktoren und mindestens dem hitzelabilen Toxin (LT) bieten, um zu gewährleisten, dass ein Schutz gegen unterschiedliche Stämme erzielt wird. Um dieses Ziel zu erreichen, könnten dieselben Abschwächungen in einer Reihe von unterschiedlichen ETEC-Stämmen durchgeführt werden, jeweils mit einem unterschiedlichen Kolonisationsfaktor. Dies würde das Deletieren der Toxine von allen diesen Stämmen bedeuten. Die vorliegende Erfindung stellt eine Gruppe von geeigneten Stämmen bereit, aus denen alle Toxingene vollständig deletiert wurden und welche den Ausgangspunkt für die Erzeugung einer Multistamm-Vakzine schaffen kann. Alternativ dazu könnte es möglich sein, mehrere Kolonisationsfaktoren in einer kleineren Anzahl von Stämmen zu exprimieren, aus denen die Toxine in ähnlicher Weise deletiert worden sind.
Toxin-deletierte Stämme der vorliegenden Erfindung wurden aus klinischen Wildtyp-Isolaten gewonnen, die aus einer langfristigen epidemiologischen Studie erhalten wurden, die in Ägypten von Wissenschaftlern an der US Navy NAMRU3 in Kairo durchgeführt worden ist. Eine Liste der bereitgestellten Stämme ist in nachstehender Tabelle enthalten.
Fachleuten wird klar sein, dass andere Stämme ebenso als Ausgangspunkt für die Erzeugung einer toxindeletierten, abgeschwächten Multistamm-Vakzine geeignet sein können.
Die Stämme mit den Codes A, B, E, H & J wurden durch die spezifische Entfernung aller bekannten Toxingene abgeschwächt und danach weiter behandelt, so wie in den beiliegenden Beispielen beschrieben. Die resultierenden Toxin-Minus-Stämme und der Stamm PTL003, die oben beschrieben sind, wurden von Acambis Research Limited von Peterhouse Technology Park, 100 Fulbourn Road, Cambridge, CB1 9PT, Vereinigtes Königreich bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Vereinigtes Königreich, am 3. September 2001 (Zugriffsnummer 010903**) bzw. am 29. August 2002 (Zugriffsnummer 020829**) gemäß dem Budapester Abkommen hinterlegt. Die Eigenschaften der Stämme und die Zugriffsnummern der hinterlegten Stämme lauten wie folgt:
Zusätzlich zu den Stämmen, die in obiger Tabelle enthalten sind, wurde ein Toxin-Minus-Derivat von Stamm B, beschrieben in Beispiel 2 unten, unter der Zugriffsnummer 01090303 hinterlegt.
Die Erfindung enthält „Abkömmlinge" dieser hinterlegten Zellen. Ein „Abkömmling" ist jegliche Zelle, die aus einer hinterlegten Zelle gewonnen wird. Die Abkömmlinge einer hinterlegten Zelle enthalten Zellen mit einer oder mehreren weiter abschwächenden Mutationen, beispielsweise den unten beschriebenen Mutationen. Zu den Abkömmlingen zählen auch Zellen, die hergestellt wurden, um heterologe Antigene zu exprimieren, beispielsweise die unten beschriebenen heterologen Antigene.
Obwohl die Bakterien der Erfindung im Allgemeinen E.coli-Bakterien sind, können andere Arten von Bakterien verwendet werden. Ein Plasmid gemäß der Erfindung kann durch Deletieren oder Inaktivieren des ST-Gens in einem Plasmid, das zum enterotoxigenen E.coli nativ ist, und durch anschließendes Transferieren des resultierenden Plasmids auf ein anderes Bakterium konstruiert werden. Auf diese Weise kann das andere Bakterium dazu gebracht werden, das CFA/I-Antigen oder das CS5- oder das CS6-Antigen zu tragen.
Die Bakterien, die verwendet werden, um die Vakzine der Erfindung herzustellen, sind im Allgemeinen jene, welche auf oralem Wege infizieren. Die Bakterien können solche sein, die eukaryotische Zellen befallen und innerhalb dieser wachsen und/oder Schleimhautoberflächen kolonisieren. Die Bakterien sind im Allgemeinen gramnegativ, wobei in einigen Ausführungsformen auch grampositive Bakterien verwendet werden können. Die Bakterien sind im Allgemeinen Pathogene.
Die verwendeten Bakterien können von der Gattung Escherichia, Salmonella, Shigella oder Vibrio sein.
Abgesehen von E. coli sind Beispiele für die Bakterienspezies, die in der Erfindung verwendet werden können, Salmonella typhimurium – die Ursache von Salmonellose in einigen Tierspezien; Salmonella typhi – die Ursache von menschlichem Typhus; Salmonella enteritidis – eine Ursache von Lebensmittelvergiftung bei Menschen; Salmonella choleraesuis – eine Folge von Salmonellose bei Schweinen; und Salmonella dublin – einer Ursache von systemischer und Diarrhoe-Erkrankung bei Rindern, insbesondere bei neugeborenen Kälbern.
Stämme von E.coli und Salmonella sind bei der Erfindung besonders nützlich. Salmonella sind mächtige Immunogene und in der Lage, systemische und lokale, zelluläre und Antikörper-Reaktionen zu stimulieren. Insbesondere wird zur Verwendung in der Erfindung ein abgeschwächter Stamm von Salmonella typhi bevorzugt. Bevorzugte Salmonella typhi-Stämme zur Verwendung in der Erfindung schließen CVD908-htrA (ΔaroC ΔaroD ΔhtrA) und CVD908 (ΔaroC ΔaroD) (49) ein. Stämme von E.coli, die nicht ETEC sind und verwendet werden können, sind u. a. E.coli (EPEC), enteroinvasives E.coli (EIEC) und enterohämorrhagisches E.coli (EHEC).
So wie hierin verwendet, stehen die Bezugnahmen auf ein „natives" Plasmid, welches CFA/I oder CS5/6 exprimiert, für ein Plasmid, das in Wildtyp-Zellen existiert, z. B. ETEC-Zellen, die von einer Person mit Diarrhoe isoliert wurden. Sie schließen ein Plasmid aus, das im Labor für die Expression von CFA/I oder CS5/6 konstruiert wurde. In einer Zelle der Erfindung wird das ST-Gen in dem nativen Plasmid deletiert oder inaktiviert. Das CFA/I- oder CS5/6-Gen in dem Plasmid ist jedoch funktionell, d. h. es exprimiert CFA/I oder CS5/6.
Weiteres Mutieren der Bakterien
Damit die Bakterien in einer Vakzine verwendet werden können, müssen sie im Allgemeinen weiter abgeschwächt werden. Die Abschwächung kann zum Beispiel durch Deletieren oder Inaktivieren von einem oder mehreren der folgenden Gene erfolgen: aroA, aroC, aroD, aroE, pur, htrA, ompC, ompF, ompR, cya, crp, phoP, surA, rfaY, dksA, hupA, sipC und clpB. Zu den bevorzugten Kombinationen von Genen gehören:

– mindestens ein aro-Gen (z. B. aroA, aroC, aroD oder aroE) und mindestens ein omp-Gen (z. B. ompC, ompF oder ompR);
– mindestens ein aro-Gen (z. B. aroA, aroC, aroD oder aroE) und das htrA-Gen;
– aroC, ompF und ompC.

Die weiterhin abschwächenden Mutationen können unter Verwendung des Suizid-Vektors und der Verfahren der Erfindung oder durch den Fachleuten bekannte Verfahren (siehe Literaturverzeichnis, 25) eingeführt werden. Geeignete bekannte Verfahren schließen das Klonieren der DNA-Sequenz in einen Vektor, d. h. ein Plasmid, und das Einfügen eines selektierbaren Markers in die klonierte DNA-Sequenz oder das Deletieren eines Teils der DNA-Sequenz ein, was zu ihrer Inaktivierung führt. Eine Deletion kann zum Beispiel durch Schneiden der DNA-Sequenz unter Verwendung von Restriktionsenzymen eingeführt werden, die an zwei Punkten in oder knapp außerhalb der Codiersequenz schneiden und die zwei Enden in der verbleibenden Sequenz ligieren. Alternativ dazu – wobei dies heutzutage üblicher ist – kann ein mutantes Allel, in welchem die flankierenden Regionen eines Zielgens getrennt amplifiziert und direkt miteinander in einer getrennten Überlappungs-PCR-Reaktion verbunden werden, mit Auslassung der dazwischen liegenden Zielsequenz, konstruiert werden (32). Ein Plasmid, das die mutierte DNA-Sequenz trägt, kann mit Hilfe von bekannten Techniken, beispielsweise Elektroporation und Konjugation, in das Bakterium transformiert werden. Danach ist es durch geeignete Selektion möglich, einen Mutanten zu identifizieren, wobei die inaktivierte DNA-Sequenz in das Chromosom des Bakteriums rekombiniert hat und die Wildtyp-DNA-Sequenz durch homologe Rekombination nicht-funktionell gemacht wurde.
Ferner müssen die Antibiotikresistenzgene im Allgemeinen aus den Bakterien entfernt werden, bevor sie in einer Vakzine verwendet werden. Bakterien, die aus der Wildnis isoliert werden, enthalten oft Antibiotikresistenzgene, beispielsweise Resistenzgene gegen Ampicillin, Streptomycin, Sulphmethoxazol, Kanamycin, Trimetheprim und Tetracyclin. Diese Gene können mit Hilfe des Suizid-Vektors und Verfahren der Erfindung oder durch Fachleuten bekannte Verfahren entfernt werden.
Natur der Mutationen
Die Mutationen, die in die bakterielle Vakzine eingeführt werden, um Expression von Enterotoxinen oder anderen Virulenzgenen zu vermeiden, deletieren oder inaktivieren das Gen. Sie schalten im Allgemeinen die Funktion des Gens vollständig aus. Dies kann entweder durch vollständiges Abschaffen der Synthese eines Polypeptids von dem Gen oder durch Schaffen einer Mutation erfolgen, die zu Synthese von nicht-funktionellem Polypeptid führt. Um die Synthese von Polypeptid abzuschaffen, kann entweder das gesamte Gen oder sein 5'-Ende deletiert werden. Eine Deletion oder Insertion innerhalb der Codiersequenz eines Gens kann verwendet werden, um ein Gen zu schaffen, das nur nicht-funktionelles Polypeptid synthetisiert (z. B. Polypeptid, das nur die N-terminale Sequenz von dem Wildtyp-Protein enthält). In dem Fall eines Toxingens kann die Mutation das Genprodukt nicht-toxisch machen.
Die Mutationen sind im Allgemeinen nicht-revertierende Mutationen. Dies sind Mutationen, welche im Wesentlichen keine Reversion zurück zum Wildtyp zeigen, wenn das Bakterium als Vakzine verwendet wird. Solche Mutationen enthalten Insertionen und Deletionen. Insertionen und Deletionen sind vorzugsweise groß, typischer Weise mindestens 10 Nukleotide in der Länge, bis zu der Länge des gesamten Gens oder der Codierungssequenz, zum Beispiel von 10 bis 600 Nukleotiden. Vorzugsweise ist die gesamte Codierungssequenz oder das gesamte Gen deletiert.
Die Mutationen sind typischer Weise positionsgerichtet. Sie können spezifisch oder selektiv in Bezug auf das Toxin-Gen oder ein anderes Virulenzfaktor-Gen sein. Im Fall des Deletierens oder Inaktivierens des ST-Gens in einem CFA/I- oder CS5/CS6-Stamm muss die Mutation spezifisch das ST-Gen targetieren, ohne das (eng verbundene) CFA/I-Gen, CS5-Gen oder CS6-Gen zu deletieren oder zu inaktivieren.
Expression von heterologen Antigenen
Ein abgeschwächtes Bakterium der Erfindung kann gentechnisch hergestellt werden, um ein Antigen zu exprimieren, das nicht durch das native Bakterium exprimiert wird (ein „heterologes Antigen"), so dass das abgeschwächte Bakterium als ein Träger des heterologen Antigens dient. Für den Fall, dass das Bakterium ein ETEC-Bakterium ist, kann das Antigen von einer anderen Spezies oder von einem anderen ETEC-Stamm kommen, so dass die Vakzine Schutz gegen die andere Spezies oder den anderen Stamm bietet. Ferner kann das Bakterium so verändert werden, dass es mehr als ein heterologes Antigen exprimiert, in welchem Fall die heterologen Antigene aus denselben oder aus unterschiedlichen Spezien oder Stämmen sein können.
Das heterologe Antigen kann ein vollständiges Protein, ein Teil eines Proteins, das ein Epitop enthält, oder ein Fusionsprotein sein. Das Antigen kann aus einem anderen Bakterium einem Virus, einer Hefe oder einem Pilz stammen. Insbesondere kann die Antigensequenz als einem pathogenen Stamm von E.coli (z. B. ETEC) stammen. Nützliche Antigene sind u. a. ETEC-Kolonisationsfaktorantigene, nicht-toxische Komponenten oder nicht-toxische Mutanten von E.coli LT (z. B. die B-Untereinheit und Mutanten der A-Untereinheit), LT-ST-Fusionsproteine und Cholera-Toxin-B-Untereinheit (CT-8) (50-55).
Die ETEC CFAs und Komponenten davon sind erstrangige Kandidaten für die Expression als heterologe Antigene. Um eine Diarrhoe-Erkrankung hervorzurufen, müssen pathogene Stämme von ETEC in der Lage sein, den Dünndarm zu kolonisieren und Enterotoxine zu entwickeln. Bei den meisten ETEC-Stämmen wurden CFAs identifiziert, welche für die Adhäsion an der Darmschleimhaut verantwortlich sind. In beinahe allen Fällen werden CFAs als Fimbrien auf der Außenfläche der Bakterien exprimiert. Eine große Anzahl von CFAs wurde identifiziert, wobei die häufigsten CFA/I, CFA/II (schließt CS1, CS2, CS3 ein) und CFA/IV (schließt CS4, CS5, CS6 ein) sind. Weitere Antigene sind unter anderem CS17, CS7, CS9, CS14, CS12, PCFO159, PCFO166.
Die DNA, welche das heterologe Antigen codiert, kann von einem Promotor exprimiert werden, der in vivo aktiv ist. Promotoren, deren gute Wirkung nachgewiesen wurde, sind der nirB-Promotor(10, 39), der htrA-Promotor (10), der pagC-Promotor (57) und der ssaH-Promotor (58). Für die Expression der ETEC-Kolonisationsfaktorantigene oder Derivate von LT, CT oder ST könnten die Wildtyp-Promotoren verwendet werden.
Ein DNA-Konstrukt, das den Promotor umfasst, der wirkungsmäßig mit der DNA verbunden ist, welche das heterologe Antigen codiert, kann hergestellt und in das abgeschwächte Bakterium mit Hilfe herkömmlicher Techniken transformiert werden. Transformanten, weiche das DNA-Konstrukt enthalten, können zum Beispiel durch Screening für einen selektierbaren Marker auf dem Konstrukt ausgewählt werden. Bakterien, welche das Konstrukt enthalten, können in vitro gezüchtet werden, bevor sie für das Verabreichen an den Wirt zu Impfzwecken formuliert werden.
Plasmidstabilisierung
Um den Verlust des Plasmids, welches das heterologe Antigen exprimiert, oder eines nativen Plasmids zu verhindern, kann ein Element zum Plasmid hinzugefügt werden, das seine Stabilität verstärkt. Es ist im Allgemeinen so, dass die Plasmide, die in ETEC-Stämmen gefunden werden, welche die verschiedenen Kolonisationsfaktorantigene codieren, eine geringe Kopieanzahl aufweisen und stabil genug sind, um ihre Aufrechterhaltung über viele Generation in Abwesenheit von spezifischen Selektionsmechanismen sicherzustellen. Dennoch können nach der Manipulation dieser Plasmide gemäß der Erfindung, zum Beispiel, um Gene für Toxine wie ST oder andere Virulenzdeterminanten zu deletieren, diese stabilen Eigenschaften beeinträchtigt sein. Dieses Problem kann durch die Anwendung von Verfahren für die Verbesserung der Plasmidstabilität gelindert werden.
Es gibt eine Reihe von „Toxin/Antitoxin"-Plasmidstabilitätsbestimmungssystemen, die bekannt sind, zum Beispiel parDE (23) von dem Plasmid RP4 (1), und hok/sok (auch bekannt als parB von dem Plasmid R1 oder pndAB aus dem Plasmid R483 (11, 12)), die zu diesem Zweck verwendet werden könnten. Diese Systeme codieren zwei Funktionen: erstens eine toxische Einheit, welche Zellen töten würde, in denen sie exprimiert ist, und die eine lange biologische Halbwertszeit hat, und zweites eine antitoxische Einheit, welche dieses Töten verhindert, aber über eine kurze biologische Halbwertszeit verfügt. Für den Fall, dass ein Plasmid, das diese Funktionen codiert, während der Teilung segregiert wird, erschöpft die Tochterzelle, welche das Plasmid nicht enthält, ihre Versorgung mit Antitoxin und wird durch die persistierendere Toxinhälfte getötet. Somit werden nur Zellen, welche weiterhin das Plasmid enthalten, in der wachsenden Population gehalten.
Ein weiteres System, das verwendet werden kann, um die Stabilität eines Plasmids gemäß der Erfindung zu verstärken, ist ein Multimerauflösungssystem. Multimerauflösungssysteme verleihen Stabilität durch Auflösen von Plasmidmultimeren in einzelne Plasmidkopien und verringern somit die Wahrscheinlichkeit, dass freie Plasmidtochterzellen durch zufällige Segregation bei der Zellteilung erzeugt werden. Eine Reihe von positionsspezifischen Rekombinationssystemen, die bewirken, dass Plasmidmultimere in Monomere aufgelöst werden, wurden identifiziert. Gemäß eines solchen Systems enthält das zu stabilisierende Plasmid eine Erkennungsstelle für eine positionsspezifische Rekombinase und die Wirtszelle enthält eine DNA-Sequenz, welche eine positionsspezifische Rekombinase codiert. Die Rekombinase wirkt auf die Erkennungsposition und steuert dadurch die ordnungsgemäße Segregation des Plasmids während der Zellteilung. Die Rekombinase kann auf dem zu stabilisierenden Plasmid oder in dem Chromosom der Wirtszelle codiert werden.
Die Rekombinase ist im Allgemeinen eine Resolvase. Beispiele für Resolvasen, die bei der Erfindung verwendet werden können, sind zum Beispiel die Cre-Rekombinase von Plasmid P1, das E.coli XerC (ArgR)-Protein, die D-Protein-Rekombinase von Plasmid F, die ParA-Rekombinasen der Plasmide RP4 und RK2, die positionsspezifische Rekombinase von Plasmid R1, Resolvasen, die von den Tn3-ähnlichen transponiblen genetischen Elementen codiert werden, und die Rsd-Resolvase aus dem Salmonella dublin-Virulenzplasmid.
Die Erkennungselemente, die in der Erfindung verwendet werden können, sind u. a. jene für die oben genannten Rekombinasen. Alle Erkennungselemente, die durch die verwendete positionsspezifische Rekombinase erkannt werden, können verwendet werden. Zu den geeigneten Erkennungselementen gehören jene Positionen, die von der XerC-positionsspezifischen Rekombinase erkannt werden, beispielsweise die cer-Position des Plasmids ColE1 und die ähnliche ckr-Position des Plasmids ColK (59), die psi-Position des Plasmids pSC101 und die cer-ähnliche Position des Plasmids pHS-2 von Shigella flexneri. Andere Erkennungselemente, die verwendet werden können, sind unter anderem die crs-Position von dem Salmonella dublin-Virulenzplasmid, die loxP-Position des Plasmids P1, die rfs-Position des F-Plasmids und die res-Position des Tn3-ähnlichen transponierbaren genetischen Elementes.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Rekombinase die Rsd-Resolvase, die über das crs-Erkennungselement wirkt. Das Rsd/crs-System wird im Detail in unserer ebenfalls anhängigen UK-Patentanmeldung Nr. 0024203.2 beschrieben.
Formulierung von Vakzinen
Die Erfindung stellt eine Vakzine gegen Diarrhoe bereit, welche eine E.coli-Zelle der Erfindung und einen pharmazeutisch geeigneten Träger oder ein Verdünnungsmittel umfasst. Im Allgemeinen enthält die Vakzine eine Mischung aus unterschiedlichen Toxin-Minus-Zellen (z. B. 2, 3, 4, 5 oder 6 Zellen), die unter sich alle die häufigsten CFAs tragen. Zum Beispiel kann die Vakzine fünf unterschiedliche Stämme von Toxin-Minus-Zellen so wie nachstehend angeführt enthalten:

