DE3853683T2

DE3853683T2 - Verfahren zur erhaltung eines erwünschten rekombinanten gens in einer genetischen zellpopulation.

Info

Publication number: DE3853683T2
Application number: DE3853683T
Authority: DE
Inventors: Roy Curtiss Iii
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 1987-10-07
Filing date: 1988-10-06
Publication date: 1995-08-31
Anticipated expiration: 2008-10-07
Also published as: EP0381706B1; DE3853683D1; AU637969B2; WO1989003427A1; AU2611188A; EP0381706A1; CA1339412C; US5672345A; JPH04501351A; EP0381706A4; ATE121785T1; US5840483A; JPH11235191A

Description

Gebiet der Technik

Die Erfindung betrifft Stoffe und Methoden zur Herstellung von Vakzinen und rekombinanten DNA-Expressionsprodukten und insbesondere gentechnisch veränderte Mikroorganismen, die geeignet sind für die Expression erwünschter Genprodukte, da sie ausgewogene Lethalmutationen darstellen, die in einer genetisch beständigen Population gehalten werden können.

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Stand der Technik

Gentechnisch veränderte Mikroorganismen können für viele Zwecke verwendet werden und sind von großer Bedeutung. So z.B. können sie zur Herstellung von Fremdproteinen verwendet werden, weshalb sie für die großtechnische Synthese von Produkten wie Interferonen, Insulin, Wachstumshormonen usw. in Frage kommen. Außerdem können sie zur Erzeugung einer Immunreaktion als Vakzinen verwendet werden. Ferner können sie in die Umwelt abgegeben werden, um Umweltgifte abzubauen oder sogar um landwirtschaftlich wichtige Kulturen befallende Schadinsekten abzutöten. Der gentechnisch veränderte Mikroorganismus muß jedoch häufig ein Genprodukt synthetisieren, das keinen Nutzen bringt, und der hohe Grad der Expression des rekombinanten Proteins kann u.U. den Mikroorganismus schädigen. Deshalb kann der gentechnisch veränderte Mikroorganismus u.U. zu einem selektiven Nachteil werden für denselben Typ von Mikroorganismen, die das geklonte Genprodukt nicht produzieren. Spontan segregierende Mutanten, welche die das gewünschte Genprodukt bestimmende DNA-Sequenz verloren haben, führen somit zu einem raschen Ausschluß des gentechnisch veränderten Mikroorganismus aus der Population. Dies kann geschehen, gleichgültig ob der Mikroorganismus in einem Bioreaktor, im Boden, auf einer Pflanze oder in einem Tier heranwächst.
Ein Verfahren zur Anwendung des selektiven Drucks auf eine Bakterienpopulation besteht darin, daß man das das gewünschte Polypeptid kodierende rekombinante Gen in ein Plasmid inseriert, das seinerseits ein die Antibiotikaresistenz kodierendes Gen enthält. Die meisten der derzeit gebräuchlichen Klonierungsvektoren besitzen ein oder mehrere die Antibiotikaresistenz bestimmende Gene. Auf diese Weise können dem Nährmedium für die Züchtung gentechnisch veränderter Mikroorganismen Antibiotika zugesetzt werden, um die Bakterien, welche das rekombinante Plasmid verloren haben, abzutöten. Diese Praxis hat Jedoch mehrere Nachteile. Erstens ist die Zugabe von Antibiotika zum Nährmedium teuer. Zweitens bleiben die Zellen, da die Antibiotikaresistenz häufig auf der Synthese Arzneimittel inaktivierender Enzyme beruht, während einer Reihe von Zellgenerationen nach Verlust der Gene für die Arzneimittelresistenz, die mit den das erwünschte rekombinante DNA-Produkt bestimmenden Genen verbunden sind, phänotypisch arzneimittelresistent. Drittens kann die letzte DNA-Sequenz, sofern das klonierte Antibiotikaresistenz-Gen nicht an das das gewünschte Produkt exprimierende Gen angrenzt, durch illegitime Rekombination ohne Verlust der Antibiotikaresistenz einer Deletion unterworfen werden. Das Ergebnis ist ein Bakterium, das antibiotikaresistent ist, jedoch des Vermögens für die Synthese des erwünschten Produktes entbehrt. Schließlich weigert sich im Falle von als lebender Vakzine zu verwendenden gentechnisch veränderten Bakterien die Food and Drug Administration, Antibiotikaresistenz exprimierende Stämme zu genehmigen.
Eine Alternative für die Antibiotikaresistenz zur Aufrechterhaltung eines rekombinanten Plasmids und/oder eines klonierten Gens in einem gentechnisch veränderten Mikroorganismus besteht in der Verwendung einer Bakterienmutante, die eines kritischen Biosyntheseenzyms entbehrt, und in der Zufuhr des Wildtyp-Gens für jenes Enzym auf dem Plasmid-Klonierungsvektor (s. Kahn et al. (1979) und Dean (1981)). Leider ist dieses Verfahren in vielen Fällen unpraktisch. Die Verwendung von Mutanten, denen bestimmte, an der Biosynthese von Aminosäuren, Purinen, Pyrimidinen und Vitamien beteiligte Enzyme fehlen, verhindert häufig nicht das Wachstum dieser Mutanten, da das dafür erforderliche Endprodukt des Stoffwechselweges häufig von der Umgebung zur Verfügung gestellt wird. So z.B. enthalten die für das Wachstum von rekombinanten Organismen in Bioreaktoren verwendeten billigen Nährmedien häufig diese Endprodukte. Außerdem kann insbesondere im Falle von Lebendvakzinen das Endprodukt in vivo vom vakzinierten Wirt bereitgestellt werden.
Es wird angenommen, daß die Probleme der genetischen Instabilität von gentechnisch veränderten Mikroorganismen mit einem klonierten Gens auf einem Plasmid dadurch abgeschwächt werden können, daß man das klonierte Gen in das Chromosom der Mikroorganismen einbaut. Diese Annahme hat jedoch zumindest einen Fehler. Wenn nämlich eine Sequenz eines fremden klonierten Gens auf einem Plasmid durch illegitime Rekombination verlorengehen kann, könnte es zum selben Rekombinationstyp auch dann kommen, wenn das klonierte Gen in das Bakterienchromosom eingebaut wird, d.h. daß die strukturellen und enzymatischen Vorgänge infolge der Deletion der DNA-Sequenzen durch illegitime Rekombination einander grundsätzlich ähnlich sind, gleichgültig, ob die DNA- Sequenz auf einem Plasmid verbleibt oder ein integraler Bestandteil des Bakterienchromosoms ist. Außerdem macht der Einbau des rekombinanten Gens in das Chromosom viele der möglichen Vorteile, die mit dem Verbleib auf dem Plasmid in Zusammenhang stehen, zunichte. So z.B. gewährleistet die Steuerung der Zahl der Kopien des das klonierte Gen enthaltenden Plasmids einen Mechanismus zur Steigerung der Produktausbeute. Außerdem bietet sie einen Mechanismus für eine temporäre Steuerung der Expression des Produktes, so daß es während des Wachstumszyklus bei weniger beeinträchtigender Zeitdauer zu einer starken Expression kommt.
Sämtliche Bakterien weisen in der Zellwand eine Peptidoglycanschicht auf, die ihr Form und Festigkeit verleiht. Das Peptidoglycan besteht aus einem Polymer von sich wiederholenden Muraminsäure-N-Acetylglucosamin-Einheiten und ist durch kurze Peptide vernetzt. Bei allen Gram-negativen Bakterien sowie bei den Arten von Mycobacterium und Nocardia der Gruppe der Eubacteria ist das Peptid zusammengesetzt aus L-Alanin, D-Glutaminsäure, m-Diaminopimelinsäure (DAP) und D-Alanin. Bei den meisten Gram-positiven Mikroorganismen ist die DAP durch ihr Decarboxylierungsprodukt L-Lysin ersetzt.
Die DAP wird in sechs enzymatischen Stufen aus β-Aspartatsemialdehyd synthetisiert, der seinerseits zweistufig aus L- Asparaginsäure synthetisiert wird. Auf der ersten Stufe wird die L-Asparaginsäure durch eine von mehreren (gewöhnlich drei) β-Aspartokinasen phosphorvliert, die von mehreren (gewöhnlich drei) getrennten Genen kodiert werden, die unabhängig voneinander durch Repression und/oder Feedbackinhibierung der Genprodukte durch die allerletzten Endprodukte L-Threonin, L-Methionin und L-Lysin gesteuert werden. Das β-Aspartophosphat wird einstufig zum β-Asparaginsäuresemialdehyd durch β-Asparaginsäuresemialdehyddehydrogenase, das Produkt des asd-Gens, umgewandelt. Mutanten mit einer Punktmutation oder einer Deletion des asd-Gens sowie Mutanten mit Mutationen in einem der sechs die Enzyme für die Umwandlung des β-Semialdehyds in DAP bestimmenden Gene stellen an DAP in sämtlichen Nährmedien eine obligatorische Anforderung. Wenn nämlich den DAP erfordernden Mutanten die DAP entzogen wird, so erfahren sie einen DAP-freien Tod, lysieren und setzen den Inhalt frei.
Die Aufnahme von asd- und damit von dap-Mutationen in Bakterienstämme bewirkt eine biologische Sicherheit, da derartige Mutantenstämme nur in sorgfältig gesteuerter Laboratmosphäre zu überleben imstande sind. Die entsprechenden Grundlagen dazu wurden in der US-PS 4 190 495 eingehend beschrieben.
Das Gen für die Asparaginsäure-β-Semialdehyddehydrogenase aus Streptococcus mutans PS14 (UAB62) wurde kloniert und in asd-Mutanten von E. coli exprimiert [s. Jagusztyn-Krynicka et al. (1982); Curtiss et al. (1982)]. Anschließend wurde das S. Mutans-asd-Gen sequenziert [s. Cardineau und Curtiss (1987)].
Sowohl bei Gram-positiven Mikroorganismen als auch bei Gramnegativen Bakterien enthalten die peptidvernetzten, sich wiederholenden Muraminsäure-N-Acetylglucosamin-Polymere D- Alanin. Dieses wird aus L-Alanin durch Alaninracemase, dem Produkt des alr-Gens (E. coli) oder des dal-Gens (B. subtilis) synthetisiert, wonach es durch das Enzym D-Alanyl-D- alaninligase, dem Produkt des ddl-Gens in D-Alanyl-D-alanindipeptid umgewandelt wird. Nach der Zugabe zum L-Alanyl-D- glutamyl-DAP oder L-Alanyl-D-glutamyl-L-lysintripeptid, das mit einem Muraminsäure-N-acetylglucosamin-Polymer zur Bildung eines Pentapeptids verknüpft wird, wird das endständige D-Alanin während der enzymatischen Vernetzung zum nächsten Muraminsäure-N-acetylglucosamin-Polymer abgespalten. Mutanten von E. coli oder Bacillus subtilis, die des Vermögens zur Synthese von D-Alanin bzw. von D-Alanyl-D-alanin entbehren, unterliegen in Nährmedien, die kein D-Alanin bzw. das Dipeptid aufweisen, der Lysis. alr-E. coli-Mutanten, die keine Alaninracemase aufweisen, wurden isoliert (Wijsman (1972a)]. Dies gilt auch für die dal-Mutanten von B. subtilis, die ebenfalls der Alaninreacemase entbehren (Dul et al. (1973)]. ddl-Mutanten, die keine D-Alanyl-D-alaninligase aufweisen, wurden in E. coli isoliert (Wijsman (1972b), Miyakawa et al. (1972), Lugtenberg et al. (1973)) sowie in B. subtilis. Wie im Falle der asd- und dap-Mutationen bewirkt der Einbau von alr- (oder dal-) und/oder ddl-Mutationen eine biologische Sicherheit, da derartige Mutantenstämme nur in sorgfältig gesteuerter Laboratmosphäre zu überleben imstande sind.

Beschreibung der Erfindung

Die einzelnen Ausführungsformen der Erfindung kennzeichnen gentechnisch veränderte Wirtszellen, die für die Expression der erwünschten Genprodukte geeignet sind, da sie ausgewogene Lethalmutationen darstellen, die in einer genetisch beständigen Population gehalten werden können.
Eine Aufgabe der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Aufrechterhaltung eines gewünschten rekombinanten Gens in einer genetischen Zellpopulation, welche das rekombinante Gen exprimiert, das die Züchtung gentechnisch veränderter Zellen umfaßt, gekennzeichnet durch:
a) das Fehlen eines funktionsfähigen, nativen, β-Aspartat- Semialdehyddehydrogenase kodierenden chromosomalen Gens, wobei die Funktion der defektiven β-Apsartat-Semialdehyddehydrogenase nicht durch ein anderes im Wirtschromosom kodiertes natives Enzym dupliziert ist;
b) die Anwesenheit eines ersten, die β-Aspartat-Semialdehyddehydrogenase kodierenden rekombinanten Gens, wobei dieses erste, die β-Aspartat-Semialdehyddehydrogenase kodierende rekombinante Gen gewöhnlich nicht mit dem defektiven chromosomalen β-Aspartat-Semialdehyddehydrogenase-Gen rekombiniert werden kann;
c) die Anwesenheit eines zweiten rekombinanten, ein erwünschtes Polypeptid kodierenden Gens und
d) die physikalische Verknüpfung zwischen dem ersten rekombinanten Gen und dem zweiten rekombinanten Gen, wobei der Verlust des ersten rekombinanten Gens Enterobacteriaceae in einem Medium, das zum Überleben der Zelle die Expression des ersten rekombinanten Gens erfordert, zur Lyse veranlaßt,
wobei das Züchtungsmedium ein Medium ist, in dem das Fehlen des ersten rekombinanten Gens die Zell-Lyse verursacht.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung sind die oben beschriebenen gentechnisch veränderten Zellen. Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung und Isolierung von Bakterien mit einer Mutation in einem Gen, das ein Enzym kodiert, das eine Stufe in der Biosynthese einer wichtigen Zellwandkomponente katalysiert, wobei diese aus DAP synthetisiert wird, das folgende Stufen umfaßt:
a) Züchtung und Mutagenisierung der elterlichen Bakterien in DAP enthaltenden Medien und
b) Selektion auf Bakterienmutanten unter Verwendung eines Nährmediums, welches die Expression der Auxotrophie erlaubt, jedoch DAP und ein Antibiotikum enthält, welches die Zellwandbiosynthese in den Bakterien stört.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein rekombinanter Bakterienstamm, der in einem asd kodierenden Gen eine Deletionsmutation enthält und für die Konstruktion von Asd-Mutanten geeignet ist, wobei dieser Stamm ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus E. coli K-12 Chi2108 und S. typhimurium Chi3520 und Mutanten davon.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein rekombinantes Plasmid, das geeignet ist für die Komplementierung eines Bakterienstammes mit einem Asd-Phänotyp, der ein erstes Asd kodierendes rekombinantes Gen und Restriktionsenzymsites enthält, wobei ein zweites, ein erwünschtes Produkt kodierendes rekombinantes Gen inseriert werden kann, wobei das erste rekombinante Gen aus S. mutans oder S. typhimurium stammt und wobei das Plasmid pYA248, wie es bei ATCC unter der Nr. 67538 hinterlegt wurde, und funktionell gleichwertige Mutanten davon oder pYA292, wie es bei ATCC unter der Nr. 67813 hinterlegt wurde, und funktionelle gleichwertige Mutanten davon darstellt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist eine einen abgeschwächten Bakterienstamm enthaltende Vakzine, gekennzeichnet durch:
a) das Fehlen eines funktionsfähigen, nativen, β-Aspartat- Semialdehyddehydrogenase kodierenden chromosomalen Gens, wobei die Funktion der defektiven β-Aspartat-Semialdehyddehydrogenase nicht durch ein anderes im Wirtschromosom kodiertes natives Enzym dupliziert ist;
b) die Anwesenheit eines ersten, die β-Aspartat-Semialdehyddehydorgenase kodierenden rekombinanten Gens, wobei dieses erste, die β-Aspartat-Semialdehyddehydrogenase kodierende rekombinante Gen gewöhnlich nicht mit dem defektiven chromosomalen β-Aspartat-Semialdehyddehydrogenase-Gen rekombiniert werden kann;
c) die Anwesenheit eines zweiten rekombinanten, ein erwünschtes Polypeptid kodierenden Gens und
d) die physikalische Verknüpfung zwischen dem ersten rekombinanten Gen und dem zweiten rekombinanten Gen, wobei der Verlust des ersten rekombinanten Gens Enterobacteriaceae in einem Medium, das zum Überleben der Zelle die Expression des ersten rekombinanten Gens erfordert, zur Lyse veranlaßt,
wobei die Zellen in einem pharmazeutisch verträglichen Träger vorliegen und die Bakterien bei einer pharmakologisch wirksamen Dosis vorliegen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Plasmid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus pYA248, Plasmiden, die davon durch Insertion eines ein Polypeptid kodierenden Gens in einen Restriktionsenzymsite abgeleitet sind, und Mutanten davon.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Plasmid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus pYA292, Plasmiden, die davon durch Insertion eines Polypeptid kodierenden Gens in einen Restriktionsenzymsite abgeleitet sind, und Mutanten davon.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Bakterienstamm, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus PYA 232 enthaltendem Chi6O97, PYA 248 enthaltenden Chi2978, Chi3520 und Chi4072 sowie pYA292 enthaltenden Chi3008, Chi2108 und Chi6097.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt ein Fließschema der Biosynthese der Aminosäuren der Aspartatfamilie;
Fig. 2 zeigt ein Fließschema der Erzeugung der δ-asd-Mutanten von Salmonella;
Fig. 3 zeigt ein Fließschema mit den signifikanten Merkmalen der zur Konstruktion von pYA235 verwendeten Plasmide;
Fig. 4 zeigt ein Fließschema mit den signifikanten Merkmalen der zur Konstruktion von pYA229 verwendeten Plasmide;
Fig. 5 zeigt eine Karte mit den signifikanten Merkmalen des Klonierungsvektors pYA248;
Fig. 6 zeigt die Nucleotidsequenz des Ptrc-Promotors und den Mehrfachklonierungssite in pYA248;
Fig. 7 zeigt eine Karte mit den signifikanten Merkmalen des rekombinanten Vektors pYA260;
Fig. 8 zeigt eine Karte mit den signifikanten Merkmalen von pYA232;
Fig. 9 zeigt ein Photo des Polyacrylamidgels mit den Expressionsprodukten der mit pYA260 oder pYA248 transformierten oder mit pYA260 und pYA232 cotransformierten Asd-Stämme;
Fig. 10 zeigt eine Karte mit der Struktur des S. mutans spaA-Gens unter Angabe der Hauptantigendeterminanten;
Fig. 11 zeigt Karten mit den signifikanten Merkmalen von pYA261 und pYA262.
Fig. 12 zeigt ein Diagramm mit den spontanen Verlustraten an pYA260, pYA261 und pYA262 aus einem Asd&supmin;-Stamm.
Fig. 13 zeigt ein Photo eines Gels mit den Coomassie-Blaugefärbten SDS-PAGE-Profilen (links) und Western- Blots (rechts) von Ganzzellproteinen von S. typhimurium-Chi4072, der die Asd&spplus;-Plasmide pYA248, pYA261 und pYA262 enthält.
Fig. 14 zeigt ein Schaubild mit der Konstruktion und den Eigenschaften von pYA272, pYA275 (mit und ohne Insertionen) und pYA277;
Fig. 15 zeigt eine Karte mit den signifikanten Merkmalen von pYA280;
Fig. 16 zeigt eine Karte mit den signifikanten Merkmalen von pYA292;
Fig. 17 zeigt ein Fließschema der Konstruktion von pYA1090 und pYA1091, die das 3.2-DNA-Insert von M. leprae enthalten;
Fig. 18 zeigt ein Fließschema der Konstruktion von pYA1092 und pYA1093, die das 7.8-DNA-Insert von M. leprae enthalten.

