DE69027313T2

DE69027313T2 - Impfstoffe enthaltende avirulente phop-type mikroorganismen

Info

Publication number: DE69027313T2
Application number: DE69027313T
Authority: DE
Inventors: Roy Curtiss; Jorge Galan
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 1989-03-31
Filing date: 1990-03-23
Publication date: 1997-01-23
Anticipated expiration: 2010-03-24
Also published as: EP0465560A1; JPH04504204A; CA2013573C; US5424065A; ATE138784T1; DE69027313D1; AU5356090A; WO1990011687A1; CA2013573A1; ES2090129T3; JP3004049B2; AU645489B2; EP0465560A4; EP0465560B1; DK0465560T3

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft Stoffe und Methoden zur Herstellung von Impfstoffen und rekombinanten DNA-Expressionsprodukten und insbesondere gentechnisch veränderte Mikroorganismen, die als Impfstoffe und als Vektoren für die Antigenfreisetzung in Frage kommen.

Zitierte Literaturstellen (Veröffentlichungen)

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Hintergrund

Die bisher verwendeten Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten werden im allgemeinen in vier Kategorien eingeteilt:
(I) spezifische Komponenten aus den ätiologischen Agentien einschließlich intakter Antigene, Fragmente davon oder synthetische Maloga natürlich vorkommender Antigene oder Epitope;
(II) antiidiotypische Antikörper
(III) das vollständig abgetötete ätiologische Agens und
(IV) ein avirulentes (abgeschwächtes) Derviat des ätiologischen Agens als Lebendimpfstoff. Abgeschwächte Impfstoffe haben den Vorteil, daß sie im Hinblick auf ihre Wirkung auf die Immunität ähnlich wie die natürliche Infektion wirken. Sie vermehren sich im Wirt und zeigen, wenn sie immunogen sind, die Tendenz zur Stimulierung einer länger anhaltenden Antikörperproduktion, um eine T-zellvermittelte Reaktion sowie eine Antikörperproduktion und Resistenz an der Eintrittsstelle zu induzieren.
Es ist möglich, avirulente Stämme dadurch zu entwickeln, daß man in potentiell pathogene Stämme des Mikroorganismus Mutationen einführt, was zu einem verminderten Vermögen des mutierten Organismus zum Überleben im Wirt führt. Die Prinzipien der Verwendung abgeschwächter Organismen werden in der Literatur bezüglich des Salmonella-Systems illustriert; diese Prinzipien sind jedoch breit anwendbar.
Die Gründe, die zur Entwicklung von avirulenten Salmonella-Stämmen geführt haben, sind zweierlei [bezüglich der Entwicklung avirulenter Stämme siehe z.B. Bacon et al. (1951), Vurtiss und Kelly (1987), Germanier und Furer (1975) und Hoiseth und Stocker (1981)]. Es wurde häufig festgestellt, daß lebende abgeschwächte Salmonella-Stämme wirksamer sind als abgetötete Impfstoffe oder Untereinheitswirkstoffe bei der Auslösung einer Immunschutzreaktion gegenüber der Infektion durch verschiedene Arten von Salmonella bei Mensch und Tier. [Hoiseth und Stocker (1981); Ashcroft et al. (1987), Collins (1974); Collins et al. (1966); Mukkur et al. (1987) und Robertson et al. (1983)]. Außerdem dringen die invasive Eigenschaften aufweisenden Vertreter der Gattung Salmonella wie z.B. S. typhimurium und S. typhi nach oraler Aufnahme tief in die Gewebe ein, indem sie sich an den Zellen des Darmlymphgewebes (GALT; Peyer-Plaques) festheften, in sie eindringen und sich dort vermehren. [siehe z.B. Carter und Collins (1974)]. Avirulente Derivate von S. typhimurium wurden verwendet, um an dieser Stelle heterologe Antigene freizusetzen, und zwar als Mittel zur Stimulierung einer sekretorischen wie auch zellulären und humoralen Immunreaktion auf diese Antigene [Clements und El Morshidy (1984); Curtiss et al. (1986); Curtiss, (1988a); Curtiss, (1988b); Formal et al. (1981) und Maskell et al. (1987)].
Um Salmonella avirulent zu machen, wurden bisher mehrere unterschiedliche Strategien verfolgt. Diese umfassen die Verwendung von auxotrophen Mutanten wie aroA [Hoisetz und Stocker (1981), asd oder thy [Curtiss et al. (1986)] oder bei der Biosynthese von Purin defektiven Mutanten (McFarland und Stocker (1987); O'Callaghan et al. (1988)], bezüglich der Verwertung oder Synthese von Kohlehydraten veränderten Mutanten wie galE (Germanier und Furer 1975; Fukasawa und Nikaido (1959); Stevenson und Manning (1985)] und bezüglich der Gesamtgenexpression veränderten Mutanten wie cya crp [Curtiss und Kelly (1987)]. Diese Mutanten wurden getestet und mit vom Wirt, der Bakterienart und dem Immunisierungsweg abhängenden Erfolg verwendet [Clements und El-Morshidy (1984); Curtiss et al. (1988a); Curtiss et al. (1988b); O'Callaghan et al. (1988)].

Offenbarung der Erfindung

Als überraschendes Ergebnis erwies sich die Tatsache, daß von hochpathogenen Salmonella- Stämmen abgeleitete phoP-Mutanten bei Dosen, die über der LD&sub5;&sub0;-Dosis der Wildtypeltern lag, avirulent waren, und obwohl sie in den GALT-Zellen nur begrenzte Infektionen auslösten, waren diese Mutantenorganismen immunogen und boten einen hohen Schutz gegen die Infektion durch die Wildtyporganismen. Die unterschiedlichen Ausführungsformen der Erfindung machen sich die Avirulenz und Immunogenität der phoP-Mutanten oder der dem phoP-Typ äquivalenten Mutanten von Salmonella in anderen Arten von Mikroorganismen zunutze.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist daher ein Impfstoff für die Immunisierung eines Individuums gegen durch Salmonella verursachte Krankheitssymptome, der avirulente Salmonella, die immunogene phoP-Mutanten darstellt, und einen parzmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein oben beschriebener Impfstoff, wobei die avirulente Salmonella wenigstens eine zusätzliche Mutation aufweist, welche die Pathogenität des Salmonella-Wildtyps, von dem die avirulente Salmonella abgeleitet ist, vermindert.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Impfstoff für die Immunisierung eines Individuums gegen durch einen pathogenen Mikroorganismus verursachte Krankheitssymptome, wobei der Impfstoff Salmonella-Trägerzellen umfaßt, die avirulente immunogene phoP-Mutanten sind, wobei die Trägerzellen mit einem ein immunogenes Antigen aus dem pathogenen Mikroorganismus kodierenden rekombinanten Expressionsvektor transformiert werden. Zu dieser Ausführungsform gehören auch Impfstoffe, wobei die Salmonella-Trägerzeilen eine für die Zellen letale Mutation enthalten, die durch ein rekombinantes Gen in einem Vektor, der die letale Mutation komplementiert, kompensiert wird, um ein kompensiertes letales Wirt-Vektor-System zu bilden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein isolierter Salmonella-Stamm, der eine phoP-Mutante darstellt und eine für die Zellen letale Mutation enthält, die durch ein rekombinantes Gen in einem Vektor, der die letale Mutation komplementiert, kompensiert wird, um ein kompensiertes letales Wirt-Vektor-System zu bilden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein isolierter Salmonella-Stamm, der eine -phoP-Mutante und auch ein δ-cya oder δ-crp darstellt.
Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein isolierter Salmonella-Stamm, ausgewählt aus der Gruppe ATCC Nr. 53864, ATCC Nr. 53865 oder ATCC Nr. 53866, sowie Derivaten und Mutanten davon.
Die Erfindung stellt außerdem die erwähnten Impfstoffe und avirulenten Mikroorganismen für die Verwendung bei einem Verfahren zur Immunisierung eines menschlichen oder tierischen Individuums gegenüber einer Krankheit bereit.
Die Erfindung kann bei Verfahren zur Immunisierung von Individuen verwendet werden. Diese Verfahren umfassen zum Beispiel ein Verfahren zur Immunisierung eines Individuums gegenüber einer durch Salmonella hervorgerufene Erkrankung, indem man dem Individuum einen Impfstoff zur Behandlung eines Individuums bei Krankheitssymptomen, die durch Salmonella verursacht werden, verabreicht, wobei dieser Impfstoff avirulente Salmonella umfaßt, die phoP-Mutanten darstellen, welche bei einer immunologisch wirksamen Dosis immunogen sind. Diese Verfahren umfassen auch die Immunisierung von Individuen gegenüber einer durch Salmonella hervorgerufene Erkrankung, indem man dem Individuum einen Impfstoff, wie oben beschrieben, verabreicht, wobei die avirulente Salmonella wenigstens eine zusätzliche Mutation aufweist, die die Pathogenität der Wildtyp-Salmonella, von der die avirulente Salmonella abgeleitet ist, in einer immunologisch wirksamen Dosis herabsetzt. Hierher gehört auch ein Verfahren zur Immunisierung eines Individuums gegenüber einer durch Salmonella hervorgerufenen Erkrankung, indem man dem Individuum einen Impfstoff zur Behandlung von durch einen pathogenen Mikroorganismus verursachten Krankheitssymptomen verabreicht, wobei der Impfstoff Salmonella-Trägerzellen umfaßt, die avirulente immunogene phoP-Mutanten sind, wobei die Trägerzellen mit einem ein immunogenes Antigen aus dem pathogenen Mikroorganismus kodierenden rekombinanten Expressionsvektor transformiert sind. Diese Ausführungsform umfaßt auch Impfstoffe, wobei die Salmonella- Trägerzellen eine für die Zellen letale Mutatiion enthalten, die durch ein rekombinantes Gen in einem Vektor, der die letale Mutation komplementiert, kompensiert wird, um ein kompensiertes letales Wirt-Vektor-System zu bilden. Die Immunisierung erfolgt bei einer immunologisch wirksamen Dosis.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die CFU's, die aus den Peyer-Plaques von beimpften Mäusen nach Beimpfung mit dem phoP-Stamm Chi3687 und nach Beimpfung mit dem Wildtypstamm Chi3181 erhalten wurden.
Fig. 2 zeigt die CFU's, die aus der Leber von beimpften Mäusen nach Beimpfung mit dem phoP-Stamm Chi3687 und nach Beimpfung mit dem Wildtypstamm Chi3181 erhalten wurden.