(i) eine Zelle, die CFA/I exprimiert (z. B. ECACC-Zugriffsnummer 01090303 oder 02082967)
(ii) eine Zelle, die CS5 und CS6 exprimiert (z. B. ECACC-Zugriffsnummer 01090305 oder 02082968);
(iii) eine Zelle, die CS4 und CS6 exprimiert (z. B. ECACC-Zugriffsnummer 01090306 oder 02082966);
(iv) eine Zelle, die CS2 und CS3 exprimiert (z. B. ECACC-Zugriffsnummer 01090304 oder 02082964); und
(v) eine Zelle, die CS1 und CS3 exprimiert (z. B. PTL003, ECACC-Zugriffsnummer 01090302 oder 02082965).

Wie oben erwähnt, wurde die unter der ECACC-Zugriffsnummer 01090302 (PTL003) hinterlegte Zelle bereits in zwei klinischen Versuchen getestet, und es wurde gezeigt, dass sie sicher und immunogen ist.
Die Vakzine kann unter Verwendung bekannter Techniken zur Formulierung von abgeschwächten bakteriellen Vakzinen formuliert werden. Die Vakzine wird vorteilhafter Weise zur oralen Verabreichung gegeben, zum Beispiel als getrocknetes, stabilisiertes Pulver zur Rekonstitution in einem geeigneten Puffer vor der Verabreichung. Die Rekonstitution erfolgt vorteilhafter Weise in einem Puffer mit einem geeigneten pH-Wert, um die Lebensfähigkeit der Bakterien sicherzustellen. Um die abgeschwächten Bakterien und die Vakzine vor der Magensäure zu schützen, wird vorteilhafter Weise bei jeder Verabreichung der Vakzine auch ein Natriumbikarbonatpräparat verabreicht. Alternativ dazu wird die Vakzine in einer gefriergetrockneten eingekapselten Form gegeben.
Die Vakzine kann bei der Impfung eines Säugetier-Wirts, insbesondere eines menschlichen Wirts, verwendet werden. Eine von einem Mikroorganismus ausgelöste Infektion, insbesondere einem Pathogen, kann daher durch die Verabreichung einer wirksamen Dosis einer Vakzine verhindert werden, die gemäß der Erfindung zubereitet wurde. Die letztlich verwendete Dosis liegt im Ermessensbereich des Arztes, wird aber von verschiedenen Faktoren abhängen, unter anderem der Größe und dem Gewicht des Wirts und dem Typ der formulierten Vakzine. Dennoch kann eine Dosis, welche die orale Verabreichung im Bereich von 10⁷ bis 10¹¹, z. B. von 10⁸ bis 10¹⁰ Bakterien pro Dosis umfasst, für einen menschlichen Wirt mit 70 kg angebracht sein.
BEISPIELE
Die im vorliegenden Abschnitt beschriebenen Beispiele dienen zur Darstellung der Erfindung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Karte des Suizid-Vektor-Plasmids pDM4.u = unbekannte Sequenz, unbekannte Länge.
2: Karte des verbesserten Suizid-Vektors pJCB12.
3: Diagramm des Verfahrens, das verwendet wird, um spezifische Gen-Deletionskonstrukte durch Überlappungs-Extensions-PCR zu schaffen. Schritt 1 = PCR-Amplifikation von zwei DNA-Fragmenten. Schritt 2 = Überlappungs-Extensions-PCR unter Verwendung von DNA-Produkten aus der Reaktion 1 und Reaktion 2 von Schritt 1 und Amplifikation des Überlappungs-Extensions-PCR-Produktes. R und S stehen für Restriktionsenzymsstellen.
4: Diagramm des Verfahrens, das verwendet wird, um die korrekte Integration des Suizid-Vektors in einen zielgerichteten Locus durch Verbindungs-PCR darzustellen.
5: Sequenz des ST-Gens und der flankierenden Regionen des Plasmids in Stamm B, welche den offenen Leserahmen des Strukturgens und die Position aller Oligonukleotide zeigt, die in dem Text beschrieben und in Tabelle 1 angeführt werden.
6: Sequenz des EAST1-Gens und der flankierenden Regionen aus IS1414 (Genbank #AF143819), welche den offenen Leserahmen des Strukturgens und die Position aller Oligonukleotide zeigt, die in dem Text beschrieben und in Tabelle 1 angeführt werden.
7: Sequenz des LT-Locus, welche die Position der Oligonukleotide zeigt, die verwendet werden, um das Deletionskonstrukt zu schaffen. Das unterstrichene ATG-Codon nahe beim Ende der Sequenz ist das Startcodon von LTA.
8: Sequenz der 3' flankierenden Region des ST-1-Gens, bestimmt aus dem Stamm E, welche die Position von Oligonukleotiden zeigt, die in dem Text beschrieben und in Tabelle 1 angeführt werden. Der offene Leserahmen des Strukturgens und die ATG- und TAA-Start- und Stopp-Codone sind unterstrichen.
9: Diagramm der einzelnen Phasen, die an der Abschwächung des Stammes E beteiligt sind.
10: Diagramm der einzelnen Phasen, die an der Abschwächung des Stammes H beteiligt sind.
11: Sequenz des aroC-Gen-Locus, welche die Position von den Oligonukleotiden, die verwendet werden, um das Deletionskonstrukt zu schaffen, und von anderen zeigt, die im Text erwähnt und in der Tabelle 1 beschrieben werden.
12: Diagramm der einzelnen Phasen, die an der Schwächung des Stammes J beteiligt sind.
13: Gel, welches die PCR amplifizierte LT-B-Codierungssequenz von Stamm E zeigt. Der linke Pfeil zeigt das LTB-PCR-Produkt und der rechte Pfeil einen 600bp-Marker.
14: Sequenz des LT-B-Gens, das von dem Stamm E kloniert ist.
15: Diagramm, welches die Konstruktion von Plasmid für die Expression von LT-B unter der Kontrolle des nirB-Promotors zeigt. Die LTB-DNA wurde mit BglII und Nhel digeriert. Der Startvektor pNCAT4 wurde mit denselben Enzymen digeriert, und das größere Vektorfragment wurde isoliert. Die LTB-DNA und das Vektorfragment wurden miteinander verbunden. Die KpnI- und BglII-Stellen in dem Endplasmid, pNLTB, können für das Klonieren des LTB-Promotors verwendet werden.
16: Western-Blot-Analyse, welche die Expression von LT-B in abgeschwächtem ETEC-Vakzinstamm PTL003 sowohl im Cytoplasma als auch Periplasma zeigt.
17: Gel, das die PCR-amplifizierte LTAB-Promotorsequenz von Stamm E zeigt. Der linke Pfeil zeigt einen 200 bp Marker und die rechte Hand zeigt das LT-Promotor-PCR-Produkt.
18: Sequenz von LTAB-Promotor, der aus Stamm E kloniert ist.
19: Western-Blot-Analyse, welche die Expression von LT-B in abgeschwächtem Vakzinstamm PTL003 unter Kontrolle des nativen LT-Promotors zeigt. PLLTB-1, -2 und -3 sind drei unabhängige Kolonien von PTL003, die mit pLLTB transformiert werden. Die drei linken Pfeile zeigen den Hintergrund, der rechte obere Pfeil zeigt LTA und der rechte untere Pfeil zeigt LTB an.
20: Diagramm der „Plasmid Rescue"-Technik, um die Sequenz der 3' flankierenden Region von ST von Stamm 8 zu erhalten. Die Technik wird im Detail in Beispiel 2 beschrieben. Eine ST-Kassette wurde durch PCR (Primer 4764 und 4765) hergestellt und in das Plasmid pJCB12 kloniert. Das resultierende pJCB12-ST-Plasmid wurde in Stamm B durch Konjugation eingeführt. Die Plasmid-DNA von einem der Transkonjuganten wurde isoliert und mit einem Restriktionsenzym (BglII) digeriert, das an einer Stelle schneidet, die von dem Zielgen entfernt ist. Die Enden 3' und 5' des resultierenden geschnittenen Plasmids wurden ligiert, um das Plasmid zu schließen. Das Plasmid wurde in SY327λpir propagiert und danach mit einem Primer (4792) sequenziert, der nur an das native ST-Gen hybridisiert (nicht an das ST-Gen von pJCB12-ST). Die mit Hilfe dieses Primers erhaltene Sequenz kann verwendet werden, um weitere Primer zu konstruieren, um die Sequenz auszuweiten.
BEISPIEL 1: EIN VERBESSERTES VERFAHREN FÜR DAS EINFÜHREN VON MEHRFACHEN GENETISCHEN MUTATIONEN IN BAKTERIELLE VAKZINSTÄMME
Der vorliegende Abschnitt beschreibt die Herstellung eines neuartigen Suizid-Vektor-Plasmids, pJCB12, und seine Verwendung bei der Erzeugung eines optimierten Verfahrens für das Einführen von Mutationen in chromosomale oder Plasmid-codierte Gen-Loci. Ferner werden am Ende des Abschnitts viele der Standardverfahren beschrieben, die in diesem und in folgenden Beispielen der Anmeldung verwendet werden. Die Sequenz und der Zweck der Oligonukleotide, die in der PCR zur Konstruktion oder Analyse von Konstruktion verwendet werden, sind in Tabelle 1 am Ende der Beispiele angeführt.
Ein verbessertes Verfahren für das Einführen von mehrfachen genetischen Mutationen in bakterielle Vakzinstämme
Die Erzeugung eines abgeschwächten ETEC-Stammes aus einem Wildtyp-Stamm erfordert die Mutation einer Reihe von unterschiedlichen genetischen Loci. Diese Mutationen werden sequentiell eingeführt, wobei jedes Mal ein Verfahren verwendet wird, das mehrere verschiedene Schritte erfordert. Wenn eine Reihe von ETEC-Stämmen eine Abschwächung erfordern, führt dies zu einer bedeutenden Anzahl an Schritten, wobei jeder potentiell mit entsprechenden Schwierigkeiten verbunden ist. Es ist daher besonders wichtig, dass das Verfahren des Einführens von Mutationen vollständig optimiert wird.
Suizid-Vektorplasmide, wie pDM4 (20), pJCB12, pCVD442(8) und andere können verwendet werden, um definierte genetische Konstrukte in spezifische Ziele in dem bakteriellen Genom einzuführen. Das Plasmid pJCB12 ist ein neuer, optimierter Suizid-Vektor, der auf dem zuvor konstruierten Suizidvektor pDM4 basiert. Das definierte genetische Konstrukt, das in das bakterielle Genom eingeführt werden soll, kann eine Deletionsmutation eines spezifischen Gens oder eine komplexere Struktur sein, wie zum Beispiel die Insertion eines Gens innerhalb eines anderen und das von einem ausgewählten Promotor von innerhalb des Konstruktes exprimiert wird. Im Allgemeinen werden die Enden der Konstrukte aus Nukleotidsequenzen bestehen, die aus der Region des Genoms gewonnen werden, das targetiert wird.
Die Suizid-Vektoren pDM4 und pJCB12 besitzen eine Reihe von Schlüsselkomponenten (siehe 1 und 2):
einen Replikationsursprung, der die Replikation des Vektors in einigen Stämmen von Bakterien, aber nicht in anderen steuert, oriR6K. oriR6K ist der Replikationsursprung, der aus dem natürlich vorkommenden Plasmid R6K gewonnen wird. Dieser Ursprung erfordert das Gen R6K pir für die Replikation, das in den Suizid-Vektoren nicht vorhanden ist. Drei Labor-E.coli-Stämme sind verfügbar und tragen das pir-Gen auf ihrem Chromosom, und zwar SY327λpir, SM10λpir und DHSαλpir. Alle drei dieser Stämme können verwendet werden, um pDM4, pJCB12 und ihre Derivate zu propagieren;
einen Transferursprung, welcher konjugativen Transfer des Vektors von einem bakteriellen Stamm zu einem anderen transferiert, mobRP4. mobRP4 ist der Transferursprung von dem natürlich vorkommenden Plasmid RP4. Dies ermöglicht den konjugativen Transfer von pDM4 und pJCB12 und deren Derivaten zu empfangenden bakteriellen Stämmen. Um zu funktionieren, erfordert mobRP4, dass die Gene, welche die RP4-Transferfunktionen codieren, in der bakteriellen Zelle des Spenders vorhanden sind. Labor-E.coli-Stamm SM10λpir trägt diese Gene auf seinem Chromosom, so dass dieser Stamm als Spenderstamm für pDM4, pJCB12 und deren Derivaten verwendet werden kann;
ein Gen, das ein Produkt codiert, das für bakterielle Zellen toxisch ist, sacB. sacB codiert für Levansucrase, die ein Produkt erzeugt, das für gramnegative Bakterien toxisch ist, wenn auf Sucrose gezüchtet;
einen selektierbaren Marker, cat. cat codiert für Chloramphenicolacetyltransferase und verleiht dem antibakteriellen Chloramphenicol Widerstand;
eine multiple Klonierungsstelle (MCS), d. h. eine Stelle, in welche definierte genetische Konstrukte für das Einführen in eine empfangende bakterielle Zelle kloniert werden können.
Aus Erfahrung wissen wir, dass bestehende Suizid-Vektoren, wie pDM4 und pCVD442 häufig nicht den korrekten Lokus targetieren und Screening einer großen Anzahl von Transkonjuganten oder Transformanten notwendig ist, um einen zu finden, der korrekt targetiert ist (falls überhaupt ein korrekt targetierter identifiziert werden kann). Außerdem trägt pCVD442 einen Ampicillinresistenzdeterminanten, der eine Selektion von Rekombinanten erlaubt. Die Selektion auf Ampicillin ist jedoch nicht so effizient wie Chloramphenicol und Versuche, für eine sehr kleine Anzahl von Rekombinanten innerhalb einer sehr großen Mischung von Bakterien zu selektieren, beispielsweise bei der Durchführung von Konjugationsexperimenten, werden oft durch „Hintergrundwachstum" vereitelt. „Hintergrundwachstum" kann die Form von Bakterienschmier annehmen, innerhalb welcher eine Identifikation von Transkonjuganten nicht möglich ist, oder von kleinen Kolonien, die bei näherer Analyse keine Transkonjuganten sind.
Wir glauben, dass die Probleme von inkorrektem Targeting teilweise auf die relativ große Größe (6-7 kb) dieser bekannten Suizid-Vektoren zurückzuführen sind, die selbst aus Komponenten von natürlich vorkommenden Plasmiden konstruiert werden. Die Suizid-Vektoren könnten daher natürlich vorkommende Plasmide innerhalb eines bakteriellen Stamms targetieren, welche ähnliche Nukleotidsequenzen tragen. Insbesondere sind Transferfunktionen unter konjugativen Plasmiden relativ gut bewahrt, und die mobRP4-Transferregion von pDM4 und pCVD442 liegt bei ungefähr 2,5 kb. Zusätzlich haben wir angesichts des Problems des inkorrekten Targetings eine Sequenzierung durchgeführt. Unsere Nukleotidsequenzdaten, die für die sacB-Region von pDM4 erhalten wurden, zeigten, dass sie ungefähr 600 bp einer IS/-ähnlichen Insertionssequenz enthält, einer Insertionssequenz, die in den Genomen von vielen Bakterien vorherrschend ist. Daraus haben wir gefolgt, dass dies zumindest teilweise für das inkorrekte Targeting verantwortlich sein könnte.
Der Suizid-Vektor pJCB12 ist eine modifizierte Version von pDM4, bei dem viel von der intergenen und nichtfunktionellen DNA entfernt worden ist. Daher gibt es viel weniger Möglichkeiten für inkorrektes Targeting, wenn dieser Suizid-Vektor verwendet wird. Während pDM4 eine Größe von ungefähr 7 kb aufweist, ist pJCB12 nur 3 kb groß, behält aber alle Schlüsselkomponenten. Insbesondere ist die mobRP4-Region von pJCB12 nur 0,15 kb groß, und die ISl-ähnlichen Nukleotidsequenzen wurden aus der sacB-Region entfernt. Diese Modifizierungen sind insbesondere vorteilhaft, wenn ETEC-Stämme manipuliert werden, die im Allgemeinen viele Plasmide enthalten, welche als unerwünschte Ziele von homologer Rekombination mit Komponenten des Suizid-Vektors wirken könnten. Außerdem ermöglicht die geringere Größe von pJCB12 eine einfacherere In-Vitro-Manipulation und Konstruktion von Derivaten, weil kleinere DNA-Moleküle sich verbinden und in E.coli-Wirte effizienter transformieren, wodurch die Chancen für das Erhalten von Derivaten der korrekten Konstruktion verbessert werden. Die geringere Größe ermöglicht auch eine größere Effizienz beim Einführen der Konstrukte in empfangende Bakterien durch Transformation anstatt durch Konjugation.
Der Labor-E.coli-Stamm SM10λpir kann verwendet werden, um pJCB12 und seine Derivate zu empfangenden bakteriellen Stämmen durch Konjugation zu transferieren, weil er die tra-Funktionen von Plasmid RP4 in sein Chromosom eingefügt hat. Der Stamm SM10λpir weist jedoch eine relativ geringe Transformationsfrequenz auf. Aus diesem Grund würde DH5αλpir normalerweise für die Konstruktion von pJCB12-Derivaten verwendet werden, und sobald die Derivate der korrekten Konstruktion identifiziert worden sind, würden diese zu SM10λpir transferiert werden, für das Einführen in empfangende Stämme durch Konjugation.
Konstruktion des Suizid-Vektors pJCB12
Der Suizid-Vektor pJCB12 wurde durch mehrere Runden von Überlappungsextensions-PCR (31, 3) unter Verwendung von pDM4-Plasmid-DNA als Matrize konstruiert. Anfangs wurden vier Fragmente aus pDM4 durch PCR unter Verwendung der High-Fidelity-DNA-Polymerase, Pfu Turbo^TM amplifiziert. Dazu zählten das oriR6K-Fragment, das unter Verwendung der Oligonukleotide 4714 und 54715 amplifiziert wurde, das mobRP4-Fragment, das unter Verwendung der Oligonukleotide 4716 und 4717 amplifiziert wurde; und das cat-Gen, das in zwei Teilen mit Hilfe der Oligonukleotide 4718 mit 4719 und 4720 mit 4721 amplifiziert wurde. Dies erfolgte, um eine EcoRI-Restriktionsenzymstelle innerhalb des cat-Gens zu entfernen. Das oriR6K-Fragment und mobRP4 wurden danach in einer Überlappungs-Extensions-PCR-Reaktion unter Verwendung der Oligonukleotide 4714 und 4717 verbunden. Ebenso wurden die cat-Fragmente unter Verwendung der Oligonukleotide 4718 und 4721 verbunden. Diese zwei resultierenden Fragmente wurden danach in einer endgültigen Überlappungs-Extensions-PCR-Reaktion unter Verwendung der Oligonukleotide 4717 und 4718 verbunden. Das resultierende PCR-Produkt wurde ligiert und in SY327λpir-Zellen transformiert, und Transformanten wurden auf L-Agar selektiert, das mit Chloramphenicol zu 20 μg/ml ergänzt wurde. Transformanten, weiche Plasmide der korrekten Größe enthielten, wurden erhalten, und eines davon, als pDM4A7 bezeichnet, wurde für eine weiterführende Manipulation ausgewählt.
In dieser Phase sind oriR6K und die cat-Komponenten des Plasmids pDM4A7 eindeutig funktionell. Um jedoch zu bestätigen, dass der mobRP4-Locu7s funktionell war, wurde das Plasmid pDM4A7 in den Stamm SM10λpir transformiert. Diese Transformanten wurden auf L-Altar gelegt, das mit Chloramphenicol zu 15 μg/ml und Nalidixinsäure zu 5 μg/ml ergänzt wurde. Das L-Altar wurde mit Zellen des Stammes SY327λpir quer ausgestrichen. Während Chloramphenicol jene bakteriellen Zellen auswählt, die pDM4A7 enthalten, selektiert Nalidixinsäure für SY327λpir. Nach einer Inkubation über Nacht wuchsen viele Kolonien, wo die Stämme quer ausgestrichen waren, an anderer Stelle auf der Platte wuchsen hingegen keine, was bestätigt, dass pDM4A7 vom Stamm SM10λpir mobilisierbar ist und dass der mobRP4-Lokus funktionell ist.
Das Plasmid pDM4A7 wurde danach mit EcoRI digeriert, mit Pfu Turbo^TM DNA-Polymerase behandelt und ligiert, um die EcoRI-Restriktionsenzymstelle zu entfernen, um das Plasmid pDM4A7ΔEcoRI zu erzeugen. Ein kurzes HindIII-Fragment von pDM4, das die multiple Klonierungsstelle einschließt, wurde danach in pDM4A7ΔEcoRI ligiert, mit HindIII digeriert. Die Ligationsreaktion wurde in SY327λpir transformiert und Transformanten auf L-Altar selektiert, ergänzt durch 20 μg/ml Chloramphenicol.
Das Oligonukleotid R6K-01 hybridisiert innerhalb des kurzen HindIII-Fragmentes von pDM4, das die multiple Klonierungsstelle einschließt. Daher wurden Transformanten durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden R6K-01 und 4720 gescreent, um jene zu identifizieren, welche das gewünschte Plasmid-Konstrukt enthielten. Eine Reihe solcher Transformanten wurden identifiziert, und einer davon, der als pDM4A7ΔE bezeichnet wird, wurde für eine weiterführende Manipulation ausgewählt.
Das Plasmid pDM4A7ΔE trägt drei EcoRI-Stellen, die auf dem kurzen HindIII-Fragment von pDM4 sehr eng beieinander sind, das die multiple Klonierungsstelle enthält. Die zwei sehr kurzen EcoRI-Fragmente von pDM4A7ΔE wurden daher durch Digestion mit EcoRI entfernt, gefolgt von einer Ligation. Dies führte zu einem pDM4A7ΔE-Derivat, welches nur eine EcoRI-Stelle besitzt, die als pJCB10 bezeichnet wurde. Die Region von pJCB10, welche oriR6K und die MCS enthält, wurde unter Verwendung der Oligonukleotide 4715 und 4917 amplifiziert, und Nukleotidsequenzbestimmungen für dieses Fragment wurden unter Verwendung von Oligonukleotid 4917 durchgeführt. Dadurch erhielten wir die Nukleotidsequenz quer über die MCS, die zuvor unbekannt war.
Danach wurde das sacB-Gen unter Verwendung von Pfu-DNA-Polymerase und der Oligonukleotide 4722 und 4723 amplifiziert. Das 1,6-kb-Produkt wurde mit dem Plasmidvektor pPCR-Script^TM (Stratagene) ligiert und in E.coli XL10 Gold^TM-Zellen (Stratagene) transformiert. Es wurden Transformanten erhalten, und die Funktionalität des sacB-Gens wurde bestätigt, indem die Klone auf L-Agar und 5 Sucrose-Agar plattiert wurden. Ein Konstrukt ergab gutes Wachstum auf L-Agar und keines auf 5 % Sucrose-Agar und wurde somit als die Quelle des sacB-Gens gewählt. Das sacB-Gen wurde danach aus diesem Klon unter Verwendung des Restriktionsenzyms PstI digeriert, für welches Stellen in Oligonukleotide 4722 und 4723 für diesen Zweck inkorporiert wurden, und mit pJCB10 ligiert, auch mit PstI digeriert. Kolonien wurden durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden 4716 und 4766 geprüft, woraus sich ein Produkt der erwarteten Größe ergab (~1700 bp). Wiederum wurde die Funktionalität des Gens durch Plattieren der Klore auf L-Altar und 5 % Sucrose-Altar bestätigt. Ein Konstrukt wuchs auf L-Altar, aber nicht auf 5 % Sucrose-Agar. Das Sequenzieren dieses Konstruktes unter Verwendung der Oligonukleotide 4715 und 4766 zeigte die Orientierung des sacB-Gens an. Dieses Konstrukt wurde als pJCB12 bezeichnet.
Prinzip zur Verwendung von pJCB12
Sobald ein definiertes genetisches Konstrukt in pJCB12 ligiert worden ist, um ein pJCB12-Derivat zu ergeben, wird das Plasmid in einen Rezipientenstamm, beispielsweise einen ETEC-Stamm, transferiert. Dies kann gemäß auf dem Fachgebiet wohl bekannten Verfahren geschehen, entweder durch Konjugation aus dem pJCB12-Wirtstamm SY327λpir oder durch Transformation des gereinigten pJCB12-Derivats direkt in den Rezipientenstamm.
Transkonjuganten oder Transformanten werden auf bakteriologischem Wachstumsmedium,, ergänzt durch antibiotisches Chloramphenicol, ausgewählt. Da der Suizid-Vektor pJCB12 unfähig ist, in der Abwesenheit des pir-Gens zu replizieren, haben sich die Transkonjuganten oder Transformanten, die wachsen werden, im Allgemeinen aus der Fusion des pJCB12-Derivats mit einem anderen Replicon durch homologe Rekombination ergeben. Die Verwendung von pDM4 und anderen größeren Suizid-Vektoren wird oft zu inkorrektem Targeting führen, und infolgedessen können Mutanten nicht in darauffolgenden zeitraubenden Schritten isoliert werden.
Obwohl das Targeting durch pJCB12 im Vergleich zu pDM4 viel besser ist, kann es immer noch zu einem inkorrekten Targeting kommen. Daher wurde ein neuer Ansatz verfolgt, um das definierte Mutationsverfahren vollständig zu optimieren und um Transformanten oder Transjuganten unter Verwendung von PCR zu screenen, um jene zu identifizieren, in denen das pJCB12-Derivat die gewünschte Region des Genoms targetiert hat. Zu diesem Zweck wird ein Oligonukleotid gestaltet, das innerhalb der pJCB12-Nukleotidsequenz hybridisiert, die zu der MCS benachbart ist, wo das definierte genetische Konstrukt eingefügt worden ist. Das andere Oligonukleotid ist gestaltet, um an die Region des zu targetierenden Genoms zu hybridisieren, benachbart zu, aber außerhalb des definierten genetischen Konstruktes. Transformanten oder Transkonjuganten, die unter Verwendung dieser PCR positiv sind, werden das pJCB12-Derivat aufweisen, das auf die korrekte Region des Genoms targetiert ist (siehe 4).
Sobald die korrekten Rekombinanten identifiziert worden sind, müssen Derivate isoliert werden, in denen der pJCB12-Vektor verloren gegangen ist. Diese Derivate können durch Ergänzen des bakteriologischen Wachstumsmediums mit 5 % Sucrose ausgewählt werden. Diese Sucroseselektion kann unter Verwendung eines L-Mediums effizienter gestaltet werden, in dem der NaCl-Inhaltsstoff abwesend ist und das mit 5 % Sucrose ergänzt wird. Unter diesen Bedingungen ist das sacB-Gen von pJCB12 toxisch, und nur Derivate, wo das sacB-Gen verloren gegangen ist, werden wachsen. Dieses Ereignis wird wiederum durch homologe Rekombination verursacht und weist eine Reihe von Ergebnissen auf. Erstens wird ein Reversionsereignis dazu führen, dass die targierte Region so bleibt wie sie war. Zweitens kann eine homologe Rekombination dazu führen, dass das definierte genetische Konstrukt mit der targierten Region getauscht wird, was dazu führt, dass das definierte Konstrukt in der Zielregion aufgenommen wird. Zusätzlich können, wenn die targierte Region Teil eines Plasmids ist, so wie viele der Toxin-Gene von ETEC-Stämmen, zwei zusätzliche Ereignisse eintreten. Diese sind, drittens, ein undefiniertes spontanes Deletions-Ereignis, welches zum Verlust eines Teils der targierten Region führt, welche sich über die Grenzen des definierten genetischen Konstruktes hinaus erstrecken kann, und, viertens, der Verlust des gesamten Plasmids, ein Ereignis, das als „spezifisches Plasmid-Kurieren" bezeichnet werden kann.
Durch das Testen von sucroseresistenten Derivaten mit Hilfe von PCR können die gewünschten Rekombinanten identifiziert werden. Zu diesem Zweck werden Oligonukleotide, welche an jedem Ende der targierten Region und außerhalb des definierten genetischen Konstruktes hybridisieren, verwendet. Wenn das PCR-Produkt dieselbe Größe aufweist wie vor dem Einführen des pJCB12-Derivatkonstruktes, dann ist es zu einem Reversionsereignis gekommen. Wenn zum Beispiel das genetisch definierte Konstrukt eine Deletionsmutation ist, dann sollte das PCR-Produkt kleiner als zuvor und von einer vorhersehbaren Größe sein. Spezifisches Plasmid-Kurieren und undefinierte spontane Deletion werden normalerweise zu keinem PCR-Produkt oder nicht-spezifischen Produkten unerwarteter Größe in diesem Typ von PCR-Reaktion führen.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der Vektor pJCB12 (oder ein anderer ähnlicher Vektor der Erfindung) in einem Verfahren zur Herstellung einer bakteriellen Zelle verwendet werden kann, bei dem ein Zielgen (d. h. ein Toxin-Gen wie ST, LT oder EAST1 oder ein chromosomales Gen, wie ein omp- oder ein aro-Gen) deletiert, inaktiviert oder ersetzt wird, wobei das Verfahren das. Transferieren des Vektors in eine bakterielle Zelle, welche das Zielgen enthält, und das Selektieren für eine Zelle, in welcher das Zielgen deletiert, inaktiviert oder ersetzt worden ist, umfasst. Das Selektieren kann unter Verwendung eines mehrstufigen Verfahrens wie folgt durchgeführt werden:

– Selektieren für eine Kolonie von Zellen, welche den selektierbaren Marker enthält. Wenn die Zelle, in welche der Vektor transferiert wird, eine ist, die keine Replikation des Vektors von der Ursprungsreplikation in dem Vektor unterstützt, werden durch das Selektieren für eine solche Kolonie vor Zellen jene Zellen identifiziert, in welchen der Vektor in ein zelluläres Replicon aufgenommen worden ist;
– Durchführen einer PCR, um für eine Zelle zu selektieren, in welcher der Vektor korrekt an das Zielgen targiert hat, wobei einer der Primer, die in der PCR verwendet werden, an eine Vektorsequenz hybridisiert, die benachbart zur Klonierungsstelle ist, und der andere an eine Stelle in der zellulären DNA hybridisiert, die benachbart zum Zielgen ist. Eine positive PCR zeigt an, dass der Vektor zum Zielgen targiert hat;
– Selektieren für eine Zelle, aus welcher die Vektorsequenz verloren gegangen ist, durch Züchten der Zelle unter Bedingungen, welche das Gen wirksam machen, das ein Produkt codiert, das für die Zellen toxisch ist, wenn unter bestimmten Bedingungen gezüchtet. Das Überleben einer Zelle zeigt an, dass die Vektorsequenz verloren gegangen ist. Wenn das Gen, welches das toxische Produkt codiert, sacB ist, kann die Zelle in einem Medium gezüchtet werden, das mit Sucrose ergänzt wird und bei dem NaCl abwesend ist; das Produkt von sacB ist toxisch, wenn die Zellen in diesem Medium gezüchtet werden.
– Schließlich kann die PCR unter Verwendung von Primern durchgeführt werden, welche an Positionen außerhalb und benachbart zu jedem Ende des Zielgens hybridisieren, wobei ein PCR-Produkt, das kleiner als das Produkt ist, das von einer Wildtyp-Zelle erhalten wurde, eine Deletionsmutation anzeigt.

Materialien und Verfahren
Verwendete bakterielle Stämme. ETEC-Stämme, so wie an anderer Stelle in der Patentanmeldung beschrieben, und Labor-Stämme von E.coli:

Stamm Referenz oder Quelle

SY327λpir Miller und Mekalanos (56)