Arten der Ausführung der Erfindung

A. Definitionen

Die Ausdrücke "rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen" und andere Mikroorganismen bezeichnende Termini sind gegenseitig austauschbar und bezeichnen Zellen, die als Empfänger für rekombinante Vektoren oder andere transferierte DNA verwendet werden können und die Nachkommenschaft der ursprünglichen transfizierten Zellen umfassen. Es versteht sich von selbst, daß die Nachkommenschaft einer einzigen Elternzelle infolge zufälliger oder beabsichtigter Mutation im Hinblick auf das Genomkomplement bzw. das Gesamt-DNA- Komplement mit dem Ausgangselter nicht unbedingt identisch sein muß. Die Nachkommen der Elternzelle, die dem Elter ausreichend ähnlich sind, können durch eine relevante Eigenschaft gekennzeichnet werden, wie z.B. durch den Ersatz eines nativen, ein essentielles Enzym kodierenden Gens durch ein kloniertes Gen, das mit einem ein gewünschtes Genprodukt kodierenden Strukturgen verknüpft ist.
Der Ausdruck "Kontrollsequenz" bedeutet DNA-Sequenzen, die für die Expression der Kodierungssequenzen, mit denen sie legiert sind, erforderlich sind. Im allgemeinen umfassen derartige Kontrollsequenzen einen Promotor- und einen Ribosomenbindungssite. Der Ausdruck "Kontrollsequenzen" umfaßt zumindest sämtliche Komponenten, deren Anwesenheit für die Expression erforderlich ist, kann jedoch auch zusätzliche Komponenten umfassen, deren Anwesenheit vorteilhaft ist, wie z.B. Operatoren.
Der Ausdruck "operabel verknüpft" bedeutet eine juxtaposition, bei der die auf diese Weise beschriebenen Komponenten zueinander in einer Beziehung stehen, welche ihre Funktion in der beabsichtigten Weise ermöglicht. Eine mit einer Kodierungssequenz "operabel verknüpfte" Kontrollsequenz ist in einer Weise legiert, daß unter den mit den Kontrollsequenzen verträglichen Bedingungen eine Expression der Kodierungssequenz erreicht wird.
Der Ausdruck "Gram-negative Bakterien" umfaßt Kokken, nichtenterale und enterale Stäbchen. Die Gram-negativen Bakterien umfassen z.B. folgende Gattungen: Neisseria, Spirillum, Pasteurella, Brucella, Yersinia, Francisella, Haemophilus, Bordetella, Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Proteus, Vibrio, Pseudomonas, Bacteroides, Acetobacter, Aerobacter, Agribacterium, Azotobacter, Spirilla, Serratia, Vibrio, Rhizobium, Chlamydia, Rickettsia, Trepanema und Fusobacterium.
Der Ausdruck "Gram-positive Bakterien" umfaßt Kokken, nichtsporenbildende und sporenbildende Stäbchen. Die Gram-positiven Bakterien umfassen z.B. folgende Gattungen: Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Lactobacillus, Listeria, Mycobacterium, Myxococcus, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus und Streptomyces.
Der Ausdruck " Mycobakterien" wird definiert, ausgehend von ihren deutlichen Anfärbungseigenschaften, d.h. aufgrund ihrer Beständigkeit gegenüber Entfärbung mit angesäuerten organischen Lösungsmitteln und aufgrund ihrer langkettigen (ca. 60 C-Atome) Mycolsäuren.
Der Ausdruck "natives Chromosomengen" bedeutet ein Gen im Chromosom eines Wildtyp-Organismus, wie z.B. das die Asparaginsäuresemialdehyddehydrogenase (asd) in E. coli oder Salmonella kodierende Gen, die Alaninracemase kodierenden Gene und die D-Alanyl-D-alanin-Ligase kodierenden Gene. Weitere Beispiele für native Gene werden unten beschrieben.
Der Ausdruck "rekombinantes Gen" bedeutet hier ein identifizierbares Polynucleotidsegment innerhalb eines größeren Polynucleotidmoleküls, das in Verbindung mit dem größeren Molekül in der Natur nicht angetroffen wird.
Der Ausdruck "essentielle Zellwandkomponente" bedeutet eine Zellwandkomponente, die für die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Zellwand erforderlich ist und ohne die die Zelle osmotisch empfindlich ist. Die osmotische Empfindlichkeit eines Stammes kann dadurch gemessen werden, daß man die Zellen in hypotonische Medien gibt und die Salzkonzentration mißt, bei der es zur Zellyse kommt, wie z.B. anhand der Änderung des Trübegrades der Zellsuspension. Die osmotische Empfindlichkeit des mutanten Stammes wird dabei verglichen mit der eines die essentielle Zellwandkomponente enthaltenden Wildtypstamms. Ein Kennzeichen von
osmotisch empfindlichen Zellen infolge des Fehlens der essentiellen Zellwandkomponente ist, daß die erhaltene Zellproteinmasse, z.B. infolge von Proteinsynthese, die Zellyse veranlaßt. Beispiele für essentielle Zellwandkomponenten sind Glycane, insbesondere Peptidoglycane bei Prokaryonten, Chitin in Zellwänden von Pilzen und Cellulose in Zellwänden von Pflanzen.
Ein "Peptidoglycan" ist ein typischer Bestandteil von Zellwänden bei fast allen Prokaryonten, die für die Starrheit bzw. Festigkeit der Zellwand verantwortlich ist. Die Peptidoglycane sind eine Gruppe von acylierte Aminozucker und 3 bis 6 unterschiedliche Aminosäuren enthaltenden Makromolekülen. Die Heteropolymere enthalten dabei durch kurze Peptide quervernetzte Glycanstränge. Einen Überblick über die Peptidoglycane geben Schleifer und Kandler (1972).
"DAP" bedeutet hier beide Stereoisomeren der Diaminopimelinsäure und ihrer Salze, d.h., wenn nicht anders angegeben, sowohl die LL- als auch die meso-Form.
Die Gensymbole für die mutanten Stämme entsprechen jenen, wie sie von Bachmann (1987) sowie Sanderson und Roth (1987) beschrieben werden. Die Symbole für die Transposone, insbesondere Tn10, folgen der Übereinkunft, wie sie von Bukhari et al. (1977) beschrieben wird.
Der Ausdruck "Individuum", das mit einer erfindungsgemäßen Vakzine behandelt wird, umfaßt hier sämtliche Vertebraten, wie z.B. Säuger, Haustiere und den Menschen eingeschlossen, verschiedene Vogelarten, wie z.B. Geflügelarten, insbesondere solche, die für die Landwirtschaft von Bedeutung sind. Außerdem umfaßt der Begriff "Individuum" auch Mollusken und bestimmte andere Invertebraten mit einem primitiven Immunsystem.
Der Ausdruck "Transformation" bedeutet hier die Insertion eines exogenen Polynucleotids in eine Wirtszelle, unabhängig vom Insertionsverfahren, wie z.B. durch unmittelbare Aufnahme, Transduktion oder Konjugation. Das exogene Polynucleotid kann als Plasmid aufrechterhalten oder aber zusammen mit dem Wirtsgenom eingebaut werden.