Arten der Ausführung der Erfindung

A. Definitionen

Die Ausdrücke "rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen" und andere Mikroorganismen bezeichnende Ausdrücke sind austauschbar und bedeuten Zellen, die Rezipienten für rekombinante Vektoren oder andere transferierte DNA darstellen können oder als solche verwendet werden können und umfassen die Nachkommenschaft der ursprünglich transfizierten Zellen. Es versteht sich von selbst, daß die Nachkommenschaft einer einzigen Elternzelle im Genom- bzw. Gesamt-DNA-Komplement infolge zufälliger oder spontaner Mutation mit dem ursprünglichen Eiter vollständig identisch sein muß. Die Nachkommenschaft der Elternzelle, die dem Eiter ausreichend ähnlich ist, um durch die relevante Eigenschaft wie z.B. die Avirulenz aufgrund einer phoP-Mutation gekennzeichnet zu werden, ist dabei mit eingeschlossen.
Der Ausdruck "Kontrollsequenz" bezeichnet die DNA-Sequenzen, die notwendig sind, um die Expression der Codesequenzen, mit denen sie ligiert sind, zu bewirken. Im allgemeinen umfassen derartige Kontrollsequenzen einen Promoter- und einen Ribosomenbindungssite. Der Ausdruck "Kontrollsequenzen" umfaßt dabei zumindest alle Komponenten, deren Anwesenheit für die Expression notwendig ist; sie können aber auch zusätzliche Komponente enthalten, deren Anwesenheit von Vorteil ist wie z.B. Operatoren.
Der Ausdruck "operabel verknüpft" bedeutet eine Juxtaposition, bei der die auf diese Weise beschriebenen Komponenten zueinander in einer Beziehung stehen, die ihre Funktion in der beabsichtigten Weise ermöglichen. Eine "operabel" mit einer Codesequenz "verknüpfte" Kontrollsequenz wird in einer Art und Weise ligiert, daß die Expression der Codesequenzen, unter den mit den Kontrollsequenzen verträglichen Bedingungen erzielt wird.
Der Ausdruck "Replikon" bedeutet ein genetisches Element wie z.B. ein Plasmid, ein Chromosom oder ein Virus, das sich innerhalb einer Zelle wie eine autonome Einheit einer Polynukleotidreplikation verhält, das heißt unter seinen eigenen Kontrolle zur Replikation befähigt ist.
Der Ausdruck "Vektor" bedeutet ein Replikon, an das ein anderes Polynukleotidsegment geheftet ist, um die Replikation und/oder Expression des angehefteten Segments durchzuführen.
Der Ausdruck "Codesequenz" bedeutet eine Polynukleotidsequenz, die in die mRNA transkribiert und/oder in ein Polypeptid transferiert wird, wenn es unter die Steuerung geeigneter Regulatorsequenzen gelangt. Die Grenzen der Codesequenz sind durch ein Translationsstartkodon am 5'-Ende und ein Translationsstopkodon am 3'-Ende definiert. Eine Codesequenz kann, ohne darauf beschränkt zu sein, cDNA und rekombinante Polynucleotidsequenzen umfassen.
Der Ausdruck "Expressionsvektor", wie er hier verwendet wird, bedeutet einen Vektor, in dem eine interessierende Codesequenz mit Kontrollsequenzen operabel verknüpft ist.
Der Ausdruck "gram-negative Bakterien" umfaßt Kokken, Nichtentero- und Enterostäbchen. Die Gattungen der gram-negativen Bakterien umfassen zum Beispiel Neisseria, Spirillum, Pasteurella, Brucella, Yersinia, Francisella, Haemophilus, Bordetella, Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Proteus, Vibrio, Pseudomonas, Bacteroides, Acetobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Azotobacter, Spirilla, Serratia, Rhizobium, Chlamydia, Rickettsia, Treponema, Camphelobacter und Fusobacterium.
Der Ausdruck "Gram-positive Bakterien" umfaßt Kokken, nichtsporenbildende und sporenbildende Stäbchen. Die Gattungen der gram-negativen Bakterien umfassen zum Beispiel Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Lactobacillus, Listeria, Mycobacterium, Myxococcus, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus und Streptomyces.
Der Ausdruck "Mykobakterien" ist auf der Basis ihres anderen Anfärbungsvermögens definiert worden; sie widersetzen sich nämlich der Entfärbung mit angesäuerten organischen Lösungsmitteln. Außerdem beruht ihre Definition auflangkettigen (ca. 60 C-Atome) Mycolsäuren.
Der Ausdruck "fakultative intracelluläre pathogene Organismen" umfaßt die Gattungen Salmonella, Yersinia, Pateurella, Legionella, Brucella, Mycobacteria, Listeria und Neisseria.
Der Ausdruck "Behandlung" bedeutet die Verabreichung des Impfstoffs an ein Individuum, wodurch eine Immunschutzreaktion bewirkt wird, und umfaßt Prophylaxe und/oder Therapie.
Unter dem Ausdruck "natives chromosomales Gen" versteht man ein solches, das im Chromosom eines Wildtyporganismus vorkommt wie zum Beispiel das Asparaginsäuresemialdehyd-Dehydrogenase kodierende Gen (Asd) in E. coli oder Salmonella, die Alanin- Racemase kodierenden Gene und die D-Alanyl-D-alanin-Ligase kodierenden Gene. Weitere Beispiele für native Gene werden weiter oben beschrieben.
Unter dem Ausdruck "rekombinantes Gen" versteht man hier ein identifizierbares Polynucleotidsegment innerhalb eines größeren Polynucleotidmoleküls, das mit diesem größeren Molekül in der Natur nicht in Verbindung steht. Das rekombinante Gen kann genomischen Ursprungs sein, aus einer CDNA stammen, halbsynthetischen oder zur Gänze synthetischen Ursprungs sein.
Unter dem Ausdruck "heterologer" Bereich einer DNA-Konstruktion ist ein identifizierbares DNA-Segment, das sich innerhalb eines anderen DNA-Moleküls befindet oder diesem angeheftet ist, in der Natur mit dem anderen Molekül verbunden jedoch nicht vorkommt. Wenn der heterologe Bereich also ein Bakteriengen kodiert, wird das Gen dann gewöhnlich von DNA flankiert, was bei dem Bakteriengen im Genom der als Quelle dienenden Bakterien nicht der Fall ist. Ein weiteres Beispiel für die heterologe Codesequenz ist eine Konstruktion, bei der die Codesequenz an sich nicht in der Natur vorkommt, wie zum Beispiel synthetische Sequenzen mit vom nativen Gen unterschiedlichen Kodonen. Allele Variationen oder natürlich vorkommende Mutationen ergeben keinen heterologen DNA-Bereich, wie er hier verwendet wird.
Die Abkürzung "DAP" bedeutet hier, sofern keine andere Angabe gemacht wird, beide Stereoisomeren der Diaminopimelinsäure und ihrer Salze, das heißt sowohl die LL- als auch die meso-Form.
Die hier verwendeten Gensymbole für die mutanten Stämme entsprechen Bachmann (1987 sowie Sanderson and Roth (1987). Die für Transposone verwendeten Symbole, insbesondere Tn10 folgen dem von Bukhari et al. (1977) beschriebenen Übereinkommen.
Unter dem Ausdruck "Individuum", das mit dem erfindungsgemäßen Impfstoff behandelt wird, versteht man hier sämtliche Wirbeltiere wie zum Beispiel Säugetiere, Haustiere und den Menschen eingeschlossen, verschiedene Arten von Vögeln einschließlich Geflügel und insbesondere landwirtschaftliche Nutztiere. Außerdem gehören hierher auch Mollusken und einige andere Wirbellose, die über ein primitives Immunsystem verfügen.
Der Ausdruck "Transformation" bedeutet hier die Insertion eines exogenen Polynucleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des dafür verwendeten Verfahrens wie zum Beispiel der unmittelbaren Aufnahme, der Elektroporenbildung, Transduktion oder Konjugation. Das exogene Polynucleotid kann als Plasmid aufrechterhalten werden oder es kann das gesamte Polynucleotid oder ein Teil davon in das Wirtsgenom integriert werden
Der Ausdruck "phoP-Gen oder ein Äquivalent davon" bedeutet ein Gen, das ein Produkt kodiert, welches die Expression anderer Gene einschließlich der Loci, welche die Virulenzeigenschaften kodieren (zum Beispiel Erleichterung der Besiedelung, Invasivität, Schädigung des infizierten Individuums und Überleben in Makrophagen oder Zellen im Immunabwehrnetzwerk) einschließlich eines eine Phosphatase kodierenden Gens wie zum Beispiel von phon in Salmonella steuert.
Organismen, die ein "phoP-Gen oder ein Äquivalent davon" enthalten, sind zur Gänze Vertreter der Familie der Enterobacteriaceae (zum Beispiel E. coli, Salmonella, Proteus, Klebsiella, Serratia, Providencia, Citrobacter, Edwardsiella, Hafnia und Enterobacter) sowie Vertreter anderer Bakteriengattungen wie zum Beispiel von Staphylococcus, Rhizobium, Mycobacterium, Aerobacter, Alcaligenes und Bacillus und mehrere Arten der Gattung Candida. Das phoP-Produkt ist ein Regulator für die sauren Phosphatasen [Kier et al. (1979)].
Der Ausdruck "pathogener Mikroorganismus" bedeutet einen solchen, der mit dem pathogenen Organismus in Zusammenhang stehende Krankheitssymptome verursacht.
Der Ausdruck "avirulenter Mikroorganismus" bedeutet einen solchen, der ein Individuum zu besiedeln und sich im befallenen Individuum zu vermehren vermag, jedoch keine Krankheitssymptome verursacht, wie sie mit den virulenten Stämme derselben Mikroorganismenart verbunden sind. Der Ausdruck "avirulent" bedeutet nicht, daß eine Mikrobe dieser Gattung oder Art nicht auch als pathogener Organismus wirken kann, sondern er bedeutet, daß die konkrete Mikrobe für das konkrete zu behandelnde Tier avirulent ist. Die Mikrobe kann zu einer Gattung oder sogar zu einer Art gehören, die gewöhnlich pathogen ist, muß jedoch einem avirulenten Stamm angehören. Avirulente Stämme sind nicht befähigt, die ganze Folge von Krankheitssymptomen auszulösen, die gewöhnlich mit seinem virulenten pathogenen Widerpart verbunden sind. Avirulente Mikroorganismenstämme können von virulenten Stämmen durch Mutation abgeleitet sein.
Der Ausdruck "Mikrobe", wie er hier verwendet wird, umfaßt Bakterien, Protozoen und einzellige Pilze.
Der Ausdruck "Trägermikrobe" bedeutet eine avirulente Mikrobe, wie sie oben definiert wurde, die ein ein interessierendes Protein kodierendes rekombinantes Gen enthält. Eine "Trägermikrobe" bedeutet hier eine Form einer rekombinanten Wirtszelle.
Der Ausdruck "Antigen" bedeutet ein Molekül, das ein oder mehrere Epitope enthält, die das Immunsystem eines Wirtes stimulieren, um eine sekretorische, humorale und/oder zelluläre antigenspezifische Reaktion auszulösen. Der Ausdruck ist auch mit "immunogen" austauschbar.
Der Ausdruck "Hapten" bedeutet ein Molekül, das ein oder mehrere Epitope enthält, das selbst das Immunsystem des Wirts nicht stimuliert, um es zu einer sekretorischen, humoralen und/oder zellulären Reaktion zu veranlassen.
Der Ausdruck "Epitop" bedeutet einen Site, an den ein für diesen Site spezifischen Antikörper gebunden wird. Ein Epitop kann drei Aminosäuren in einer räumlichen, allein diesem Epitop zukommenden Anordnung umfassen. Gewöhnlich besteht ein Epitop aus wenigstens fünf derartigen Aminosäuren und insbesondere aus wenigstens acht bis zehn Aminosäuren. Dieser Ausdruck ist mit den Ausdrücken "Antigendeterminante" oder "Antigendeterminantensite" austauschbar.
Der Ausdruck "immunologische Reaktion" auf eine Zusammensetzung oder einen Impfstoff bedeutet, daß es im Wirt zu einer zellulären und/oder duch Antikörper vermittelten Immunreaktion auf die jeweilige Zusammensetzung oder den jeweiligen Impfstoff kommt. Gewöhnlich besteht eine solche Reaktion darin, daß das Subjekt Antikörper, B-Zellen, T-Helferzellen, T-Suppressorzellen und/oder cytotoxische T-Zellen produziert, die spezifisch auf ein Antigen oder Antigene gerichtet sind, die in der jeweiligen Zusammensetzung oder im jeweiligen Impfstoff enthalten sind.
Der Ausdruck "Impfstoffzusammensetzung" bedeutet ein Agens, das zur Stimulierung des Immunsystems eines lebenden Organismus verwendet wird, wodurch dieser vor einer künftigen Schädigung geschützt wird.
Der Ausdruck "Immunisierung bedeutet den Prozeß der Induzierung einer anhaltenden hohen Antikörpermenge und/oder einer zellulären Immunreaktion, bei dem die T-Lymphozyten den pathogenen Organismus abtöten und/oder andere Zellen wie zum Beispiel Phagozyten in einem Organismus dazu aktivieren können und wobei dieser Prozeß gegen einen pathogenen Organismus oder ein Antigen gerichtet ist, dem der Organismus vorgängig ausgesetzt war.
Obwohl der Ausdruck "Immunsystem" Reaktionen von Einzellern auf die Anwesenheit von Fremdkörpern wie zum Beispiel die Interferonproduktion umfassen kann, ist hier der Ausdruck auf die anatomischen Merkmale und Mechanismen beschränkt, durch die ein Mehrzeller Antikörper gegen ein Antigenmaterial produziert, das in die Zellen des Organismus oder in die extrazelluläre Flüssigkeit des Organismus eindringt. Der auf diese Weise produzierte Antikörper kann zu einer der immunologischen Klassen wie zu den Immunoglobulinen A, D, E, G oder M gehören. Von besonderem Interesse sind Impfstoffe, welche die Produktion von Immunoglobulin A (IgA) stimulieren, da dieses das Hauptimmunoglobulin ist, das durch das sekretorische System von Warmblütern erzeugt wird. Die Immunreaktion auf Antigene ist bereits gut untersucht und häufig beschrieben worden. Eine Übersicht über die Immunologie wird von Barrett, James T., Textbook of Immunology, 4. Auflage, C.V. Mosby Co., St. Louis, MO (1983) gegeben.
Der Ausdruck "Wirbeltier" bedeutet einen beliebigen Vertreter des Subphylum der Vertebraten, der Hauptabteilung des Phylums der Chordata, welches die Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel und Säuger umfaßt, die alle durch eine segmentierte knöcherne oder knorpelige Wirbelsäule gekennzeichnet sind. Alle Wirbeltiere haben ein funktionelles Immunsystem und reagieren auf Antigene durch Antikörperproduktion.
Der Ausdruck "Protein" wird hier zur Bezeichnung eines natürlich vorkommenden Polypeptids verwendet.
Der Ausdruck "Polypeptid" wird hier im weitesten Sinne verwendet, das heißt im Sinne eines Polymers von über Peptidbindungen miteinander verknüpften Aminosäuren (Dipeptide oder höhere Peptide). Der Ausdruck "Polypeptid" umfaßt somit Proteine, Oligpeptide, Proteinfragmente, Analoga, Muteine, Fusionproteine und dgl.