DH5αλpir P. Barrow, Institute for Animal Health,

Compton

SM10λpir Simon et al., 1983 (47)
Bakteriologisches Wachstumsmedium. ETEC-Stämme werden routinemäßig in L-Brühe und auf L-Agar gezüchtet und bei 37 °C über Nacht inkubiert. L-Brühe besteht aus 10 g/l Pepton, 5 g/l Hefeextrakt und 5 g/l NaCl, aufgelöst in 1 1 entionisiertem Wasser. L-Agar ist L-Brühe, ergänzt mit 15 g/l Agar. Das Wachstumsmedium, das 5 % Sucrose enthielt, war wie oben beschrieben, aber ohne die 5 g/l NaCl. Um die Expression von CFAs zu optimieren, wurden ETEC-Stämme aus CFA-Agar (1 % Casaminosäuren, 2 % Agar, 0,15 % Hefeextrakt, 0,005 % MgSO₄, 0,0005% MnCl₂) geerntet. Chloramphenicol wurde in einer Konzentration von 10 μg/ml, Tetracyclin mit 15 μg/ml und Streptomycin mit 20 μg/ml verwendet.
Bakterielle Konjugationen wurden durch Mischen von Spender- und Empfänger-ETEC-Stämmen auf L-Agar gemischt und 3 bis 18 h lang bei 37 °C inkubiert. Das bakterielle Wachstum wurde in L-Brühe gekratzt und auf L-Agar-Platten plattiert, ergänzt mit Chloramphenicol und einem anderen geeigneten Antibiotikum, um ETEC-Stämme (Streptomycin für Stamm B, Tetracyclin für andere ETEC-Stämme) auszuwählen, welche das pJCB12-Derivat aufgenommen hatten.
Identifikation von korrekt targierten Rekombinanten. Transkonjuganten oder Transformanten, die durch Wachstum auf L-Agar erhalten wurden, ergänzt mit Chloramphenicol, nach dem Einführen von pJCB12-Derivat-Konstrukten, wurden durch PCR getestet, um jene zu identifizieren, in denen der gewünschte genetische Locus targetiert worden war. Zu diesem Zweck hybridisierte eines der Oligonukleotide innerhalb der pJCB12-Nukleotidsequenzen benachbart zur multiplen Klonierungsstelle (MCS), wo das definierte genetische Konstrukt eingefügt worden war. Das andere Oligonukleotid hybridisierte an das Genom, benachbart zu, aber außerhalb des definierten genetischen Konstruktes. In einer solchen PCR zeigte die Erzeugung eines Fragmentes an, dass die Bindungsstellen für die jeweiligen Oligonukleotide verbunden worden waren, was nur passieren konnte, wenn das pJCB12-Derivat die korrekte Region des Genoms targetiert hatte.
Ausschneiden von pJCB12 aus Transkonjuganten durch Wachstum in Gegenwart von 5 % Sucrose. Transkonjuganten oder Transformanten, bei denen das pJCB12-Derivat die richtige Region des Genoms targetiert, wurden danach auf frisches L-Agar gestrichen, ergänzt mit Chloramphenicol und einem anderen geeigneten Antibiotikum, um ETEC-Stämme (siehe oben) auszuwählen, und bei 37 °C inkubiert, damit Kolonien wachsen konnten. L-Brühe-Kulturen, die von diesen frischen Platten inokuliert wurden, wurden danach gezüchtet. Zellen von diesen Kulturen wurden geerntet, in 5 % Sucrosebrühe resuspendiert und über Nacht inkubiert, vor dem Plattieren von seriellen Verdünnungen auf 5 % Sucrose-Agar, um Rekombinanten auszuwählen, in denen das pJCB12-Derivat ausgeschnitten hatte. Die inokulierten Sucrose-Agar-Platten wurden danach über Nacht inkubiert und die resultierenden Kolonien wurden durch PCR unter Verwendung von relevanten Oligonukleotiden getestet, um die Mutanten zu identifizieren.
DNA-Manipulationen wurden unter Verwendung von Standardverfahren ausgeführt (25). Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Plasmidreinigungs-Kits von QUIAGEN (Crawley, UK) zubereitet, und DNA-Fragmente wurden aus Agarose-Gels unter Verwendung des QIAquick^TM Gel-Extraktions-Kit von QIAGEN isoliert.
PCR-Reaktionen wurden routinemäßig unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase (Life Technologies) durchgeführt; wenn eine High-Fidelity-PCR erforderlich war, wie bei der Konstruktion von pJCB12, wurde eine Pfu „Turbo"-DNA-Polymerase (Stratagene) verwendet. Beide DNA-Polymerasen wurden gemäß den Herstellerhinweisen verwendet. Routinemäßig wurde folgender PCR-Zyklus verwendet:
Schritt 1; 95°C, 50 Sekunden
Schritt 2; 95°C, 10 Sekunden
Schritt 3; 55°C, 1 Minute
Schritt 4; 72°C, 1 Minute
Schritt 5; Wiederholungsschritte 2 bis 4 fünfundzwanzig Mal
Schritt 6; 72°C, 1 Minute
Für die Konstruktion von pJCB12 wurde ein pDM4-Plasmid-DNA-Präparat als Matrize in PCR-Reaktionen verwendet. Für routinemäßiges PCR-Screening wurde ein Überimpfen aus einer bakteriellen Kolonie als Matrize verwendet. Für die Konstruktion von Toxin-Deletionsmutationen wurden Plasmid-DNA-Präparate verwendet, die aus geeigneten ETEC-Stämmen extrahiert wurden. Plasmid pJCB12 und DNA-Fragmente, welche Deletionsmutationen enthielten, wurden unter Verwendung einer Modifikation einer Überlappungsextensions-PCR (31) erzeugt. In der modifizierten Version gibt es kein Überlappen in den amplifizierten Fragmenten. Stattdessen flankieren die Fragmente die zu deletierende Region, und die komplementären Sequenzen, welche ein Zusammenfügen der zwei Fragmente erlauben, sind in den 5'-Enden der relevanten Oligonukleotide enthalten; siehe 3.
SDS-PAGE
Dies wurde im Wesentlichen so ausgeführt, wie von Laemmli (16) beschrieben, und wurde für die Visualisierung von exprimierten CFAs und zum Überprüfen von LPS-Profilen verwendet. Für LPS-Profile wurden Zellen über Nacht in L-Brühe gezüchtet, geerntet und in Wasser resuspendiert, um eine Zellsuspension mit einem A600 von 20/cm zu ergeben. Die Zellsuspension wurde mit einem gleichen Volumen von 50 mM TrisHCL pH 6,8, 2 % (w/v) SDS, 10 % (v/v) Glycerol, 0,25 (w/v) Bromophenolblau, 2 % (v/v) 2-Mercaptoethanol vermischt und 5 Minuten lang gekocht. Proteinase K wurde danach zu einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml hinzugefügt und die Proben bei 60 °C eine Stunde lang inkubiert, bevor 5 bis 10 μl auf SDS-PAGE-Gels geladen wurden. Für CFAs wurden Bakterien aus CFA-Agar geerntet und in Wasser resuspendiert, um eine Zellsuspension mit einem A600 von 20/cm zu ergeben. Die Zellsuspension wurde 10 Minuten lang auf 65 °C erhitzt, die Proben wurden danach zentrifugiert, um ganze Zellen zu entfernen. Ein gleiches Volumer von 50 mM TrisHCl pH 6,8, 2 % (w/v) SDS, 10 % (v/v) Glycerol, 0,25 % (w/v) Bromophenolblau, 2 % (v/v) 2-Mercaptoethanol wurde dann hinzugefügt. Volumen von 3 bis 10 μl wurden danach auf 12 % Trisglycin-SDS-PAGE-Gels (Invitrogen) geladen. CFAs wurden durch Coomassie-Blau-Färbung (Sambrook et al 1989, Literaturverzeichnis, 25) visualisiert, während LPS mit Hilfe eines SilverXpress^TM-Silberfärbungs-Kit (Invitrogen) visualisiert wurden.
BEISPIEL 2: ENTFERNEN VON TOXIN-GENEN UND EINFÜHREN VON ABSCHWÄCHENDEN MUTATIONEN IN STÄMME, DIE CFA/I EXPRIMIEREN
Manipulation von Stamm A, um Stamm ACAM 2010 herzustellen
Der Stamm A (WS-1858B) exprimiert das Kolonisationsfaktorantigen CFA/I und das hitzestabile Toxin ST. Um ein ST-negatives Derivat zu erzeugen, das weiterhin die CFA/I-Kolonisationsfaktoren exprimiert, wurde der Stamm zuerst mit einem Plasmid transformiert, das Tetracyclinresistenz verleiht. Dies geschah, um eine darauffolgende Selektion des Stammes aus Konjugationsmischungen zu ermöglichen. Das Plasmid, das Tetracyclinresistenz verleiht, ist ein Derivat von Plasmid pACYCl84 (40), in dem der Chloramphenicolresistenzdeterminant durch Deletion eines BsmBl-Restriktionsenzymfragmentes unter Anwendung von standardmäßigen DNA-Manipulationsverfahren inaktiviert worden war. Das Plasmid wurde als „pACYC-Tc" bezeichnet und in den Stamm A durch Elektrotransformation eingeführt.
Das TetR-Derivat von Stamm A wurde mit SM10λpir konjugiert, welcher Plasmid pJCB12-STI enthielt. Das pJCB12-Derivat enthielt ein Fragment des STI-Gens, das aus dem Stamm B unter Verwendung von Oligonukleotiden 4764 und 4765 amplifiziert wurde, die in die MCS kloniert worden waren. Die Sequenz dieses Konstruktes wird in 5 dargestellt. Hierbei ist zu beachten, dass das STI-Fragment in diesem Derivat keine Deletion ist; das Ziel besteht darin, den Locus mit den Markern zu targetieren, welche durch pJCB12 codiert sind, um eine Selektion für Deletionsereignisse zu ermöglichen, die zu dem korrekten Ergebnis führen.
Transkonjuganten wurden durch Plattieren der Mischung auf L-Agar ausgewählt, ergänzt durch Tetracyclin und Chloramphenicol, und die erhaltenen Kolonien wurden als Transkonjuganten mit Hilfe eines PCR-Testverfahrens unter Verwendung von Oligonukleotiden 4720 und 4721 bestätigt, was den Chloramphenicolresistenzdeterminanten amplifiziert. Drei Transkonjuganten wurden identifiziert und als A13, A14 bzw. A18 bezeichnet Jeder Transkonjugant wurde auf einem 5 Sucrosemedium gezüchtet, und die erhaltenen Kolonien wurden auf ST unter Verwendung der Oligonukleotide 4764 und 4765 gescreent. Eines der ST-negativen Derivate, das identifiziert worden war, wurde als A18-34 bezeichnet und mit Hilfe von PCR auf die Gegenwart des cfaB-Gens unter Verwendung der Oligonukleotide BgIIIFOR und BglmodREV, auf die Gegenwart des cfaC-Gens unter Verwendung der Oligonukleotide 4727 und 4728 und auf die Gegenwart des cfaR-Gens unter Verwendung der Oligonukleotide 4785 und 4786 überprüft. Alle drei dieser PCR-Reaktionen waren positiv, wodurch die Gegenwart der relevanten Gene bestätigt wurde. Der Derivatstamm A18-34 wurde danach auf CFA-Agar gezüchtet und für SDS-PAGE verarbeitet, um CFA/I-Expression zu visualisieren. Dies bestätigte, dass der Stamm A18-34 CFA/I exprimierte und daher, dass ein ST-negativer CFA/I-exprimierender Stamm isoliert worden war.
Im nächsten Schritt wurde ein ampicillinsensibles Derivat von Stamm A18-34 identifiziert. Zu diesem Zweck wurde der Stamm A18-34 in LB-Brühe durch drei Passagen gezüchtet. Die resultierende Kultur wurde danach verdünnt und auf LB-Agar plattiert. Wenn kleine Kolonien sichtbar wurden, wurden sie auf LB-Agar replika-plattiert, ergänzt mit Ampicillin zu 200 μg/ml und danach inkubiert, damit Kolonien wachsen konnten. Eine Kolonie wurde identifiziert, die bei der Ampicillin ergänzten Replica-Platte abwesend war und danach als ampicillinsensibel bestätigt wurde. Dieser Stamm wurde als A18-34 Ap^S bezeichnet.
Im nächsten Schritt wurde ein trimethoprimsensibles Derivat von Stamm A18-34 Ap^S isoliert. Zu diesem Zweck wurde der Stamm A18-34 Ap^S wie oben beschrieben, aber auf LB-Agar und M9 Minimalsalz-Agar replica-plattiert, ergänzt mit 0,4 % Glucose und Trimethoprim zu 25 μg/l. Zwei Kolonien wurden identifiziert, die nicht auf den Trimethoprim ergänzten Replica-Platten gewachsen waren, eine davon, die als A18-34 Ap^S, Tp^S bezeichnet wurde, wurde für weiterführende Manipulationen ausgewählt.
Das EAST1-Toxin-Gen wurde danach aus dem Stamm A18-34 ApS TpS deletiert. Zu diesem Zweck wurden Konjugationen mit SM1Oλpir durchgeführt, der ein pJCB12-Plasmidderivat enthielt, das eine definierte EAST1-Deletion als Spenderstamm und Stamm A18-34 Ap^S Tp^S als Empfängerstamm trug. Transkonjuganten wurden auf L-Agar selektiert, ergänzt mit Tetracyclin zu 15 μg/ml und Chloramphenicol zu 10 μg/ml. Ein Transkonjugant wurde durch PCR identifiziert, unter Verwendung der Oligonukleotide 4917 und 4778, wobei das pJCB12-Derivat an der korrekten Position eingefügt wurde. Dieser tetracyclin- und chloramphenicolresistente Transkonjugant wurde danach in 5 % Sucrosemedium gezüchtet, um Rekombinanten zu selektieren, in welchen das pJCB12-Derivat ausgeschnitten hatte (wie in Materialien und Verfahren beschrieben). Kolonien, die auf L-Agar, ergänzt mit: 5 % Sucrose, wuchsen, wurden danach durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4749 und 4752 getestet. Drei Isolate wurden identifiziert, die negativ waren in dieser PCR-Reaktion, was darauf hinweist, dass der EAST1-Locus verloren gegangen war.
Definierte Deletionsmutationen wurden danach in die Gene aroC, ompC und ompF eingeführt, um das A18-34 Ap^S Tp^S ΔEAST1 Derivat so wie in anderen Beispielen beschrieben weiter abzuschwächen. Anfängliche Versuche, die ΔdaroC Mutation einzuführen, waren wenig erfolgreich, genauso wenig wie dies beim Konstruieren einer Stamm J-Derivat aroC-Deletionsmutation (siehe unten) der Fall war. Daher wurden Versuche unternommen, um die ΔdaroC^J Mutation einzuführen (siehe unten zwecks Details der Mutation). Nach dem Transfer pJCB12-ΔdaroC^J in das A18-34 Ap^S Tp^S ΔEAST1 Derivat, wurde ein Transkonjugant durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4917 und 4742 identifiziert. Dieser Transkonjugant wurde in 5 % Sucrosemedium gezüchtet, um Rekombinanten zu selektieren, in denen das pJCB12-Derivat ausgeschnitten hatte (wie in Materialien und Verfahren beschrieben). Kolonien, die auf L-Agar wuchsen, ergänzt mit 5 % Sucrose, wurden danach mit Hilfe von PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 47116 und 47117 getestet, und ein Derivat, welches die ΔdaroC^J definierte Deletionsmutation trug, wurde identifiziert. Aromatische Aminosäurenauxotrophie wurde in diesem A18-34 Ap^S Tp^S ΔEAST1 ΔdaroC^J Stamm durch Streichen auf Minimalagar und Minimalagar, ergänzt mit einem „Aro-Mix", nachgewiesen. Der Stamm wuchs nur auf dem Agar, das durch den Aro-Mix ergänzt worden war, während der Mutterstamm A18-34 Ap^S Tp^S ΔEAST1 sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit des „Aro-Mixes" wuchs.
Als nächstes wurde die ΔompC definierte Deletionsmutation in das A18-34 Ap^S Tp^S ΔEAST1 daroC^J-Derivat so wie für Stamm H (Beispiel 4) beschrieben eingeführt und ein ΔompC Deletionsmutation identifiziert. Expression von CFA/I und LPS durch diesen A18-34 Ap^S Tp^S ΔEAST1 ΔaroC^J ΔdompC Stamm wurde durch SDS-PAGE bestätigt.
Als nächstes wurde die ΔdompF definierte Deletionsmutation in das A18-34 Ap^S Tp^S ΔEAST1 ΔaroC^J ΔompC -Derivat so wie für den Stamm H (Beispiel 4) beschrieben eingeführt und ein ΔdompF-Deletionsmutant identifiziert. Die Expression von CFA/I und LPS durch diesen A18-34 Ap^S Tp^S ΔEAST1 ΔaroC^J ΔompC ΔompF Stamm wurde durch SDS-PAGE bestätigt.
Schließlich wurde das pACYC-Tc-Plasmid, das in den Stamm A eingeführt worden war, speziell aus dem A18-34 Ap^S Tp^S ΔEAST1 ΔaroC^J ΔompC ΔompF Stamm kuriert. Zu diesem Zweck wurde das Plasmid pJCB12-pACYCori, das in Beispiel 4 beschrieben wird, durch Elektrotransformation eingeführt. Transformanten, welche pJCB12-pACYCori enthalten, wurden durch Wachstum auf L-Agar, ergänzt mit Chloramphenicol, ausgewählt. Ein Transformant wurde danach in 5 Sucrosemedium gezüchtet, um Derivate auszuwählen, aus denen das pJCB12-pACYCori-Plasmid kuriert worden war (wie in Materialien und Verfahren beschrieben). Kolonien, die auf L-Agar, ergänzt mit 5 % Sucrose, gewachsen sind, wurden danach auf L-Agar-Medium, ergänzt mit Chloramphenicol, und auf L-Agar-Medium, ergänzt mit Tetracyclin, übergeimpft. Dadurch wurden eine Reihe von Derivaten identifiziert, welche gegenüber diesen beiden Antibiotika sensibel sind, wodurch bestätigt wurde, dass das pJCB12-pACYCori-Plasmid tatsächlich spezifisch den Stamm des pACYC-Tc-Marker-Plasmids kuriert hatte und es danach durch Wachstum in der Gegenwart von Sucrose kuriert worden ist.
Eines dieser antibiotikasensiblen Derivate wurde ausgewählt und durch PCR auf die Gegenwart der Gene cfaA, cfaC und cfaD unter Verwendung der Oligonukleotidpaare 47104 mit 47105, 4729 mit 4730 und 4785 mit 4786 getestet. Darüber hinaus wurde die Gegenwart der Deletionsmutationen ΔaroC^J, ΔompC und ΔompF mit Hilfe der Oligonukleotidpaare 47116 mit 47117, 4732 mit 4743 und 4733 mit TT1 bestätigt. Die Expression von CFA/I und LPS wurde in diesem Stamm unter Verwendung von SDS-PAGE bestätigt und die Nukleotidsequenz über die Mutationen JaroC^J, ΔompC und ΔompF bestätigt.
Manipulation von Stamm B, um Stamm ACAM2011 herzustellen
Der Stamm B (WS-4437A) exprimiert das Kolonisationsfaktorantigen CFA/I und das hitzestabile Toxin ST. Anfangs wurde die Isolierung einer spontanen ST-Deletionsmutation mittels Targeting von ST unter Verwendung des Plasmids pJCB12-STI versucht. Dieses Plasmid wurde in den Stamm B durch Konjugation aus SM10λpir eingeführt und Transkonjuganten wurden durch Wachstum auf L-Agar, ergänzt mit Chloramphenicol, erhalten. Nach mehreren Versuchen wurden eine Reihe von ST-negativen Mutanten identifiziert, die aber alle für CFA/I negativ waren.
Es wurde daher beschlossen, eine definierte STI-Deletionsmutation zu konstruieren, die für den Stamm B spezifisch ist. Die erste Anforderung bestand darin, eine Nukleotidsequenz zu bestimmen, welche das 3'-Ende des ST-Gens flankiert. Das Verfahren, das zu diesem Zweck angewendet wurde, ist in 20 dargestellt. Die Plasmid-DNA wurde aus einem Transkonjugantenstamm isoliert, in dem pJCB12-STI auf das ST-Gen targetiert wurde. Gereinigte DNA wurde einer Restriktionsendonukleasedigestion mit BglII unterzogen, welche das ETEC-Plasmid schneidet, aber nicht das ST-Gen oder das pJCB12-Konstrukt. Die digerierte DNA wurde ligiert und in SY327λpir elektrotransformiert, und es wurden Transformanten auf L-Agar, ergänzt mit Chloramphenicol, selektiert. Dieses Verfahren wird als „Plasmid Rescue" bezeichnet und führt zur Re-Isolierung des pJCB12-Replicon, welches ein großes DNA-Fragment aufnimmt, das die gesamte STI-Region und einen großen Teil der flankierenden DNA enthält. Die Sequenz der flankierenden DNA wurde erhalten. Die daraus erhaltenen Nukleotidsequenzdaten erlaubten danach, dass weitere Oligonukleotide (4797 und 4798) entwickelt und verwendet wurden, um eine zusätzliche Nukleotidsequenz weiter stromabwärts des STI-Gens im Stamm B zu bestimmen. 5 zeigt die bestimmte Sequenz und die Position aller Oligonukleotid-Bindungsstellen.
Unter Verwendung der bestimmten Nukleotidsequenz wurde eine ST-Deletionsmutation konstruiert. Dies erfolgte durch Amplifizieren von zwei Fragmenten aus dem STI-Locus unter Verwendung der Oligonukleotide 47101 mit 47114 und 47115 mit 47100. Die zwei resultierenden Fragmente wurden dann durch Überlappungsextensions-PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 47100 und 47101 verbunden und in die MCS von pJCB12 mit Hilfe von Standardtechniken ligiert.
Das Konstrukt wurde in den Stamm B mit Hilfe einer Konjugation aus SM10λpir eingeführt und chloramphenicolresistente Transkonjuganten, in denen ST korrekt targiert worden ist, wurden durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4917 und 4799 identifiziert. Diese Transkonjuganten wurden in der Gegenwart von Sucrose gezüchtet, und die erhaltenen Kolonien wurden danach unter Verwendung der Oligonukleotide 47100 und 47101 gescreent, um die ST-Deletionsmutanten zu identifizieren. Ein Derivat wurde gefunden, das unter Verwendung dieser Oligonukleotide negativ war, was darauf hinweist, dass eine spontane Deletion zum Verlust des gesamten ST-Locus geführt hat. Dieses Derivat war positiv durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4727 mit 4728, welche einen Teil des cfaC-Gens amplifizieren. Es war auch positiv unter Verwendung der Oligonukleotide BglIIFOR und BglmodREV, welche das cfaA-Gen amplifizieren, und unter Verwendung der Oligonukleotide 4785 und 4786, welche das CFA/I-Regulatorgen, cfaD, amplifizieren. Eine funktionelle Prüfung für ST bestätigte, dass dieses Derivat ST-negativ war, während SDS-PAGE bestätigte, dass es weiterhin CFA/I exprimierte.