B. Allgemeine Beschreibung

Bei der Durchführung der Erfindung bedient man sich, wenn nicht anders angegeben, der üblichen Techniken der Zellzüchtung, Molekularbiologie, Mikrobiologie, DNA-Rekombination und Immunologie, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Techniken werden in der Literatur eingehend beschrieben, wie z.B. in: Maniatis, Fritsch und Sambrook, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING; B. I und II Glover, ed., 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait ed., 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Hames und S.J. Higgins, eds., 1984); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); die Serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); VECTORS: A SURVEY OF MOLECULAR CLONING VECTORS AND THEIR USES (R.L. Rodriguez und D.T. Denhardt, eds., 1987, Butterworths) und J.H. Miller, EXPERIMENTS IN MOLECULAR GENETICS (1972, Cold Spring Harbor Laboratory).
Ein Teil der Erfindung betrifft gentechnisch veränderte Wirtszellen, die als genetisch beständige Population aufrechterhalten werden können, wobei die Wirtszellen ein erwünschtes rekombinantes Genprodukt exprimieren. Die Wirtszellen in dieser Population hatten kennzeichnenderweise ein natives Gen inaktiviert, das ein Enzym kodiert, das für das Überleben der Zelle essentiell ist, da es eine Stufe der Biosynthese katalysiert. Außerdem wird die Funktion des nativen Gens durch ein rekombinantes Gen ersetzt, welches das defektive Chromosomengen, dessen Expression mit der Expression des erwünschten Genprodukts operabel verknüpft ist, nicht zu ersetzen vermag. Die Erfindung beschreibt Verfahren zur Erzeugung und Isolierung von als Wirtszellen in Frage kommenden Zellen. Beschrieben werden außerdem Plasmide, die geeignet sind für die Transformation der Wirtszellen, welche das rekombinante Ersatzenzym enthalten und in die das das erwünschte Polypeptid kodierende Gen inseriert werden kann. Die erfindungsgemäßen Zellen sind geeignet für die Produktion der erwünschten Polypeptide in Industrieanlagen, wie z.B. durch Züchtung in Bioreaktoren. Diese Zellen können auch Komponenten von Vakzinen, insbesondere von lebenden Vakzinen, sein.
Ein Merkmal der erfindungsgemäßen Wirtszellen besteht darin, daß ihre Wände ein Strukturpolymer, z.B. Peptidoglycan oder Chitin oder Cellulose enthält, das für die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Zelle erforderlich ist, d.h. ohne das die Zelle osmotisch empfindlich ist. Die Wirtszellen können somit prokaryotische Zellen, wie z.B. Bakterien sein, die Peptidoglycan enthalten oder eukaryotische Zellen, z.B. Pilzzellen, die Chitin enthalten, oder Pflanzenzellen, die Cellulose enthalten. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Wirtszellen prokaryotische Zellen, die Peptidoglycan als Teil der Zellwand enthalten. Das Peptidoglycan kann z.B. im Vernetzungspeptid D-Alanin enthalten. Wirtszellen von diesem Vernetzungstyp sind bekannt. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Wirtszellen jedoch prokaryotische Zellen, bei denen das Peptidoglycan aus DAP besteht. Beispiele für Wirtszellen, in denen das Peptidoglycan aus DAP besteht, sind dem Fachmann bekannt (s. zum Beispiel Schleifer und Kandler (1972)] und umfassen z.B. vermutlich sämtliche Gram-negativen Bakterien sowie zahlreiche andere Organismen, wie einige Arten der Gruppen Bacilli, Clostridia, Lactobacilli, Corynebacteria, Propionibacteria, Actinomycetales, Myxobacteriales, Rickettsiae sowie Blaualgen. Einen Überblick über die Verfahren, durch die ein Peptidoglycan auf seinen Gehalt an DAP hin gekennzeichnet werden kann, geben Schleifer und Kandler (1972).
Ein weiteres Merkmal der erfindungsgemäßen Wirtszellen ist, daß sie mutiert haben, so daß ein natives Chromosomengen, das das Enzym kodiert, das eine Stufe der Biosynthese der essentiellen Zellwandkomponente katalysiert, nicht funktionell ist, d.h. daß es kein funktionelles Enzym ergibt. Verfahren zur Mutation von Zellen zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Wirtszellen sind bekannt und umfassen z.B. chemische Mutagenese, UV-Mutagenese und via Einwirkung von Transposonen induzierte Mutationen (s. zum Beispiel Miller (1972); Davis, Botstein und Roth; und Methods in Enzymology). Obwohl in den oben beschriebenen Genen Punktmutationen aufweisende Wirtszellen von der Erfindung mit umfaßt sind, ist es doch vorzuziehen, in diesen Genen Deletionsmutationen aufweisende Wirtszellen zu verwenden, da sich Deletionsmutanten im allgemeinen nicht zurückverwandeln.
Enzyme, die die Biosynthese der Zellwandkomponente sowie ihre Precursorprodukte katalysieren, sind bekannt. So z.B. kann das Enzym bei der Synthese von Peptidoglycanen die Insertion der Vernetzungpeptide katalysieren, z.B. wie im Falle von D-Alanyl-D-alanin-Ligase oder es katalysiert die Synthese des Kohlehydratpolymers oder eine Stufe in der Biosynthese eines Precursors, wie z.B. von DAP. Figur 1 zeigt den Weg für die Biosynthese der Aspartatgruppe von Aminosäuren, zu denen beide Stereoisomeren des DAP gehören. Einen Überlick über die Biosynthese dieser Gruppe von Aminosäuren gibt Umbarger (1978). Beispiele für Gene, welche Enzyme kodieren, die Stufen in der Biosynthese von DAP kodieren, sind für eine große Zahl von Organismen bekannt [s. zum Beispiel GENETIC MAPS 1987 (S.J. O'Brien, ed., Cold Spring Harbor Laboratories)) und umfassen z.B. bei S. typhimurium die Gene dapA und dapB und z.B. in E. coli die Gene dapA, dapB, dapC, dapD und dapE. Ein weiteres Enzym dieser Art, d.h. ein für die Synthese von DAP essentielles Enzym ist Aspartatsemialdehyddehydrogenase (ASD), das im asd-Gen kodiert wird.
In den nachfolgenden Beispielen werden Verfahren zur Einführung von Deletionsmutationen in das asd-Gen (δ-asd) bei einer Reihe von Bakterienstämmen der Enterobacteriacea sowie ein Verfahren zur Isolierung der asd-Mutanten anderer Gramnegativer Bakterien und Mycobaterien beschrieben. Tabelle 1 enthält die zur Isolierung der asd-Mutanten und ihrer Derivate verwendeten Stämme E. coli K-12 und S. typhimurium LT- 2; die Asd&supmin;-Stämme sind dabei jeweils Beispiele für Stämme, die zur Konstruktion anderer Stämme unter Verwendung der Transposonstechniken, wie unten beschrieben, verwendet werden können. Asd&supmin;-Stämme werden auch in der US-PS 4 190 495 beschrieben. Tabelle 1 Bakterienstämme Stamm Nr. Elternstamm/Plasmid Relevanter Genotyp Ableitung A. Escherichia coli-Stämme prototroph supressorfrei Sammlung Curtiss B*/-NO&sub2;&submin;induzierte Asd&supmin;-Mutante von X2087 dam-3-Derivate von X2234 (H.G. Marinus) P. Leder unter Selektion auf Bibliothek Tabelle 1 (Fortsetzung 1) B. Salmonella typhimurium-Stämme prototroph suppressorfrei FAr Tcs Derate von X2981 Nanoil und Beckwitha unter Selektion auf Viera und Messingb Promega Biotech Sammlung Curtiss BNO&sub2;-induzierte Asd&supmin;-Mutante von X3000 Tabelle 1 (Fortsetzung 2) unter Selektion auf Palva und Liljestromd Derivat von AS68 (E.T.Palva Lysat von Bruce Stocker. unter nachfolgender Selektion gegen auxotrophe Marker (val, metE, metA) unter Verwendung von P22HTint (X3000) Tn10 95% verknüpft mit gyrA Tabelle 1 (Fortsetzung 3) unter Selektion auf Bibliothek Derivat von Tabelle 1 (Fortsetzung 4) unter Selektion auf Derivat von Curtiss und Kelly, vorgelegt) a (1985) Proc. Natl. Acaed. Sci. USA 82:8129 b (1982) Gene 19:259-268 c (1983) J. Bact. 156:471-474 d (1981) Mol. Gen. Genet. 181:153-157 e Da X3021 für P22 lysogen ist, wurde P22HTint, dem anfänglich Transduktanten von X3021 unter nachfolgender HV-Induktion (15 sec bei 5 l/m²) des Prophagen vermehrt. Das erhaltene Lysat wurde zur Transduktion von X3000 verwendet.
Die üblichen Mutagenese- und Mutantenanreichungsmethoden sind im Falle der Gewinnung von Asd-Mutanten nicht wirksam genug, da eine Mutante, die DAP erfordert, in Abwesenheit von DAP lysiert und abstirbt. Die vorgängig isolierten asd- Mutenten wurden daher indirekt und zufällig oder durch Brute-force-Screening unter Millionen potentieller Mutanten entdeckt. Die Erfindung umfaßt ein wirksames Verfahren für die selektive Anreicherung und Isolierung von asd-Mutanten.
In einem synthetischen Nährmedium erfordern die asd-Mutanten L-Methionin, L-Threonin und DAP für ihr Wachstum. Die Forderung nach L-Methionin und L-Threonin wird durch Homoserin abgedeckt, das einen üblichen Precursor sowohl für Methionin als auch für Threonin darstellt (siehe Fig. 1). Die Mutagenese eines E. coli- oder S. typhimurium-Stammes unter nachfolgender Ampicillin-Cycloserin-Behandlung für die Anreicherung auxotropher Mutanten läßt selten, wenn überhaupt, Mutanten mit einer einzigen Forderung für Homoserin gewinnen. Curtiss et al. (1965) beschreiben ein Verfahren zur Anreicherung mit Cycloserin für die Selektion von auxotrophen Mutanten sowie eine Modifikation dieses Verfahrens ebenfalls unter Verwendung von Ampicillin in den Beispielen. Der Grund dafür, daß Homoserin erfordernde auxotrophe Mutanten selten isoliert werden, liegt darin, daß der ß-Asparaginsäuresemialdehyd von einer der beiden in zwei Genen kodierten Dehydrogenasen in Homoserin umgewandelt wird. Die Wahrscheinlichkeit der Inaktivierung beider Gene in einer einzigen Zelle ist äußerst gering, weshalb die Homoserin erfordernden auxotrophen Mutanten nicht durch Techniken des Random-Screening nachgewiesen zu werden brauchen.
Dieses Problem wird durch die Entdeckung gelöst, daß die Aufnahme von DAP in sämtliche Nährmedien während der Mutagenese sowie die Anreicherung oder Selektion unter Verwendung der Ampicillin-Cycloserin-Technik zur Gewinnung von asd- Mutanten führt, die sowohl Homoserin als auch DAP erforderlich machen. Sowohl Ampicillin als auch Cycloserin inhibieren die Zellwandsynthese in wachsenden, zur Proteinsynthese befähigten Zellen, üben Jedoch keinerlei Wirkung aus auf auxotrophe Mutanten, die aufgrund der fehlenden Nährstoffansprüche zur Proteinsynthese nicht befähigt sind. Die asd- Mutantenstämme Chi3008 und Chi2108 (siehe Tabelle 1), die jeweils Stämme von S. typhimurium und E. coli darstellen, wurden unter Einsatz dieses Verfahrens isoliert. Der Asd&supmin;- Phänotyp von Chi3008 beruht auf einer Punktmutation im asd- Gen, weshalb die Frequenz der Rückverwandlung in Asd&spplus; ziemlich hoch ist. Andererseits ergibt sich der Asd&supmin;-Phänotyp von Chi2108 aus der Deletion im asd-Gen, weshalb hier die Reversionsfrequenz ziemlich gering ist.
Mutationen des asd-Gens, insbesondere die wünschenswerten Deletionsmutationen aufweisenden Stämme, können unter Einsatz von Transposonstechniken erzeugt werden. Die Transposone können einem Bakterienchromosom an vielen Stellen zugefügt werden. Die Merkmale der Transposonsinsertion und -deletion sind bei Kleckner (1977) zusammengefaßt. So z.B. kann das Transposon Tn10, das Tetracyclinbeständigkeit (und Empfindlichkeit gegenüber Fusarsäure) verleiht, zur Erzeugung von delta-asd-Mutanten bei einer Vielzahl von Bakterienarten, einschließlich z.B. E. coli und S. typhimurium, verwendet werden.
Ein Verfahren zur Erzeugung von delta-asd-Mutanten bei E. coli und S. typhimurium wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Dabei wird zuerst in den Bakterienchromosomen unter Verwendung eines geeigneten Transposonsvektors, wie z.B. von λ-NK561 bei E. coli (Kleckner et al. (1977)) zusammen mit einem λ-empfindlichen Stamm von S. typhimurium, wofür exemplarisch Chi3324 (s. Tabelle 1) steht, eine Bibliothek von Random-Tn10-Insertionen erzeugt. Ein geeigneter transduzierender Phage, wie z.B. P1L4 im Falle von E. coli oder P22HT im Falle von S. typhimurium, die auf der Tn10- Bibliothek in entsprechenden Spezies vermehrt wurden, wird zur Transduktion der Asd&supmin;-Mutanten dieser Spezies verwendet, wonach einen Asd&spplus;-Tc&supmin;-Phänotyp enthaltende Bakterien selektiert werden. Beispiele für verwendbare asd&supmin;-Stämme sind der E. coli-Stamm Chi2108 und der S. typhimurium-Stamm Chi3008 (s. Tabelle 1). Da Einzelereignisse wahrscheinlicher sind als Doppelereignisse, haben die meisten transduzierenden Stämme, wie z.B. Chi2978 und Chi3013 (s. Tabelle 1) das Tn10 eng verknüpft mit dem asd-Gen. Durch Selektion auf Fusarsäureresistenz als Ergebnis der Deletion des Tn10 und der benachbarten DNA-Sequenzen erhält man delta-asd-Mutanten, bei denen sämtliche Anteile des damit eng verknüpften asd- Gens oder ein Teil davon der Deletion unterlagen. Die deltaasdA1-Mutation im S. typhimurium-Stamm Chi3021 wurde auf diese Weise aus Chi3013 isoliert (s. Tabelle 1).
Deletionsmutationen wurden auch unter Verwendung von Techniken der rekombinanten DNA im Bakterienchromosom durchgeführt. So z.B. wurde das asd-Gen von S. typhimurium in pUC18 geklont, wodurch man pYA272 erhielt, wonach durch eine Transposonsmutagenese eine Subklonierung durchgeführt wurde, um das Ausmaß des S. typhimurium-asd-Gens in pYA275 zu begrenzen (s. Figur 14). Ausgehend von dieser Information kann das asd-Gen aus pYA272 durch Deletion entfernt werden, wonach das abgeleitete Plasmid in einen asd&spplus;-S. typhimurium- Stamm eingeführt wird, um eine homologe Rekombination zu ermöglichen, was zu Zellen führt, welche sowohl im Chromosom als auch im Plasmid die gentechnisch veränderte δ-delta-asd- Mutation enthält. Die Züchtung erfolgt bei erhöhten Temperaturen, wie z.B. bei 43ºC, in Anwesenheit geringer Konzentrationen an Novobiocin, wonach auf einem antibiotikafreien Medium plattiert wird und dann auf ein Ampicillin enthaltendes Medium replikaplattiert wird, um die Klone zu identifizieren, die das rekombinante Plasmid verloren haben, welches von pUC18 abgeleitet ist, das Ampicillinresistenz verleiht.
Nach der Isolierung und Kennzeichnung einer Deletionsmutante kann es von Vorteil sein, angrenzend an die Deletion ein Tn10 anzufügen, so daß die Deletion dann in andere Stämme übertragen werden kann. So z.B. kann die zhf-2:: Tn10-Insertion im E. coli-K-12-Stamm Chi6096 (s. Tabelle 1) unter Verwendung der für P1L4 üblichen Tansduktionsverfahren transduziert werden, um das Transposon in eine große Zahl verschiedener Bakterienstämme und -arten einzubauen, die mit dem durch einen breiten Wirtsbereich generalisierten transduzierenden Phagen P1L4 transduzierbar sind. Da Tetracyclinresistenz mit Fusarsäuresensibilität verbunden ist, kann man ein P1L4-Lysat, das auf einem eine δ-asd-Mutation, wie z.B. Chi2984 (s. Tabelle 1) aufweisenden Stamm gezüchtet wurde, verwenden und jeden Empfängerstamm mit zhf-2::Tn10 transduzieren und nachfolgend auf Fusarsäureresistenz selektieren. In diesem Fall ersetzt die δ-asd-Mutation das zhf-2::Tn10. Zeigt der Empfängerstamm ein anderes Restriktionsverhalten als E.coli K-12, kann diese Barriere durch einen kurzen Hitzeschock des Empfängerstammes, z.B. während 5 bis 10 Minuten bei 45 bis 50ºC beseitigt werden.
Eines analogen Verfahrens kann man sich bei der Isolierung von δ-asd-Mutanten von verschiedenen Stämmen von S. typhimurium bedienen. Der generalisierte transduzierende Phage P22HT int kann auf Stämmen, wie z.B. Chi3013, Chi3536 oder Chi3537 gezüchtet werden, die jeweils zhf-1::Tn10, zhf- 4::Tn10 und zhf-3::Tn10 besitzen (s. Tabelle 1). Der das Transposon tragende Phage wird dann zur Transduktion weiterer geeigneter Empfängerstämme für Tetracyclinresistenz verwendet. Ein P22HT int-Lysat, das man erhält durch Vermehrung des Phagen auf einem Bakterienstamm, der eine δ-asd- Mutation, z.B. Chi3021 oder Chi3628, aufweist, wird dann zur Transduktion eines eine zhf::Tn10-Insertion aufweisenden Stammes verwendet. Danach werden die fusarsäureresistenten Mutanten selektiert. Ähnlich wie bei E. coli ersetzt auch hier die δ-asd-Mutation das inserierte Tn10.
Es ist darauf hinzuweisen, daß die Transduktion zur Insertion von δ-asd-Mutationen als Ersatz für eine zhf::Tn10- Insertion unter Selektion des erwünschten transduzierenden Phagen durch seine Fusarsäureresistenz bei einer Frequenz von 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;&sup5; abläuft, wohingegen der spontane Verlust des Tn10-Inserts durch eine Mutation vom Deletionstyp bei einer Frequenz von ca. 10&supmin;&sup8; abläuft. Der Einsatz der Transduktion mit einem ein δ-asd-Gen aufweisenden Phagen bei der Konstruktion der erwünschten Stämme gewährleistet den richtigen Genotyp bei sehr geringer Wahrscheinlichkeit einer Gewinnung neuer Deletionsmutanten.
Viele Salmonella-Stämme sind mit dem Phagen P22 nicht transduzibel. Zwei der mit dem asd-Gen verknüpften Tn10-Insertionen, nämlich die δ-asdA13-Mutation und die δ-asdA4-Mutation, die mit dem zhf-4::Tn10 verknüpft ist, wurden in eine galE- Mutation aufweisende Salmonellastämme eingebaut. Werden diese Stämme, und zwar Chi3629, Chi3638, Chi3630 und Chi3656, in Anwesenheit von Galactose gezüchtet, zeigen sie einen normalen glatten Liposaccharidbelag (LPS) und sind P22-sensibel. Wurde Jedoch in Abwesenheit von Galactose gezüchtet, zeigten die Zellen einen rauhen Belag, wobei LPS- Seitenketten fehlten; die in Abwesenheit von Galactose gezüchteten Zellen waren mit P1L4 infizierbar. Dieses kann auf Chi3629 gezüchtet werden (s. Tabelle 1) und das Lysat kann zur Transduktion eines P1L4-sensiblen Stammes verwendet werden, der sich aus einer zhf-3::Tn10-Insertion in den Stamm ergibt. P1L4 wird auf Chi3630 vermehrt, der die δ- asdA13-Mutation aufweist und wird zur Transduktion des Tn10 aufweisenden Stammes verwendet. Es wurden dann die fusarsäureresistenten Zellen selektiert. Das Ergebnis ist der Einbau der δ-asdA13-Mutation in eine neue Salmonellaart. P1L4 kann aber auch auf Chi3656 vermehrt werden, wonach ein geeigneter Empfänger in Anwesenheit von DAP auf Tcr transduziert wurde.
Auf diese Weise kann die δ-asdA4-Mutation erblich mit zhf4::Tn10 verknüpft werden. Das zhf-4::Tn10 kann dann durch Transduktion mit auf Chi3385 gezüchtetem P1L4 entfernt werden (s. Tabelle 1) und zur Transduktion auf Tcs durch Selektion auf Fusarsäureresistenz verwendet werden.
Ist die Transduktion einer der zugänglichen asd-Deletionsmutationen in eine Art oder einen Stamm der Wahl nicht durchführbar oder möglich, dann kann die oben beschriebenen Strategie für die Isolierung der asd-Mutanten angewandt werden. Ein Bakterienstamm wird dabei mutagenisiert, wonach die Mutantenanreicherung erfolgt und die Selektion in Anwesenheit von DAP auf selektiv isolierte Mutanten erfolgt, die zur Homoserinsynthese nicht befähigt sind. Nach Erzielung einer asd-Mutation wird die Reversionsfrequenz der Mutante ermittelt. Ist eine Deletionsmutation erwünscht, kann dies auf verschiedene bekannte Weise erfolgen, am einfachsten jedoch durch Einführung einer Tn10-Transposonsbibliothek durch Transduktion und Selektion auf gleichzeitig vorliegenden Asd&spplus;- und Tcr-Phänotyp. Im allgemeinen ist das Tn10 eng mit dem asd-Gen verknüpft, und werden fusarsäureresistenzte Isolate selektiert, führt die Deletion des Tn10 und der angrenzenden DNA im asd-Gen zu einer asd-Deletionsmutation. Läßt das Tn10-Verfahren keine Ergebnisse in einer Bakterienart erzielen, kann zur Herstellung der Verknüpfung mit dem asd-Gen ein anderes Transposon verwendet werden; die zugänglichen Transposone sind bekannt (s. Bukhari et al.). Der Transposon-asd-Gen-Komplex kann unter Verwendung bekannter gentechnischer Methoden kloniert werden. Es kann dabei durch genaue Deletion des asd-Gens ein rekombinantes Produkt erzeugt werden. Nach der Deletion wird dann das asd-Gen, wie oben beschrieben, wieder in den Wildtyp-Bakterienstamm zurückgeführt.
Ein weiteres Merkmal der erfindungsgemäßen Wirtszellen besteht darin, daß sie mit einem zwei Gene kodierenden rekombinanten Polynucleotidkonstrukt transformiert werden. Das erste rekombinante Gen kodiert ein Polypeptid, das funktionell die enzymatische Aktivität des inaktiven nativen Gens ersetzt. So z.B. kann eine Asd-E. coli-Zelle mit einem rekombinanten Polynukleidkonstrukt, welches das asd-Gen aus S. mutans kodiert, transformiert werden. Die Tatsache, daß das S. mutans asd-Genprodukt funktionell das E. coli-Genprodukt ersetzt, wurde von Curtiss et al. (1982) beschrieben. Außerdem illustriert das S. mutans-Gen noch eine weitere Eigenschaft, die für das erste rekombinante Gen erforderlich ist, d.h. nämlich, daß es normalerweise mit dem E. coli-Gen nicht rekombiniert, und zwar aufgrund der fehlenden Sequenzhomologie. Die S. mutans-asd-Gensequenz und das Fehlen der Homologie gegenüber der E. coli-Sequenz wurden von Cardineau und Curtiss (1987) beschrieben. Dieses Fehlen der Rekombination zwischen dem Wirtszellgenen und dem rekombinanten Gen ist erforderlich für die Aufrechterhaltung des damit verbundenen selektiven Drucks für das zweite rekombinante Gen. Man kann jedoch auch ein aus dem erwünschten Empfängerstamm kloniertes asd-Gen verwenden, vorausgesetzt, daß der Empfängerwirt einen Teil oder die Gesamtheit der Nucleotidsequenz des asd&spplus;-Gens und/oder die flankierenden Sequenzen aufweist, die so durch Deletion erhalten wurden, daß eine Doppel-Crossover-Rekombination mit dem klonierten asd-Gen im Vektor nicht möglich ist. Beispiele dafür sind die Verwendung des asd-Gens von S. typhimurium, wie es im Vektor pYA292 und in einer Vielzahl von E. coli- und/oder S. typhimurium-Stämmen mit δ-asd-Stämmen enthalten ist, die sämtlicher in pYA292 enthaltener Nucleotidsequenzen entbehren, sowie ein System, bei dem die Deletion nur teilweise das asd-Strukturgen umfaßt, sich jedoch in die flankierenden Regionen erstreckt. Weitere Beispiele für Gene, welche eine asd-Mutation komplementieren können, sind bekannt und umfassen z.B. das asd-Gen aus B. lactofermentum (Marquez et al. (1985)). Die Konstruktion von das asd-Gen aus S. mutans enthaltenden Vektoren, die zur Transformation von asd&supmin;-Stämmen von E. coli und S. typhimurium verwendet werden können, werden in den nachfolgenden Beispielen illustriert und umfassen pYA248 und pYLA292. Tabelle 1 enthält eine Zusammenstellung der Bakterienstämme und Tabelle 2 (in Beispiel 10) der Stämme und Plasmide für die Plasmidkonstruktion.
Das zweite rekombinante Gen in der Polynucleotidsequenz kodiert das Gen eines erwünschten Polypeptids, wie z.B. ein Viren- oder Bakterien- oder Pilz- oder Parasitenantigen, ein industriell erwünschtes Enzym oder Polypeptid usw., dessen Expression von einer mit dem ersten Gen verknüpften Kontrollsequenz abhängen kann. Diese Verknüpfung kann das Ergebnis der Ausrichtung der beiden Gene im Vektor sein, so daß z.B. beide Gene unter der Kontrolle derselben Kontrollelemente, wie z.B. desselben Promotors und desselben Operators stehen können. Methoden für die Konstruktion von Vektoren mit diesen Eigenschaften sind für die Technik der DNA- Rekombination bekannt und werden im nachfolgenden Abschnitt über die Vakzinen eingehender besprochen. Beispiele für Vektoren, bei denen das zweite Gen β-Galactosidase, Surface- Protein-Antigen A (SpaA) von S. mutans und Antigene aus M. leprae kodiert, werden im Beispielteil angeführt. Dieser umfaßt auch die Expressionsvektoren, welche das asd-Gen von S. mutans oder S. typhimurium enthalten, die geeignet sind für die Komplementierung des Asd&supmin;-Phänotyps bei S. typhimurium und E. coli.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszellen für die Herstellung von erwünschten Polypeptiden. Die Zellzüchtungsbedingungen hängen dabei von Gattung und Stamm der jeweils ausgewählten Wirtszelle ab. Die Zellen werden Jedoch in einem Medium gezüchtet, in dem der Verlust des rekombinanten Gens, dessen Produkte das fehlende Enzym für die Zellwandproduktion funktionell komplementieren, Zellyse verursacht. Ist z.B. die Wirtszelle eine asd&supmin;-Mutante von E. coli oder S. typhimurium, werden die Zellen, welche das rekombinante asd-Gen enthalten, das operabel mit dem zweiten rekombinanten Gen verknüpft ist, in einem Medium gezüchtet, das kein DAP aufweist, jedoch Homoserin oder Threonin und Methionin enthält. Der Verlust des rekombinanten asd-Gens bewirkt eine Rückumwandlung in den DAP&supmin;-Phänotyp und eine fortgesetzte Züchtung in Abwesenheit von DAP verursacht Zellyse.
Eine weitere Ausführungsform betrifft die Verwendung als für die Freisetzung in die Umwelt bestimmte Bakterien zur Erzeugung von Pestiziden, Fungiziden usw. sowie zum Abbau toxischer Schadstoffe, wobei die rekombinanten Gene, welche das Pestizid, Fungizid oder das (die) den toxischen Abfallstoff abbauende(n) Enzym(e) bestimmen, mit einem rekombinanten Gen verknüpft sind, dessen Produkt eine Mutation des Bakteriums, welches die Abwesenheit eines für die Zellwandproduktion essentiellen Enzyms verursacht, funktionell komplementiert. Da dies ein ausgewogenes lethales Konstrukt bildet, überleben und reproduzieren sich nur die das gewünschte Merkmal exprimierenden Bakterien, was eine fortgesetzte Produktion des Pestizids, Fungizids usw. oder des den toxischen Abfallstoff abbauenden Enzyms garantiert.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung der Konstruktion der ausgewogenen lethalen Anordnungen einer Mutation im Chromosom bei der Blockierung der Synthese einer einzigen essentiellen Zellwandkomponente mit einem nichthomologen Wildtyp-Gen, welches den Mangel komplementiert und mit einem Gen verknüpft ist, welches die Herstellung eines für Medizin, Technik oder Landwirtschaft wertvollen Produktes bestimmt. In diesen Fällen wird das ausgewogene lethale Konstrukt unter Einsatz der Fermentationstechnik am wahrscheinlichsten gezüchtet.