B. Allgemeine Beschreibung

Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung bedient man sich, wenn nicht anders angegeben, der üblichen Techniken der Zellkultur, der Molekularbiologie, der Mikrobiologie, rekombinanten DNA und der Immunologie, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Techniken werden in der Literatur umfassend beschrieben. Vergleiche dazu zum Beispiel Davis R.W., Botstein D. und Roth J.R., ADVANCED BACTERIAL GENETIC: A MANUAL FOR GENETIC ENGINEERING. /Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1980/; Maniatis, Fritsch and Sambrooek, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, Bd. I und II /D.N. Glover, ed., 1985/; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS /M.J. Gait, ed., 1984/; NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION /B.D. Hames and S.J. Higgins, eds., 1984/; B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING /1984/; die Reihen METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); VECTORS: A SURVEY OF MOLECULAR CLONING VECTORS AND THEIR USES (R.L. Rodriguez and D.T. Denhardt, ed., 1987, Butterworths); und J.H. Miller, EXPERIMENTS IN MOLECULAR GENETICS (1972, Cold Spring Harbor Laboratory) und HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Bd. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, ed. 1986, Blackwell Scientific Publications).
Ein zentrales Merkmal der Erfindung sind Mikroorganismen, die infolge einer vollständigen oder teilweisen Mutation in einem phoP-Gen oder seinem Äquivalent avirulent sind, jedoch seine Immunogenität beibehalten haben. Die erfindungsgemäßen Zellen sind als Komponenten für Lebendimpfstoffe geeignet. Die Impfstoffe können zur Behandlung eines Individuums zur Verhinderung einer Krankheit verwendet werden, die durch einen pathogenen Stamm aus der Familie der Mikroorganismen, von denen die avirulenten Stämme abgeleitet sind, verursacht wird, wie zum Beispiel durch die Gattung Salmonelig, bei der die avirulenten Mirkoorganismen immunogen sind. Bei anderen Arten von Impfstoffen sind die Mikroorganismen vom phoP-Typ Trägerorganismen, die ein rekombinantes Gen enthalten, das ein heterologes Polypeptid kodiert, so daß das Antigen des heterologen Polypeptids an den mit dem Impfstoff behandelten Individuum an der Besiedelungsstelle freigesetzt wird.
Das phoP-Gen und seine Äquivalente sind vom Typ der "Gesamtsteuerung der Pathogenität", das heißt sie steuern koordiniert eine Anzahl von Genen einschließlich jener Gene, welche die Faktoren der Bakterienvirulenz kodieren. Es steuert die Expression der Virulenzgene in einer Art, die mit der von toxR von Vibrio cholerae oder von vir von Bortadella pertussis verglichen werden kann. Das toxR-Gen wird bei Miller and Mekalanos (1984) und Taylor et al. (1987) und das vir-Gen bei Stibitz et al. (1988) diskutiert. Dem entspricht die Annahme von Fields et al. (1989), daß das phoP-Produkt die Expression von Genen steuert, die es einem pathogenen Mikroorganismus ermöglichen, in Makrophagen zu überleben und Defensinen gegenüber, die kationische Makrophagenproteine mit bakterizider Aktivität darstellen, unempfindlich zu sein. (Fields et al. /1989/, Miller et al. /1989/). Bei Salmonella steuert das phop-Genprodukt auch die Expression nichtspezifischer saurer Phosphatase aus dem phoN-Gen.
Einige Merkmale der mutanten Stämme vom phoP-Typ zeigen auch die ummunogenen phoP-Mutanten von S. typhimurium. Diese avirulenten Mutanten sind zur Infektion der Peyer-Plaques oral infizierter Tiere während einer ausreichenden Zeitdauer befähigt, um eine Immunreaktion auszulösen, sind jedoch, was das Erreichen der Milz betrifft, sehr unwirksam. Die phoP-Mutanten sind in ähnlicher Weise wie die pathogenen Elternstämme in der Lage, sich an Gewebekulturzellen anzuheften und in sie einzudringen, die Indikatoren für die Virulenz des Stammes darstellen. Die Identität dieser Indikatorzellen ist dem Fachmann bekannt. So zum Beispiel vermögen pathogene Stämme von Salmonella, einschließlich S. typhimurium, in eine Vielzahl von gezüchteten Zellen, wie zum Beispiel in Henle 407-, Hela-, Hep-2-, CHO- und MDCK-Zellen einzudringen. Außerdem behalten die Mutantenstämme von Salmonella die elterliche Motilität sowie die Pili vom Typ 1 bei und haben eine Lipopolysaccharid-(LPS-)Zusammensetzung, die mit der der Eltemstämme vergleichbar ist. Außerdem ist der Phänotyp der Mutantenstämme beständig. Die Methoden zur Ermittlung der zuletzt genannten Eigenschaften sind dem Fachmann bekannt. Es wird jedoch davon ausgegangen, daß die Phänotypen von die phoP-Mutation aufweisenden Stämmen durch weitere Mutationen in anderen Genen als im phoP-Gen verändert sein können. Stämme, die zusätzlich zur phoP-Mutation auch noch weitere Mutationen enthalten, kommen hier ebenfalls in Betracht und sind in den Erfindungsumfang mit eingeschlossen.
Ein weiteres und signifikantes Merkmal der phoP-Mutanten ergibt sich aus der Steuerung des phoP gegenüber dem Strukturgen im Hinblick auf Phosphatasen wie zum Beispiel der nichtspezifischen sauren Phosphatase bei Salmonella. Wie zum Beispiel Salmonella zeigt, besitzen im allgemeinen Mutanten vom phoP-Typ keine nichtspezifische saure Phosphataseaktivität. Dieses Fehlen von Phosphataseaktivität kann durch eine zweite Mutation beseitigt werden, die höchstwahrscheinlich die Expression des Strukturgens für Phosphatase der Steuerung durch das Gen vom phoP-Typ entzieht. Es können auf diese Weise phoP-Mutanten erhalten werden, die zwar ihre Avirulenz behalten, die jedoch hinsichtlich des Phänotyps Pho&spplus; sind und Phosphatase produzieren. Die Unfähigkeit zur Produktion von Phosphatase ist also an sich nicht verantwortlich für die Avirulenz von phoP-Mutanten.
Stämme, die Mutationen in phoP oder seinen äquivalenten Genen und insbesondere erwünschte Deletionsmutationen aufweisen, können durch Techniken unter Verwendung von Transposonen erzeugt werden. Transposone können einem Bakterienehromosom an vielen Stellen zugesetzt werden. Die Merkmale der Transposoninsertion und -deletion werden von Kleckner (1977) beschrieben. So z.B. kann das Transposon Tn10, das Tetracyclinresistenz und Fuarsäureempfindlichkeit verleiht, verwendet werden, um bei einer Vielzahl von Bakterienarten phoP-Mutanten zu erzeugen, wie zum Beispiel bei E. coli und einer Viezahl von Arten der Gattung Salmonella, wie zum Beispiel bei S. typhimurium, S. typhi, S. enteritis, S. dublin, S. gallinarium, S. pylorum, S. arizona und S. choleraesuis. Die Isolierung der Mutanten anderer Organismen, die eine Deletionsmutation in einem ein phoP-Gen entsprechenden Äquivalent enthalten, kann durch Transposonmutagenese erreicht werden wie zum Beispiel bei Verwendung von Tn5, Tn10, Tn916, Tn917 oder von anderen aus dem Stand der Technik bekannten Transposonen, um die Deletion im virulenten Stamm zu verursachen, sowie durch Screening auf den Pho-Phänotyp unter Verwendung eines Substrats für nichtspezifische bzw. saure Phosphatasen wie zum Beispiel von 4-Brom-3-chlor-2-indolylphosphatase oder α- Naphtyphosphatase. Enthält der Mikroorganismus Phosphatasen, die durch phoP oder ein äquivalentes Gen nicht gesteuert werden, müssen die Ausgangsstämme für die Transposonmutagenese Mutationen für die Inaktivierung dieser Phosphatasen enthalten.
Eine Methode zur Erzeugung eines phoP-Mutantenstammes wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Zusätzliche Mittel sind möglich. Gemäß einer Methode wird die an das phoP-Gen angrenzende Tn&sub1;&sub0;-Insertion in einem phoP-Mutanten von S. thyphimurium, LT-2, durch Vermehrung des transduzierenden Phagen P22 HT int an einer Tn10-Bibliothek im LT-2-Stamm X3000 (s. USSN 251.304) und Selektion auf Neidhardt-Medium mit 12 E Tetracyclin/ml und 40 µg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) als einziger Phosphatquelle selektiert. Selten vorkommende wachsende Tansduktanten weisen höchstwahrscheinlich Tn10 auf das mit dem Wildtyp-phoP&spplus;-Gen eng verknüpft ist. Die Selektion von fusarsäureresistenten Derivaten einer Anzahl von Tn&sub1;&sub0;-Transduktanten und Plattierung auf Medien mit BCIP soll in jenen Fällen δ-phoP-Mutationen ergeben, in denen das Tn&sub1;&sub0; nahe genug am phoP liegt, so daß die Deletion der DNA zwischen den Tn&sub1;&sub0;-Insertionen zweckmäßigerweise zur Überführung der δ-phoP-Mutationen in andere Stämme unter Verwendung von Standardmethoden eingesetzt werden kann (s. Kleckner /1977/ und USSN 251.304, deren Inhaber der Rechtsnachfolger ist und auf die hier Bezug genommen wird).
Weitere Mittel zur Erzeugung von phoP-Mutationen machen von einer mit dem phoP-Gen von S. typhimurium eng verknüpften auxotrophen Mutation Gebrauch. Entsprechende Eigenschaften weist das purB-Gen auf. Die purB-Mutante LT-2 von S. typhimurium wird unter Verwendung eines P22 HT int-Lysats, das an der obenerwähnten Tn10-Bibliothek vermehrt wurde, zu PurB&spplus; transduziert, wonach die Tcr PhoP&supmin; PurB&spplus;-Transduktanten selektiert und auf Neidhardt-Medium, das frei ist von Adenin und Tetracyclin sowie BCIP enthält, identifiziert werden. Die erwünschten Mutanten weisen dann in das phoP-Gen inseriertes Tn10 auf, das heißt phoP::tn10. Die Selektion auf Fusarsäureresistenz ergibt dann tetracyclinempfindliche δ-phoP-Mutationen.
Die in LT-2 von S. typhimurium isolierte δ-phoP-Mutation kann auf andere Salmonella- Stämme unter Verwendung einer mit der δ-phoP::Tn10 Tn10-Insertion transduziert werden. In jedem Falle werden die Transduktanten auf Tetracyclinresistenz selektiert. Ist der durch Einführung einer phoP-Mutation avirulent zu machende erwünschte hochvirulente Salmonella-Stamm gegen P22 empfindlich, kann man den P22 HT int entweder auf dem δ-phoP- Stamm mit dem verknüpften Tn10 oder auf den phoP::Tn10-Mutanten vermehren und das Lysat zur Tranduktion der virulenten Salmonella auf Tetracyclinresistenz verwenden. Das an die δ-phoP-Mutation angrenzende oder in das phoP inserierte Tn10 kann durch Selektion auf Fusarsäureresistenz entfernt werden. Im Falle der phoP::Tn10-Mutante wird dabei eine δ- phoP-Mutation erzeugt. Ist der durch Einführung einer phoP-Mutation avirulent zu machende erwünschte hochvirulente Salmonella-Stamm gegen P22 resistent, kann man auch einen anderen transduzierenden Phagen wie P1L4 verwenden, der im allgemeinen nur bei der Infektion von rauhen Salmonella-Stämmen wirksam ist. In diesem Falle kann eine galE- Mutation in die LT-2-δ-phoP- oder phoP::Tn10-Mutanten von S. typhiniurium entweder durch Transduktion oder durch Selektion auf 2-Deoxygalactose-Resistenz eingeführt werden (USSN 251.304). Das Wachstum der galE-Mutanten in Abwesenheit von Galaktose macht sie rauh und empfindlich für P1L4, was die Vermehrung eines transduzierenden Lysats ermöglicht. Die galE-Mutanten des virulenten Salmonella-Empfängerstammes müssen auch unter Verwendung von 2-Deoxygalaktose selektiert werden. Die Transduktion dieser galE- Empfänger unter Verwendung von P1L4, der auf dem galE-δ-phoP mit dem verknüpften Tn10 oder dem galE-phoP::Tn10-Stamm vermehrt wurde, kann durch Plattierung auf Transduktanten auf einem Medium mit Tetracyclinen und BCIP zur Identifizierung der phoP&supmin;-Transduktanten erfolgen. Durch die Selektion auf Fusarsäureresistenz wird das Tn10 entfernt und im Falle der phoP::Tn10-Mutante eine δ-phoP-Mutation erzeugt. Die galE- Mutation kann dann durch mit P1L4 vermittelte Transduktion unter Verwendung von P1L4 entfernt werden, der auf einem galE&spplus;-Stamm von LT-2 von S. typhimurium vermehrt wurde, der aufgrund einer Mutation in einem anderen Gen als galE rauh geworden ist. Derartige Mutanten sind dem Fachmann auf dem vorliegenden Gebiet allgemein bekannt (s. Sanderson and Roth).
Es ist offensichtlich, daß zur Erzeugung von phoP-Mutationen bei verschiedenen pathogenen Bakterien auch Techniken der rekombinanten DNA in Frage kommen. Dies kann unter Verwendung von Genklonung und Techniken der DNA-Hybridisierung, Kartierung der Restriktionsenzymsites, Erzeugung von Deletionen mit Hilfe von Restriktionsenzymen durch Schneiden geklonter phoP-Sequenzen und allele Ersatzrekombination zur Einführung des δ- phoP-Defekts in eine selektierte pathogene Bakterie erfolgen. Die Methoden zur Durchführung dieser Techniken sind dem Fachmann allgemein bekannt (s. oben).
Die erste Ausführungsform der Erfindung betrifft Impfstoffe für die Behandlung eines Individuums bei einer durch einen pathogenen Mikroorganismus verursachten Erkrankung. Der Impfstoff stellt einen avirulenten, immunogenen Mikroorganismus dar, der eine Mutation, vorzugsweise eine Deletionsmutation im phoP oder seinem äquivalenten Gen und einen pharmazeutisch geeigneten Träger umfaßt. Eine bevorzugte Ausführungsform stellt einen Impfstoff für die Behandlung einer Erkrankung dar, die durch einen virulenten Salmonella- Stamm und insbesondere einen solchen verursacht wird, die bei landwirtschaftlichen Nutztieren (zum Beispiel Geflügel, Rindern, Pferden, Schafen, Schweinen oder Ziegen), bei Tieren für Sportzwecke und Kleinhaustieren sowie beim Menschen Krankheiten auslösen. Diese Impfstoffe umfassen avirulente Mutanten vom phoP-Typ von Salmonella, die immunogen sind und einen Schutz gegenüber dem virulenten, die Krankheit verursachenden Stamm bieten.
Eine weitere Ausführungsform betrifft Impfstoffe, die Mikroorganismen mit einer Mutation im phoP oder einem äquivalenten Gen umfassen und die auch eine oder mehrere weitere Mutationen enthalten, die den Zellen beim Einsatz als Impfstoffe als Trägermikroben und/oder als Quellen für die Erzeugung von erwünschten Polypeptiden erwünschte Eigenschaften verleihen.