Danach wurden definierte Deletionen in die Gene AroC, ompC und ompF eingeführt, um das Stamm-B-ST-negative Derivat abzuschwächen. Anfängliche Versuche, die ΔaroC-Deletion einzuführen, blieben erfolglos. Daher wurde die ΔaroC^J-Deletion verwendet (siehe unten zwecks Details zur Mutation). Nach dem Transfer der pJCB12daroC^J-Deletion in das Stamm-B-ST-negative Derivat wurden Transkonjuganten durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4917 mit 4742 identifiziert. Ein Transkonjugant wurde identifiziert und danach in 5 % Sucrosemedium gezüchtet, um Rekombinanten zu selektieren, in denen das pJCB12-Drivat ausgeschnitten worden war (wie in Materialien und Verfahren beschrieben). Die Kolonien, die auf L-Agar ergänzt mit 5 % Sucrose, wuchsen, wurden durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden 47116 mit 47117 getestet und ein Derivat, das die ΔaroC^J-Deletion trug, wurde identifiziert. Der CFA/-Status des Exkonjuganten wurde durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4727 mit 4728 auf cfaC geprüft, 4785 mit 4786 auf cfaD und BgIIFOR mit BglIImodREV auf cfaA.
Die ΔompC-definierte Deletionsmutation wurde dann in das Stamm-B-ST-negative ΔaroC^J-Derivat so wie für Stamm H (Beispiel 4) beschrieben eingeführt, und ein ΔompC-Deletionsmutant wurde identifiziert. Der CFA/I-Status des Exkonjuganten wurde durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4727 mit 4728 auf cfaC, 4785 mit 4786 auf cfaD und BglIIFOR mit BglIImodREV auf cfaA geprüft.
Die ΔompF-definierte Deletionsmutation wurde danach in das Stamm-B-ST-negative ΔaroC^J ΔompF ΔompC Derivat wie oben für Stamm H (Beispiel 4) beschrieben, eingeführt, und ein ompF-Deletionsmutant wurde identifiziert. Der CFA/I-Status des Exkonjuganten wurde durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4727 mit 4728 auf cfaC, 4785 mit 4786 auf cfaD und BglIIFOR mit BglIImodREV auf cfaA überprüft.
Schließlich wurde das pStrep-Plasmid, das Streptomycinresistenz verleiht, speziell aus dem Stamm-B-ST-negativen ΔaroC^J ΔompF ΔompC-Derivat kuriert. Zu diesem Zweck wurde ein Plasmid-Derivat von pJCB12 konstruiert, das den pStrep-Replikationsursprung aufnahm. Dies erfolgte durch Shotgun-Klonierung von pStrep-Fragmenten, die durch Restriktionsendonucleasedigestion mit Sphl in die Sphl-Stelle von pJCB12 erzeugt wurden, und Transformieren der DNA in die XL-10 Gold ultrakompetenten E.coli-Zellen (Stratagene). Die Transformanten wurden auf L-Agar, ergänzt durch Chloramphenicol, plattiert. Da pJCB12 ein Suizid-Vektor ist, der spezielle Wirtsstämme erfordert, welche das pir-Gen tragen, wurde angenommen, dass Transformanten, die in der Gegenwart von Chloramphenicol wuchsen, Derivate von pJCB12 waren, welche den pStrep-Replikationsursprung trugen. Die Plasmid-DNR von vier dieser Transformanten zeigte, dass in jedem Fall ein Sphl-DNA-Fragment von ungefähr 2kb in den pJCB12 kloniert worden ist. Dieses pJCB12-Derivat wurde als pJCB12-pStrep-ORI bezeichnet.
Das Plasmid pJCB12-pStrep-ORI wurde in das Stamm-B-ST-negative ΔaroC^J ΔompF ΔompC-Derivat durch Konjugation aus dem Stamm SM10λpir eingeführt, und die resultierenden Transkonjuganten wurden durch Wachstum auf Agarmedium, ergänzt mit Chloramphenicol, selektiert. Kolonien, die wuchsen, wurden verwendet, um Brühe, ergänzt mit Chloramphenicol, zu inokulieren und – nach der Inkubation zur Ermöglichung von Wachstum – wurden Verdünnungen dieser Kultur auf Agar, ergänzt mit Chloramphenicol, plattiert. Kolonien, welche auf diesem Medium wuchsen, wurden auf Agar, ergänzt mit Streptomycin, übergeimpft, um jene zu identifizieren, aus denen das pStrep-Plasmid verloren gegangen war. Eine dieser streptomycinsensiblen Kolonien wurde danach in L-Brühe, ergänzt mit 5 % Sucrose, gezüchtet, um für ein Derivat zu selektieren, aus dem das pJCB12-pStrep-ORI-Plasmid verloren gegangen war. Verdünnungen von dieser Brühkultur wurden auf L-Agar, ergänzt mit 5 % Sucrose, plattiert, und nach der Inkubation wurden einige der resultierenden Kolonien auf Agar, ergänzt mit Chloramphenicol, übergeimpft, um jene z. identifizieren, aus denen das pJCB12-pStrep-ORI-Plasmid verloren gegangen war.
Der CFA/I-Status des Exkonjuganten wurde abermals durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden 4727 mit 4728 auf cfaC, 4785 mit 4786 auf cfaD und BglIIFOR mit BglIImodREV auf cfaA geprüft. Die CFA/I-Proteinexpression wurde danach durch SDS-PAGE und Western-Blotting geprüft. Das LPS-Profil wurde auch überprüft. Zusätzlich wurden die ΔaroC^J, ΔompC und ΔompF Mutationen durch Sequenzieren bestätigt, und es wurde auch die aromatische Aminosäurenabhängigkeit des Stammes bestätigt.
BEISPIEL 3: EIN DERIVAT EINES VIRULENTEN WILD-TYP-ETEC-STAMMES, DER CS5, CS6, LT, ST UND EAST1 EXPRIMIERT, WOBEI DIE GENE LT, ST UND EAST1 DELETIERT WORDEN SIND
Stamm E exprimiert CS5, CS6 und die Toxine EAST1, ST und LT. Um die genetische Manipulation zu erleichtern, wurde das Plasmid pACYC-Tc (in Beispiel 2 oben beschrieben) in den Stamm E durch Elektrotransformation eingeführt, um Tetracyclin-Resistenz zu verleihen.
Das EAST1-Toxin-Gen wurde zuerst aus dem Stamm E deletiert. Dies erforderte die Konstruktion eines pJCB12-Derivats, das eine definierte EAST1-Deletionsmutation trägt. Eine solche Deletionsmutation wurde durch Amplifizieren von EAST1-Fragmenten aus dem ETEC-Stamm H10407 unter Verwendung der Oligonukleotide 4749 mit 4750 und 4751 mit 4752 erzeugt, um zwei DNA-Fragmente zu erzeugen, welche das EAST1-Gen flankieren. 6 zeigt die Sequenz des EAST1-Locus, die aus IS1414 (Genbank-Zugriffsnummer AF143819) gewonnen wurde, und alle verwendeten Oligonukleotide. Diese wurden dann durch eine zusätzliche Überlappungsextensions-PCR- Reaktion unter Verwendung der Primer 4749 und 4752 fusioniert, und das resultierende Fragment wurde in pJCB12 unter Verwendung der SalI- und SphI-Restriktionsstellen kloniert. Somit wurde ein pJCB12-Dervvat konstruiert, welches diese Deletionsmutation enthielt.
Der Stamm SM10λpir, der pJCB12-ΔEAST1 enthält, wurde mit dem Stamm E konjugiert, und es wurden Transkonjuganten ausgewählt. Kolonien, die auf L-Agar, ergänzt mit Chloramphenicol und Tetracyclin, wuchsen, wurden unter Verwendung der Oligonukleotide 4917 und 4753 (gleichwertig zu Oligos 4 und 1 in 4) gescreent. Zwei Transkonjuganten wurden erhalten, welche in beiden PCR-Reaktionen positiv waren, was anzeigte, dass das pJCB12-ΔEAST1-Plasmid das EAST1-Gen korrekt targiert hatte.
Diese chloramphenicolresistenten Transkonjuganten wurden dann in 5 % Sucrosemedium gezüchtet, um Rekombinanten zu selektieren, in denen das pJCB12-Derivat ausgeschnitten hatte. Vier Exkonjuganten wurden auf dem Sucrose-Agar erhalten und diese waren negativ, wenn sie auf die Gegenwart des EAST1-Gens durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4749 und 4752 getestet wurden, was anzeigte, dass die gesamte EAST1-Region in diesem Derivat verloren gegangen war.
Das Stamm-E-EAST1-negative Derivat wurde danach durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4738 mit 4780 getestet, die für das CS5-Operon spezifisch sind, und unter Verwendung der Oligonukleotide 4740 mit 4781, die für das CS6-Operon spezifisch sind. Diese PCR-Reaktionen waren für alle vier Exkonjuganten positiv, was bestätigte, dass sie weiterhin die CS5- und CS6-Gene enthielten.
Danach wurde ein LT-Deletionsmutant des Stamm-E-EAST1-negativen Derivats konstruiert. Zu diesem Zweck wurde ein pJCB12-Derivat-Plasmid konstruiert, das eine definierte Deletion des LT-A-Gens in dem LT-Locus trug. Siehe 7.
Eine definierte LT-A-Deletion wurde durch PCR-Amplifizierung unter Verwendung der Oligonukleotide 4772 mit 4773 und 4774 mit 4746 konstruiert, um zwei DNA-Fragmente zu erzeugen, welche das LT-A-Gen flankieren. Diese wurden danach durch eine zusätzliche Überlappungsextensions-PCR-Reaktion fusioniert, und das resultierende Fragment wurde in pJCB12 unter Verwendung der SalI- und SphI-Restriktionsstellen kloniert.
Das pJCB12-ΔLT-A-Konstrukt wurde in das Stamm-E-ΔEASTI-Derivat durch Konjugation aus dem pJCB12-Wirtsstamm SM10λpir eingeführt, und Transkonjuganten wurden auf L-Agar, ergänzt mit Chloramphenicol und Tetracyclin, selektiert. Die resultierenden Kolonien wurden durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4762 und R6K-01 gescreent, welche zwei Transkonjuganten identifizierten, in denen der LT-Locus korrekt targiert worden war.
Diese chloramphenicolresistenten Transkonjuganten wurden danach in 5 % Sucrosemedium gezüchtet, um Rekombinanten zu selektieren, in denen das pJCB12-Derivat ausgeschnitten worden war. Kolonien, die auf dem Sucrose-Agar wuchsen, wurden durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4762 und 4746 getestet, um LT-A-Deletionsmutanten zu identifizieren. Drei Derivate wurden identifiziert, die in dieser PCR-Reaktion negativ waren, was darauf schließen lässt, dass sie den gesamten LT-Locus verloren hatten. PCR-Reaktionen, die auf diesen drei LT-negativen Derivaten unter Verwendung der Oligonukleotide 4738 mit 4780 ausgeführt wurden, und die Oligonukleotide 4740 mit 4781 bestätigten die Gegenwart der CS5- bzw. CS6-Gene.
Als nächstes wurde das ST-Gen aus diesem Stamm-E-EAST1-negativen LT-negativen-Derivat deletiert. Zu diesem Zweck wurde das Plasmid pJCB12-STI (wie in Beispiel 2 beschrieben) in den Stamm E aus SM10λpir transferiert und ein Transkonjugant auf L-Agar, ergänzt mit Chloramphenicol, selektiert. Ein Transkonjugant wurde durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4917 und 4794 identifiziert, und dieser Transkonjugant wurde danach in 5 % Sucrosemedium gezüchtet, um für Derivate zu selektieren, aus denen pJCB12-STI verloren worden war. Von 133 gescreenten Kolonien wiesen nur 3 verlorene STI auf, die anderen waren Revertanten, und alle dieser 3 STI-negativen Derivate waren auch für CS5 und CS6 negativ. Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass der STI-Locus auf demselben Plasmid vorhanden war wie die CS5- und CS6-Gene (so wie die Daten der Southern-Hybridisierung) und dass der STI-Locus relativ stabil war, so dass Revertanten oder Derivate erhalten wurden, in denen nur spezifisches Plasmid-Kurieren erfolgt ist.
Es wurde daher beschlossen, dass eine definierte STI-Deletionsmutation, die für Stamm E spezifisch ist, benötigt wurde. Um dieses Konstrukt herzustellen, waren zusätzliche Nukleotidsequenzdaten für die Region stromabwärts des STI-Gens in Stamm E erforderlich. Daher wurde einer der pJCB12-ST-Transkonjuganten für Sequenz-Bestimmungen an dem STI-Locus verwendet, unter Verwendung des Plasmid-Rescue-Verfahrens, das in Beispiel 2 beschrieben und in 20 dargestellt wurde. Ein pJCB12-Derivat wurde erhalten, das ein großes DNA-Fragment enthält, welches das STI-I-Gen aufweist und einen großen Teil der flankierenden DNA vom Stamm E. Diese Plasmidzubereitung wurde als Matrize in den Nukleotidsequenzbestimmungsreaktionen unter Verwendung des Oligonukleotids 4764 verwendet, um die Sequenz durch das STI-Gen zu bestimmen, und unter Verwendung des Oligonukleotids 4792, um die Sequenz stromabwärts des STI-Gens zu bestimmen. Die neuen Sequenzdaten erlaubten, dass ein zusätzliches Oligonukleotid, 47106, entwickelt wurde, das in weiteren Nukleotidsequenzbestimmungen verwendet wurde. Diese zusätzlichen neuen Sequenzdaten ermöglichten es, dass die Oligonukleotide 47112, 47120 und 47121 für die Konstruktion der Deletionskassette entwickelt wurden. Die Sequenz des ST-1-Gens und flankierende Regionen, welche die Bindungsstellen aller verwendeten Oligonukleotide zeigen, sind in 8 angeführt.
So wie bei anderen Deletionsmutanten, wurden zwei DNA-Fragmente aus der ST-Region durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4764 mit 47120 und 47121 mit 47112 amplifiziert, und die zwei erzeugten Fragmente wurden durch eine zusätzliche Überlappungsextensions-PCR-Reaktion unter Verwendung von Oligonukleotiden 4764 und 47112 fusioniert. Das resultierende Fragment wurde in pJCB12 unter Verwendung der SacI- und SalI-Restriktionsendonukleasestellen von pJCB12 und jener kloniert, die in die Oligonukleotide 4764 bzw. 47112 aufgenommen sind.
Das resultierende rekombinante Plasmid pJBCl2-ΔSTI^E wurde in das Stamm-E-EAST1-negative LT-negative Derivat aus Stamm SM10λpir eingeführt. Die resultierenden chloramphenicol- und tetracyclinresistenten Transkonjuganten wurden durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4917 mit 4794 und R6K-01 mit 47113 gescreent. Zwei Transkonjuganten wurden identifiziert, die positiv waren, was darauf hinweist, dass das STI-Gen korrekt targiert worden ist.
Diese chloramphenicolresistenten Transkonjuganten wurden danach in Medium, ergänzt mit Sucrose, gezüchtet, gefolgt von Plattieren auf 5 % Sucrose-Agar, um ein Ausschneiden des pJCB12-Derivats zu erhalten. Die Kolonien, die auf Sucrose-Agar wuchsen, wurden unter Verwendung der Oligonukleotide 4764 mit 47112 gescreent, und es wurden einige identifiziert, die negativ waren, und drei Kolonien wurden identifiziert, welche die Gegenwart der STI-Deletionsmutation zeigten. PCR-Reaktionen, die auf den STI-Deletionsmutanten unter Verwendung der Oligonukleotide 4738 mit 4739 durchgeführt wurden, um CS5 zu erfassen, 4740 und 4741, um CS6 zu erfassen und 4783 und 4784, um das CS5-Regulatorgen zu erfassen, waren alle positiv, was darauf hinweist, dass diese Gene in diesen definierten STI-Deletionsmutanten behalten worden waren. Zusätzliche abschwächende Mutationen in aroC, ompC und ompF wurden so wie beschrieben eingeführt (Ref 32 und Beispiel 4). Siehe 9.
BEISPIEL 4: ENTFERNEN VON TOXIN-GENEN UND EINFÜHREN VON ABSCHWÄCHENDEN MUTATIONEN IN STÄMME, WELCHE CS2/CS3 (STAMM H) UND CS4/CS6 (STAMM J) EXPRIMIEREN
Manipulation von Stamm H
Stamm H exprimiert CS2 und CS3 sowie die Toxine FAST und ST. Er weist auch die Gene für LT auf, wobei aber das LT-Protein nicht durch In-Vitro-Tests entdeckt worden ist. Um die genetische Manipulation zu erleichtern, wurde das Plasmid pACYC-Tc (in Beispiel 2 beschrieben) in den Stamm H durch Elektrotransformation eingeführt, um Tetracyclin-Resistenz zu verleihen.
Das EAST1-Toxin-Gen war das erste, das aus dem Stamm H deletiert wurde. Der Stamm SM10λpir, der das in Beispiel 3 beschriebene pJCB12-ΔEASTI-Plasmid enthielt, wurde mit Stamm H und Transkonjuganten konjugiert, welche auf L-Agar selektiert wurden, das Chloramphenicol und Tetracyclin enthielt. Die Transkonjuganten-Kolonien, in denen das EAST1-Gen korrekt targetiert worden war, wurden durch PCR identifiziert, unter Verwendung der Oligonukleotide 4917 und 4753. Danach wurden die Transkonjugaten verarbeitet, um die Derivate zu selektieren, in denen das pJCB12-Derivat ausgeschnitten hatte (oben beschrieben). Kolonien, die auf 5 % Sucrose-Agar wuchsen, wurden durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4775 und 4777 getestet, und einige wurden durch PCR als negativ identifiziert, was darauf hinweist, dass die gesamte EAST1-Region verloren worden war. Diese Stamm-H-EAST1-negativen Derivate wurden dann auf die Gegenwart eines transkriptionalen Aktivators für Kolonisationsfaktoren, rns, durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide RNS-G3 und RNS-04 getestet. Zwei der Stamm-H-EAST1-negativen Mutanten waren für rns positiv. Weiteres Testen durch PCR für CS2 unter Verwendung der Oligonukleotide 4712 und 4779 und CS3 unter Verwendung der Oligonukleotide CS3-02 und CS3-03 zeigten an, dass die Mutanten beide CS1 und CS3 positiv waren. Das Testen durch PCR auf den LT-Locus unter Verwendung der Oligonukleotide LT-04 und LT-05 und auf den STI-Locus unter Verwendung der Oligonukleotide EST-01 und 4765 zeigte, dass die Mutanten für diese Toxine negativ waren, was anzeigte, dass die ST- und LT-Loci gleichzeitig mit EAST1 verloren gegangen waren. Die Expression von C52 und CS3 in den Stamm H toxinnegativen Mutanten wurde durch SDS-PAGE bestätigt.
Definierte Deletionsmechanismen wurden danach in die Gene aroC, ompC und ompF eingeführt, um das Stamm-H-toxinnegative Derivat unter Verwendung eines Verfahrens weiter abzuschwächen, das dem zuvor beschriebenen (32) ähnelt. Diese frühere Beschreibung für das Einführen dieser Mutationen verwendete jedoch den Suizid-Vektor pCVD442, der in Beispiel 1 beschrieben wird. Dieser Suizid-Vektor codiert für Ampicillinresistenz, was für das Selektieren von nicht häufigem Transkonjugant aus einer großen gemischten bakteriellen Population nicht optimal ist. Außerdem exprimiert in dieser Phase das Stamm H toxinnegative Derivat weiterhin seine eigene Ampicillinresistenz, wodurch pCVD442 bei diesem Stamm nutzlos wird. Daher wurden die ΔaroC, ΔompC und ΔompF Deletionsmutationen, die zuvor in pCVD442 (32) kloniert worden waren, in pJCB12 subkloniert. Zu diesem Zweck wurde die ΔaroC-Mutation unter Verwendung der Restriktionsendonukleasestellen XbaI und SacI subkloniert, ΔompC verwendete SacI- und SalI-Stellen, und ΔompF verwendete SacI- und SphI-Stellen. Die pJCB12-Derivate wurden danach in den Stamm SM10λpir transferiert.
Die definierte ΔaroC-Mutation war die erste, die in das Stamm-H-Toxin-Derivat aus Stamm SM10λpir eingeführt wurde. Transkonjugante Kolonien, welche auf L-Agar, ergänzt mit Chloramphenicol und Tetracyclin, wuchsen, wurden durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4917 und 4742 gescreent, um jene zu identifizieren, in denen der aroC-Locus korrekt targetiert worden ist. Diese Transkonjugantkolonien wurden dann auf frisches L-Altar, ergänzt mit Chloramphenicol und Tetracyclin, gestrichen. Nach der Inkubation wurden die Kolonien, die wuchsen, auf die Gegenwart von rns durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotidprimer RNS-03 und RNS-04 und auf CS2 unter Verwendung der Primer 4712 und 4779 getestet. Die Reaktionen bestätigten, dass die Transkonjuganten für beide Loci positiv waren. Danach wurden die Transkonjuganten verarbeitet, um Derivate zu selektieren, in denen das pJCB12-Derivat ausgeschnitten hatte (wie in vorhergehenden Beispielen beschrieben). Kolonien, welche auf 5 % Sucrose-Agar wuchsen, wurden durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotidprimer 4731 und TT20 getestet, um Derivate zu identifizieren, welche die definierte ΔaroC-Deletionsmutation enthielten. Ein definierter SM10λpir acorC-Deletionsmutant wurde identifiziert und wiederum durch PCR geprüft, um die Gegenwart von rns und CS2 zu bestätigen, wie oben beschrieben. Die Expression von CS2 und CS3 durch diese definierten ΔaroC-Deletionsmutanten wurde unter Verwendung von SDS-PAGE bestätigt, und seine LPS wurden unter Verwendung von SDS-PAGE geprüft.
Als nächstes wurde die ompC definierte Deletionsmutation in dieses Stamm H toxinnegative ΔaroC-Derivat durch Konjugation aus Stamm SM10λpir eingeführt, der pJCB12-ΔompC enthielt. Die Transkonjugantkolonien, welche auf L-Agar, ergänzt mit Chloramphenicol und Tetracyclin wuchsen, wurden durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4917 und 4743 gescreent, um jene zu identifizieren, in denen der ompC-Locus korrekt targetiert worden ist. Danach wurden die Transkonjuganten verarbeitet, um Derivate zu selektieren, in denen das pJCB12-Derivat ausgeschnitten hatte (wie oben beschrieben). Kolonien, die auf 5 % Sucrose-Agar wuchsen, wurden durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer 4732 und 4743 getestet, um Derivate zu identifizieren, welche die definierte ΔompC-Deletionsmutation enthielten.
Danach wurde die ompF-Mutation in das Stamm H toxinnegative ΔaroC ΔompC-Derivat eingeführt, in einer ähnlichen Weise wie jener, die für die ompC-Mutation oben beschrieben wurde, außer, dass Transkonjugantkolonien durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide R6K-01 und 4733 gescreent wurden, um jene zu identifizieren, in denen der ompF-Locus korrekt targetiert worden ist. Kolonien, die auf 5 Sucrose-Agar wuchsen, wurden durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4733 und TT1 getestet, um Derivate zu identifizieren, welche die definierte ΔompF-Deletionsmutation enthielten.