Die erfindungsgemäßen Wirtszellen sind außerdem geeignet als Komponenten für Lebendvakzinen, bei denen das zweite rekombinante Gen das Antigen eines Mittels zur Bekämpfung einer Pilz-, Bakterien-, Parasiten- oder Viruserkrankung kodiert. Lebendvakzinen sind besonders für jene Fälle geeignet, in denen eine lokale Immunität entscheidend ist und diese eine erste Verteidigungslinie abgeben kann. In diesem Fall ist es jedoch wichtig, daß die Wirtszellen für das impfende Individuum, nicht pathogen ist. Beispiele für Zellen, aus denen geeignete Wirtszellen durch Insertion, wie z.B. durch asd- Mutation und nachfolgende Transformation durch ein die beiden oben beschriebenen rekombinanten Gene enthaltendes Polynucleotid gewonnen werden können, sind die von Curtiss und Kelly (1987) beschriebenen δ-cya-δ-crp-Mutanten.
Sind die Mikroben z.B. durch Einbau der δ-cya-δ-crp-Mutationen einmal avirulent geworden, kommen sie als immunogene Komponente einer Vakzine zur Induzierung der Immunität gegen die Mikrobe in Frage. Somit kann erfindungsgemäß jede Mikrobe verwendet werden, welche die oben beschriebenen Eigenschaften der Wirtszellen einschließlich der Nichtpathogenität aufweisen, wie z.B. die Mikroben der Gattung Salmonella, E. coli-S. typhimurium-Hybriden, sowie Mikroben der Gattungen Shigella, Yersinia, Pasteurella, Legionella oder Brucella, wobei jedoch die Erfindung nicht auf diese Mikroben beschränkt ist. Bevorzugt werden als Mikroben Vertreter der Gattung Salmonella, wie z.B. S. typhimurium, S. typhi, S. paratyphi, Se gallinarum, S. enteritidis, S. choleraesius, S. arizona oder S. dublin verwendet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das avirulente Derivat einer pathogenen Mikrobe, das auch als Trägerbakterium bezeichnet wird, dazu verwendet werden, ausgewählte Antigene gegenüber den GALT-Zellen, wie z.B. den Peyer-Haufen des Dickdarms zu liefern. Einige Bakteriengattungen, wie z.B. Salmonella, sind dafür bekannt, daß sie in den Peyer-Haufen siedeln (Carter, P.B. und F.M. Collins, J. Exp. Med. 139:1189 (1974)). S. typhimurium-E. coli-Hybride besiedeln auch die Peyer-Haufen von Mäusen (Nohmann, A.W., et al. Infect. und Immun. 22:763 (1978)). Enthalten und exprimieren diese Trägerbakterien ein rekombinantes Gen aus einem pathogenen Organismus, werden Antikörper gegen das vom pathogenen Organismus produzierte Antigenprodukt erzeugt. Dank der Techniken der rekombinanten DNA ist es nun möglich geworden, völlig einzigartige Vakzinen zu entwickeln, bei denen spezifische Antigene nicht durch das ätiologische Agens erzeugt werden, sondern durch einen anderen zur Exprimierung des Gens für dieses Antigen befähigten Bakterien- Wirtsstamm. Außerdem ist es möglich, sich der Techniken der rekombinanten DNA zu bedienen, für den Fall daß Antigene mit einem Antigen des Säugerwirts eine Kreuzreaktion eingehen und damit die Induzierung der Autoimmunität verstärken könnten, um das Gen so abzuändern, daß die einwirkende Kreuzreaktion-Antigendeterminante nicht erzeugt wird. Der Techniken der DNA-Rekombinante kann man sich somit bedienen, um Vakzinen zu erzeugen, die keinen Stoff enthalten, der zur Kreuzreaktion mit Vertebraten-Wirtsantigenen oder zur Auslösung eines autoimmunen Zustandes befähigt wäre.
Es ist offensichtlich, daß die vorliegende Erfindung in großem Umfang auf die Entwicklung wirksamer Vakzinen gegen Bakterien-, Pilz-, Parasiten- oder Viruserkrankungen auslösende Agenzien, in denen eine lokale Immunität entscheidend ist und diese eine erste Verteidigungslinie abgeben kann, anwendbar ist. Einige Beispiele dafür sind Vakzinen für die Bekämpfung der Lungenpest, verursacht durch Yersinia pestis, von Gonorrhoe, verursacht durch Neisseria gonorrhoeae, von Syphilis, verursacht durch Treponema pallidum, und von Geschlechtskrankheiten sowie von Augeninfektionen, verursacht durch Chlamydia trachomatis. Streptokokkenarten der Gruppe A und B, wie z.B. Arten, die schmerzhafte Hals- und Herzerkrankungen hervorrufen, wie z.B. Neisseria meningitidis, Mycoplasma pneumoniae, Hemophilus influenza, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Bordetella avium, Escherichia coli, Streptococcus equi, Streptococcus pneumoniae, Brucella abortus, Pasteurella hemolytica, Vibrio cholera, Shigella sp. und Legionella pneumophila sind weitere Beispiele für erfindungsgemäß in Frage kommende Bakterien, aus denen Gene erhalten werden können. Virusvakzinen, wie sie z.B. gegen Influenzaviren erzeugt werden, werden von der Erfindung ebenfalls umfaßt. Virusvakzinen können auch gegen andere Viren, seien es nun DNA- oder RNA-Viren, wie z.B. den Klassen der Papo-, Adeno-, Herpes-, Pox-, Parvo-, Reo-, Picorna-, Myxo-, Paramyxo- oder Retroviren erzeugt werden. Vakzinen zum Schutz vor Infektionen durch pathogene Pilze, Protozoen und Parasiten werden ebenfalls von der Erfindung umfaßt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, bei der die immunogene Komponente der Vakzine ein Allergen des Wirts ist, kann eine Vakzine für die spezifische Desensibilisierung eines allergischen Wirts ("exposure regimen") verwendet werden.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Vakzine für die Immunisierung eines Vertebraten, die ein lebendes avirulentes Derivat einer pathogenen Mikrobe umfaßt, wobei dieses Derivat praktisch unfähig ist, funktionelle Adenylatcyclase und ein AMP-Rezeptorprotein zu erzeugen, jedoch ein rekombinantes Gen zu exprimieren vermag, das aus einem Organismus erhalten wird, der für das betreffende Tier pathogen ist oder ein Allergen für dieses Tier produziert.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft avirulente Mikroben, die als Vektoren für die Synthese verschiedener Wirtsproteine verwendet werden können. Da die erfindungsgemäßen avirulenten Mikroben eine Vielzahl immunokompetenter Strukturen einschließlich GALT-Gewebe, mesenterische Lymphknoten und Milz nach ihrer Einführung in den Wirt zu durchdringen vermögen, werden sie als Target für eine Vielzahl immunoregulatorischer Produkte verwendet. Ein oder mehrere immunoregulatorische Proteine oder Peptide kodierende Gene können somit auf dem Wege der Rekombination in die avirulenten Mikroben eingeführt werden, so daß die Mikroben nach ihrer Aufnahme in das geeignete immunokompetente Gewebe in der Lage sind, das rekombinante Produkt zu exprimieren, um die Immunreaktion im Wirt zu unterdrücken, zu verstärken oder abzuändern. Beispiele für immunoregulatorische Moleküle, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, sind Koloniebildung stimulierende Faktoren (Makrophagen, Granulozyten oder Gemische davon), Makrophagenchemotoxin, Makrophageninhibierungsfaktor, Leukozyteninhibierungsfaktoren, Lymphotoxine, Blastogenfaktor, Interferon und Interleukine.
Jeder der in den einzelnen Ausführungsformen der Erfindung genannten Ausdrücke wird nachfolgend näher erläutert:
Unter einer "Vakzine" versteht man ein Agens, das zur Stimulierung des Immunsystems eines Lebewesens verwendet wird, um auf diese Weise den Schutz vor einer künftigen Schädigung zu gewährleisten. Der Ausdruck "Immunisierung" bedeutet das Verfahren zur Induzierung eines fortgesetzt hohen Niveaus an Antikörpern und/oder einer Zellimmunreaktion, bei der die T- Lymphozyten das Pathogen entweder abtöten und/oder andere Zellen, z.B. Phagozyten, aktivieren, wie z.B. in einem Organismus, wo dies gegen ein Pathogen oder ein Antigen gerichtet ist, dem der Organismus zuvor ausgesetzt war. Obwohl der Ausdruck "Immunsystem" Reaktionen von Einzellern auf die Anwesenheit von Fremdkörpern, z.B. die Interferonproduktion, auch umfassen kann, ist er in der vorliegenden Anmeldung auf die anatomischen Merkmale und Mechanismen beschränkt, durch die ein mehrzelliger Organismus Antikörper gegen ein Antigenmaterial erzeugt, das in die Zellen des Organismus oder seine extrazelluläre Flüssigkeit eindringt. Der auf diese Weise erzeugte Antikörper kann zu einer beliebigen immunologischen Klasse gehören, wie z.B. zu den Immunoglobulinen A, D, E, G oder M. Von besonderem Interesse sind Vakzinen, welche die Produktion von Immunoglobulin A (IgA) stimulieren, da dies das vom sekretorischen System der Warmblüter erzeugte Hauptimmunoglobulin ist, obwohl die erfindungsgemäßen Vakzinen nicht auf jene beschränkt sind, welche die IgA-Produktion stimulieren. So z.B. können Vakzinen von der oben beschriebenen Art in ähnlicher Weise auch zur Erzeugung eines breiten Bereichs von anderen Immunreaktionen zusätzlich zur IgA-Bildung, wie z.B. der Zell- und Humoralimmunität verwendet werden. Die Immunreaktion auf Antigene ist gut erforscht und wird häufig beschrieben. Eine Übersicht über die Immunologie geben Barrett, James T., Textbook of Immunology: Fourth Edition, C.V. Mosby Co., St. Louis, MO (1983).
Unter einem "Vertebraten" versteht man einen Vertreter des Unterstammes der Vertebrata, des wichtigesten Typs des Stammes der Chordaten, der die Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel und Säuger umfaßt, die alle durch eine gegliederte knöcherne bzw. knorpelige Wirbelsäule gekennzeichnet sind. Sämtliche Vertebraten haben ein funktionelles Immunsystem und reagieren auf Antigene durch Erzeugung von Antikörpern. Sämtliche Vertebraten sind somit befähigt, auf Vakzinen zu reagieren. Obwohl Vakzinen meist Säugern verabreicht werden, wie z.B. den Menschen oder Hunden (Tollwutvakzine), werden von der Erfindung auch Vakzinen für Nutztiere darstellende Vertebraten aus anderen Klassen, wie z.B. Fische und Vögel, wenn sie von der oben beschriebenen Art sind, mitumfaßt.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung eines avirulenten Derivats einer pathogenen Mikrobe, die in GALT- oder BALT-Zellen siedelt, als Träger des Genprodukts, das zur Stimulierung der Antikörperreaktion auf ein Pathogen oder Allergen verwendet wird. Der Ausdruck "avirulent" bedeutet nicht, daß eine Mikrobe einer bestimmten Gattung oder Art überhaupt nicht als Pathogen zu fungieren vermag, sondern daß die konkrete Mikrobe in bezug auf das konkrete zu behandelnde Tier avirulent ist. Die Mikrobe kann zu einer Gattung oder sogar zu einer Art gehören, die gewöhnlich pathogen ist, muß jedoch einem Stamm angehören, der avirulent ist. Unter dem Ausdruck "Pathogen" versteht man Mikroorganismen, welche Krankheiten hervorrufen oder die normalen physiologischen Funktionen zu beeinträchtigen vermögen. Avirulente Stämme sind nicht in der Lage, die ganze Gruppe von Krankheitsymptomen, die gewöhnlich mit seinem virulenten pathogenen Gegenstück verbunden sind, zu induzieren. Unter dem Ausdruck "Mikroben" versteht man hier Bakterien, Protozoen und einzellige Pilze.
Die Techniken der Übertragung von genetischem Material von einem ersten Organismus auf einen zweiten, der gewöhnlich mit dem ersten nicht sein genetisches Material austauscht, haben in letzter Zeit breite Anwendung gefunden und sind das Ergebnis der sich rasch ausbreitenden Technik der DNA-Rekom bination. In der vorliegenden Anmeldung wird das genetische Material, das von einem Organismus in einen anderen auf eine Weise übertragen wird, daß die Reproduktion des zweiten Organismus Abkömmlinge entstehen läßt, welche dasselbe genetische Material enthalten, als "rekombinantes Gen" bezeichnet. Der Ausdruck "Gen" wird hier in seiner breitesten Bedeutung verwendet und steht für jede biologische Vererbungseinheit. Es ist nicht notwendig, daß das rekombinante Gen ein vollständiges Gen darstellt, wie es im elterlichen Organismus vorliegt, das zur Erzeugung oder Regulierung der Produktion eines Makromoleküls, wie z.B. eines funktionierenden Polypeptids, befähigt war. Erforderlich ist nur, daß das Gen als Matrize im Sinne einer Leitlinie bei der Erzeugung eines antigenen Produkts zu fungieren vermag. Das Produkt kann von einer Art sein, wie man sie in genau dieser Form im elterlichen Organismus nicht vorgefunden wurde. Ein ein Polypeptidantigen mit 100 Aminosäureresten kodierendes funktionelles Gen kann z.B. als Teil auf eine Trägermikrobe so übertragen werden, daß durch den zellulären Mechanismus der Wirtszelle ein Peptid aus lediglich 75, ja sogar nur 10 Aminosäureresten erzeugt wird. Ist dieses Genprodukt jedoch ein Antigen, welches die Bildung von Antikörpern gegen ein ähnliches Antigen im elterlichen Organismus auslöst, liegt dieses Gen innerhalb des Bedeutungsumfangs des Ausdrucks "Gen", wie er erfindungsgemäß definiert wird. Andererseits kann, falls die Aminosäuresequenz eines konkreten Antigens oder Fragments davon bekannt ist, das DNA-Fragment oder -Analogon davon mit Hilfe automatisierter Gensynthesizer oder ähnlichen Vorrichtungen chemisch synthetisiert und diese DNA-Sequenz in einem geeigneten Expressionsvektor eingebaut werden. Am anderen Ende des Spektrums liegt ein langer DNA-Abschnitt, der mehrere Gen-Produkte kodiert, von denen eines oder alle Antigencharakter haben können. Ein Gen, wie es hier beansprucht wird, wird daher definiert als eine beliebige Vererbungseinheit, die zur Produktion eines Antigens befähigt ist. Das Gen kann dabei aus Chromosomen, Plasmiden oder Viren stammen.
Damit das Gen eine Immunreaktion wirksam auslöst, muß es exprimiert werden. Der Ausdruck "Expression eines Gens" bedeutet, daß die der Struktur des Gens (die Sequenz der DNA-Basen) innewohnende Information in ein physikalisches Produkt in Form eines RNA-Moleküls, eines Polypeptids oder eines anderen biologischen Moleküls durch den biochemischen Mechanismus der Zelle, in der das Gen lokalisiert ist, umgewandelt wird. Das auf diese Weise erzeugte biologische Molekül wird als Genprodukt bezeichnet. Der Ausdruck "Genprodukt", wie er hier verwendet wird, bedeutet ein beliebiges biologisches Produkt bzw. biologische Produkte, die erzeugt werden durch biochemische Reaktionen, die unter der Kontrolle eines Gens ablaufen. Das Genprodukt kann z.B. ein RNA-Molekül, ein Peptid oder ein unter der Kontrolle eines Enzyms erzeugtes Produkt oder ein anderes Molekül sein, welches das Ausgangsprodukt des Gens, d.h. ein Stoffwechselprodukt darstellt. So z.B. kann ein Gen zuerst die Synthese eines RNA-Moleküls steuern, das dann unter der Wirkung von Ribosomen in ein Enzym übersetzt wird, welches die Bildung von Glycanen im Medium, das die ursprüngliche Zelle, in der das Gen gefunden wurde, umgibt, steuert. Das RNA-Molekül, das Enzym und das Glycan fallen zur Gänze unter den Begriff "Genprodukte". Alle diese Genprodukte und viele andere derartige Genprodukte, wie z.B. Glycoproteine und Polysaccharide, wirken, wenn sie dem Immunsystem eines Tiers zugeführt werden, als Antigene. Für die Verwendung als Antigene in Vakzinen sind Glycoproteine und Lipoproteine enthaltende Proteingenprodukte die bevorzugten Genprodukte.
Damit eine Vakzine Antikörper wirksam zu produzieren vermag, muß das Antigenmaterial auf eine Weise freigesetzt werden, daß der Antikörper produzierende Mechanismus des geimpften Tiers zur Wirkung gelangt. Deshalb muß der Mikrobenträger des Genprodukts dem Tier zugeführt werden. Zur Stimulierung einer bevorzugten Reaktion der GALT- oder BALT-Zellen, wie sie oben beschrieben wurde, wird die Einführung der Mikrobe bzw. des Genprodukts unmittelbar in den Darm bzw. den Bronchus bevorzugt, wie z.B. durch orale Verabreichung, Magenintubation oder in Form von Aerosolen, obwohl auch andere Verfahren zur Verabreichung der Vakzine, wie z.B. in- travenöse, intramuskuläre, subkutane Injektion oder intremammäre, intrapeniale oder vaginale Verabreichung möglich sind.
Wird als Trägermikrobe die avirulente Mikrobe verwendet, und liegt diese einmal im Tier vor, muß das Antigen dem Immunsystem des Tiers zugänglich sein. Dies kann z.B. dann der Fall sein, wenn die Trägermikrobe abstirbt, so daß die Antigenmoleküle freigesetzt werden. Natürlich ist auch die Verwendung der "lecken" avirulenten Mutanten, welche den Inhalt des Periplasmas ohne Lyse freisetzen, auch möglich. Als Alternative kann ein Gen ausgewählt werden, welches die Produktion eines Gens steuert, was durch die Trägerzelle über das umgebende Medium vor dem Absterben der Zelle erfolgen kann.
Die Verwendung des avirulenten Stammes mit den asd-Mutationen und dem gelegentlichen Verlust des Asd&spplus;-Klonierungsvektors ermöglicht die Lyse von ca. 1% der Bakterien während jeder Generation (siehe die Beispiele) zur Freisetzung des Zellinhalts, um damit eine Immunreaktion gegen den freigesetzten Zellinhalt einschließlich Koloniebildung und Virulenzantigene zu stimulieren.
Die Verwendung von pathogenen Organismen zur Bereitstellung von Antigenen aus anderen Pathogenen gegenüber dem GALT- oder BALT-Gewebe wäre ungeeignet, wäre es nicht möglich, derartige Pathogene unter Beibehaltung der Fähigkeit zur Invasion von Peyer-Haufen oder von BALT-Geweben avirulent zu machen.
Der Organismus, aus dem das rekombinante Gen gewonnen wird, kann ein Pathogen des zu impfenden Tiers oder ein Organismus sein, der ein Allergen oder ein anderes Antigen des Tiers produzierte. Allergene sind Substanzen, die allergische Reaktionen auslösen, und zwar in diesem Fall beim Tier, das gegen sie geimpft wird. Viele unterschiedliche Stoffe können Allergene sein, wie z.B. tierische Reizstoffe und Pollen, wobei die allergische Reaktion der einzelnen Tiere vom konkreten Allergen abhängt. Man kann einem Tier, das gewöhnlich allergische Reaktionen zeigt, die Toleranz gegenüber einem Allergen induzieren. Die Methoden zur Induzierung der Toleranz sind allgemein bekannt und umfassen im allgemeinen die Verabreichung des Allergens an das Tier in zunehmenden Dosen. Eine weitere Erörterung der Toleranzinduktion findet sich im oben zitierten Lehrbuch von Barrett. Nicht zuletzt kann auch der Wirtsorganismus selbst als Quelle für das genetische Material dienen, wenn von den Vektoren immunoregulatorische Gene exprimiert werden.
Die Verabreichung einer lebenden Vakzine des beschriebenen Typs an ein Tier erfolgt nach bekannten bzw. standardisierten Techniken. Diese umfassen die orale Aufnahme, die Magenintubation oder das Sprühen in Bronchien und Nase. All diese Methoden ermöglichen der lebenden Vakzine, daß diese die GALT- oder BALT-Zellen rasch erreichen und eine Antikörperbildung induzieren, weshalb sie die bevorzugten Verabreichungsmethoden darstellen. Andere Verabreichungsmethoden wie intravenöse Injektion, die es der Trägermikrobe erlauben, den Blutstrom des Tieres zu erreichen, kommen ebenfalls in Frage. Intravenöse, intramuskuläre oder intramammäre Injektionen sind auch für andere Ausführungsformen der Erfindung geeignet, was weiter unten beschrieben werden wird.
Da die bevorzugten Verabreichungsmethoden die orale Aufnahme, das Aerosolspray und die Magenintubation sind, sind bevorzugte Trägermikroben solche, die zu den Arten gehören, die bevorzugt die Lymphoepithelstrukturen des Darms oder der Bronchien des zu impfenden Tieres besiedeln. Diese Stämme sollten vorzugsweise avirulente Derivate von enteropathogenen Stämmen sein, die durch gentechnische Manipulation von enteropathogenen Stämmen hergestellt werden. Stämme, welche die Peyer-Haufen besiedeln und damit unmittelbar die Produktion von IgA stimulieren, sind besonders bevorzugt. Bei Tieren sind dies bestimmte Stämme von Salmonella und Salmonella- E. coli-Hybride, welche die Peyer-Haufen besiedeln.
Die Techniken der DNA-Rekombination sind heute ausreichend bekannt und so weit verbreitet, daß sie als Routinetechniken angesehen werden können.
Allgemein gesprochen besteht das Verfahren in der Übertragung des genetischen Materials - oder insbesondere eines Teils davon - eines Organismus auf einen zweiten Organismus, so daß das übertragene genetische Material zum ständigen Bestandteil des genetischen Materials des Organismus wird, auf den es übertragen wird bzw. mit diesem Material rekombiniert wird. Dieses Verfahren besteht gewöhnlich darin, daß man zuerst aus dem Elternorganismus entweder aus einem Plasmid oder einem Elternchromosom ein kleines Stück DNA gewinnt. Ein Plasmid (auch als extrachromosomales Element bezeichnet) ist eine Vererbungseinheit, die vom Chromosom der Zelle physikalisch getrennt ist. Die DNA kann eine beliebige Größe aufweisen und wird häufig durch Einwirkung eines Restriktionsendonucleasenenzyms gewonnen, das die DNA- Moleküle an bestimmten Basenpaarsites aufspaltet. Nach der Ligierung mit Plasmid-, Phagen- oder Cosmidvektoren unter Bildung rekombinanter Moleküle können diese auf verschiedenem Wege, wie z.B. durch Transformation (Aufnahme der nackten DNA aus dem umgebenden Medium, was durch die Anwesenheit verschiedener chemischer Agenzien, wie z.B. Calciumionen, künstlich induziert werden kann) auf eine Wirtszelle übertragen werden. Weitere Verfahren wie die Transduktion sind ebenfalls geeignet, wobei die rekombinante DNA in einem Phagen wie in einem transduzierenden Phagen oder in Cosmidvektoren gepackt wird. Liegt die rekombinante DNA in der Trägerzelle einmal vor, kann sie weiterhin als getrenntes Stück (im allgemeinen gilt dies für vollständige übertragene Plasmide) vorliegen oder sie kann in das Wirtszellenchromosom inseriert und mit dem Chromosom während der Zellteilung reproduziert werden.
Derivate von avirulenten Mikroben werden von der Erfindung auch mitumfaßt. Unter einem "Derivat" versteht man hier auf sexuellem oder asexuellem Wege gewonnene Nachkommen und Mutanten der avirulenten Stämme einschließlich Einbasen- oder Mehrbasensubstitutionen, Deletionen, Insertionen oder Inversionen, welche die Unfähigkeit für die Produktion von funktioneller Adenylatcyclase und AMP-Rezeptorprotein mit natürlich vorkommenden Virulenzplasmiden oder ohne diese aufrechterhalten. So z.B. tragen Stämme wie Chi4O62 und Chi4O64 die gyrA-Mutation, die Nalidixinsäurebeständigkeit verleiht, die hier als geeigneter Marker verwendet wird. Arzneimittelbeständigkeit ist jedoch keine erwünschte Eigenschaft bei als Vakzinen zu verwendenden Stämmen. Die gyrA- Mutation kann somit leicht durch Transduktion des Nalidixinsäure-Empfindlichkeit verleihenden gtyrA&spplus;-Gens auf die Stämme durch Selektion auf Vererbung eines eng verknüpften Tn10 und nachfolgende Entfernung des Tn10 durch Selektion auf Fusarsäureresistenz entfernt werden (s. die Beispiele).
Die erforderlichen Dosierungen hängen von der Antigenizität des Genproduktes ab und brauchen nur in einer Menge vorzuliegen, die für die Induzierung einer für die vorliegenden Vakzinen typischen Immunreaktion ausreicht. Durch Routineexperimente kann die erforderliche Menge leicht festgestellt werden. Übliche Anfangsdosierungen für die Vakzine können bei 0,001 bis 0,1 mg Antigen/kg Körpergewicht liegen, wobei je nach Bedarf zur Gewährleistung des erwünschten Schutzgrades die Mengen angehoben oder Mehrfachdosierungan verwendet werden können.
Der pharmazeutische Träger, in dem die Vakzine suspendiert oder gelöst ist, kann ein beliebiges Lösungsmittel oder ein Feststoff sein, oder sie kann in einem Material eingekapselt sein, das für das beimpfte Tier nichttoxisch und mit dem Trägerorganismus bzw. dem antigen wirkenden Genprodukt verträglich ist. Geeignete pharmazeutische Träger sind flüssige Träger wie normale Kochsalzlösung und andere bei physiologischen Konzentrationen oder annähernd solchen Konzentrationen nichttoxische Salze und feste Träger, die beim Menschen nicht verwendet werden, wie z.B. Talk oder Saccharose sowie Futter für Nutztiere. Zur Verstärkung der Antigenizität können, wenn erwünscht, Adjuvantien zugesetzt werden. Bei der Verabreichung über die Bronchien wird die Vakzine vorzugsweise in Form eines Aerosols gereicht.
Die Immunisierung mit einem aus einem Genprodukt gewonnenen Pathogen kann auch in Verbindung mit einer vorangehenden Immunisierung mit dem avirulenten Derivat eines pathogenen, als Träger wirkenden Mikroorganismus verwendet werden, um das von einem rekombinanten Gen aus einem pathogenen Mikroorganismus festgelegte Genprodukt zu expremieren. Eine derartige parenterale Immunisierung kann als Booster zur Verstärkung der Expression der sekretorischen Immunreaktion dienen, sobald das sekretorische Immunsystem in bezug auf das aus dem pathogenen Organismus gewonnene Genprodukt durch Immunisierung mit der das aus dem pathogenen Mikroorganismus gewonnene Genprodukt exprimierenden Trägermikrobe stimuliert wurde, um die Lymphzellen der GALT- oder BALT-Gewebe ihrerseits zu stimulieren. Die verstärkte Reaktion ist bekannt als sekundäre Reaktion bzw. Booster- oder anamnestische Reaktion und führt zu einer Verlängerung des Immunschutzes des Wirts. Boosterimmunisierungen können viele Male unter Erzielung günstiger Ergebnisse wiederholt werden.
Die obigen Ausführungen beschreiben die Erfindung in großen Zügen. Für ein umfassenderes Verständnis der Erfindung sorgen die nachfolgenden konkreten Beispiele, die lediglich illustrierenden Charakter haben und, sofern nicht anders angegeben, die Erfindung nicht einschränken.