Ein abgeschwächter Impfstoffstamm sollte im Idealfall eine Reihe von Merkmalen aufweisen. Erstens sollte er vollständig avirulent und hochimmunogen sein. Dies erfordert eine entsprechende Balance, die häufig nur schwer zu erreichen ist, insbesondere aufgrund der genetischen Unterschiede in der immunisierten Population und der erheblichen Unterschiede zwischen den Individuen in bezug auf Ernährung und Hygiene. Zweitens muß er zumindest im Hinblick auf avirulente Salmonella seine Fähigkeit beibehalten, den Darm und die GALT- Zellen zu besiedeln, ohne eine Krankheit zu verursachen oder die normale Physiologie bzw. das normale Wachstum des Wirts zu beeinträchtigen. Die zuletzt genannten Eigenschaften sind besonders wichtig bei der Immunisierung von landwirtschaftlichen Nutztieren, da ein vorübergehender Wachstumsstillstand negative wirtschaftliche Folgen hat. Drittens sollte er zwei oder drei abschwächende Mutationen, vorzugsweise Deletionsmutationen aufweisen, um einen Verlust der Eigenschaften infolge Reversion oder Gentransfer zu vermeiden. Das zuletzt genannte Merkmal steigert die Sicherheit des abgeschwächten Impfstoffs und ist besonders bei Impfstoffen für den Menschen und bei Impfstoffstämmen für die Immunisierung von Tieren in Betracht zu ziehen, wobei der Stamm über die Nahrungskette auf den Menschen übertragen werden kann. Viertens darf der abschwächende Phänotyp nicht durch einen Zusatz zur Nahrung oder durch den tierischen Wirt nicht beeinflußt werden. Wird der immunisierende Mikroorganismus als Trägermikrobe verwendet, sollte das System eine beständige (und vorzugsweise hochgradige) Expression der geklonten Gene im immunisierten Individuum gewährleisten.
Eine Form dieser Ausführung der Erfindung betrifft somit einen Impfstoff, der einen Mikroorganismus umfaßt, welcher einen fakultativen intrazellulären Parasiten darstellt, vorzugsweise Salmonella, der wenigstens zwei Mutationen aufweist, und zwar eine im phoP-Gen und eine in einem Gen, das auch abschwächend auf den Mikroorganismus wirkt und das außerdem die Wahrscheinlichkeit erheblich steigert, daß der Mikroorganismus nicht zur Wildtypvirulenz zurückkehrt, wenn es im phoP-Gen zur Reversion kommt. Diese Mutationen können zum Beispiel in Genen vorliegen, die, wenn sie mutiert oder deletiert werden, einen Verlust der Virulenz verursachen (zum Beispiel plasmidgehärtete Stämme), den Stamm auxotroph machen, eine Veränderung in der Kohlehydratverwertung oder -synthese bewirken oder bei der Gesamtgenexpression defektiv sind. Ein Beispiel für das zuletzt genannte sind die von Curtiss und Kelly (1987) beschriebenen cya crp-Mutanten.
Vom Erfindungsumfang mitumfaßt werden auch Mikroorganismen, insbesondere Salmonella, die zwei oder mehrere Mutationen des beschriebenen Typs haben, solange diese Mikroorganismen ihre Avirulenz und Immunogenität beibehalten. Beispiele für Mutationen in Salmonella, die mit der phoP-Mutation aufgenommen werden können, sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1 Mutationen, die Salmonella avirulent machen
* Nur einige Mutanten dieser typen sind avirulent. Die avirulenten Mutanten wurden hinsichtlich Immunogeniität nicht untersucht. Tabelle 1 (Forts.) Mutationen, die Salmonella avirulent machen
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Impfstoffe, die Mikroorganismen mit einer Mutation im phoP oder einem äquivalenten Gen umfassen, wobei diese Mikroorganismen "Träger" sind, die (ein) rekombinante(s) Gen(e) enthalten, das (die) (ein) heterologe(s) Polypeptid(e) enthalten, so daß das (die) Expressionsprodukt(e) des (der) rekombinanten Gens (Gene) am Besiedelungssite in dem mit dem Impfstoff behandelten Individuum freigesetzt wird (werden). Das rekombinante Gen im Trägermikroorganismus kodiert dann ein Antigen eines pathogenen Agens auf der Basis von Pilzen, Bakterien, Parasiten oder Viren oder ein Allergen. Lebendimpfstoffe sind besonders dort geeignet, wo eine lokale Immunität entscheidend ist und eine erste Verteidigungslinie sein könnte. Die Forderung nach Avirulenz der Trägermikrobe wird von der phoP-Mutation in der Mikrobe erfüllt. Zum Umfang der vorliegenden Ausführungsform gehören auch Mikroorganismen, insbesonder Salmonella, die wenigstens eine Zusatzmutation aufweisen und die Wahrscheinlichkeit der Reversion des Mikroorganismus zur Wildtypvirulenz vermindern. Beispiel für derartige Typen von Mutationen wurden oben beschrieben.
Im Falle von Trägermikroorganismen kann es auch wünschenswert sein, die Mikroorganismen vom PhoP&supmin;-Typ gentechnisch zu verändern, so daß sie dann "ausbalancierte letale Mutanten" darstellen, bei denen die Nichtexpression eines (von) rekombinanten heterologen Polypeptids (Polypeptiden) mit dem Tod des Mikroorganismus verbunden ist.
"Ausbalancierte letale" Mutanten dieses Typs sind gekennzeichnet durch das Fehlen eines funktionierenden nativen chromosomalen Gens, das ein Enzym kodiert, das für das Überleben der Zelle unumgänglich ist, vorzugsweise ein Enzym, welches eine Stufe in der Biosynthese einer lebensnotwendigen Zellwandstrukturkomponente katalysiert, und insbesondere durch das Fehlen eines die β-Asparaginsäuresemialdehyd-Dehydrogenase (asd) kodierenden Gens. Die Mutanten enthalten jedoch ein erstes rekombinantes Gen, das ein Enzym kodiert, das ein funktioneller Ersatz für das native Enzym darstellt, wobei das erste rekombinante Gen das defektive chromosomale Gen nicht ersetzen kann. Das erste rekombinante Gen ist strukturell mit einem zweiten, ein erwünschtes Produkt kodierenden rekombinanten Gen verknüpft. Der Verlust des ersten rekombinanten Gens bewirkt den Zelltod, und zwar durch Lyse in den Fällen von Verlust von asd, wenn sich die Zellen in einer Umgebung befinden, in der aufgrund der Expression des ersten rekombinanten Gens ein Produkt fehlt. Die Methoden zur Herstellung dieser Typen von "ausbalancierten letalen" Mutanten werden in U.S.S.N. 251.304, eingereicht am 3. Oktober 1988, deren Eigentümer der Rechtsnachfolger ist, beschrieben. Es muß darauf hingewiesen werden, daß die "ausbalancierten letalen" Mutanten, die aufgrund einer Mutation in einem Gen vom phoP-Typ oder im phoP avirulent sind, außerdem für die großtechnische Herstellung der erwünschten Produkte sowie für die Freisetzung in die Umwelt geeignet sind.
Gemäß den Ausführungsformen der Erfindung kann (können) das (die) avirulente(n) Denvat(e) einer pathogenen Mikrobe auch als Trägerbakterium für die Freisetzung ausgewählter Antigene an GALT-Zellen wie zum Beispiel an die Peyer-Plaques des Dickdarms verwendet werden. Einige Bakteriengattungen wie zum Beispiel Salmonella sind dafür bekannt, daß sie die Peyer-Plaques besiedeln (Carter P.B. und F.M. Collins, 3. Exp. Med. 139:1189 /1974/). S. typhimurium-E. coli-Hybride sind ebenfalls dafür bekannt, daß sie die Peyer-Plaques bei Mäusen besiedeln (Hohmann A.W. et al. Infect. and Immun. 22:763 /1978/). Entahlten diese Trägerbakterien ein rekombinantes Gen aus einem pathogenen Organismus und exprimieren es, werden Antikörper gegen das vom pathogenen Organismus produzierte, als Antigen wirkende Genprodukt erzeugt. Mit dem Aufkommen der Techniken der rekombinanten DNA ist es heute möglich, ganz einzigartige Impfstoffe zu entwickeln, bei denen spezifische Antigene erzeugt werden, jedoch nicht durch das ätiologische Agens, sondern durch einen anderen Wirtsstamm von Bakterien, der zur Exprimierung des Gens für dieses Antigen befähigt ist. Es ist jedoch auch möglich, für den Fall, daß Antigene mit einem Antigen eines Säugerwirts eine Kreuzreaktion eingehen könnten und auf diese Weise die Auslösung der Autoimmunität verstärken könnten, die Technik der rekombinanten DNA zur Veränderung des Gens so einzusetzen, daß es zu keiner Beeinflußung der die Kreuzreaktion bewirkenden Antigendeterminante kommt. Die Technik der rekombinanten DNA kann daher zur Entwicklung von Impfstoffen verwendet werden, die keinerlei Stoff enthalten, der für eine Kreuzreaktion mit den Antigenen des Wirbeltierwirts oder zur Auslösung eines autoimmunen Zustandes befähigt wäre.
Es ist somit offensichtlich, daß die vorliegende Erfindung breit Anwendung finden kann bei der Entwicklung wirksamer Impfstoffe gegen Erkrankungen durch Bakterien, Pilze, Parasiten oder Viren, wobei der lokalen Immunität entscheidene Bedeutung zukommt und diese die erste Verteidigungslinie abgeben könnte. Beispiele dafür sind Impfstoffe gegen Lungenpest, verursacht durch Versinia pestis, gegen Gonorrhoe, verursacht durch Neisseria gonorrhoeae, gegen Syphillis, verursacht durch Treponema palladium und verschiedene Geschlechtskrankheiten wie auch Augeninfektionen, verursacht durch Chlamydia trachomatis. Die Arten von Streptokokken der Gruppe A und B wie zum Beispiel die Arten, die Halsentzündung oder Herzerkrankungen hervorrufen wie Neiseria meningitidis, Mycoplasma pneumoniae, Hemophilu infiuenza, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Bordetella avium, Escherichia coli, Streptococcus equi, Streptococcus pneumoniae, Brucella abortus, Pasteurella hemolytica, Vibrio cholera, der Arten der Gattung Shigella und Legionella pneumophila sind zusätzliche Beispiel für Bakterien innerhalb des Erfindungsumfanges, aus denen Gene erhalten werden können. Virenimpfstoffe, wie solche die gegen Grippeviren erzeugt werden, werden ebenfalls von der Erfindung mit umfaßt. Virenimpfstoffe können auch gegen andere Viren, und zwar DNA- oder RNA-Viren erzeugt werden, wie zum Beispiel gegen solche aus den Klassen der Papoviren, Adenoviren, Herpesviren, Poxviren, Parvoviren, Reoviren, Picomaviren, Myxoviren, Paramyxoviren oder Retroviren. Impfstoffe zum Schutz vor Infektion durch pathogene Pilze, Protozoen und Parasiten werden ebenfalls von der Erfindung mit umfaßt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann, wenn die immunogene Komponente des Impfstoffs ein Allergen des Wirts ist, dieser Impfstoff zur Behandlung des allergischen Wirts durch spezifische Desensibilisierung verwendet werden.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft einen Impfstoff für die Immunisierung eines Wirbeltiers, der ein lebendes avirulentes Derivat einer pathogenen Mikrobe umfaßt, das praktisch nicht in der Lage ist, funktionelle Adenylatcyclase und ein AMP-Rezeptorprotein zu erzeugen, wohingegen es ein rekombinantes Gen zu exprimieren vermag, das aus einem Organismus erhalten wurde, der pathogen wirkt oder der ein Allergen des Tiers erzeugt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen avirulenten Mikroben als Vektoren für die Synthese unterschiedlicher Wirtsproteine verwendet werden. Da die erfindungsgemäßen avirulenten Mikroben in der Lage sind, nach dem Eindringen in den Wirt eine Reihe immunokompetenter Strukturen einschließlich der GALT-Zellen, der mesenterealen Lymphknoten und der Milz zu durchqueren, können diese Mikroben verwendet werden, um eine Reihe von immunoregulatorischen Produkten zu ergeben. Dementsprechend kann ein oder können mehrere Gene, die immunregulatorsische Proteine oder Peptide kodieren, durch Rekombination in die avirulenten Mikroben aufgenommen weden, so daß sie dann, wenn sie sich in dem geeigneten immunkompetenten Gewebe angesiedelt haben, fähig sind, das rekombinante Produkt zu exprimieren, um die Immunreaktion im Wirt zu unterdrücken, zu verstärken oder zu verändern. Beispiele für immunregulatorische Moleküle sind, ohne darauf beschränkt zu sein, die Koloniebildung stimulierende Faktoren (Makrophagen, Granulozyten oder Gemische davon), Makrophagenchemotoxin, Makrophagenmigationsinhibitionsfaktor, Leukocyteninhibitionsfaktoren, Luphotoxine, blastogener Faktor, Interferon und Interleukine.
Jeder der in diesen Ausführungsformen der Erfindung verwendeten Ausdrücke wird in der nachfolgenden Diskussion noch näher analysiert.
Unter einem Impfstoff versteht man ein Agens, das zur Stimulierung des Immunsystems eines lebenden Organismus verwendet wird, wodurch dieser vor einer künftigen Schädigung geschützt wird. Immunisierung bedeutet den Prozeß der Induzierung einer anhaltenden hohen Antikörpermenge und/oder einer zellulären Immunreaktion, bei dem die T-Lymphozyten den pathogenen Organismus abtöten und/oder andere Zellen wie zum Beispiel Phagozyten in einem Organismus dazu aktivieren können und wobei dieser Prozeß gegen einen pathogenen Organismus oder ein Antigen gerichtet ist, dem der Organismus vorgängig ausgesetzt war. Obwohl der Ausdruck "Immunsystem" Reaktionen von Einzellern auf die Anwesenheit von Fremdkörpern wie zum Beispiel die Interferonproduktion umfassen kann, ist hier der Ausdruck auf die anatomischen Merkmale und Mechanismen beschränkt, durch die ein Mehrzeller Antikörper gegen ein Antigenmaterial produziert, das in die Zellen des Organismus oder in die extrazelluläre Flüssigkeit des Organismus eindringt. Der auf diese Weise produzierte Antikörper kann zu einer der immunologischen Klassen wie zu den Immunoglobulinen A, D, E, G oder M gehören. Von besonderem Interesse sind Impfstoffe, welche die Produktion von Immunoglobulin A (IgA) stimulieren, da dieses das Hauptimmunoglobulin ist, das durch das sekretorische System von Warmblütern erzeugt wird, obwohl die erfindungsgemäßen Impfstoffe nicht auf solche beschränkt sind, die die IgA-Produktion stimulieren. So zum Beispiel können Impfstoffe der oben beschriebenen Art einen breiten Bereich anderer Immunreaktionen zusätzlich zur IgA-Bildung wie zum Beispiel zelluläre und humorale Immunität auslösen. Die Immunreaktion auf Antigene ist bereits gut untersucht und häufig beschrieben worden. Eine Übersicht über die Immunologie wird von Barrett, James T., Textbook of Immunology, 4. Auflage, C.V. Mosby Co., St. Louis, MO (1983) gegeben.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung eines avirulenten Derivats einer pathogenen Mikrobe, die die GALT-und BALT-Zellen als Träger des Genproduktes besiedelt, das zur Stimulierung der Antikörperreaktion auf einen pathogenen Organismus oder ein Allergen verwendet wird. "Avirulent" bedeutet nicht, daß eine Mikrobe dieser Gattung oder Art nicht auch als pathogener Organismus wirken kann, sondern bedeutet, daß die konkrete Mikrobe für das konkrete zu behandelnde Tier avirulent ist. Die Mikrobe kann zu einer Gattung oder sogar zu einer Art gehören, die gewöhnlich pathogen ist, muß jedoch einem avirulenten Stamm angehören. Unter "pathogen" versteht man die Fähigkeit, eine Krankheit zu verursachen oder die normalen physiologischen Funktionen zu beeinträchtigen. Avirulente Stämme sind nicht befähigt, die ganze Folge von Krankheitssymptomen auszulösen, die gewöhnlich mit seinem virulenten pathogenen Widerpart verbunden sind. Der Ausdruck "Mikrobe" wie er hier verwendet wird, umfaßt Bakterien, Protozoen und einzellige Pilze.