Alle der definierten Deletionsmutationen des Stamm H toxinnegativen ΔaroC ΔompC ΔompF-Derivats wurden danach mit Hilfe von PCR auf einen Vergleich mit dem Wildtyp-Stamm H geprüft. Zu diesem Zweck waren die Oligonukleotide, die für aroC verwendet wurden, 4731 und TT20, für ompC 4732 und 4743 und für ompF 4733 und TT1. Die PCR-Produkte, die durch diese Reaktionen erzeugt wurden, wurden für Nukleotidsequenzbestimmungen über die Deletionsmutationen hinweg verwendet. Die für die Nukleotidsequenzbestimmungsreaktionen verwendeten Oligonukleotide waren TT35, TT38 und TT33 für aroC, ompC und ompF. Alle Deletionsmutationen wiesen die erwartete Nukleotidsequenz auf. Der Mutant wurde auch durch PCR auf die Gegenwart von rns und CS2 geprüft und auf die Abwesenheit der Toxin-Loci, wie oben beschrieben. Die Gegenwart des CS3-Locus wurde auch durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide CS3-03 und CS3-06 bestätigt. Die Expression von CS2 und CS3 wurde unter Verwendung von SDS-PAGE bestätigt und die LPS unter Verwendung von SDS-PAGE geprüft.
Der Ampicillinresistenzdeterminant wurde danach aus dem Stamm H toxinnegativen ΔaroC ΔompC ΔompF-Derivat entfernt. Zu diesem Zweck wurde der Derivatstamm durch drei Passagen in L-Brühe gezüchtet, und danach wurden Verdünnungen auf L-Agar plattiert, um gut getrennte Kolonien zu erhalten. Die Kolonien wurden danach replika-plattiert auf L-Agar, ergänzt mit Ampicillin 100 μg/ml. Nach der Inkubation, um den Kolonien ein Neuwachsen zu ermöglichen, wurden die L-Agar-Platten geprüft, um etwaige Kolonien zu identifizieren, die auf dem L-Agar vorhanden waren, welche nicht auf dem durch Ampicillin ergänzten L-Agar wuchsen. Eine solche Kolonie wurde identifiziert und bei weiteren Experimenten verwendet.
Schließlich wurde das pACYC-Tc-Plasmid, das in den Stamm H eingeführt wurde, um Chloramphenicolresistenz zu verleihen, spezifisch aus dem Stamm H toxinnegativen ΔaroC ΔompC ΔompF-Derivat kuriert. Dies erforderte die Konstruktion des Plasmids pJCB12-pACYCori. Zu diesem Zweck wurde der pACYC-Tc-Replikationsursprung durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4760 und 4761 amplifiziert und in pJCB12 unter Verwendung der Restriktionsendonuklease-Stellen SacI und SalI kloniert. Der Stamm SM10λpir, der pJCB12-pACYCori enthält, wurde mit dem Stamm H toxinnegativen ΔaroC, ΔompC, ΔompF-Derivat konjugiert, und es wurden Transkonjuganten auf L-Agar selektiert, das Chloramphenicol enthielt. Es bestand die Hoffnung, dass durch Einführen eines zweiten Plasmids, welches denselben pACYC184-Replikationsursprung trägt, und durch Selektieren für seine Aufrechterhaltung, das erste pACYC-Tc-Plasmid instabil gemacht werden würde und in Abwesenheit einer Selektion für seine Aufrechterhaltung häufiger spontan verloren ginge. Chloramphenicolresistente Transkonjugantenkolonien, welche das pJCB12-pACYCori-Plasmidderivat enthielten, wurden auf L-Agar, ergänzt mit Tetracyclin, übergeimpft, und eine dieser Kolonien erwies sich als tetracyclinsensibel, was darauf hinweist, dass das pACYC-Tc-Plasmid verloren gegangen war. Diese tetracyclinsensible, chloramphenicolresistente Kolonie wurde danach auf 5 % Sucrosemedium gezüchtet, um für Derivate zu selektieren, aus denen pJCB12-pACYCori spontan verloren gegangen war. Kolonien, die auf 5 % Sucrose-Agar wuchsen, wurden auf L-Agar, ergänzt mit Chloramphenicol ergänzt, übergeimpft, um zu bestätigen, dass das pJCB12-pACYCori-Plasmid tatsächlich verloren gegangen war.
Diese Manipulationen sind schematisch in 10 dargestellt.
Manipulation des Stammes J
Der Stamm J exprimiert CS4 und CS6 sowie die Toxine EAST und ST. Er weist auch die Gene für LT auf, wobei das LT-Protein nicht durch In-Vitro-Prüfungen erfasst worden ist. Um die genetische Manipulation zu erleichtern, wurde das Plasmid pACYC-Tc (in Beispiel 2 beschrieben) in den Stamm J durch Elektrotransformation eingeführt, wodurch eine Tetracyclinresistenz verliehen wurde.
Das EAST1-Toxin-Gen wurde zuerst aus dem Stamm J deletiert. Der Stamm SM10λpri, welcher pJCB12-ΔEAST1 enthielt, wurde mit dem Stamm J konjugiert, und Transkonjuganten wurden auf L-Agar selektiert, das Chloramphenicol und Tetracyclin enthielt. Kolonien, die wuchsen, wurden durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4917 und 4753 gescreent, um jene zu identifizieren, in denen das EAST1-Gen korrekt targetiert worden war. Diese Transkonjugantkolonien wurden danach auf frisches L-Agar, ergänzt mit Chloramphenicol und Tetracyclin, gestrichen und inkubiert, damit Kolonien wachsen konnten. Diese Kolonien wurden durch PCR getestet, um die fortlaufende Gegenwart des CS4-Operons unter Verwendung der Oligonukleotide 4768 und 4769 und des CS6-Opersons unter Verwendung der Oligonukleotide 4740 und 4781 zu bestätigen.
Ein Transkonjugant, der für beide dieser PCR-Reaktion positiv war, wurde verarbeitet, um Derivate zu selektieren, in denen das pJCB12-Derivat-Plasmid ausgeschnitten hatte (oben beschrieben). Kolonien, die auf 5 % Sucrose-Agar wuchsen, wurden durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4749 und 4752 getestet, um EAST1-Mutanten zu identifizieren. Alle getesteten Kolonien waren gemäß dieser PCR-Reaktion negativ, was darauf hinweist, dass die gesamte EAST1-Region in diesen Derivaten verloren gegangen war. Weitere PCR-Reaktionen wurden durchgeführt, um auf fortlaufende Gegenwart der Gene CS4 und CS6 zu überprüfen, wie oben beschrieben, und die Expression von CS6 wurde durch SDS-PAGE bestätigt.
PCR-Reaktionen unter Verwendung der Oligonukleotide LT-04 und LT-05 amplifizierten ein Produkt der erwarteten Größe für den LT-Locus in dem Stamm J EAST1-negativen Derivat. Nukleotidsequenzbestimmungsreaktionen, welche dieselben Oligonukleotide verwendeten, zeigten, dass dieses durch PCR erzeugte Fragment in der Tat der LT-Locus war. Daher wurde dieser Locus unter Verwendung des pJCB12-ΔLT-A-Konstruktes in derselben Weise targetiert, wie in Beispiel 3 beschrieben. LT-negative Derivate wurden identifiziert, in denen der gesamte LT-Locus deletiert worden war. Weitere PCR-Reaktionen zum Überprüfen auf die Gegenwart von CS4 unter Verwendung der Oligonukleotide 4768 und 4769 und von CS6 unter Verwendung der Oligonukleotide 4740 und 4781 bestätigten die fortlaufende Gegenwart dieser Loci in den LT-negativen Derivaten. Die Expression von CS6 durch Stamm J EAST1-negative LT-negative Derivate wurde durch SDS-PAGE bestätigt.
PCR-Reaktionen, die unter Verwendung der Oligonukleotide ST-01 und ST-02 durchgeführt wurden, zeigten, dass das ST, das in Stamm J vorhanden war, jenes gewesen ist, das durch das Transposon Tn1681 (41) codiert wurde. Die Stamm J EAST1-negativen LT-negativen Derivate wurden durch PCR getestet, unter Verwendung der Oligonukleotide ST-01 und ST-02, und erwiesen sich als ST-negativ.
Der aroC-Locus des Stamm J toxinnegativen Derivats wurde unter Verwendung von pJCB12-ΔaroC targetiert, so wie oben für Stamm H beschrieben. Korrekt targetierte Transkonjuganten wurden identifiziert. Ungewöhnlicher Weise wurden jedoch nach dem Wachstum auf 5 % Sucrosemedium alle Derivate, die in einer großen Anzahl von Experimenten erzeugt wurden, als Revertanten identifiziert. Daher wurde ein neues pJCB12-ΔaroC-Konstrukt geschaffen, das eine kleinere Deletion in dem aroC-Locus enthielt. Dies wurde durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der Oligonukleotide 47116 und 47118 sowie 47119 mit 47117 konstruiert, um zwei DNA-Fragmente zu erzeugen, welche die Region des zu deletierenden aroC-Gens flankierten. Diese wurden danach durch eine zusätzliche Überlappungsextensions-PCR-Reaktion unter Verwendung der Oligonukleotide 47116 mit 47117 fusioniert, und das resultierende Fragment wurde in pJCB12 kloniert, unter Verwendung der Restriktionsendonukleasestellen XbaI und SacI. Dieses Konstrukt wurde als pJCB12-ΔaroC^J bezeichnet und in SM10λpir elektrotransformiert. Die Sequenz des aroC-Gens und die Bindungsstellen der Oligonukleotide, die verwendet wurden, um dieses neuartige Deletionskonstrukt zu konstruieren, werden in 11 gezeigt.
Während pJCB12-ΔaroC^J konstruiert wurde, wurde die ompC definierte Deletionsmutation in das Stamm J toxinnegative Derivat eingeführt, unter Verwendung des pJCB12-ΔompC-Konstruktes und des für Stamm H beschriebenen Verfahrens.
Ein ompC-definierter Deletionsmutant wurde durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4732 und 4743 identifiziert.
Die definierte aroC-Deletionsmutation wurde danach in den Stamm J toxinnegativen ΔompC-Mutanten unter Verwendung des neuen pJCB12-ΔaroCJ-Konstruktes durch Konjugation aus dem Stamm SM10λpir eingeführt. Kolonien, die auf L-Agar, ergänzt durch Chloramphenicol und Tetracyclin, wuchsen, wurden durch PCR gescreent, unter Verwendung der Oligonukleotide 4917 und 4742, um jene zu identifizieren, in denen das aroC-Gen korrekt targetiert worden war. Danach wurden Transkonjuganten verarbeitet, um Derivate zu selektieren, in denen das pJCB12-Derivatplasmid ausgeschnitten hatte (oben beschrieben). Kolonien, die auf 5 % Sucrose-Agar wuchsen, wurden mit Hilfe von PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4731 und TT20 getestet, um jene zu identifizieren, welche die definierte aroC^J-Deletionsmutation enthielten.
Die definierte ompF-Deletionsmutation wurde danach in ein identifiziertes Stamm J toxinnegatives ΔompC ΔaroC Derivat aufgenommen. Dies erfolgte genauso wie oben für Stamm H beschrieben, und es wurde ein ompF-Deletionsmutant identifiziert.
Das tetracyclinresistente Plasmid pACYC-Tc wurde danach spezifisch aus dem toxinnegativen ΔompC ΔaroC ΔompF Derivat von Stamm J unter Verwendung von pJCB12-pACYCori kuriert, und danach wurde dieses Plasmid selbst entfernt, wiederum so wie oben für Stamm H beschrieben.
Schließlich wurden PCR-Reaktionen durchgeführt, um die Gegenwart von CS4 unter Verwendung der Oligonukleotide 4768 mit 4769 und von CS6 unter Verwendung der Oligonukleotide 4740 mit 4781 zu bestätigen. In ähnlicher Weise wurde die Gegenwart des CFA/IV-Regulatorgens unter Verwendung der Oligonukleotide 4785 und 4786 bestätigt. Die Nukleotidsequenzen der definierten aroC-, ompC- und ompF-Deletionsmutationen wurden so wie oben für Stamm H beschrieben bestimmt, und erwiesen sich so wie erwartet. Die Abwesenheit von EAST1, LT und ST Loci wurde wiederum durch PCR, wie oben beschrieben, bestätigt. Die Expression von CS6 wurde durch SDS-PAGE bestätigt, und LPS wurde auch unter Verwendung von SDS-PAGE geprüft.
Ein Diagramm, dass alle an diesen Manipulationen beteiligten Schritte darstellt, wird in 12 gezeigt.
BEISPIEL 5: ERHÖHEN DER STABILITÄT VON MANIPULIERTEN CFA-PLASMIDEN
Dieses Beispiel beschreibt eine Darstellung eines Systems zur Stabilisierung eines CFA-Plasmids. Der parDE-Locus wurde als die stabilisierende Hälfte verwendet.
Um ein Derivat eines ETEC-Stammes zu erhalten, das nicht für ST codiert, aber weiterhin seine CFA-Gene exprimiert, wird ein pJCB12-ΔSTI-Derivat konstruiert, wo der parDE-Locus durch Regionen flankiert wird, die zu den Regionen, welche das ST-Gen in dem zu targetierenden Plasmid flankieren, homolog sind. Das Einführen dieses Plasmids in einen Rezipientenstamm und die Selektion auf Chloramphenicol werden nun zu Transkonjuganten führen, in denen beide Loci in dem CFA-Plasmid vorhanden sind. Der funktionelle parDE-Locus wird nun sicherstellen, dass dieses Plasmid in diesen Zellen behalten wird. Wachstum auf Sucrose, um Derivate zu identifizieren, aus denen die pJCB12-Komponenten verloren gegangen ist, wird nun stark für Zellen selektiert, welche ein rekombinantes Plasmid enthalten, in dem das gewünschte Cross-Over stattgefunden hat (d. h. das Ersetzen des ST-Strukturgens durch den parDE-Locus). Zellen, in denen ein Reversionsereignis stattgefunden hat oder aus denen das gesamte Plasmid verloren gegangen ist, werden durch die Wirkung des Toxins getötet. Die Aufnahme des parDE-Locus wird auch dazu dienen, das Erbe des CFA-Plasmids während nachfolgender Mutationsrunden zu stabilisieren, zum Beispiel das Einführen von zusätzlichen abschwächenden Mutationen wie in den Genen aroC, ompC und ompF.
Die Oligonukleotide 4789 und 4790 werden verwendet, um den parDE-Locus aus dem Plasmid RP4 zu amplifizieren. Das gereinigte PCR-Produkt wird danach in pJCB12-ΔSTI kloniert, unter Verwendung der XhoI-Restriktionsenzymstellen, um das Plasmid pJCB12-ΔSTI::parDE zu ergeben. Dieses Plasmid wird nun in einen Rezipientenstamm durch Konjugation aus SM10λpir oder Elektrotransformation mit gereinigter Plasmid-DNA eingeführt, und die erforderlichen Zwischenprodukte und Derivate werden durch Verfahren isoliert, die im Detail in den vorhergehenden Beispielen beschrieben wurden.
BEISPIEL 6: EXPRESSION VON LT-B IN EINEM ABGESCHWÄCHTEN ETEC-STAMM, PTL003, UM EINE SCHÜTZENDE IMMUNREAKTION GEGEN LT HERVORZURUFEN
Ziel
Das Ziel dieser Arbeit lag darin, die B-Untereinheit von Escherichia coli hitzelabilem Toxin in einem Vakzinstamm von ETEC zu exprimieren. Das LTB-Gen wurde aus dem Stamm WS2773-E (NAMRU3, Kairo, Ägypten) gewonnen, aber es könnte auch von jedem anderen LTB-codierenden Stamm gewonnen werden. Ähnlich könnte der Ansatz so ausgedehnt werden, dass er auch Mutanten von LT-A, LT-B einschließt, die an andere Proteine (z. B. ST) fusioniert sind, oder die Expression von CT-B oder Derivaten davon. Anfängliche Plasmidkonstrukte wurden so geschaffen, dass sie zeigten, dass LT-B in einem ETEC-Vakzinstamm in der Abwesenheit von LT-A exprimiert und korrekt exportiert und zusammengefügt werden könnte. Nachfolgende Konstrukte verwendeten den nativen LT-Promotor, um die Expression anzutreiben.
Schließlich könnte ein ähnliches Konstrukt in das Chromosom von ETEC eingefügt werden, um einen stabilen Stamm ohne die Notwendigkeit für antibiotische Selektion zu schaffen.
Verfahren
Abschnitt 1 – PCR-Amplifizierung der LTB-CDS (Proteincodierungssequenz)
Primer
Es wurden Genbanksequenzen verwendet, um geeignete PCR-Primer (Tabelle 1) zu gestalten. Der Vorwärts-Primer (Bfor) wurde gestaltet, um von dem Startcodon des LTB-Gens aus zu amplifizieren und beruhte auf der Genbanksequenz M17874 (17). Um das Klonieren in die Expressionsvektoren zu erleichtern, wurde eine BglII-Restriktionsstelle aufgenommen, die 8 Basen 5' Prime von dem ATG-Startcodon beginnt. Der Rückwärts-Primer (Brev) wurde gestaltet, um von 200 Basen stromabwärts des Stoppcodons zu amplifizieren, so dass etwaige Transkriptionsterminatoren in das PCR-Produkt aufgenommen würden, und beruhte auf der Genbanksequenz AF190919 (26). Eine Nhel-Restriktionsstelle wurde in den Primer aufgenommen, um das Klonieren in die Expressionsvektoren zu erleichtern.
Matrize
Die Plasmid-DNA wurde aus dem Stamm WS2773-E (NAMRU3, Kairo, Ägypten) zur Verwendung als Matrize isoliert.
Reaktion
Ergebnisse
Ein 600 bp-PCR-Produkt wurde synthetisiert und von einem 1 Agarose-Gel unter Verwendung eines QIAquick^TM-Gelextraktions-Kit (Quiagen) gemäß den Herstelleranweisungen (13) isoliert.
Abschnitt 2 – Klonieren des LTB-PCR-Produktes
Klonieren in pPCR-Skript Amp SK+
Ein gel-isoliertes PCR-Produkt wurde in pPCR-Script Amp SK+^TM (Stratagene) gemäß den Anweisungen im Handbuch des Herstellers (#211188) ligiert. 2 μ1 Ligationsmischung wurden verwendet, um E.coli XL10-Gold^TM superkompetente Zellen (Stratagene #230350) zu transformieren, und es wurden korrekte Konstrukte durch Digestion von gereinigter Plasmid-DNA mit PvuII identifiziert. Ein korrektes Konstrukt wurde als pPCRLTB bezeichnet. Das LTB-Gen wurde vollständig sequenziert (14) und mit der Genbanksequenz M17874 (17) verglichen. Vier Basisänderungen wurden festgestellt, die zu zwei Aminosäureänderungen führten. Die PCR wurde wiederholt und ein zweiter Klon sequenziert und ergab identische Ergebnisse, was zeigte, dass die LT-B-Sequenz im Stamm WS2773-E sich von der Datenbanksequenz unterscheidet.
Klonieren in einen induzierbaren Expressionsvektor
Das LTB-Gen wurde in den Expressionsvektor pNCRT4 (15) transferiert. pNCAT4 ist ein Expressionsvektor, der zur Verwendung in Salmonellas typhi und Typhimurium gestaltet ist. Der Vektor wurde ursprünglich aus pTETnir15 (3) gewonnen, wurde aber durch den Austausch des TetC-Gens mit dem H.pylori-Katalase-Gen und durch den Austausch des bla-Ampicillinresistenzgens durch ein Kanamycinresistenzgen modifiziert. In diesem Plasmid ist das Katalase-Gen unter der Kontrolle des nirB-Promotors, der unter anaeroben Bedingungen nach oben reguliert wird. Zu diesem Zweck der vorliegenden Erfindung könnten viele alternative Expressionsplasmide, die auf dem Fachgebiet wohl bekannt sind, gegen pNCAT4 oder pTETnir15 ausgetauscht werden.
Das Plasmid pPCRLTB wurde mit den Restriktionsenzymen BglII und Nhel digeriert, und ein 600-bp-Fragment, welches das LTB-Gen enthält, wurde aus einem 1 % Agarose-Gel unter Verwendung eines QIAquick^TM-Gelextraktions-Kit (Qiagen) gemäß den Herstelleranweisungen isoliert. Das Plasmid pNCAT4 wurde mit den Restriktionsenzymen BglII und NHel digeriert, und ein 2,6 kb Vektorfragment wurde aus einem 1 % Agarose-Gel unter Verwendung eines QIAquick^TM-Gelextraktions-Kit (Qiagen) gemäß den Herstelleranweisungen isoliert.
Der Vektor wurde an das LTB-Gen (25) ligiert, und das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E.coli-XL10-Gold^TM superkompetente Zellen (Stratagene #230350) zu transformieren. Korrekte Klone wurden durch Restriktionsenzymanalyse identifiziert, und einer (als pNLTB gekennzeichnet) wurde verwendet, um elektrokompetentes ETEC-PTL003 zu transformieren.
Abschnitt 3 – Expression und Lokalisierung von LTB in ETEC-PTL003
Probenzubereitung
Kulturen von PTL003 und PTL003-pNLTB wurden über Nacht in einem LB-Medium mit geeigneten Antibiotika gezüchtet. Die Proben (1 ml) wurden in 100 ml Medium verdünnt und unter Schütteln ungefähr 3 Stunden lang gezüchtet. Die Kolben wurden in einen statischen Inkubator transferiert und das Wachstum für weitere 1,5 h fortgeführt.
Die Bakterien wurden mit Hilfe folgender Verfahren in periplasmatische und Sphäroblast-Komponenten fraktioniert:
Die Zellen wurden durch Zentrifugation über einen Zeitraum von 5 Minuten bei 10 400 × g geerntet. Das Zellpellet wurde in 5 ml von 200 mM Tris HCl, pH-Wert 8,0 resuspendiert und in ein 50 ml Becherglas, das einen magnetischen Floh enthielt, transferiert. Dazu wurden 5 ml TES-Puffer (200 mM Tris HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM Na₂EDTA, 1 M Sucrose) hinzugefügt. Das Rührwerk wurde in Bewegung gesetzt und ein Timer gestartet. Bei t = 90s wurden 1 mg Lysozym (10 mg/ml-Lösung) hinzugefügt und bei t = 135s wurden 10 ml Wasser beigegeben; das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von weiteren 30 Minuten inkubiert. Die Sphäroblast-Bildung wurde mit einem Lichtmikroskop geprüft und – falls abgeschlossen – wurde das Präparat über einen Zeitraum von 20 Minuten bei 47 500 × g bei 20 °C zentrifugiert. Der Überstand, welcher die periplasmatischen Proteine enthält, wurde geerntet und ungefähr zweifach in einem Centricon Macrosep^TM Spin-Konzentrator (3000 NMWL, Millipore) konzentriert. Das Pellet, welches die Sphäroblast-Proteine (cytoplasmatisch und membrangebunden) enthält, wurde in PBS resuspendiert. Proben der Zellfraktionen wurden mit gleichen Mengen von Tris-Glycin SDS-PAGE-Probenpuffer (Invitrogen LC267) gemischt, der 0,1 M Dithiothreitol enthielt. Ein Teil der periplasmatischen Probe wurde 5 Minuten lang bei 95 °C erhitzt, während der Rest bei Raumtemperatur gehalten wurde.
Probenanalyse