Hinterlegung der für die Durchführung der Erfindung geeigneten Stämme

Biologisch reine Kulturen der nachfolgend genannten Stämme wurden bei der Sammlung American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland hinterlegt. Die Festlegung der angeführten Eingangsnummer erfolgte nach erfolgreichem Test auf Lebensfähigkeit und nachdem die erforderlichen Gebühren bezahlt worden waren. Die angeführten Hinterlegungen werden für einen Zeitraum von 30 Jahren, beginnend mit dem Hinterlegungstag, bzw. für 5 Jahre nach der letzten Aufforderung auf Hinterlegung bzw. für die Laufzeit des Patents, welche Zeit auch immer länger sein mag, aufrechterhalten. Sollte eine Kultur ihre Lebensfähigkeit verlieren oder zufällig zerstört werden oder sollten Plasmide enthaltende Stämme ihr Plasmid verlieren, würde eine solche Kultur durch eine lebensfähige Kultur bzw. lebensfähige Kulturen mit derselben taxonomischen Beschreibung ersetzt werden. Stamm Hinterlegungstag 6. Oktober 1987 26. September 1988
Nachfolgend werden die Beispiele der Erfindung aufgeführt, die lediglich illustrierenden Charakter haben und den Erfindungsumfang nicht einschränken. Die vorliegende Beschreibung ermöglicht im Rahmen der Ansprüche eine ganze Reihe von Ausführungsformen, die für den Durchschnittsfachmann offensichtlich sind.