Die Techniken für die Übertragung von genetischem Material aus einem ersten Organismus in einen zweiten, der gewöhnlich mit dem ersten Organismus sein genetisches Material nicht austauscht, finden seit einiger Zeit infolge der rasch sich ausbreitenden Technik der rekombinanten DNA breite Anwendung. In der vorliegenden Anmeldung wird das genetische Material, das von einem Organismus in den zweiten auf eine Weise übergeführt wird, daß die Vermehrung des zweiten Organismus zu Abkömmlingen führt, die dasselbe genetische Material enthalten, als rekombinantes Ges bezeichnet. Der Ausdruck "Gen" wird hier im weitesten Sinne verwendet und bedeutet jede biologische Vererbungseinheit. Es ist nicht notwendig, daß das rekombinante Gen ein vollständiges Gen ist, wie es im elterlichen Organismus vorliegt, der in der Lage war, ein Markomolekül, wie zum Beispiel ein funktionierendes Polypeptid zu erzeugen oder dessen Erzeugung zu steuern. Das Gen muß lediglich in der Lage sein, eine Matrize abzugeben, die bei der Herstellung eines Antigenprodukts als Leitlinie dient. Auch ist es nicht notwendig, daß das Produkt genau der Form im elterlichen Organismus entspricht. So zum Beispiel kann ein funktionelles Gen, das ein Polypeptidantigen mit 100 Aminosäureresten kodiert, lediglich teilweise in eine Trägermikrobe übertragen werden, so daß dann durch den zellulären Mechanismus der Wirtszelle ein Peptid erzeugt wird, das lediglich aus 75 oder sogar nur 10 Aminosäureresten besteht. Wenn jedoch dieses Genprodukt ein Antigen ist, das die Bildung von Antikörpern gegen ein ähnliches, im elterlichen Organismus vorhandenes Antigen bewirkt, wird es als Gen im Sinne der erfindungsgemäßen Definition betrachtet. Wenn andererseits die Aminosäuresequenz eines konkreten Antigens oder eines Fragments davon bekannt ist, ist es möglich, das DNA- Fragment oder das Analogon davon mit Hilfe automatisierter Gensynthesizer oder ähnlichen Geräten zu synthetisieren und diese DNA-Sequenz in einen geeigneten Expressionsvektor einzubringen. Am anderen Ende des Spektrums liegt ein langer, mehrere Genprodukte kodierender DNA-Abschnitt, wobei eines dieser Produkte oder alle Antigencharakter haben können. Ein Gen, wie es hier definiert und beansprucht wird, ist somit eine zur Antigenproduktion befähigte Vererbungseinheit. Das Gen kann chromosomalen Ursprungs sein, aus einem Plasmid stammen oder viralen Ursprungs sein.
Damit das Gen bei der Auslösung einer Immunreaktion wirksam wird, muß es exprimiert werden. Die Expression eines Gens bedeutet, daß die der Genstruktur innewohnende Information (die Sequenz der DNA-Basen) in ein physikalisches Produkt in Form eines RNA- Moleküls, Polypeptids oder eines anderen biologischen Moleküls durch den biochemischen Mechanismus der Zelle, in dem das Gen lokalisiert ist, umgewandelt wird. Das auf diese Weise erzeugte biologische Molekül wird als Genprodukt bezeichnet. Der Ausdruck "Genprodukt", wie er hier verwendet wird, bedeutet jedes biologische Produkt oder biologische Produkte, die das Ergebnis der biochemischen Reaktionen sind, die unter der Steuerung eines Gens ablaufen. Das Genprodukt kann zum Beispiel ein RNA-Molekül, ein Peptid oder ein Produkt sein, das unter der Kontrolle eines Enzyms oder eines anderen Moleküls erzeugt wird, das das Anfangsprodukt des Gens, das heißt ein Stoffwechselprodukt ist. Ein Gen kann zum Beispiel zuerst die Synthese eines RNA-Moleküls steuern, das dann durch die Wirkung von Ribosomen in ein Enzym transferiert wird, das die Bildung von Glykanen in dem Medium, das die ursprüngliche Zelle, in dem das Gen gefunden wurde, außen umgibt, steuert. Das RNA-Molekül, das Enzym und das Glykan sind alles Genprodukte in dem hier verwendeten Sinne. Jedes dieser Genprodukte sowie viele andere Arten von Genprodukten wie zum Beispiel Glycoproteine und Polysaccharide wirken als Antigene, wenn sie dem Immunsystem eines Tier zugeführt werden. Proteingenprodukte, Glycoproteine und Lipoproteine eingeschlossen, sind die bevorzugten Produkte als Antigene in Impfstoffen.
Damit ein Impfstoff bei der Erzeugung von Antikörpern wirksam werden kann, muß das Antigenmaterial auf eine solche Weise freigesetzt werden, daß der Antikörper erzeugende Mechanismus des beimpften Tiers seine Wirkung entfalten kann. Deshalb muß der Mikrobenträger des Genprodukts dem Tier zugeführt werden. Zur Stimulierung einer bevorzugten Reaktion der GALT- und BALT-Zellen wird, wie oben ausgeführt, die Zufuhr der Mikrobe bzw. des Genprodukts unmittelbar in den Darm oder in den Bronchus wie zum Beispiel durch orale Verabreichung, Magenintubation oder in Form von Aerosolen bevorzugt, obwohl auch andere Methoden der Verabreichung des Impfstoffs wie intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Injektion oder intramammale, intrapeniale oder vaginale Verabreichung möglich sind.
Wird die avirulente Mikrobe als Trägermikrobe verwendet und ist diese einmal im Tier, muß das Antigen seinem Immunsystem zugänglich gemacht werden. Dies kann dadurch erfolgen, daß die Trägermikrobe abstirbt, so daß die Antigenmoleküle freigesetzt werden. Möglich ist natürlich auch die Verwendung "undichter" avirulenter Mutanten, welche den Periplasmainhalt ohne Lyse freisetzen. Auch kann ein Gen ausgewählt werden, das die Produktion eines Antigens steuert, das von der Trägerzelle der äußeren Umgebung zugänglich gemacht wird, bevor die Zelle abstirbt.
Die Verwendung des avirulenten Stammes mit asd-Mutationen und der gelegentliche Verlust des Asd&spplus;-Klonungsvektors ermöglichen die Lyse von ca. 1 % der Bakterien während jeder Generation (s. die Beispiele), um den Zellinhalt freizusetzen und damit eine Immunreaktion gegen den freigesetzten Zellinhalt, sämtliche Besiedelungs- und Virulenzantigene eingeschlossen, zu stimulieren.
Die Verwendung von pathogenen Organismen zur Freisetzung von Antigenen aus anderen pathogenen Organismen in die GALT- oder BALT-Zellen wäre ungeeignet, wenn nicht diese pathogenen Organismen avirulent gemacht werden könnten, wobei ihre Fähigkeit in Peyer- Plaques oder in die BALT-Zellen einzudringen, erhalten bleibt.
Der Organismus, von dem das rekombinante Gen erhalten wird, kann ein beliebiger pathogener Organismus des zu impfenden Tiers oder ein Organismus sein, der ein Allergen oder ein anderes Antigen des Tiers erzeugt hat. Allergene sind Substanzen, die allergische Reaktionen hervorrufen, und zwar in diesem Fall im Tier, das gegen sie geimpft wird. Viele unterschiedliche Stoffe können Allergene abgeben, wie zum Beispiel Haarschuppen von Tieren und Pollen, wobei die allergische Reaktion der einzelnen Tiere auf das konkrete Allergen unterschiedlich ist. Es ist möglich, bei einem Tier, das gewöhnlich eine allergische Reaktion zeigt, Toleranz gegenüber einem Allergen zu induzieren. Die Methoden zur Induzierung der Toleranz sind allgemein bekannt und umfassen im allgemeinen die Verabreichung des Allergens an das Tier in steigenden Dosen. Eine nähere Beschreibung der Toleranzinduktion findes sich in dem oben zitierten Lehrbuch von Barrett. Schließlich kann der Wirtsorganismus selbst als Quelle für das genetische Material dienen, wenn immunregulatorische Gene durch die Vektoren exprimiert werden.
Die Verabreichung eines Lebendimpfstoffs vom oben beschriebenen Typ an ein Tier kann auf beliebige Weise bzw. nach den üblichen Techniken erfolgen. Diese umfassen die orale Verabreichung, die Magenintubation bzw. das Sprühen in Bronchien und Nase. Alle diese Methoden erlauben es, daß der Lebendimpfstoffleicht die GALT- oder BALT-Zellen erreicht und die Antikörperbildung induziert, weshalb diese Methoden die bevorzugten Verabreichungsmethoden sind. Akzeptabel sind auch andere Verabreichungsmethoden wie die intravenöse Injektion, die es ermöglicht, daß die Trägermikrobe das Blut des Tiers erreicht.
Bei anderen Ausführungsformen der Erfindung sind, wie nachfolgend beschrieben, auch intravenose, intramuskuläre und intramammale Injektionen möglich.
Da die bevorzugten Verabreichungsmethoden die orale Einnahme, der Aerosolspray und die Magenintubation sind, sind die bevorzugten Trägermikroben solche, die zu einer Art gehören, die vorzugsweise eine beliebige Lymphoepithelialstruktur des Darms oder der Bronchien des zu impfenden Tiers besiedeln. Diese Stämme sind vorzugsweise avirulente Derivate von enteropathogenen Stämmen, die aus diesen durch Genmanipulation erzeugt werden. Besonders bevorzugt sind Stämme, welche die Peyer-Plaques besiedeln und damit unmittelbar die IgA-Produktion stimulieren. Bei Tieren sind dies bestimmte Stämme von Salmonella und Salmonella-E. coli-Hybride, welche die Peyer-Plaques besiedeln.
Die Techniken der rekombinanten DNA sind heutzutage ausreichend bekannt und weit verbreitet, so daß sie als Routinetechnik betrachtet werden können. Ganz allgemein gesprochen besteht diese Methode in der Übertragung von genetischem Material oder häufig eines Teils des genetischen Materials eines Organismus in einen zweiten Organismus, so daß das übertragene genetische Material zu einem ständigen Teil des Organismus wird, auf den es übertragen wird, das heißt mit seinem genetischen Material rekombiniert wird. Dies besteht gewöhnlich darin, daß man zuerst ein kleines Stück der DNA des elterlichen Organismus entweder von einem Plasmid oder einem elterlichen Chromosom gewinnt. Ein Plasmid, auch als extrachromosomales Element bezeichnet, ist eine Erbeinheit, die physikalisch vom Chromosom der Zelle getrennt ist. Die DNA kann jede Größe aufweisen und wird häufig durch Einwirkung eines Restriktionsendonukleaseenzyms, das die DNA-Moleküle an spezifischen Basenpaarensites spaltet, gewonnen. Nach der Ligierung mit dem Plasmid, dem Phagen oder Cosmidvektoren zur Bildung von rekombinanten Molekülen können diese in eine Wirtszelle auf verschiedene Weise wie zum Beispiel durch Transformation (Aufnahme nackter DNA aus der Umgebung, die auf künstlichem Wege durch die Anwesenheit verschiedener chemischer Agentien wie zum Beispiel von Kalziumionen induziert werden kann) übertragen werden. Geeignet sind auch andere Methoden wie zum Beispiel die Transduktion, bei der die rekombinante DNA in einen Phagen gepackt wird. Geeignete transduzierende Phagen sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen, ohne auf sie beschränkt zu sein, transduzierende Phagen für Cosmidvektoren. Sobald sich die rekombinante DNA in der Trägerzelle befindet, existiert sie weiter als getrenntes Stück (dies gilt im allgemeinen für vollständig übertragene Plasmide) oder sie kann in das Wirtszellenchromosom inseriert und dort mit dem Chromosom während der Zellteilung vermehrt werden.
Derivate avirulenter Mikroben werden auch als zum Erfindungsumfang gehörig betrachtet. Unter einem Derivat versteht man auf sexuellem oder asexuellem Wege erhaltene Nachkommen und Mutanten der avirulenten Stämme einschließlich Einfach- oder Mehrfachbasensubstitutionen, Deletionen, Insertionen oder Inversionen, welche die Eigenschaften der Avirulenz und Immunogenität beibehalten.
Die erforderliche Dosierung an avirulenten Bakterien oder rekombinanten Derivaten, die als Trägermikroorganismen verwendet werden, hängt von der Antigenität der Bakterien bzw. des Genproduktes ab und braucht nur eine Menge zu sein, die ausreicht, eine für die existierenden Impfstoffe typische Immunrekation auszulösen. Die erforderliche Menge kann ohne weiteres durch Routineversuche festgestellt werden. Wenn erforderlich, können zur Erzielung des erwünschten Schutzgrades auch Mehrfachdosen verwendet werden.
Nach der Züchtung und dem Abernten der Bakterienstämme können die Zellen lyophilisiert werden, insbesondere dann, wenn sie Nahrungsmitteln beigemischt werden oder in Kapseln hergestellt werden sollen. Die Impfstoffe, die Bakterien der avirulenten phoP-Mutante enthalten, können unter Verwendung eines beliebigen Trägers hergestellt werden, der für das zu behandelnde Individuum pharmazeutisch verträglich ist. Wenn zum Beispiel der Impfstoff in fester Form verabreicht werden soll, können die Zellen mit einem Stoff, der für das beimpfte Individuum nicht toxisch und mit den Bakterien verträglich ist, beschichtet und/oder darin verkapselt werden. Soll der Impfstoff in flüssiger Form verabreicht werden, können die Zellen in einem geeigneten flüssigen Träger wie zum Beispiel Magermilch, normaler physiologischer Kochsalzlösung und/oder anderen nichttoxischen Salzen bei physiologischen oder fast physiologischen Konzentrationen sowie in anderen geeigneten flüssigen, dem Fachmann bekannten Trägern suspendiert werden. Wenn erwünscht, können Hilfsstoffe zugesetzt werden. Wird der Impfstoff für die Verabreichung über die Bronchien hergestellt, kann dies in einem geeigneten Puffer erfolgen, wobci er vorzugsweise in Form eines Aerosols dargereicht wird.
Der pharmazeutische Träger, in dem der Impfstoff suspendiert oder gelöst wird, kann ein beliebiges Lösungsmittel oder ein Feststoff sein oder er ist in einem für das beimpfte Tier und mit dem Trägerorganismus oder dem antigenen Genprodukt verträglichen Stoff verkapselt. Geeignete pharmazeutische Träger sind flüssige Träger wie normale physiologische Kochsalzlösung und andere nichttoxische Salze bei physiologischen oder annähernd physiologischen Konzentrationen sowie feste Träger, wie sie beim Menschen nicht verwendet werden, wie zum Beispiel Talk oder Saccharose, sowie das Futter bei landwirtschaftlichen Nutztieren. Hilfsstoffe können gegebenenfalls zur Verstärkung der Antigenität zugesetzt werden. Bei der Verabreichung über die Bronchien wird der Impfstoff vorzugsweise in Form eines Aerosols dargereicht.
Die Immunisierung mit einem aus einem pathogenen Organismus erhaltenen Genprodukt kann außerdem in Verbindung mit einer früheren Immunisierung mit dem avirulenten Derivat eines pathogenen Mikroorganismus, der als Träger für die Exprimierung des Genproduktes, das durch ein rekombinantes Gen aus einem pathogenen Organismus bestimmt wird, durchgeführt werden. Eine derartige parenterale Immunisierung kann als Booster für die Verstärkung der Expression der sekretorischen Immunreaktion dienen, nachdem das sekretorische Immunsystem zu diesem aus dem pathogenen Organismus abgeleitete Genprodukt durch Immunisation mit der das aus dem pathogenen Organismus abgeleitete Genprodukt exprimierenden Trägermikrobe geprimt worden ist, um die Lymphzellen des GALT- oder BALT- Systems zu stimulieren. Die verstärkte Reaktion ist bekannt als sekundäre, das heißt als Booster- oder als anamnestische Reaktion und führt zu einem verlängerten Immunschutz des Wirts. Boosterimmunisierungen können unter Erzielung günstiger Ergebnisse viele Male wiederholt werden.
Die oben dargelegte Offenbarung beschreibt in allgemeinen Zügen die vorliegende Erfindung. Die nachfolgenden spezifischen Beispiele geben ein vollständigeres Bild von der Erfindung; sie dienen jedoch lediglich der Veranschaulichung der Erfindung und stellen, wenn nicht anders angegeben, keine Einschränkungen dar.