Die Proben wurden durch Elektrophorese auf 18 % Tris-Glycin-Gels (Invitrogen EC6505) getrennt und auf Nitrozellulose-Membrane gemäß den Anweisungen transferiert, die mit dem Xcell-II-Blot-Modul^TM (Invitrogen E19051) geliefert wurden. Die Blots wurden wie folgt inkubiert:

Block	eine Stunde in PBS, 0,05 % Tween 20^TM
	enthaltend 5 % Trockenmilch (Marvel^TM), bei
	leichtem Rütteln.
Primärantikörper	eine Stunde lang mit Hasen-Anticholera-
	Toxinantikörper (Sigma C3062), verdünnt 1:10
	000 in PBS, 0,05 % Tween 20^TM, enthaltend 1
	Marvel und eine 1:2 000 Verdünnung eines
	E.coli-Extraktes (Promega #S3761). Das
	Gemisch aus Antikörper und Extrakt wurde vor
	der Verwendung über einen Zeitraum von einer
	Stunde vorinkubiert, um die nicht
	spezifische Bindung an E.eoli-Proteine zu
	reduzieren.
Waschen	drei 5-Minuten-Wäschen in PBS, Tween 20^TM, 1
	% Marvel^TM.
Sekundäre Antikörper	eine Stunde mit Meerrettich-
	Peroxidase konjugiertem Anti-Hasenantikörper
	(Sigma A4914), verdünnt 1:10 000 in PBS,
	0, 05 % Tween 20^TM, 1 % Marvel^TM.
Waschen	drei 5-Minuten-Wäschen in PBS, Tween 2O^TM, 1
	Marvel^TM.
	zwei 5-Minuten-Wäschen in PBS, Tween 20^TM
	zwei 5-Minuten-Wäschen in PBS
Entwicklung	Blots wurden unter Verwendung eines
	SuperSignal West Pico Chemiluminescent
	Substrate^TM Kit (Pierce) entwickelt.

Die Ergebnisse der Western-Blots sind in 16 dargestellt. LTB-Monomere wurden sowohl in den Sphäroblast-Fraktionen als auch den periplasmatischen gekochten Fraktionen erfasst. In den periplasmatischen Proben, die bei Raumtemperatur gehalten wurden, wurden LTB-Pentamere entdeckt, was darauf hinweist, dass das LTB quer über die Zellmembran transportiert und in normaler Weise zusammengefügt werden könnte.
Abschnitt 4 – PCR-Amplifikation des LTB-Promotors
Primer
PCR-Primer wurden auf der Grundlage von vorläufigen Sequenzdaten der stromaufwärtigen Region des LTA-Gens von WS2773-E (7) gestaltet. Der Vorwärts-Primer (Pfor) wurde ungefähr 200 bp stromaufwärts von dem LTA-Gen einem Annealing unterzogen. Eine KpnI-Restriktionsstelle wurde in den Primer aufgenommen, um das Klonieren in Expressionsvektoren zu erleichtern. Der Rückwärtsprimer (Prev) wurde unmittelbar stromaufwärts von dem Startcodon des LTA-Gens einem Annealing unterzogen und wurde gestaltet, um eine BglII-Restriktionsstelle einzuführen, um eine korrekte Positionierung des Promotorfragmentes in Bezug auf das LTB-Gen zu ermöglichen.
Matrize
Die Plasmid-DNA wurde aus dem Stamm WS2773-E (NAMRU3, Kairo, Ägypten) zur Verwendung als Matrize isoliert.
Reaktion
Die Reaktionsbedingungen waren so wie für das LTB-Gen in Abschnitt 1 beschrieben.
Ergebnisse
Ein 200-bp-PCR-Produkt wurde synthetisiert und aus einem 1 Agarose-Gel unter Verwendung eines QIAquick^TM-Gelextraktions-Kit (Qiagen) gemäß den Herstelleranweisungen (17) isoliert.
Abschnitt 5 – Klonierung des LT-Promotors
Klonierung in pPCR-Skript AmpSK+
Das gelisolierte PCR-Produkt wurde in pPCR-Skript Amp SK^TM+ (Stratagene) gemäß den Anweisungen des Herstellers im Herstellerhandbuch (#211188) ligiert. 2 μl Ligationsmischung wurden verwendet, um E.coli XL10-Gold^TM superkompetente Zellen (Stratagene #230350) zu transformieren, und korrekte Konstrukte wurden durch Digestion von gereinigter Plasmid-DNA mit PvuII identifiziert. Ein korrektes Konstrukt wurde als pPCRProm bezeichnet. Die Sequenz dieses Konstruktes wird in 18 beschrieben.
Klonieren in einen LTB-Expressionsvektor
Plasmid pPCRProm wurde mit KpnI und BgIII digeriert, und das 200 bp Promotorfragment wurde aus einem 1 % Agarose-Gel unter Verwendung eines QIAquick^TM-Gelextraktions-Kit (Qiagen) gemäß den Herstelleranweisungen isoliert. Der nirB-Promotor von pNLTB wurde ausgeschnitten durch ? , digeriert mit KpnI und BglII (15) und das restliche 3,7 kb-Vektorfragment aus einem 1 % Agarose-Gel unter Verwendung eines QIAquick^TM-Gelextraktions-Kits (Qiagen) gemäß den Herstelleranweisungen isoliert. Der Vektor wurde mit dem LT-Promotorfragment (Sambrook et al., 1989, Literaturverzeichnis, 13) ligiert, und das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E.coli XL10-Gold^TM superkompetente Zellen (Stratagene #230350) zu transformieren. Korrekte Klone wurden durch eine Restriktionsenzymanalyse von gereinigter Plasmid-DNA identifiziert und einer (als pLLTB bezeichnet) wurde verwendet, um elektrokompetentes ETEC-PTL003 zu transformieren.
Abschnitt 6 – Expression von LTB unter der Kontrolle des LT-Promotors
Probenzubereitung
Kulturen von PTL003 und PTL003-pLLTB wurden über Nacht in einem LB-Medium mit geeigneten Antibiotika gezüchtet. Eine Absorbanz von 600 nm wurde verwendet, um die Konzentration der Zellen in den Kulturen zu bestimmen. Aliquote, welche 5 × 10⁷ Zellen enthalten, wurden durch Zentrifugation konzentriert, und die Pellets wurden in 10 μl Tris-Glycine SDS-PAGE-Probenpuffer (Invitrogen LC267) resuspendiert, der 0,1 M Dithiothreitol enthielt.
Probenanalyse
Proben wurden durch SDS-PAGE (16) und Western-Blotting genauso wie in Abschnitt 3 beschrieben analysiert.

Die Ergebnisse werden in 19 dargestellt. LTB wurde in PTL003 unter der Kontrolle des LTAB-Promotors exprimiert.