Beispiele

1. Isolierung der asd&supmin;-Mutanten

Isoliert werden die für Homoserin oder Threonin und Methionin in Anwesenheit von DAP auxotrophen Mutanten (die Biosynthesewege sind in Fig. 1 dargestellt). Es liegen hier zwei Gene vor, welche zwei unterschiedliche Homoserindehydrogenasen bestimmen, die zur Umwandlung von β-Aspartat- Semialdehyd in Homoserin befähigt sind und da Doppelmutationen äußerst selten sind, benötigen alle diese Homoserin erfordernden Mutanten auch ständig DAP, und zwar aufgrund einer einzigen Mutation, welche einen spezifischen Defekt im asd-Gen verursacht. Das Selektionsverfahren beruht auf der Entdeckung, daß die Anwesenheit von DAP in Mutagenese- und Selektionsmedien die Erschöpfung des Homoserins und seiner Produkte Methionin und Threonin ermöglicht, was zur Einstellung der Proteinsynthese in den Mutanten führt, wodurch diese gegenüber die Zellwandsynthese inhibierenden Antibiotika unempfindlich werden. Im Gegensatz dazu setzen die Wildtypzellen ihre Proteinsynthese fort und sind somit gegenüber diesen Antibiotika sensibel.
Mit den Bouillon-Kulturen, und zwar dem prototrophen E. coli K-12-Stamm Chi289 und einem Wildtyp-prototrophen S. typhimurium-Stamm Chi3000, werden getrennte, ein mit 0,5% Glucose als Energiequelle supplementiertes Mineralsalznährmedium enthaltende Kolben beimpft. Sämtliche Minimalmedien mit den von Miller (1972) beschriebenen Formulierungen kommen hier in Frage. Die Kulturen werden unter Belüftung bis zu einer Dichte von ca. 5 x 10&sup8; Zellen pro ml gezüchtet.
Die Kultur wird zur Verstärkung der Frequenz der asd&supmin;-Mutanten mutagenisiert. Die Mutagenese erfolgt durch chemische Methoden, wie z.B. mit salpetriger Säure, oder durch UV- Bestrahlung. Beide Techniken werden von Miller (1972) beschrieben. Man kann sich aber auch der durch ein Transposon induzierten Mutagenese bedienen. Einen Überblick über die Transposontechniken für die Mutagenese geben Kleckner et al. (1977). Nach Abschluß der Mutagenese wird das Nährmedium mit 60 ug L-Homoserin pro ml und 50 ug meso-DAP pro ml supplementiert. Die Zellen in der Kultur werden unter Belüftung für annähernd 10 Generationen gezüchtet, damit sämtliche Mutantenzellen im Hinblick auf den mutanten Genotyp homogen werden und den mutanten Phänotyp vollständig exprimieren. Insgesamt werden von jeder mutagenisierten Kultur 1,0 x 10&sup8; Zellen durch Filtration auf vorgängig angefeuchteten sterilisierten Millipore-Filtern (Porengröße 0,45 um) gesammelt. Die Filter durften dabei während der Filtration nicht austrocknen. Die Zellen werden dann mehrfach mit vorgewärmter, DAP enthaltender, abgepufferter Salzlösung mit Gelatine (BSG) gewaschen.
Die Filter werden dann entfernt und jeweils in 20 ml eines synthetischen Mineralsalznährmediums gegeben, das mit 50 ug meso-DAP pro ml und 0,5% Glucose supplementiert ist. Die in den 250 ml-Erlenmeyer-Kolben enthaltenen Kulturen werden bei 37ºC unter Belüften durch Umlaufschütteln inkubiert. Die Kulturen werden ausreichend lange gezüchtet, um den asd&supmin;- Mutanten die Erschöpfung ihrer inneren Zufuhr an Homoserin und seinen Aminosäurederivaten Threonin und Methionin zu ermöglichen, d.h. während einer Zeitdauer von ca. einer Stunde. Während dieses 1stündigen Züchtens sollte die Zellzahl in der Kultur von ca. 5 x 10&sup6; Zellen/ml auf ca. 1 x 10&sup7; Zellen/ml ansteigen. Eine höhere Zelldichte sollte nicht erreicht werden, da die Wildtypzellen während der Selektion lysieren, wobei sie Threonin und Methionin freisetzen, die dann Substrate für die Proteinsynthese in den mutanten asd&supmin;- Zellen abgeben können. Demgegenüber ist eine aus 10&sup7; Zellen freigesetzte Aminosäurekonzentration für die Aufrechterhaltung des Wachstums dieser Mutanten unzureichend.
Die Selektion auf Mutanten erfolgt in Anwesenheit von D- Cycloserin und Ampicillin. Das D-Cycloserin, hergestellt in einer Menge von 50 mg/ml und eingestellt auf einen pH von 8,0 mit Hilfe eines Phosphatpuffers (Curtiss et al., 1965), und Ampicillin, hergestellt in einer Menge von 50 mg/ml in sterilem Wasser, werden 20 ml Kultur zugesetzt, um jeweils Endkonzentrationen von 100 ug/ml Ampicillin und 50 ug/ml D- Cycloserin zu ergeben. Die Kultur wird gezüchtet unter Belüftung bei 37ºC während ca. 3 Stunden. Während dieser Zeit wirken D-Cycloserin und Ampicillin synergistisch im Sinne der Inhibierung der Zellwandsynthese bei den wachsenden Zellen, jedoch nicht bei den nicht im Wachstum begriffenen Zellen. Die überlebenden Zellen werden dann auf einem sterilen vorgängig befeuchteten Millipore-Filter (Porengröße 0,45 um) gesammelt, wonach die Antibiotika durch Waschen mit vorgewärmtem, DAP enthaltendem BSG entfernt werden. Danach wird der Filter auf einen Kolben transferiert, der in 20 ml eines Mineralsalznährmediums gegeben wird, das mit Homoserin, DAP und Glucose supplementiert ist, wonach man über Nacht in einem Umlaufschüttler 37ºC wachsen läßt. Die Ampicillin-Cycloserin-Anreicherung kann wiederholt werden. Nach zwei Selektionsrunden werden entsprechende Verdünnungen der Bakteriensuspension entweder auf ein Glucose als C-Quelle enthaltendes und mit Homoserin und DAP supplementiertes Mineralsalz-Nährmedium oder auf einem mit 50 ug DAP/ml supplementiertem komplexem Agar-Nährmedium wie L-Agar oder Pennassay-Agar plattiert. Die Kulturen wurden so verdünnt, daß sich pro Platte 100 bis 200 Kolonien ergaben. Die Platten werden dann so lange inkubiert, bis sich Kolonien mit einem Durchmesser von 2 bis 3 mm gebildet haben. Gewöhnlich ist dabei ein Halten über Nacht ausreichend. Danach werden sie auf einem Agar-Nährmedium ohne DAP, auf dem asd&supmin;-Mutanten nicht gedeihen, replikaplattiert. Die Kolonien, die auf der Ausgangsplatte gedeihen, nicht jedoch auf der Replikaplatte, werden aufgenommen, gereinigt und auf ein DAP enthaltendes Nährmedium überimpft und dann bis zu ca. 10&sup8; Zellen/ml wachsen gelassen. Die vermuteten Mutanten werden auf Auxotrophie in bezug auf DAP und Homoserin bzw. DAP und Methionin und Threonin geprüft. Außerdem werden die Mutanten auf eine obligate Forderung nach DAP geprüft, das von L-Lysin nicht geliefert werden kann. Die E. coli-asd&supmin;-Mutante Chi2108 (Tabelle 1) und die S. typhimurium-asd&supmin;-Mutante Chi3008 wurden unter Verwendung des obigen Verfahrens isoliert. Die nach dem obigen Verfahren induzierten und isolierten Mutanten können entweder Punkt- oder Deletionsmutationen enthalten.

2. Bewertung der genetischen Beständigkeit der asd&supmin;-Mutanten

Deletionsmutanten im asd-Gen verwandeln sich im wesentlichen nicht wieder zurück, während Punktmutationen reversibel sind. Die genetische Beständigkeit der nach dem Verfahren in Beispiel 1 isolierten Mutanten wird wie folgt bewertete:
Die Mutantenzellen werden in 20 ml-Kulturen bis zu einer Dichte von ca. 2 x 10&sup9; Zellen/ml gezüchtet. Die Kulturen werden dann ca. 50fach durch Zentrifugieren eingeengt, wonach 100 ul-Anteile von nichtverdünntem Material und 10&supmin;¹-, 10&supmin;²- und 10&supmin;³-Verdünnungen auf Agar plattiert werden, d.h. auf Penassay- oder L-Agar oder Mineralsalzagar mit Glucose, jedoch ohne DAP. Die spontane Rückverwandlung der Mutanten wird durch Halten eines Plattensatzes bei 37ºC während 2 Tagen ermittelt. Die UV-induzierte Rückverwandlung wird ermittelt, indem man einen weiteren Plattensatz einer UV- Bestrahlung von ca. 1,5 J/m² aussetzt und danach in der Dunkelheit während zwei Tagen hält. Das Halten in der Dunkelheit verhindert dabei die Photoreaktivierung der UV- induzierten Mutationen. Die Rückverwandlung wird ermittelt anhand des Verlustes der Auxotrophie für DAP sowie für Homoserin oder Threonin und Methionin.
Unter Verwendung des obigen Verfahrens wurde ermittelt, daß Chi2108, die E. coli-asd-Mutante, sich praktisch nicht zurückverwandelt, weshalb sie eine Deletionsmutation enthält. Im Gegensatz dazu verwandelt sich die S. typhimurium-asd- Mutante Chi3008 infolge ihrer Punktmutation zurück.

3. Konstruktion von Bibliotheken von Tn10-Insertionen bei S. typhimurium

Tn10 ist 9,2 kb groß, weshalb es nur für Insertionsvektoren mit einem Bakteriophagen Transposon in Frage kommt, die beträchtliche nichtessentielle Phagengene durch Deletion entfernt haben. Ein Beispiel dafür ist der von Kleckner et al. (1977) konstruierte Vektor NK561 mit dem Transposon Tn10 des λ-Phagen. S. typhimurium ist von Natur aus gegenüber dem λ-Phagen resistent. Es kann jedoch durch Einbau des lamB- Gens von E.coli K-12, welches den Proteinrezeptor der Außenmembran für die Anheftung des λ-Phagen kodiert, sowie durch Aufnahme der galE-Mutation, welche eine Aufrauhung des Belags durch Entfernung des Lipopolysaccharids bewirkt, sensibilisiert werden. Transposon-Bibliotheken von Random- Tn10-Insertionen im Chromosom von S. typhimurium können somit durch Infektion entweder von B4673 oder von Chi3477 mit λ-NK561 unter Verwendung des nachfolgenden Verfahrens hergestellt werden (s. Tabelle 1 bezüglich der Beschreibung und Gewinnung der beiden Stämme).
Übernachtkulturen des Stammes werden auf Glucose mit λ- Bouillon oder mit λ-Bouillon ohne Glucose, jedoch mit 0,2% Maltose zur Induzierung der Expression von lamB gezüchtet. Hat die Kultur eine Zellzahl von ca. 3 x 10&sup8; Zellen/ml erreicht, wird bei einer Konzentration von 1,0 x 10&sup9; Phagen/ml, d.h. bei einer Durchschnittszahl von ca. 3 Phagen pro Bakterium λ-NK561 zugesetzt. Der λ-Phage wird in S. typhimurium nicht repliziert, weshalb eine höhere Multiplizität der Infektion verwendet werden kann als bei E. coli, da die λ- Infektion nicht den Tod der infizierten S. typhimurium- Zellen verursacht. Nach Inkubation bei 37ºC während einer ausreichenden Zeitdauer, um das Tn10 aus dem λ-Phagengenom auf verschiedene Sites im S. typhimurium-Genom zu transponierten, gewöhnlich während 60 bis 90 Minuten, werden gleiche Teile von unverdünnten und 10fach verdünnten Suspensionen unmittelbar auf L- oder Penassay-Agar mit 12,5 ug Tetracyclin/ml plattiert. Die Platten werden dann über Nacht bei 37ºC inkubiert, wonach zu jeweils ca. 10 Platten 1 bis 2 ml Bouillon zugesetzt werden, wonach die Kolonien unter Verwendung eines sterilen Glasverteilers erneut suspendiert werden. Die Zellen in der Suspension werden durch Zentrifugieren gesammelt, gewaschen und in 1%igem Pepton plus 5% Glycerin erneut suspendiert. Die Bibliothek wird dann bei -70ºC aufbewahrt.

4. Herstellung der Phage-P22-Lysate der Tn10-Transposon- Bibliothek

Die Bewegung der Transposone bei S. typhimurium erfordert im allgemeinen die Verwendung des generalisierten Salmonella transduzierenden Phagen P22. Lysate des mit hoher Frequenz transduzierenden Phagen P22HT int auf Tn10-Transposon-Bibliotheken, die in DB4673 und Chi3477 konstruiert wurden, wie sie in Beispiel 3 beschrieben werden, werden wie folgt hergestellt:
Übernachtkulturen der Transposon-Bibliotheken in DB4673 und Chi3477 werden in Lura-Bouillon gezüchtet. Jede Kultur wird 100fach in der Luria-Bouillon verdünnt und unter Belüftung 2 bis 3 Stunden lang bei 37ºC gezüchtet, um eine exponentiell wachsende Kultur bei einer Zellzahl von ca. 3 x 10&sup8; Zellen/ml zu erhalten. P22HT int wird bei einer Durchschnittszahl von 3 Phagen/Zelle zugesetzt, wonach das Gemisch unter Belüftung durch Umlaufschütteln bei 37ºC während 90 Minuten inkubiert wird, wonach der Zellsuspension zur Erleichterung der Lyse und/oder des Absterbens der restlichen lebensfähigen Zellen eine geringe Menge Chloroform zugesetzt wird. Nach einer weiteren Inkubationsdauer von 10 Minuten unter Belüftung bei 37ºC wird das Lysat zur Entfernung der nicht lysierten Bakterien und der Bakterienbruchstücke bei 7000 U/min während 10 Minuten in einer Sorvall- Kühlzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird dann sorgfältig dekantiert und in Anwesenheit einiger Tropfen Chloroform bei 4ºC aufbewahrt.

5. Erzeugung und Selektion von S. typhimurium-Stämmen, bei denen das Tn10 mit dem asd-Gen eng verknüpft ist

Stämme, bei denen das Tn10 mit dem asd-Gen eng verknüpft ist, sind geeignet für die Herstellung von δ-asd-Mutanten und können wie folgt hergestellt und isoliert werden. Fig. 2 zeigt ein Fließschema für die Erzeugung von δ-asd-Mutanten, in dem die für die Erzeugung der Mutanten verwendbaren Stämme in Klammern angegeben sind.
Der S. typhimurium-Stamm Chi3008, der eine asdA15-Punktmutation enthält, wird über Nacht bei 37ºc in einer 50 ug DAP/ml enthaltenden Luria-Bouillon inkubiert. Die Übernachtkultur wird dann 100fach in frischem Nährmedium verdünnt und dann bis zu einem Titer von 3 x 10&sup8; Zellen/ml (im allgemeinen 2 bis 3 Stunden) inkubiert. Anschließend wird der Phage P22HTint, der auf einem S. typhimurium-Stamm vermehrt worden war, der eine Tn10-Bibliothek, hergestellt in DB4673 oder Chi3477, wie in Beispiel 4 beschrieben, trägt, bei einer Durchschnittszahl von ca. 0,3, d.h. bei einem Titer von 1,0 x 10&sup8; Phagen/ml, zugesetzt. Nach 20minütiger Inkubation für die Anheftung des Phagen und die Injektion wurden 100 ul Anteile der unverdünnten, 10fach verdünnten und 100fach verdünnten Zellsuspension entweder auf Penassay-Agar oder auf L-Agar plattiert, der kein DAP enthielt, jedoch 12,5 g Tetracyclin pro ml aufwies. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert.
Beobachtet werden die überaus seltenen Tcr-Asd&spplus;-Transduktanten. Diese ergeben sich aus zwei unabhängigen Schritten, d.h. der Transduktion von Asd&supmin; in Asd&spplus; und der Transduktion des Tn10 an einem anderen Chromosomensite oder durch einmalige Transduktion, bei der das Tn10 in das angrenzende asd&spplus;-Gen transduziert wird. Einmalige Transduktionen kommen weit häufiger vor als Doppeltransduktionen. Demnach weist die überwiegende Zahl der Tcr-Asd&spplus;-Transduktanten ein Tn10 auf, das mit dem asd-Gen eng verknüpft ist. Es werden dann mehrere Tcr-Asd&spplus;-Kolonien aufgenommen, gereinigt und entsprechende Kulturen hergestellt.
P22HTint-Lysate werden auf jedem Tcr-Asd&spplus;-Transduktanten unter Verwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren vermehrt, wobei jedoch anstelle der oben beschriebenen Kulturen die Tcr-Asd&spplus;-Kulturen eingesetzt werden. Jedes Lysat wird dann zur Transduktion einer Kultur von Chi3008 verwendet, die in einer mit 50 ug DAP/ml supplementierten Luria-Bouillon gezüchtet wird. Die transduzierten Stämme werden dann auf einem Penassay-Agar plattiert, der entweder kein DAP aufweist oder dieses und 12,5 ug Tetracyclin/ml enthält. Im erstern Fall werden Asd&spplus;-Transduktanten selektiert und im letzteren Fall ein Tn10 erbender Tcr-Transduktant. Von jeder Selektion werden ca. 50 Transduktanten genommen und auf Kotransduktion des anderen Merkmals bewertet. Werden Tn10 und asd&spplus; miteinander verbunden, muß eine große Zahl von Asd&spplus;-Transduktanten tetracyclinbeständig sein und umgekehrt. Die Frequenz der Kotransduktion kann verwendet werden, um die Nähe des Tn10 zum asd&spplus;-Gen zu bestimmen.
Dieses Verfahrens bedient man sich zur Isolierung von Chi3013 (Fig. 2), das einen Tcr-AsD&spplus;-Transduktanten von Chi3008 darstellt (s. Tabelle 1).