Beispiele

Konstruktion von phoP-Mutanten von S. typhimurium

Die hochvirulenten S. typhimurium-Stämme Chi3181 und Chi3339 wurden nach Maus- Passage mit einem Lysat von auf S. typhimurium-Stamm AD154 gezüchtetem P22 RT int infiziert, wonach auf Tetracyclin und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphate (BCIP) enthaltenden L-Agarplatten Transduktanten selektiert wurden. AD154 trägt ein beständiges Insert des Transposons Tn10 in purB, das bei einer hohen Frequenz (90%) mit phoP kotransduziert wird. Die tetracyclinresistenten BCIP-negativen Transduktanten (weiße Kolonien) wurden zur Isolierung solange ausgestrichen, bis sie vom P22 RT int-Phagen frei waren. Das Ergebnis dieses Verfahrens waren zwei Transduktanten, die das Tn10-Transposon integriert hatten; sie stellten phoP- und purB-Mutanten dar, wurden selektiert und als Chi3686 (abgeleitet von Chi3181) und Chi3688 (abgeleitet von Chi3339) bezeichnet. Diese wurden dann mit im S. typhimurium-Stamm Chi3339 gezüchteten P22 RT int infiziert und dann auf BCIP enthaltenden Fusarsäureplatten plattiert, um auf Rekombinationsverlust an Tn10 zu selektieren. Die fusarsäureresistenten BCIP-negativen Transduktanten wurden erneut auf dasselbe Medium ausgestrichen, bis sie von P22 RT int-Phagen frei waren. Die selektierten Transduktanten wurden dann auf die Abwesenheit von nichtspezifischer Säurephosphataseaktivität, P22- Empfindlichkeit und das Vermögen, in adeninfreiem Minimalmedium zu wachsen, geprüft. Chi3687 und Chi3689 (Tabelle 2) waren zwei der von Chi3181 bzw. Chi3339 abgeleiteten Transduktanten, die zum Wachstum im Minimalmedium befähigt waren und die keine Säurephosphatase-Aktivität zeigten, was sich mit der unten beschriebenen Plattenfärbungsmethode nachweisen ließ.
Die in der obigen Beschreibung verwendeten Bakterienstämme und die erhaltenen phoP- Mutantenstämme sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Chi3181 ist derselbe Stamm wie der von Roiser & Starker (1981) beschriebene Stamm SR-11; Chi3339 ist der von Schneider (1956) beschriebene Stamm SL1344 nach Mause-Passage. Die Stämme wurden bei -20ºC in 50%igem Glycerin und bei -70ºC in 1%igem 5% Glycerin enthaltendem Bactopepton für Kurz- bzw. Langzeitlagerung gehalten. Für die Transduktionsuntersuchungen wurde der von Schmeiger (1972) beschriebene Bacteriophage P22 HT int verwendet. Die Transduktionsbedingungen bei Verwendung des Bacteriophagen p22 HT int wurden von Davis (1980) beschrieben. Die Bakterien wurden wie von Lennox (1955) beschrieben in L-Bouillon oder L- Agar gezüchtet. Bei Bedarf wurde BCIP in einer Konzentration von 40 µg/ml und Tetracyclin in einer Konzentration von 12 µg/ml zugegeben. Die Selektion der tetracyclinempfindlichen fusaräureresistenten Mutanten erfolgte unter Verwendung der Technik und Medien, wie sie von Bochner (1983) beschrieben wurden. Tabelle 2 Bakterienstämme
Die Bestimmung der nichtspezifischen Säurephosphataseaktivität erfolgte im wesentlichen nach der von Kier et al. (1979) modifizierten Methode von Toh-e et al. (1973). Zu diesem Zweck wurden Lösungen des Substrats in 0,6 M Na-Acetat bei einem pH von 5,5 in den folgenden Konzentrationen frisch bereitet:
α-Naphthylphosphat (5 mg/ml) und Tetrastickstoff-o-dianisidin (50 mg/ml). Ein 100 µl- Anteil jeder Substratlösung wurde dann 2,8 ml 0,6 %igem Agar in 0,5 M Na-Azetat bei einem pH von 5,5 zugegeben. Das das Substrat enthaltende Weichagar wurde als Beschichtung für die Bakterienkolonien verwendet, die auf L-Agar über Nacht gezüchtet wurden. Nichtspezifische Säurephosphataseaktivität zeigende Kolonien entwickelten während 10 Minuten der Zugabe des Substrats eine orangegelbe Färbung.

Kennzeichnung der phoP-Mutanten von S. typhimurium

Die pliqe-Mutantenstämme Chi3687 und 3689, wie sie im obigen Beispiel isoliert wurden, wurden auf die Anwesenheit gewisser Determinanten geprüft, die sich als Virulenzeigenschaften von S. typhimurium zeigten oder als solche vermutet werden konnten. Zu diesen zählte die Eigenschaft, sich an Henle-407-Zellen anzuheften und in sie einzudringen, die Anwesenheit des für Virulenz und Motilität erforderlichen Plasmids, die Anwesenheit von Pih vom Typ 1, die LPS-Zusammensetzung und die Beständigkeit des Phänotyps.
Die Invasion der Gewebekulturzellen durch die Mutantenstämme Chi 3687 und Chi 3689 wurde mit derjenigen der Elternstämme Chi 3181 und Chi3339 verglichen. Die von der Sammlung ATCC erhaltenen Henle-407-Zellen wurden in 24 Vertiefungen aufweisenden Platten in Eagle's minimal essential medium (MEM) gezüchtet, das mit 10%igem (V/V) fötalem Kalbserum, 5 mM Glutamin, Penicillin (100 E/ml) und Streptomycin (100 µg/ml) supplementiert war, und zwar bis zu einer annähernden Dichte von 5x 10&sup5;/Vertiefung. Monoschichten wurden dann mit 10&sup6; Bakterien pro Vertiefung in einer ausbalanzierten Salzlösung nach Hanks (HBSS) 2 Stunden bei 37ºC in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre infiziert. Die Monoschichten wurden dann fünfmal mit HBSS gewaschen und dann mit 0,1%iges (G/V) Na-Deoxycholat enthaltender phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) lysiert, um die anhaftenden Bakterien zu bestimmen oder während 3 Stunden mit 100 µg/ml Gentamycin enthaltendem Eagle's MEM weiter inkubiert, um extrazelluläre Bakterien zu Gentamycin enthaltendem Eagle's MEM weiter iiikubiert, um extrazelluläre Bakterien zu entfernen, bevor dann in ähnlicher Weise wie oben lysiert wurde. Die Ergebnisse des Vergleichs sind in Tabelle 3 zusammengefaßt, wobei festgestellt werden kann, daß beide Mutantenstämme, d.h. Chi3687 und Chi3689 den elterlichen Wildtypstämmen in ihrem Vermögen, sich an Henle-407-Zellen anzuheften und in sie einzudringen, ebenbürtig waren, d.h. die nach drei Stunden Behandlung mit Gentamycin aus den Gewebekulturzellen erhalten Inokulate waren für die Mutantenstämme einerseits und die Eltemstämme andererseits im wesentlichen identisch. Tabelle 3 Penetration von Henle 407-Zellen durch S. tryphimurium
a Prozentanteil an nach der Infektion gewonnenem Gesamtinokulat. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei Analysenproben.
b Prozentanteil an nach Infektion und Behandlung mit Gentamicin erhaltenem Gesamtinokulat. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei Analysenproben.
Bei den obigen Untersuchungen wurden die Bakterienstämme in einer über Nacht bei 37ºC stehenden L-Brühe, die in einer vorgewärmten L-Bouillon verdünnt wurde, gezüchtet, wobei solange geschüttelt wurde, bis die Kulturen einen OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert von 0,7-0,9 erreicht hatten. Die Minimalmedien wurden wie von Neidhardt (1974) beschrieben hergestellt.
Die An- oder Abwesenheit des Virulenzplasmids wurde nach der Methode von Birnboim (1983) ermittelt. Die Ergebnisse der Analyse (die Analysendaten sind nicht angegeben) zeigten, daß sowohl die Mutantenstämme, als auch die Elternstämme das 100 kb-Virulenzplasmid enthielten. Dieses ist entscheidend für die Virulenz von S. typhimurium bei Mäusen (siehe z.B. Gulig und Curtiss (1987).
Die Motilität wurde mit Hilfe der Motilitätsmedien von Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI) ermittelt. Die An- oder Abwesenheit von Pili vom Typ I wurde durch Hämagglutination unter Verwendung von frischgezogenen Meerschweinchenerythrocyten bei einer Konzentration von 3% (VIV) in phosphatgepufferter Salzlösung ermittelt. Die Analyse der Motilität und der Pili ergab, daß die phoP-Mutanten beweglich waren und zeigte Pili vom Typ I (die Analysenergebnisse sind nicht angegeben).
Die LPS-Zusammensetzung der phoP-Mutanten wurde verglichen mit der des Elternstammes, und zwar im wesentlichen nach der Methode von Hitchcock und Brown (1983). Die Analyse erfolgte an Polyacrylamidgelen in Anwesenheit von Na-Dodecylsulfat (SDS), hergestellt nach (Laemmli (1970). Nach der Elektrophorese wurden die Gele nach der Methode von Tsai und Frasch (1982) angefärbt. Eine Prüfung der angefärbten Gele ergab, daß die LPS-Zusammensetzung der Mutantenstämme Chi3687 und Chi 3689 ähnlich der der Elternstämme Chi 3181 und Chi3339 war (die Analysenergebnisse sind nicht angegeben).
Die Beständigkeit des Phänotyps der Mutantenstämme erfolgte durch Plattierung von Zellen in mit BCIP als einziger Phosphatquelle supplementiertem Minimalmedium.
Unter dieser Bedingung war die Frequenz der Reversion zu Pho&spplus;
8 x 10&supmin;&sup8; bei Chi3687 und 3 x 10&supmin;&sup9; bei Chi3689.