GenBank-Zugriffsnummern für Sequenzdaten Tabelle 2

EAST1 (astA)	AF143819
ST (estA)	M18346
LT-A (eltA)	V00275
LT-B (eltB)	M17874
CFA/I Operon	M55661
CS2 Operon	Z47800
CS3 Operon	X16944
CS4 Operon	AF296132
CS5 Operon	AJ224079
CS6 Operon	U04844
cfaD	M55609
csvR	X60106
rns	J04166
parDE RK2	L05507
sacB	X02730
oriR6K	M65025
mobRP4	X54459
cat	V00622

LITERATURVERZEICHNIS

1. Burkardt, H.J., G. Riess and A. Puhler, Relationship of group P1 plasmids revealed by heteroduplex experiments: RP1, RP4, R68 and RK2 are identical. J Gen Microbiol, 1979. 114 (2): p. 341-8.
2. Chatfield, S.N., et al., Role of ompR-dependent genes in Salmonella typhimurium virulence: mutants deficient in both ompC and ompF are attenuated in vivo. Infect Immun, 1991. 59(1): p. 449-52.
3. Chatfield, S.N., et al., Use of the nirB promoter to direct the stable expression of heterologous antigens in Salmonella oral vaccine Stamms: development of a singledose oral tetanus vaccine. Biotechnology (N Y), 1992. 10(8): p. 888-92.
4. Chatfield, S.N., et al., Evaluation of Salmonella typhimurium Stamms harbouring defined mutations in htrA and aroA in the murine salmonellosis model. Microb Pathog, 1992. 12(2): p. 145-51.
5. Cravioto, A. 1980, PhD Thesis, University of London, London, Vereinigtes Königreich.
6. Cravioto, A., et al., Risk of diarrhea during the first year of life associated with initial and subsequent colonization by specific enteropathogens. Am J Epidemiol, 1990. 131(5): p. 886-904.
7. Curtiss, R., 3rd und S.M. Kelly, Salmonella typhimurium Deletion mutants lacking adenylate cyclase and cyclic AMP receptor protein are avirulent and immunogenic. Infect Immun, 1987. 55(12): p. 3035-43.
8. Donnenberg, M.S. and J.B. Kaper, Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect Immun, 1991. 59(12): p. 4310-7.
9. Dougan, G., et al., Construction and characterization of vaccine strains of Salmonella harboring mutations in two different aro genes. J Infect Dis, 1988. 158 (6): p. 1329-35.
10. Everest, P., et al., Expression of LacZ from the htrA, nirB and groE promoters in a Salmonella vaccine Stamm: influence of growth in mammalian cells. FEMS Microbiol Lett, 1995. 126(1): p. 97-101.
11. Gerdes, K., P.B. Rasmussen, and S. Molin, Unique type of plasmid maintenance function: postsegregational killing of plasmid-free cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 1986. 83(10): p. 3116-20.
12. Gerdes, K., et al., The hok killer gene family in gram-negative bacteria. New Biol, 1990. 2(11): p. 946-56.
13. Hohmann, E.L., et al., phoP/phoQ-deleted Salmonella typhi (Ty800) is a safe and immunogenic single-dose typhoid fever vaccine in volunteers. J Infect Dis, 1996. 173(6): p. 1408-14.
14. Hone, D., et al., Construction of defined galE mutants of Salmonella for use as vaccines. J Infect Dis, 1987. 156(1): p. 167-74.
15. Jones, P.W., et al., Oral vaccination of calves against experimental salmonellosis using a double aro mutant of Salmonella typhimurium. Vaccine, 1991. 9(1): p. 29-34.
16. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227 (259): p. 680-5.
17. Leong, J., A.C. Vinal and W.S. Dallas, Nucleotide sequence comparison between heat-labile toxin B-subunit cistrons from Escherichia coli of human and porcine origin. Infect Immun, 1985. 48(1): p. 73-7.
18. Levine, M.M., et al., Attenuated Salmonella as live oral vaccines against typhoid fever and as live vectors. J Biotechnol, 1996. 44(1-3): p. 193-6.
19. Miller, S.I., A.M. Kukral und J.J. Mekalanos, A twocomponent regulatory system (phoP phoQ) controls Salmonella typhimurium virulence. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989. 86(13): p. 5054-8.
20. Milton, D.L., et al., Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. J Bacteriol, 1996. 178(5): p. 1310-9.
21. Pickard, D., et al., Characterization of defined ompR mutants of Salmonella typhi: ompR is involved in the regulation of Vi polysaccharide expression. Infect Immun, 1994. 62(9): p. 3984-93.
22. Qadri, F., et al., Prevalence of toxin types and colonization factors in enterotoxigenic Escherichia coli isolated during a 2-year period from diarrhea) patients in Bangladesh. J Clin Microbiol, 2000. 38(1): p. 27-31.
23. Roberts, R.C., A.R. Strom and D.R. Helinski, The parDE operon of the broad-host-range plasmid RK2 specifies growth inhibition associated with plasmid loss. J Mol Biol, 1994. 237(1): p. 35-51.
24. Rudin, A., L. Olbe and A.M. Svennerholm, Monoclonal antibodies against fimbrial subunits of colonization factor antigen I (CFA/I) inhibit binding to human enterocytes and protect against enterotoxigenic Escherichia coli expressing heterologous colonization factors. Microb Pathog, 1996. 21(1): p. 35-45.
25. Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular cloning: a loboratory manual. 2nd ed. 1989: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
26. Schlor, S., et al., Genetic rearrangements of the regions adjacent to genes encoding heat-labile enterotoxins (e1tAB) of enterotoxigenic Escherichia coli Stamms. Appl Environ Microbiol, 2000. 66(1): p. 352-8.
27. Strugnell, R., et al., Characterization of a Salmonella typhimurium aro vaccine Stamm expressing the P.69 antigen of Bordetella pertussis. Infect Immun, 1992. 60(10): p. 3994-4002.
28. Svennerholm, A.M., et al., Roles of different coli surface antigens of colonization factor antigen II in colonization by and protective immunogenicity of enterotoxigenic Escherichia coli in rabbits. Infect Immun, 1990. 58(2): p. 341-6.
29. Tacket, C.O., et al., Enteral immunization and challenge of volunteers given enterotoxigenic E. coli CFA/II encapsulated in biodegradable microspheres. Vaccine, 1994. 12(14): p. 1270-4.
30. Tacket, C.O. and M.M. Levine, Vaccines against enterotoxigenic Escherichia coli infections, in New Generation Vaccines, M.M. Levine, et al., Editors. 1997, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y.
31. Tao, B.Y. and K.C.P. Lee, Mutagenesis by PCR, in PCR Technology: current innovations, H.G. Griffin and A.M. Griffin, Editors. 1994, CRC Press, Inc.: Boca Raton, Florida. p. 69-83.
32. Turner, A.K., et al., Construction and characterization of genetically defined aro omp mutants of enterotoxigenic Escherichia coli and preliminary studies of safety and immunogenicity in humans. Infect Immun, 2001. 69(8): p. 4969-79.
33. Wolf, M.K., Occurrence, distribution, and associations of O and H serogroups, colonization factor antigens, and toxins of enterotoxigenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev, 1997. 10(4): p. 569-84.
34. Yamamoto, T. and P. Echeverria, Detection of the enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 gene sequences in enterotoxigenic E. coli Stamms pathogenic for humans. Infect Immun, 1996. 64(4): p. 1441-5.
35. Dougan EP-B 0322237.
36. Dougan EP-B 0400958.
37. Dougan EP-B 0524205.
38. Chatfield WO 99/49026.
39. Charles WO 92/15689.
40. Chang, A.C. and S.N. Cohen, Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J Bacteriol, 1978. 134(3): p. 1141-56.
41. So, M. and B.J. McCarthy, Nucleotide sequence of the bacterial transposon Tn1681 encoding a heat-stable (ST) toxin and its identification in enterotoxigenic Escherichia coli Stamms. Proc Natl Acad Sci U S A, 1980. 77(7): p. 4011-5.
42. Echeverria, P., et al., Plasmids coding for colonization factor antigens I and II, heat-labile enterotoxin, and heat-stable enterotoxin A2 in Escherichia coli. Infect Immun, 1986. 51(2): p. 626-30.
43. Levine, M.M., et al., Colonization factor antigens I and II and type 1 somatic pili in enterotoxigenic Escherichia coli: relation to enterotoxin type. Infect Immun, 1983. 39(2): p. 889-97.
44. McConnell, M.M., et al., Plasmids coding for colonization factor antigen I and heat-stable enterotoxin production isolated from enterotoxigenic Escherichia coli: comparison of their properties. Infect Immun, 1981. 32(2): p. 927-36.
45. Murray, B.E., et al., CFA/I-ST plasmids: comparison of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) of serogroups 025, 063, 078, and 0128 and mobilization from an R factor-containing epidemic ETEC isolate. J Bacteriol, 1983. 153(1): p. 566-70.
46. Reis, M.H., et al., Transfer of a CFA/I-ST plasmid promoted by a conjugative plasmid in a Stamm of Escherichia coli of serotype 0128ac:H12. Infect Immun, 1980. 29(1): p. 140-3.
47. Simon, R., U. Priefer and A. Puhler, A broad host range mobilisation system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram negative bacteria. Bio/Technology, 1983. 1: p. 784-791.
48. Turner et al (1998) Infection and Immunity 66(5)2099-2106.
49. Tacket et al, 1997, Infection & Immunity, 65 (2), 452 to 456.
50. Cieplak et al (1995) Journal of Biol. Chem. 270(51), 30545-30550.
51. Chong et al (1998) Vaccine 16, 732-740.
52. Rappuoli et al (1999) Immunology Today 20(11), 493-500.
53. Clements (1990) Infect. & Immun. 58(5), 1159-1166.
54. Aitken and Hirst (1993) Vaccine 11(2), 227-233.
55. Sanchez et al (1990) Res. Microbiol. 141, 971-979.
56. Miller, V.L. and J.J. Mekalanos, Synthesis of cholera toxin is positively regulated at the transcriptional level by toxR. Proc Natl Acad Sci U S A, 1984. 81(11): p. 3471-5.
57. Dunstan, S., Simmons, C. and Strugnell, R. Use of invivo regulated promoters to deliver antigens from attenuated Salmonella typhimurium. Infection and Immunity (1999) 67, 5133-5141.
58. Valdivia, R. and Falkow, S. Fluorescence-based isolation of bacterial genes expressed within host cells. Science (1997), 277, 2007-2011.
59. Summers et al, Mol. Genet. Genes., 201(2): 334-338.

Claims

Bakterielle Zelle, welche Kolonisationsfaktorantigen CFA/I von einem nativen Plasmid exprimiert, jedoch nicht hitzestabiles Toxin (ST) exprimiert und nicht hitzelabiles Toxin (LT) exprimiert.
Bakterielle Zelle, welche Kolonisationsfaktorantigen CS5 von einem nativen Plasmid exprimiert, jedoch nicht hitzestabiles Toxin (ST) exprimiert und nicht hitzelabiles Toxin (LT) exprimiert.
Zelle nach Anspruch 2, welche Kolonisationsfaktorantigen CS6 von einem nativen Plasmid exprimiert.
Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welche eine Escherichia coli-Zelle ist.
Zelle nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin: (a) das Plasmid ein enterotoxigenes E.coli-Plasmid ist, in welchem das ST-Gen inaktiviert oder deletiert ist; (b) das Plasmid eine Deletion des gesamten oder eines Teils des ST-Gens enthält; (c) die Zelle mittels einer Methode erhältlich ist, welche die Deletion des gesamten oder eines Teils des ST-Gens mit einem Suizid-Vektor umfasst; (d) die Zelle nicht EAST1 exprimiert; (e) die Zelle nicht ein Antibiotikaresistenzgen exprimiert; und/oder (f) die Zelle mittels einer Methode erhältlich ist, welche die positionsgerichtete Deletion oder Inaktivierung des LT-Gens umfasst.
Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welche erhältlich ist mittels einer Methode, die das Schaffen einer Mutation im ST-Gen und/oder im LT-Gen umfasst, welche das Genprodukt nicht-toxisch macht.
Zelle nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Plasmid ein Element enthält, welches seine Stabilität erhöht .8. Zelle nach Anspruch 7, worin: (a) das Element ein Toxin-Antitoxin-Element oder ein Rekombinase-Erkennungs-element ist; oder (b) das Stabilitätselement parDe oder crs ist .9. Escherichia coli-Zelle, hinterlegt bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC) unter der Zugriffsnummer 01090303, Nummer 01090304, Nummer 01090305, Nummer 01090306, Nummer 02082964, Nummer 02082966, Nummer 02082967 oder Nummer 02082968; oder ein Abkömmling einer solchen Zelle.
Zelle nach einem der vorangehenden Ansprüche, welche außerdem abgeschwächt ist durch eine positionsgerichtete Deletion oder Inaktivierung eines Gens.
Zelle nach Anspruch 10, welche außerdem abgeschwächt ist durch Deletion oder Inaktivierung von: (a) einem oder mehreren von aroA, AroC, AroD, AroE, pur, htrA, ompC, ompF, ompR, cya, crp, PhoP, surA, rfaY, dksA, hupA, sipC und cipB; (b) mindestens einem aro-Gen und mindestens einem omp-Gen; (c) mindestens einem aro-Gen und dem htrA-Gen; oder (d) jedem von aroC, ompF und ompC.
Zelle nach einem der vorangehenden Ansprüche, welche ein heterologes Antigen exprimiert.
Zelle nach Anspruch 12, wobei das heterologe Antigen ein E.coli-Antigen ist.
Zelle nach Anspruch 13, wobei das heterologe Antigen ist: (a) ein E.coli-Kolonisationsfaktorantigen (CFA); oder (b) eine nicht-toxische Komponente oder Form von LT.
Zelle nach Anspruch 14, wobei die nicht-toxische Komponente von LT die B-Untereinheit ist.
Natives enterotoxigenes E.coli-Plasmid, worin das Gen, das ST-Toxin codiert, deletiert oder inaktiviert ist, und welches codiert: – Kolonisationsfaktorantigen CFA/I; oder – Kolonisationsfaktorantigen CS5 und/oder Kolonisationsfaktorantigen CS6.
Vakzine gegen Diarrhoe, umfassend eine Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und einen pharmazeutisch geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel.
Vakzine gegen Diarrhoe, umfassend sowohl eine Zelle nach Anspruch 1 als auch eine Zelle nach Anspruch 2, und einen pharmazeutisch geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel.
Vakzine nach Anspruch 17 oder 18, welche außerdem eine Zelle umfasst, die Kolonisationsfaktorantigen CFA/II exprimiert.20. Vakzine nach Anspruch 17, 18 oder 19, welche umfasst: (i) eine Zelle, welche CFA/I exprimiert, nach einem der Ansprüche 1 und 4 bis 25; (ii) eine Zelle, welche CS5 und CS6 exprimiert, nach einem der Ansprüche 3 bis 25; (iii) eine Zelle, welche CS4 und CS6 exprimiert; (iv) eine Zelle, welche CS2 und CS3 exprimiert; und (v) eine Zelle, welche CS1 und CS3 exprimiert.
Vakzine nach Anspruch 20, worin: (i) die Zelle, welche CFA/I exprimiert, jene ist, die bei ECACC unter der Zugriffsnummer 01090303 oder 02082967 hinterlegt ist, oder ein Abkömmling davon; (ii) die Zelle, welche CS5 und CS6 exprimiert, jene ist, die bei ECACC unter der Zugriffsnummer 01090305 oder 02082968 hinterlegt ist, oder ein Abkömmling davon; (iii) die Zelle, welche CS4 und CS6 exprimiert, jene ist, die bei ECACC unter der Zugriffsnummer 01090306 oder 02082966 hinterlegt ist, oder ein Abkömmling davon; (iv) die Zelle, welche CS2 oder CS3 exprimiert, jene ist, die bei ECACC unter der Zugriffsnummer 01090304 oder 02082964 hinterlegt ist, oder ein Abkömmling davon; und (v) die Zelle, welche CS1 und CS3 exprimiert, jene ist, die bei ECACC unter der Zugriffsnummer 01090302 oder 02082965 hinterlegt ist, oder ein Abkömmling davon.22. Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder eine Vakzine nach einem der Ansprüche 17 bis 21 zur Verwendung bei einer Methode der Impfung gegen Diarrhoe.23. Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder einer Kombination von Zellen nach einem der Ansprüche 18 bis 21 für die Herstellung eines Medikaments zur Impfung gegen Diarrhoe.24. Suizid-Vektor, welcher weniger als 5 kb in der Größe beträgt und die sacB-Region umfasst, welche für ein Produkt codiert, das toxisch für Bakterien ist, wenn auf Sucrose gezüchtet, in welcher Region die IS1-Insertionssequenz deletiert oder inaktiviert ist.
Vektor nach Anspruch 24, welcher außerdem umfasst: (a) einen Transferursprung, welcher den konjugativen Transfer des Vektors von einem Bakterienstamm auf einen anderen steuert; (b) einen Replikationsursprung; (c) einen selektierbaren Marker; und/oder (d) eine Klonierungsstelle, umfassend mindestens eine Restriktionsenzymstelle, die im Vektor einzigartig ist.
Vektor nach Anspruch 25, worin: (a) der Transferursprung mobRP4 ist; (b) der Replikationsursprung oriR6K ist, welcher das pir-Gen für die Replikation erfordert; (c) der selektierbare Marker das cat-Gen ist, welches für Chloramphenicolacetyltransferase codiert und Chloramphenicol Resistenz verleiht; und/oder (d) der Vektor die Sequenz eines Zielgens in der Klonierungsstelle umfasst.27. Vektor nach einem der Ansprüche 24 bis 26, welcher etwa 3kb in der Größe beträgt.
Vektor nach Anspruch 25, welcher außerdem die Sequenz eines Zielgens in der Klonierungsstelle umfasst, wobei das Zielgen ein Wildtyp- oder inaktiviertes E.coli-Toxingen ist.
Vektor nach Anspruch 28, welcher ein Wildtyp- oder inaktiviertes ST-Gen in der Klonierungsstelle enthält.
Verfahren zur Herstellung einer bakteriellen Zelle, in welcher ein Zielgen deletiert, inaktiviert oder ersetzt ist, welche Methode das Übertragen (a) eines Vektors nach Anspruch 25, welcher außerdem die Sequenz eines Zielgens in der Klonierungsstelle umfasst; oder (b) einen Vektor nach Anspruch 28 oder 29; in die bakterielle Zelle, welche das Zielgen enthält, und das Auswählen einer Zelle umfasst, in welcher das Zielgen deletiert, inaktiviert oder ersetzt wurde.
Verfahren nach Anspruch 30, welches umfasst: (a) Ausführen einer PCR zum Auswählen einer Zelle, in welcher der Vektor das Zielgen korrekt angezielt hat, wobei einer der in der PCR verwendeten Primer an die Vektorsequenz angrenzend an die Klonierungsstelle hybridisiert und der andere an eine Stelle in der zellulären DNA angrenzend an das Zielgen hybridisiert, und worin eine positive PCR anzeigt, dass der Vektor das Zielgen angezielt hat; und/oder (b) Auswählen einer Zelle, aus der der Vektor ausgeschnitten wurde, durch Züchten der Zelle in einem Medium, ergänzt mit Sucrose, bei der NaCl abwesend ist.