6. Erzeugung und Isolierung von S. typhimurium-Stämmen mit einem durch Tn10 erzeugten δ-asd-Gen

Die Insertion von Tn10 in Zellen verursacht Fusarsäure- Sensibilität sowie Tetracyclinresistenz. Zellen, die Tn10 verloren haben, was häufig der Fall ist, werden fursarsäureresistent. Der Verlust von Tn10 verursacht Deletionen in der angrenzenden DNA. Der Verlust von Tn10, das nahe dem asd&spplus; inseriert wird, verursacht häufig eine Deletion im asd-Gen.
Hergestellt wird eine Übernachtkultur von Chi3013 (s. Fig. 2), die einen Tcr-Asd&spplus;-Transduktanten darstellt, wonach die Zellen in 8 bis 10 ml-Anteilen, die durch Zentrifugieren bei 7.000 U/min während 10 Minuten pelletiert werden, in 200 ul L-Bouillon suspendiert werden. Die einzelnen Verdünnungen werden dann auf 50 ug DAP/ml, 6 ug Fusarsäure/ml und 12 ug autoklaviertes Chlortetracyclin/ml enthaltendem Nähragar plattiert. Nach Halten über Nacht bei 37ºC werden isolierte Kolonien aufgenommen und auf einem DAP und Fusarsäure enthaltende. Medium gereinigt. Aus den gereinigten Stämmen werden kleine Kulturen hergestellt, von denen jede auf ihre Unfähigkeit, in Abwesenheit von DAP zu wachsen, sowie auf ihre Tetracyclinsensibilität getestet werden.
Die Bestätigung dafür, daß das gesamte Tn10 verloren gegangen ist und daß die Forderung nach DAP auf einer nicht revertierenden Deletionsmutation beruht, erhält man durch Feststellung, ob die Tcs-Asd--Mutanten sich in Tcr oder Asd&spplus; rückverwandeln. Dies wird wie folgt durchgeführt:
10 bis 20 ml-Anteile der Kultur in DAP enthaltender L-Bouillon werden unter Belüftung bis zu einer hohen Zelldichte gezüchtet, wonach die Zellen durch Zentrifugieren auf das 50fache eingeengt werden und geeignete Verdünnungen entweder auf DAP-freien Penassay-Agar oder auf sowohl DAP als auch 12,5 ug Tetracyclin/ml enthaltendem Penassay-Agar plattiert. Die Platten werden dann 1 bis 2 Tage bei 37ºC gehalten. Bei Abwesenheit von Tcr- oder Asd&spplus;-Kolonien kann angenommen werden, daß der Stamm Deletionen des Tn10 und der asd-Gensequenz aufweist. Ein repräsentativer Stamm, der diesen Forderungen entspricht ist Chi3021 (s. Fig. 2 und Tabelle 1).

7. Erzeugung und Isolierung von S. typhimurium-Stämmen mit einem an ein δ-asd-Gen angrenzenden Tn10

Die Zugänglichkeit von Stämmen mit einem an ein δ-asd-Gen angrenzenden Tn10 ermöglicht die Übertragung der Deletion auch in andere Stämme.
Die Stämme werden, wie in Beispiel 5 beschrieben, konstruiert, nur daß als Empfänger vor der Selektion der Tcr-Asd&spplus;- Transduktanten Chi3021 verwendet wird (s. Fig. 2). Die Stämme Chi3537 und Chi3536 (Tabelle 1), welche die Tn10- Insertionen zhf-3::Tn10 und zhf-4::Tn10 tragen, wurden nach diesem Verfahren konstruiert.
Nach Überprüfung der Verknüpfung des Tn10 mit der δ-asdAl- Mutation kann man den Transduktanten, der tetracyclinresistent ist, jedoch weiterhin DAP erfordert, abtrennen. Ein Beispiel dafür ist der Stamm Chi3520 (s. Tabelle 1), welcher die δ-asdAl-Mutation besitzt.
Die Transduktion von Chi4064 (s. Tabelle 1) mit P22, der auf Chi3520 vermehrt wurde (s. Tabelle 1), und die nachfolgende Selektion auf Tetracyclinresistenz in Anwesenheit von DAP erzeugten den Stamm Chi4070 (s. Tabelle 1, Fig. 2).
Die Entfernung der zhf-4::Tn10 aus Chi4070 durch Selektion auf Fusarsäureresistenz ergab Tcs-asd&supmin;-Stämme, von denen einer Chi4072 ist.
Der Verlust des Transposons kann auch durch Transduktion mit dem auf einem Tcs-prototroph wie Chi3000 (s. Tabelle 1) vermehrten Phagen P22HTint unter nachfolgender Selektion auf Fusarsäureresistenz ausgelöst werden.
Das oben beschriebene Verfahren kann wiederholt werden und neuerliche Deletionen des asd-Gens in Verbindung mit der Deletion der Tn10-Insertionen in Chi3536 und Chi3537 können isoliert werden. Aufdiese Weise isolierte fusarsäureresistente Tcs-δ-asd-Mutantenstämme sind Chi3628 und Chi3647.

8. Isolierung und Kennzeichnung von E. coli-Stämmen mit Deletionen im asd-Gen und mit mit dem asd-Gen verknüpften Tn10-Transposonen

Die Verfahren zur Isolierung und Kennzeichnung dieser Stämme sind ähnlich denen, wie sie für die Erzeugung der Asd&supmin;-Mutanten von S. typhimurium beschrieben wurden. Zur Infektion des suppressorfreien prototrophen Stammes Chi2842 wird jedoch der λ-NK561-Transposonvektor verwendet. Der λ-Vektor ist nämlich aufgrund seiner bernsteinfarbenen Mutationen im O- und P-Gen für die DNA-Replikation nicht zur Replikation in Chi2842 befähigt. Der einzige Weg, daß Tcr-überlebende Organismen erzeugt werden können, besteht in der Transposition des Tn10 aus dem λ-NK-Genom auf das E. coli K-12-Chromosom.
Die Tn10-Bibliothek wird verwendet zur Vermehrung des generalisierten transduzierenden Phagen P1L4, der seinerseits zur Transduktion eines E. coli-Stammes wie Chi2637 verwendet wird (s. Tabelle 1). Die Transduktanten, die Tcr und Asd&spplus; darstellen, werden werden selektiert; ein Beispiel für diesen Typ von Transduktanten ist Chi2978 (s. Tabelle 1).
Stämme, bei denen das Tn10 an ein δ-asd-Gen angrenzt, können ebenfalls isoliert werden. So z.B. wurde das Tn10 in Nachbarschaft zur δ-aSDA4-Mutation in Chi2637 inseriert, wodurch man den Stamm Chi2979 erhielt (s. Tabelle 1).
Die mit zhf-2::Tn10 aus Chi2981 (s. Tabelle 1) verknüpfte δ-asdA4-Mutation kann durch P1L4-Transduktion in andere Stämme wie JM83 (s. Tabelle 1) übertragen werden, wodurch man den Stamm Chi6096 erhielt (s. Tabelle 1). Durch nachfolgende Fusarsäureselektion, durch die das Tn10 eliminiert wird, erhält man neue δ-asd-Stämme. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde Chi6097 (s. Tabelle 1) isoliert.

9. Andere Mittel zum Einbau von δ-asd-Mutationen in E. coli- und S. typhimurium-Stämme

Zusätzlich zur Erzeugung von asd-Deletionen durch Selektion auf Deletionsverlust des an ein asd&spplus;-Gen angrenzenden Tn10 (z.B. zur Erzeugung der δ-asdAl-Mutation in Chi3021 (s. Tabelle 1) oder durch Übertragung einer spezifischen asd- Mutation wie der δasdAl durch Kotransduktion mit einem eng verknüpften Tn10, wie z.B. zhf-4::Tn10 (wie z.B. für die Konstruktion von Chi4070 aus Chi3520, s. Tabelle 1), ist auch ein drittes Verfahren zum Einbau von δ-asd&supmin;-Mutationen möglich (s. den Kasten in Fig. 2). Bei diesem Verfahren wird das mit asd verknüpfte Tn10 in einen Targetempfängerstamm transduziert, wonach die Tcr-Transduktanten isoliert werden. Die mit asd verknüpften Tn10s können zhf-1::Tn10, zhf-3::Tn10 oder zhf-4::Tn10 darstellen. Der neue Tn10 enthaltende Stamm wird mit dem Lysat eines auf einem Stamm mit einer δ-asd-Mutation vermehrten Phagen transduziert, wonach die fusarsäureresistenten Transduktanten in Anwesenheit von DAP selektiert werden. Das auf dieser Stufe verwendete Phagenlysat kann auf Stämmen mit δ-asdA1 oder δ-asdA13 oder δ-asdA14 vermehrt werden. Pro Zelle gibt es in den in einer Bouillon gezüchteten Kulturen mehrere Kopien des Tn10. Der Verlust sämtlicher Kopien des Tn10 ist vor der vollständigen phänotypischen Expression der Fusarsäureresistenz erforderlich. Deshalb muß der transduzierte Empfänger über mehrere Generationen vor der Plattierung auf einem selektiven Agar-Nährmedium gezüchtete werden, das DAP, Fursarsäure und autoklaviertes Chlortetracyclin enthält. Dieses Verfahren ist jedoch durchaus effizient und ermöglicht es, das Tn10 einstufig durch eine gut gekennzeichnete Deletionsmutation zu ersetzen. Es muß nochmals darauf hingewiesen werden, daß der Ersatz einer Tetracyclinresistenz verleihenden zhf::Tn10-Insertion durch Transduktion mit einer Frequenz von 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;&sup5; abläuft, wohingegen der spontane Verlust der Tn10-Insertion bei einer Frequenz von ca. 10&supmin;&sup8; abläuft. Nach der Transduktion besteht somit eine 1000- bis 10.000fach höhere Wahrscheinlichkeit für die Insertion einer spezifischen δ-asdA-Mutation als für die Erzeugung einer spontan ablaufenden neuen δ-asdA-Mutation.

10. Konstruktion von das asd&spplus;-Gen aus S. mutans enthaltenden Klonierungsvektoren

DAP erfordernde Asd&spplus;-Mutanten, einschließlich δ-asd-Mutanten, von E. coli und S. typhimurium können in einen Asd&spplus;-Phänotyp durch Transformation mit das asd&spplus;-Gen aus S. mutans enthaltenden Plasmiden umgewandelt werden. Die Klonierungsvektoren, welche dieses Gen enthalten, in das ein erwünschtes, ein heterologes Polypeptid kodierendes Gen inseriert werden kann, werden wir folgt synthetisiert (s. Fig. 3 und 4).
Wenn nicht anders angegeben, werden für die nachfolgenden Konstruktionen die Standardtechniken der Technik der DNA- Rekombination, wie sie z.B. von Maniatis, Fritsch und Sambrook (1982 und DNA CLONING (1982) beschrieben werden, verwendet. Die Derivierung, die Eigenschaften und der Genotyp bestimmter Plasmide, wie sie hier verwendet werden, sind in Tabelle 2 angegeben. Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme und die DNA-Linker für Bg1II und EcoRI sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 2 Plasmide Plasmid Eigenschaften Derivierung Nr. des Wirtsstammes Relevanter Genotyp Multiklonierungssites Ptrc-Promotor kryptisches Plasmid niedere Kopienzahl Yanisch-Perron et al.a Hanna et al.b, erhalten von Brousseau konstruiert aus pKK233-2 (Amann und Brosiusc) von R. Goldschmidt erhalten von S.S. Cohen über D.S. Strauss Chang und Cohend Cardineau und Curtisse konstruiert von R. Goldschmidt erhalten durch Insertion des 1,1 kb-EcoRI-Fragments des Plasmids pAJC178 (Boulaine et al.f), das das lacIq-Gen und seinen Promotor enthält, in den einzigen EcoRI-Site von pSC101 enthält. Tabelle Tabelle 2 (Fortsetzung) Ptrc Promotor, Überproduktion der Rekombinante SpaA, Apr zigen EcoRI-Site von pSC101 Erringtong das PvuII-HindIII-Fragment des spaA-Gens wurde in das Plasmid pYA99 inseriert Tabelle 1 a (1985) Gen 33:103-119; b (1984) Gen 30:247-250; c (1985) Gen 40:183-190; d (1978) J. Bacteriol. 134:1141-1156; e (1987) J. Biol. Chem. 262:3344-3353; f (1986) Mol. Gen. Genet. 205:339-348; g (1986) J. Gen. Microbiol. 132:2953-2960. Tabelle 3 Verwendete DN-Liner Linker

10. A. Konstruktion von pYA235 und seinen Derivaten

Das Plasmid pYA235 enthält ein asd&spplus;-Gen-Derivat aus S. mutans, bei dem die EcoRI-Sites aus dem nativen Gen entfernt sind.
Das BglII-AvaI-Fragment aus pYA631 (Cardineau und Curtiss (1987)), das das S. mutans-asd&spplus;-Gen enthält, das seine Promotorsequenz einschließt, wurde unter Verwendung des Klenow- Fragments der DNA-Polymerase I (Klenow) gefüllt und dann in den HincII-Site von pUC18 kloniert. Dieses Fragment enthält auch ein Tcr-Gen. Das erhaltene Plasmid ist pYA220. Das Konstrukt mit dem asd-Gen in entgegengesetzter Ausrichtung ist unbeständig.
Ein großer Teil des TcrGens sowie eine Reihe von Spaltungssites für Restriktionsenzyme wurden aus pYA220 wie folgt durch Deletion erhalten. Das Plasmid wurde mit SmaI und danach mit Bal31 verdaut, mit Klenow zur Füllung der Oberhangs behandelt und ligiert. Das erhaltene Plasmid war pYA224.
Der EcoRI-Site im asd-Gen von pYA224 wurde durch teilweise Verdauung mit EcoRI entfernt, dann mit Klenow behandelt und religiert. Das erhaltene Plasmid pYA227 komplementiert nicht den Asd&supmin;-Phänotyp der δ-asd-mutanten Zellen. Die Behandlung verursacht die Insertion von vier Basen und führt zur Umwandlung der TGG, AAT, TCA, ATC-Sequenz, die Trp, Asn, Ser und Ileu kodiert, in TGG, AAT, TAA, TTC, die Trp und Asn und ein Translationsterminierungssignal kodiert.
Das asd&supmin;-Gen von pYA227 wurde durch intragene Suppression, d.h. durch eine Basenpaardeletion, welche den korrekten Leserahmen wiederherstellt, in ein asd+-Gen umgewandelt. pYA227 wurde in Chi6096 transformiert (s. Tabelle 1), das eine δ-asd-Mutation aufweist. Die Transformanten wurden in Anwesenheit von DAP bis zur Erzielung einer hohen Dichte gezüchtet, in abgepufferter, Gelatine enthaltender Kochsalzlösung eingeengt und dann auf L-Agarplatten, die kein DAP enthielten, plattiert. Kolonien, die Asd&spplus; darstellten, traten mit einer Häufigkeit von 10&supmin;&sup9; auf. Diese Kolonien gewannen jedoch den EcoRI-Site wieder. Eine Kolonie, die mit einer Frequenz von 10&supmin;¹&sup0; auftrat, wurde isoliert. Sie stellte Asd&spplus; dar, gewann jedoch den EcoRI-Site nicht wieder. Ein aus dieser Kolonie isoliertes Plasmid wurde mit pYA233 bezeichnet.
Der restliche EcoRI-Site in pYA233 wurde durch Verdauung mit EcoRI eliminiert, wonach mit Klenow behandelt und religiert wurde. Das erhaltene Plasmid pYA235 zeigte keine EcoRI- Sites.
Die BamHI- und/oder die PstI-Sequenz im asd-Gen von pYA235 kann enbfalls mit bekannten Techniken eliminiert werden.

10. B. Konstruktion von pYA237

Der Expressionsvektor pYA237, der den Promotor Ptr'c enthält, die Restriktionsenzymsites, in die ein heterologes Gen kloniert werden kann, das S. mutans- asd&spplus;-Gen und die rrnB- Terminierungssignale wurden wie folgt konstruiert (s. Fig. 4).
Der Plasmidexpressionsvektor pKK233-2 (Amann und Brosius (1985)) wurde mit PstI verdaut mit T4-DNA-Polymerase behandelt, wonach vor der Ligierung SstI-Linker (s. Tabelle 3) angefügt wurden. Das erhaltene Plasmid pYA99 wurde isoliert.
der EcoRI-Site in pYA99 wurde durch einen BglII-Site ersetzt. pYA99 wurde mit EcoRI verdaut und mit Klenow gefüllt, wonach vor der Ligierung BglII-Linker (s. Tabelle 3) angefügt wurden. Das erhaltene Plasmid pYA223 wurde isoliert.
Der EcoRI-Linker d(pCCGGAATTCCGG) (s. Tabelle 3) wurde in pYA223 am NcoI-Site (nach Füllen mit Klenow) inseriert. Das erhaltene Plasmid pYA228 wurde isoliert. Der EcoRI-Site in diesem Vektor hat nun denselben Leserahmen wie der EcoRI- Site in λ-gtll.
Ein HaeII-Fragment von pUC8-2 wurde in den SstI-Site (behandelt mit T4-DNA-Polymerase) von pYA228 kloniert. Das Plasmid pYA229 wurde isoliert. Dieses Plsamid hat den lac-Promotor und die lacZ (α)-Kodierungssequenz.
pYA229 wurde mit EcoRI verdaut, um das den lac-Promotor enthaltende EcoRI-Fragment zu eliminieren Das erhaltene Plasmid pYA230 wurde in M83 transformiert (s. Tabelle 1). Die pYA230 enthaltenden Zellen wurden auf Agar mit dem chromogenen X-gal-Stubstrat für β-Galactosidase hellblau.
Das lacZ (α) von pYA230 enthaltende HindIII-Fragment wurde durch das HindIII-Fragment, welches das S. mutans asd&spplus;-Gen aus pYA 235 bestimmt (s. Beispiel 10. a.) ersetzt, wodurch man zu pYA237 gelangt.
Weitere HindIII-Fragmente aus pYA235-Derivaten, welche das S. mutans-asd-Gen enthalten, die keine EcoRI- und BamHI- Sites sowie keine EcoRI-, BamHI- und PstI-Sites aufweisen, werden ebenfalls inseriert, um das α-lacZ von pYA230 zu ersetzen.
Das Plasmid pYA237 wird in Chi6097/pYA232 und Chi6060 stabil gehalten (s. Tabelle 2), ist jedoch in Chi6096 und LE392 unbeständig.