Virulenz von phoP-Mutanten in Mäusen

Die Virulenz der phoP-Mutantenstämme Chi3687 und Chi3689 wurde mit derjenigen der Elternstämme Chi3181 und Chi3339 durch intraperitoneale (i.p.) und perorale (p.o.) Beimpfung von BALB/c-Mäusen mit unterschiedlichen Dosen der beiden Stämme, sowie durch Prüfung der beimpften Tiere auf Krankheitssymptome verglichen.
Es wurden 8 bis 10 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (Sasco, Inc. St. Louis, MO) verwendet. Die p.o.-Beimpfungen erfolgten nach dem nachfolgend beschriebenen Verfahren:
Den Mäusen wurden während 4 Stunden Nahrung und Wasser entzogen, wonach sie mit 50 µl 10%igem (G/V) Natriumbicarbonat und anschließend mit 20 µl der entsprechenden Bakteriensuspension in 0,1%ige (G/V) Gelatine (BSG) enthaltender gepufferter Salzlösung gefüttert wurden. 30 Minuten nach der Beimpfung wurden ihnen wieder Nahrung und Wasser gegeben. Die i.p. Beimpfungen erfolgten dadurch, daß man den Mäusen 100 µl der geeigneten Mutante bzw. der Suspension der Wildtypbakterien in BSG unter Verwendung einer 26-Gauge-Nadel injizierte. Bei diesen Untersuchungen erfolgte die Bakterienzählung unter Verwendung eines MacConkey-Agars.
Die Ergebnisse der Untersuchungen auf Infizierbarkeit durch die auf peroralem und intraperitonealem Wege verabreichten Bakterien sind in Tabelle 4 bzw. 5 zusammengefaßt. Die p.o. mit Chi3687 bzw. Chi3689 beimpften Mäuse überlebten das orale Challenging bei einer Organismenzahl, die das 10&sup4;fache der oralen LD&sub5;&sub0;-Dosis der Wildtypelternstämme betrug (siehe Tabelle 4). Die überlebenden Mäuse zeigten keinerlei Krankheitssymptome und blieben mindestens 30 Tage nach dem Challenging gesund. Annliche Ergebnisse erzielte man auch, wenn die Mäuse die phoP-Mutantenstämme auf dem i.p.-Weg erhielten (siehe Tabelle 5). Tabelle 4 Virulenz von phoP-Mutanten von S. typhimurium nach peroraler Beimpfung
a Überlebende Organismen 30 Tage nach Challenging
b Gesund: keine Anzeichen von Krankheit; unansehnlich: merklich krank.
p.o. LD&sub5;&sub0; für Chi3181 (3 x 10&sup5; CFU) und Chi3339 (6 x 10&sup4;) wurden bereits bestimmt [Gulig und Curtiss (1987)]. Tabelle 5 Virulenz von phoP-Mutanten nach intraperitonaler Beimpfung
a Überlebende Organismen 30 Tage nach der Beimpfung.
b Gesund: keine Anzeichen von Krankheit; unansehnlich: merklich krank.
p.o. LD&sub5;&sub0; für Chi3181 (< 50 CFU) und Chi3339 (< 50 CFU) wurden bereits bestimmt [Gulig und Curtiss (1987)].

Verteilung der phoP-Mutanten im Gewebe von Mäusen

Geprüft wurde die Verteilung von oral entweder mit der phoP-Mutante Chi3687 oder mit dem Wildtypelternstamm Chi3181 im Gewebe infizierter Mäuse.
Weibliche BALB/c-Mäuse wurden oral mit ca. 10&sup9; Zellen von Chi3687 oder Chi3181 nach dem oben in Zusammenhang mit den Virulenzuntersuchungen beschriebenen Verfahren infiziert, wonach die Organismenverteilung während mehrerer Tage verfolgt wurde. Die Mäuse wurden durch Ersticken mit CO&sub2; getötet, wonach jeweils die Milz aseptisch entfernt und mit Hilfe eines Gewebehomogenisators (Firma Brinkman Instruments) homogenisiert wurde. Anschließend wurden die Peyer-Plaques aus dem Dünndarm entfernt, in BSG gewaschen, um die lose anhaftenden Bakterien zu entfernen, und unter Verwendung desselben Homogenisators homogenisiert. Geeignete Verdünnungen der Suspensionen im BSG wurden auf MacConkey-Agar plattiert, um die Bakterienzahl zu ermitteln. Die Ergebnisse der Untersuchungen über die Besiedelung der Peyer-Plaques durch die Stämme nach der Beimpfung sind in Fig. 1 dargestellt. Darin sind die nach der Beimpfung mit dem phoP-Stamm Chi3687 sowie mit dem Wildtypstamm Chi3181 erhaltenen Kolonien bildenden Einheiten (CFU) durch schwarze bzw. weiße Quadrate dargestellt. Jeder Zeitpunkt stellt das geometrische Mittel der CFU's von drei Mäusen dar, wobei die senkrechten Striche die Standardabweichungen bezeichnen. Die mit Chi3181 beimpften Mäuse gingen 8 Tage nach dem Challenging ein. Aus Fig. 1 geht klar hervor, daß der phoP-Stamm Chi3687 zur Infizierung der Peyer-Plaques der dem Challenging unterzogenen Mäuse befähigt war, selbst wenn diese Fähigkeit beschränkt war. Die Zahl der aus den Peyer- Plaques gewonnenen phoP-Mutanten war wesentlich niedriger als beim Wiltyp-Elternstamm. Am 15. Tag nach der Beimpfung wurden aus den Peyer-Plaques der mit Chi3687 beimpften Mäuse keine Mikroorganismen mehr isoliert.
Die Ergebnisse der Gewinnung der aus der Milz von beimpften Mäusen erhaltenen Stämme Chi3687 bzw. Chi3181 sind in Fig. 2 dargestellt. Die aus der Milz von mit Chi3687 bzw. Chi3181 beimpften Mäusen erhaltenen CFU's sind durch einen weißen Balken bzw. schraffierte Balken bezeichnet. Die breiten Balken bezeichnen jeweils das geometrische Mittel der CFU's von drei Mäusen und die vertikalen Striche die Standardabweichungen.
Wie Fig. 2 zeigt, wurde nur eine sehr geringe Zahl von Chi3687's aus der Milz der infizierten Mäuse isoliert. Am 5. Tag nach dem Challenging konnten lediglich aus drei der fünf infizierten Tiere Organismen gewonnen werden. Außerdem konnte Chi3687 sieben Tage nach der oralen Beimpfung in der Milz nicht nachgewiesen werden. Bei keinem der mit Chi3687 infizierten Tiere wurde eine Milzvergrößerung festgestellt. Der geringe Grad an Infektiosität steht in scharfem Gegensatz zur hohen Zahl der Zellen des Wildtyps Chi3181, die während der gesamten Untersuchungsdauer aus der Milz der infizierten Tiere gewonnen wurden.

Schutz von mit phoP-Mutanten von S. thyphimurium geimpften Mäusen

Weibliche BALB/c-Mäuse wurden mit dem phoP-Mutantenstamm Chi3687 unter Anwendung der oben beschriebenen p.o.- bzw. i.p.-Techniken geimpft. Die Immunisierung wurde entweder p.o. mit ca. 10&sup8; bzw. 10&sup9;CFU's des phoP-Mutantenstammes oder i.p mit ca. 10&sup5; bzw. 10&sup6; CFU's des Stammes durchgeführt. Dreißig Tage nach der Beimpfung wurden die Mäuse dem Challenging mit dem Wildtyp-Elternstamm Chi3181 unterzogen. Die Menge an Wildtyp-Organismen, die für das Challenging verwendet wurden, hing dabei von der Verabreichungsart ab und betrug das 10³- bis 10&sup4;-fache des LD&sub5;&sub0;-Werts für den Wildtypstamm.
Die Ergebnisse des Schutzes von Mäusen bei p.o.-Verabreichung und nach Challenging sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. Unabhängig von der Immunisierungsdosis überlebten sämtliche Mäuse bei 10³ LD&sub5;&sub0;-Dosen an Chi3181. Erfolgte das Challenging bei einer Dosis von 10&sup4; LD&sub5;&sub0; des virulenten Stammes, überlebten vier von fünf mit 10&sup8; CFU's Chi3687 immunisierten Mäusen und neun von zehn mit 10&sup9; CFU's dieses Stammes immunisierten Mäusen die Infektion. In allen Fällen blieben die nach dem Challenging überlebenden Mäusen gesund. Tabelle 6 Schutz von Mäusen gegen perorales Challenging mit S. typhimurium SR-11 30 Tage nach peroraler Immunisierung mit phoP-Mutanten von S. typhimurium SR-11
a Überlebende Organismen 30 Tage nach Challenging.
b Gesund: keinerlei Anzeichen von Krankheit.
Die Ergebnisse des Schutzes von Mäusen unter Mwendung der i.p.-Verabreichung und Challenging sind in Tabelle 7 zusammengefaßt. Die mit 10&sup5; bzw. 10&sup6;CFU's Chi3687 immunisierten Mäuse widerstanden dem Challenging mit 10² bzw. 10&sup4; CFU's Chi3181, wobei die zuletzt genannte Dosis den LD&sub5;&sub0;-Wert an nichtimmunisierten Mäusen um das 10&sup4;- fache überstieg. Alle überlebenden Mäuse waren dreißig Tage nach dem Challenging gesund. Tabelle 7 Schutz von Mäusen gegen intraperitonales Challenging mit S. typhimurium SR-11 30 Tage nach intraperitonaler Immunisierung mit phoP-Mutanten von S. typhimurium SR-11
a Überlebende Organismen 30 Tage nach Challenging.
b Gesund: keinerlei Anzeichen von Krankheit.

Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen von mit phoP-Mutanten von S. typhimurium beimpften Mäusen

Die verzögerte Überempfindlichkeit (DTH) ist ein Indikator für die Eigenschaft eines Agens, eine T-zellvermittelte Reaktion zu induzieren. Zur Prüfung der DTH-Reaktion auf phoP-Mutanten wurden Mäuse p.o. mit 10&sup9; CFU's Chi3687 beimpft, wonach nach dreißig Tagen die DTH-Reaktionen gemessen wurden. Der Test wurde an immunisierten Tieren sowie an Kontrolltieren durchgeführt und zwar durch Injizieren von 20 µg Protein aus Ganzzell-Lysaten von S. typhimurium in 50 µl PBS in den rechten hinteren Fußballen von BALB/c-Mäusen. Dasselbe Volumen an PBS wurde auch in den Fußballen auf der entgegengesetzten Seite injiziert. Zwei Tage nach der Beimpfung wurde mit Hilfe eines digimatischen Greifzirkels der Firma Mitutoyo, Japan, die Schwellung gemessen. Die Ergebnisse sind als Prozentzunahme der Schwellung des beimpften Fußballens gegenüber deni kontralateralen mit PBS injizierten Kontrollfußballens ausgedrückt.
Zur Herstellung eines Ganzzell-Lysats von S. typhimurium wurde SR-11 in L-Bouillon bis zu einem OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert von 0,6 gezüchtet, wonach die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und dann durch Zentrifugieren gesammelt wurden. Das erhaltene Zellpellet wurde im selben Puffer suspendiert. Die Bakterienzellen wurden dann unter Verwendung von Glaskügeichen mit einem Durchmesser von 0,1 mm in einer Zellzerreiß-Vorrichtung der Firma B. Braun, Melsungen AG, Bundesrepublik Deutschland, lysiert, wonach die Zellbruchstücke bei 10.000 g während 10 min abzentrifugiert wurden.
Die Ergebnisse der DTH-Untersuchungen sind in Tabelle 8 zusammengefaßt. Die Mäuse, die oral mit Chi3687, einem phoP-Derivat von S. typhimurium, immunisiert worden waren, zeigten eine erheblich höhere Fußballenschwellung als die Kontrolltiere (P< 0,02) bei der Reaktion auf die Injektion mit Ganzzell-Lysaten von S. typhimurium. Tabelle 8 DTH-Reaktionen von Mäusen dreißig Tage nach der peroralen Immunisierung mit 2 x 10&sup9; CFU's phoP-Mutanten von S. typhimurium SR-11
adie Reaktionen sind ausgedruckt als Prozentanstieg der Schwellung der getesteten Fußballen gegenüber der kontralateralen Kontrollfußballen (Injektion von PBS) zwei Tage nach der Einspritzung des Antigens. Die Werte stellen die mittlere und Standardabweichung von fünf Mäusen dar. Die Unterschiede zwischen den immunisierten und nichtimmunisierten Tieren waren statistisch signifikant (P< 0,02).

Avirulenz von Pho&spplus;Revertanten von phoP-Mutanten

Drei Pho-Revertanten von Chi3687 und Chi3689 wurden durch i.p.-Beimpfung mit 10&sup5; CFU's von jeder Mutante auf Virulenz getestet. Die 6 Pho&spplus;-Revertanten behielten die Avirulenz der Stämme, von denen sie abgeleitet waren. Dies zeigt, daß die Abwesenheit von Phosphatase in einem phoP-Mutanten nicht für die Avirulenz verantwortlich ist und daß das phoP-Genprodukt ein oder mehrere für die Wildtypvirulenz notwendige Gene steuern muß.

Durch das phoP-Gen gesteuerte definierende Gene

Die Identifizierung von wichtigen durch das phoP-Genprodukt gesteuerten Virulenzdeterminanten, das heißt von Genen kann auf verschiedene Weise erreicht werden. Es ist wahrscheinlich, daß einige oder möglicherweise auch alle derartige Virulenzdeterminanten für Produkte verantwortlich sind, die auf der Zelloberfläche oder im perioplasmatischen Raum von Bakterien angeordnet sind. Das Transposon TnPhoA (Manoil &Beckwith /1984/), welches das Strukturgen für alkalische Phosphatase (AP) enthält, ist in einzigartiger Weise für die Identifizierung dieser Gene geeignet. Die AP-Aktivität kann nur dann exprimiert werden, wenn das Enzym durch die Zytoplasmenmembran der Bakterien hindurch zum Periplasma bzw. zur Zelloberfläche transportiert wird. Da die AP in TnphoA abgestumpft wurde, um die die Signalsequenz definierende Nukletotidsequenz zu deletieren, kann die AP-Aktivität nur dann exprimiert werden, wenn das TnphoA in ein Bakteriengen für ein periplasmatisches oder ein Zelloberflächenprotein inseriert wird, um die Bildung einer Proteinfusion der durch das TnphoA definierten AP mit der Signalsequenz für das penplasmatische oder Zelloberflächenprotein zu verursachen. In diesem Falle wird die AP durch die Zytoplasmenmembran transportiert und kann nachgewiesen werden, indem man den auf einem das chromogene AP-Substrat BCIP enthaltendem Medium wachsenden Kolonien eine blaue Färbung verleiht.
Zur Identifizierung einer oben beschriebenen Virulenzdeterminante wird in einem virulenen Wildtypstamm von S. typhimurium wie z.B.Chi3339 eine TnphoA-Bibliothek erzeugt (s. Tabelle 2), indem man den Stamm mit einem geeigneten Vektor für die TnphoA- Transposition infiziert (Manoil and Beckwith /1984/). Da die TnphoA-Insertion in das Chromosom oder in das Virulenzplasmid in Chi3339 Kanomycinresistenz verleiht, werden die Infektionsgemische auf einem Kanomycin und XP enthaltenden Agarmedium plattiert. Nach Bebrüten über Nacht werden alle blauen Kolonien aufgenommen und gereinigt. Ein Zellgemisch von allen diesen blauen Kolonien bildet eine TnphoA-Bibliothek, die in allen periplasmatische und Oberflächennzellproteine definierenden Genen Inserte enthalten sollte. Mit dieser Bibliothek wird dann ein P22 HT int-Transduzierungslysat hergestellt, wobei man zur Transduzierung eine phoP-Mutante von S. typhimurium wie z.B. Chi3689 verwendet (s. Tabelle 2). Die kanomycinresistenten Transduktanten werden dann auf einem BCIP enthaltenden Agarmedium plattiert. Die meisten Transduktantenkolonien sind blau; diejenigen jedoch, die in einem Gen, dessen Expression vom Wildtyp-phoP-Genprodukt abhängt, TnphoA-Inserte enthalten, sind weiß. Die weißen Kolonien können aufgenommen und gereinigt werden. Den Beweis dafür, daß die Zellen in diesen Kolonien in einem durch phoP gesteuerten Gen Inserte aufweisen, erhält man dadurch, daß man diese Mutanten zu phoP&spplus; transduziert, was dann die Bildung von blauen Kolonien auf BCIP enthaltenden Medien ermöglicht. Für die vollständige Kennzeichnung des durch phoP gesteuerten Virulenzgens und seines Produktes bedient man sich dann der üblichen Methoden der Genklonung, der DNA-Hybridisierung, des Screenings von S. typhimurium- Bibliotheken unter nachfolgender Subklonung, gekoppelter in vitro-Transkription und -Translation und schließlich der DNA-Sequenzierung. Zur Ermittlung der Mechanismen, mit deren Hilfe jedes durch phoP gesteuerte Virulenzgenprodukt die Pathogenität beeinflußt und der Art und Weise, wie diese Genprodukte für die Entwicklung von Impfstoffen verwendet werden könnten, können an Tieren und Zellkulturen weitere Untersuchungen durchgeführt werden.

Hinterlegung der Stämme

Die nachfolgend aufgeführten Stoffe können unter den Bedgingungen des Budapester Vertrages bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, hinterlegt werden. Die angegebene Eingangsnummer wurde nach erfolgreichem Test auf Lebensfähigkeit und Zahlung der erforderlichen Gebühren festgelegt. Der Zugang zu diesen Kulturen ist, solange die Patentanmeldung in Schwebe ist, für jedermann bei Zustimmung des Commissioner gemäß 37 CFR. 1.14 und 35 USC 122 möglich. Sämtliche Beschränkungen für die Zugänglichkeit zu den Kulturen für jedermann werden nach Erteilung eines Patents auf der Grundlage der Anmeldung unwiderruflich aufgehoben. Außerdem werden die angeführten Hinterlegungen während einer Zeitdauer von dreißig Jahren nach dem Hinterlegungstag oder während fünf Jahren ab der letzmaligen Beantragung der Hinterlegung aufrechterhalten. Sollte eine Kultur ihre Lebensfähigkeit verlieren oder unwiderruflich zerstört werden oder sollten Plasmid enthaltende Stämme ihr Plasmid verlieren, wird eine solche Kultur durch (eine) lebensfähige Kultur(en) mit derselben taxonomischen Beschreibung ersetzt. Die hier erwähnten hinterlegten Stoffe entsprechen nur der Übereinkunft und sind nicht für die Ausführung der vorliegenden Erfindung im Hinblick auf die Beschreibung erforderlich; außerdem wird auf diese Stoffe hier nur Bezug genommen.

Gewerbliche Verwendbarkeit

Die wirksame Immunistät mit avirulenten Stämmen, insbesondere mit avirulenten Salmonella-Stämmen erfordert es, daß der avirulente Mikroorganismus im Darmlymphgewebe (GALT oder Peyer-Plaques) des immunisierten Individuums eine bestimmte Zeit überdauert. Die von hochvirulenten Stämmen abgeleiteten phoP-Mutantenstämme von Salmonella haben diese Fähigkeit, wie es in ihrer Immunogenität zum Ausdruck kommt. Sie kommen daher für die großtechnische Erzeugung von Impfstoffen in Frage. Außerdem können die erfindungsgemäßen Zellen als Quellen einer Deletionsmutation in phoP verwendet werden, die durch Transposonmutagenese in andere Stämme übertragen werden kann, die, wenn sie avirulent sind, die erwünschten Impfstoffe ergeben.
In der biotechnologischen Industrie wird heute eine große Zahl durch gentechnisch veränderte Mikroorganismen synthetisierter, komerziell wertvoller Nebenprodukte erzeugt. Die beständige Aufrechterhaltung der gentechnisch veränderten Mikroorganismen unter den Wachstumsbedingungen in einem Fermenter würde durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Zellen erleichtert werden, wie z.B. solcher Zellen, die zusätzlich zur phoP- Mutation oder zu seinem äquivalenten Gen in der Zelle, welche ein asd&spplus;-Gen als selektierbaren Marker enthält, noch delta-asd-Mutationen und Polynudeotidinserte aufweisen. Der PhoP&supmin;-Phänotyp steigert die Sicherheit beim Arbeiten mit Mikroorganismen und die einzigen Zellen, die zum Wachstum und zur Expression von Proteinen befähigt sind, sind die, die das gewünschte Antigen kodieren. Auf diese Weise wird unter relativ sicheren Bedingungen die Ausbeute an erwünschtem Produkt gesteigert.

Claims

1. Impfstoff für die Immunisierung eines Individuums gegen durch Salmonella verursachte Krankheitssymptome, der avirulente Salmonella, die immunogene phoP-Mutanten darstellt, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die avirulente Salmonella wenigstens eine zusätzliche Mutation aufweist, welche die Pathogenität des Salmonella-Wildtyps, von dem die avirulente Salmonella abgeleitet ist, vermindert.

3. Impfstoff nach Anspruch 1, wobei phoP-Mutanten auch immunogene δ-cya- oder δ- crp-Mutanten sind.

4. Impfstoff für die Immunisierung eines Individuums gegen durch einen pathogenen Mikroorganismus verursachte Krankheitssymptome, wobei der Impfstoff Salmonella-Trägerzeilen umfaßt, die avirulente immunogene phoP-Mutanten sind, wobei die Trägerzellen mit einem ein immunogenes Antigen aus dem pathogenen Mikroorganismus kodierenden rekombinanten Expressionsvektor transformiert werden.

5. Impfstoff nach Anspruch 4, wobei die Salmonella-Trägerzellen eine für die Zellen letale Mutation enthalten, die durch ein rekombinantes Gen in einem Vektor, der die letale Mutation komplementiert, kompensiert wird, um ein kompensiertes letales Wirt-Vektor- System zu bilden.

6. Impfstoff nach Anspruch 4, wobei die Salmonella-Trägerzellen

a) eines funktionierenden nativen chromosomalen Gens entbehren, das β-Aspartatsemialdehyddehydrogenase (asd) kodiert,

b) ein rekombinantes Gen enthalten, das ein funktionales Asd-Polypeptid, das die native chromosomale asd-Mutation komplementiert, das fehlende chromosomale Gen durch Rekombination jedoch nicht zu ersetzen vermag, und

c) eine physikalische Bindung zwischen den das funktionale Asd-Polypeptid kodierenden rekombinanten Genen und dem immunogenen Antigen aufweisen, wobei der Verlust des das funktionale Asd-Polypeptid kodierenden rekombinantcn Gens die Zellen zur Lyse veranlaßt, wenn sie sich in einem Medium befinden, in dem das Fehlen des funktionalen Asd die Zellen zur Lyse veranlaßt.

7. Isolierter Salmonella-Stamm, der eine phoP-Mutante darstellt und eine für die Zellen letale Mutation enthält, die durch ein rekombinantes Gen in einem Vektor, der die letale Mutation komplementiert, kompensiert wird, um ein kompensiertes letales Wirt-Vektor- System zu bilden.

8. Isolierter Salmonella-Stamm, der eine phoP-Mutante und auch ein δ-cya oder δ-crp darstellt.

9. Isolierter Salmonella-Stamm, ausgewählt aus der Gruppe ATCC Nr. 53864, ATCC Nr. 53865 oder ATCC Nr. 53866, sowie Derivaten und Mutanten davon.

10. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Immunisierung.

11. Avirulente Salmonella-phoP-Mutante, die für die Verwendung bei einem Verfahren zur Immunisierung eines menschlichen oder tierischen Individuums gegen eine Krankheit immunogen ist.

12. Avirulente Salmonella-phoP-Mutante für die Verwendung nach Anspruch 11, die nach einem der Ansprüche 2 bis 6 definiert ist.

13. Verwendung einer in einem der Ansprüche 1 bis 6 definierten avirulenten Salmonella für die Herstellung eines Impfstoffs.

14. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs für die Immunisierung eines Individuums gegen durch Salmonella verursachte Krankheitssymptome, das die Kontakierung der avirulenten Salmonella, die immunogene phoP-Mutanten darstellt, mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.

15. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs für die Immunisierung eines Individuums gegen durch einen pathogenen Mikroorganismus verursachte Kranktheitssymptome, wobei der Impfstoff Salmonella-Trägerzellen umfaßt, die avirulente immunogene phoP-Mutanten sind, das die Transformation der Trägerzellen mit eineni ein inimunogenes Antigen aus dem pathogenen Mikroorganismus kodierenden rekombinanten Expressionsvektor umfaßt.