10. C. Konstruktion von pYA248

Der Klonierungsvektor pYA248 ermöglicht die Insertion der klonierten DNA-Fragmente unter Verwendung der Restriktionsenzyme EcoRI, SmaI, Sphl und SalI. Er wurde wie folgt konstruiert:
Das p15A-Replikon ist zur Gänze auf einem 1,0 kb-HincII- Fragment enthalten. Dieses wurde mit dem SspI-Fragment aus pYA237 (s. Fig. 4) ligiert, das die Ptrc-MCS-asd&spplus;-rrnB-Sequenz enthält, und zwar unter Verwendung von BglII-Linkern. Das erhaltene Plasmid ist der 3,0 kb-Klonierungsvektor pYA248. Wichtige Merkmale des Plasmids sind in Fig. 5 dargestellt.
Zu pYA248 analoge Klonierungsvektoren wurden durch Entfernung der BamHI- und PstI-Sites im asd-Gen konstruiert (s. Beispiel 10.A.) konstruiert. Die Entfernung dieses Sites ermöglicht die Verwendung dieser Enzyme für die Klonierung.
Die Nucleotidsequenz des Ptrc-Promotors und die Mehrfachklonierungssites in pYA248 sind in Fig. 6 dargestellt.

11. Konstruktion eines ein asd&spplus;-Gen und ein β-Galactosidase kodierendes Gen enthaltenden Expressionsvektors

Das SalI-Fragment (3,1 kb) aus pSGMU37, das lacZ enthält, wurde in den SalI-Site von pYA248 inseriert. Das erhaltene Plasmid ist pYA260. Signifikante Merkmale von pYA260 sind in Fig. 7 dargestellt.

12. Expression der β-Galactosidase und ASD in asd&supmin;-Mutanten von S. typhimurium und E. coli kodierenden Gene

Die Asd&supmin;-Stämme Chi3115, Chi4072 und Chi2984 werden mit pYA260 oder pYA248 transformiert und in einem Medium ohne DAP unter die Proteinsynthese ermöglichenden Bedingungen gezüchtet. Außerdem wurde auch Chi2984 mit pYA260 und pYA232 kotransformiert. Signifikante Merkmale von pYA232 sin in Fig. 8 gezeigt. Dieses Plamid bestimmt den lacIq-Repressor.
Die von den transformierten Zellen und den Kontrollzellen synthetisierten Produkte werden durch Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgelen, wie von Laemmli (s. Methods in Enzymology) beschrieben, analysiert. Ein Foto eines die aufgetrennten Produkte enthaltenden Gels ist in Fig. 9 dargestellt.
Die mit pYA260 transformierten Stämme Chi3115, Chi4072 und Chi2983 synthetisieren sowohl Asd-Protein als auch β-Galactosidase. Ein sowohl mit pYA260 als auch mit pYA232 kotransformierter Stamm Chi2984 synthetisiert jedoch nicht ß-Galactosidase aufgrund des durch pYA232 bestimmten lacIq-Repressors. Das Asd-Protein wird von sämtlichen δ-asd-Stämmen, die mit pYA248 oder pYA260 transformiert wurden, in großer Menge erzeugt.

13. Konstruktion eines ein asd-Gen und ein spaA-Gen enthaltenden Expressionsvektors

Die Struktur des spaA-Gens von S. mutans, das die Hauptantigen-Determinanten angibt, ist in Fig. 10 dargestellt.
Die DNA von pYA248 wird durch Behandlung mit EcoRI linearisiert. Die Enden der DNA werden mit Klenow und bakterieller Alkaliphosphatase behandelt. Das das spaA-Gen enthaltende NcoI-HindIII-Fragment von pYA177 wird mit Klenow behandelt. Die beiden DNA's werden mit T&sub4;-DNA-Ligase zu pYa261 ligiert. Das die Hauptantigen-Determinanten des spaA-Proteins in der Hauptsache im SstI-Fragment lokalisiert ist (s. Fig. 10), wurde das SstI-Fragment von pYa261 gereinigt und mit dem Rest von pYA261 unter Beibehaltung des Leserahmens des spaA- Gens zur Herstellung von Tandemwiederholungen dieser Region ligiert. Auf diese Weise wurde das drei Tandemwiederholungen des SstI-Fragments enthaltende Plasmid pYA262 erhalten. pYA261 und pYA262 sind in Fig. 11 beschrieben.

14. In vitro-Beständigkeit von pYA260, pYA261 und pYA262 in Chi4072

Die in vitro-Beständigkeit von pYA260 (offene und geschlossene Kreise), pYA261 (offene und geschlossene Dreiecke) und pYA262 (offene und geschlossene Quadrate) in Chi4072 wird bestimmt durch Inkubieren der Zellen in L-Bouillon in Anwesenheit (geschlossene Symbole) oder Abwesenheit (offene Symbole) von DAP und Überwachung des Prozentanteils der Zellen, die in den nachfolgenden Generationen Asd&spplus;, LacZ&spplus; und Spa&spplus; darstellen. Wie die Ergebnisse in Fig. 12 zeigen, beträgt der spontane Anteil an pYA260-Verlust 1%/Bakterium/- Generation, wobei dieser Anteil bei den kleineren Plasmiden pYA261 und pYA262 beständiger ist.

15. Expression des spaA-Antigens aus pYA261 und pYA262

Chi4072 ist ein avirulentes Derivat von S. typhimurium, das bei oraler Verbareichung an Mäuse hochimmunogen ist (s. Curtiss und Kelly (1987) und Nakayama et al. (1988)). pYA261 und pYA262 werden in Chi4072 transformiert. Die Produktion des SpaA-Proteins läßt sich sowohl durch Blaufärbung des SDS-Polyacrylamidgels der Elektrophoreseprofile nach Coomassie als auch durch Western blot-Analyse unt Verwendung von anti-SpaA-Sera nachweisen (s. Fig. 13). Es läßt sich erkennen, daß die δ-cya-δ-crp-Stämme das spaA-Protein in sehr großem Maße produzieren, was die Produktion an SpaA- Protein durch rekombinante Stämme von E. coli K-12 und durch andere avirulente Salmonella-Vakzinestämme übersteigt.
Das SpaA-Protein ist das wichtigste Oberflächenprotein auf der Zelloberfläche von S. mutans. Es ist erforderlich, damit sich S. mutans auf den Speichelproteinen auf der Zahnoberfläche festsetzen kann (s. Curtiss, 1985, Current Topics in Microbiology and Immunology 118:253-277). SpAA-Mangelmutanten von S. mutans sind nicht befähigt, keimfreie Ratten zu besiedeln und vermögen daher auch nicht, Zahnkaries zu induzieren. Gelangt das SpaA-Antigen zu GALT-Zellen, stimuliert dies eine Immunreaktion der Mucosa, welche die Besiedelung mit S. mutans verhindert.
Mit dem pYA262 enthaltenden Stamm Chi4072 immunisierte Mäuse können auf eine Saccharose enthaltende Diät gesetzt und dann mit einem virulenten S. mutans-Stamm (UAB66) getestet werden. Zuerst wird dann das Vermögen von UAB66, Zähne zu besiedeln, untersucht und dann die Wirksamkeit der Kariesverhütung geprüft. Die Besiedelung wird während der ersten Woche bzw. zwei Wochen nach der Kontrollinfektion bewertet, wohingegen die Kariesverhütung sechs bis zwölf Wochen nach der Infektion ermittelt wird.

16. In vivo-Beständigkeit von pYA262 in Chi4072

pYA262 enthaltende Chi4072-Zellen wurden oral Balb c-Mäusen verabreicht. Diese Zellen haften auf Galt-Zellen, dringen in sie ein und verbleiben dort. Wie die Angaben in Tabelle 4 zeigen, stellen 100% der drei Wochen nach der Erstbeimpfung der Mäuse erhaltenen Chi4072-Isolate Asd&spplus; dar und produzierten weiterhin das SpaA-Protein. Dies untermauert die Behauptung, daß die Verwendung eines Asd&spplus;-Vektors in einem avirulenten Stamm wie Chi4072 mit einer δ-asd-Mutation zu einer beständigen Aufrechterhaltung des rekombinanten Gens in einem Medium ohne exogenen selektiven Druck aufrechterhält. Mit pYA262 beherbergenden Chi4072-Zellen immunisierte Mäuse entwickeln im Speichel sekretorisches IgA und im Serum IgG gegen SpaA-Protein und bilden so einen verzögerten Typ der Hypersensibilisierungsreaktion (DTH) auf das in die Hinterpfote injizierte SpaA-Protein. Die kleine Fraktion der pYA261 oder pYA262 beherbergenden Chi4072-Zellen, die bei jeder Generation das Plasmid verlieren, unterliegen einem DAP-losen Tod, setzen ihren Zellinhalt frei und verbessern so die Immunisierung des tierischen Wirts. Dies ist ein bevorzugtes Merkmal der Erfindung. Tabelle 4 In vivo-Beständigkeit von pYA262, das das SpaA-Protein in S. typhimurium SR-11 Δcya Δcrp Δasd-Stamm X4072a bestimmt Tötungstag Maus Gesamt-cfu in Peyer-Haufen Gesamt-cfu in der Milz a Acht Wochen alte BALB/c- Mäuse wurden oral mit 1,2 x 10&sup9; X4072(pYA262)-Zellen am Tag 0 beimpft

17. Klonierung des asd&spplus;-Gens von S. typhimurium und Konstruk tion von pYA272, pYA275 und pYA277

DNA-Bibliotheken von S. typhimurium SR11 (Chi3306) DNA wurden unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme zur Verdauung der DNA sowie von Klonierungsvektoren konstruiert. Das S. typhimurium-asd&spplus;-Gen wurde zuerst in mehreren Cosmidbibliotheken identifiziert. Durch Verdauung eines dieser Rekombinanten mit PstI-Klonierung in pUC18 und Selektion auf Asd&spplus;-Transformanten in Chi6097 erhielt man pYA272. Die Subklonierung mit EcoRI wurde unter Erzielung von pYA275 durchgeführt (s. Fig. 14). Die Tn1000-Mutagenese führte zu vielen Insertionen in pYA275, die dann zur Analyse der Insertionsinaktivierung des asd-Gens auf Chi3630 transferiert wurden. Die Mutagenese und das Screening-Verfahren entsprachen im wesentlichen dem von Guyer (1983) beschriebenen Verfahren. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde ein 1,75 kb EcoRI- SstI-Fragment, welches das S. typhimurium asd&spplus;-Gen enthielt, in pUC18 zu pYA277 subkloniert (s. Fig. 14). 18. Konstruktion von pYA280 Zur Erleichterung der Konstruktion der Klonierungsvektoren mit dem S. typhimurium-asd&spplus;-Gen wurde der Vektor pYA280 (s. Fig. 15) konstruiert. Dieser Vektor enthält das S. typhimurium-asd&spplus;-Gen in einer Kassette. pYA280 wurde konstruiert durch Entfernung des 1,75 kb-EcoRI-PstI-Fragments, das das S. typhimurium-asd&spplus;-Gen aus pYA277 enthielt, Reinigung, Entfernung des 5'-Überhangs am SstI-Site, Auffüllen im 3'- Überhang am EcoRI-Site und Anfügen von BglII-Linkern durch Ligierung mit dem stumpfen Ende. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in ein Derivat von pUC-4k, bei dem der PstI-Site in einen BglII-Site umgewandelt wurde, kloniert. Der erhaltene rekombinante Vektor ist pYA280, der in Chi6097 eingeführt wurde.
Das S. typhimurium-asd&spplus;-Gen kann aus pYA280 als Kassette unter Verwendung der Restriktionsenzyme EcoRI, BamHI, SalI oder BglII entfernt werden.

19. Konstruktion von pYA292

Der Klonierungsvektor pYA292 (s. Fig. 16) wurde auf einer Reihe von Stufen unter Verwendung der üblichen DNA-Klonierungstechniken konstruiert. pYA292 enthält den rrnB-Transkriptionsterminator und den p15A-Ursprung der Replikation aus pYA248 (s. Fig. 5) sowie den Ptrc-Promotor bis zum HindIII-Site (s. Fig. 6). Das das S. typhimurium-asd+-Gen enthaltende 1,75 kb BglII-Fragment wurde aus pYA280 gewonnen (s. Fig. 15). Ein HindIII-Fragment, das die aus pYA230 gewonnene lacZ-α-Kodierungsseqenz (s. Fig. 4) enthält, wurde zugesetzt, um die Selektion zu ermöglichen, die sich an der blauen Färbung erkennen läßt, wenn der pYA292 enthaltende Stamm Chi6097 auf einem das chromogene Substrat X-gal enthaltenden Nährmedium plattiert wird. Die Insertion der DNA- Fragmente in einen der potentiellen Klonierungssites in pYA292 führt gewöhnlich zu einem Verlust des Vermögens, die β-Galactosidasen zu hydrolysieren, was unter diesen Plattierungsbedingungen zu weißen Kolonien führt. Dieser Verlust des Vermögens, die β-Galacotsidasen zu hydrolysieren, braucht jedoch nicht einzutreten, wenn die Insertion so geartet ist, daß sie die Synthese eines enzymatisch aktiven β-Galactosidase-Fusionsproteins erlaubt.
Die Klonierungssites in pYA292 umfassen die Restriktionsenzym-Sites für EcoRI, SmaI, BamHI, SalI und PstI.

20. Konstruktion von Expressionsvektoren, die ein asd&spplus;&supmin;-Gen und M. leprae-Antigene kodierendes Gen enthalten

20. 1. Isolierung von M. leprae-Antigene kodierenden Klonen aus einer λ-gtll-Bibliothek

Eine Bibliothek von M. leprae-Antigenen in λ-gtll wird hergestellt durch zufällige Aufteilung der M. leprae-DNA und Klonierung der DNA in den EcoRI-Site des Vektors, so daß Mycobakterienpolypeptide als Fusionsprotein mit β-Galaktosidase produziert werden. Die Expression der β-Glactosidase- Bibliothek erfolgt unter der Kontrolle des lac-Operons, so daß sie durch Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert werden kann.
Die λ-gtll::M. leprae-Bibliothek wird auf E. coli Y1090 plaquiert, wodurch man ca. 5000 Plaques pro Platte erhält. Die Platten werden dann 2 Stunden lang bei 42ºC gehalten, um die Bakteriophagen zu induzieren. Die Plaques werden dann mit Nitrocellulosemambranen belegt, die dann in 10 mM IPTG getaucht und während weiterer 2 Stunden bei 37ºc gehalten werden. Die Nitrocellulosemembranen werden dann in Tris- Puffer bei pH 8,0 mit 0,5% Tween 80 gewaschen und mit 0,25% BSA + 0,25% Gelatine im selben Puffer blockiert. Die verwendeten Sera von Leptrapatienten waren ein Geschenk von Dr. Thomas H. Rae. Die Sera von 21 Patienten werden gesammelt und stark mit ganzen Zellen und beschallten Extrakten von E. coli Y1090 absorbiert. Die beschallten Extrakte werden dann mit durch Cyanogenbromid aktivierter Sepharose 4B gekuppelt und auf Nitrocellulosemembranen aufgetropft und zur Entfernung der kreuz-reaktiven Antikörper verwendet. Die die Plaques enthaltenden Nitrocellulosefilter werden dann in einer 1:1000-Verdünnung der LL-Sera inkubiert, gewaschen und dann mit anti-menschlichen Antikörpern, die mit Alkalinphosphatase konjugiert sind, inkubiert, wonach die Reaktivität durch Verwendung des chromogenen Substratgemischs aus Nitro Blue Tetrazolium (NBT) und Bromchlorindolylphosphat (BCIP) ermittelt wid. Die positive Signale erzeugenden Plaques werden dreimal durch erneute Isolierung auf ähnliche Weise gereinigt. Unter Einsatz dieser Methode werden insgesamt 20 rekombinante Klone identifiziert. Die einzelnen Klone zeigen unterschiedliche Reaktivität, was die Intensität der Reaktivität gegenüber den LL-Sera betrifft.
Die Bibliothek wird auf Reaktivität des Expressionsproduktes unter Verwendung der folgenden Komponenten analysiert: Ein monoklonaer Antikörper gegen ein M. leprae-65kDa-Protein (s. Buchanan et al. (1987)); Sera von Patienten mit Lepra der LL-Form und mit Tuberkulose der TT-Form. Die Produkte werden durch Western blot-Analyse identifiziert.
Die immunologische Reaktivität der beiden Klone 3-2 und 7-8 ist in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5 Eigenschaften der immunologisch reaktiven Klone von λ-gtll::M. leprae Klon Nr. Insertgröße (kb) Reaktivität LL-Sera Reaktivität TT-Sera Reaktivität Mab - = keine Reaktivität; + bis ++++ = subjektive visuelle Bewertung; Mag = monoklonaler Antikörper.

20. B. Konstruktion der Expressionsvektoren, die Gene enthalten, welche asd und M leprae-Antigene kodieren

Gereinigte EcoRI-Inserts aus den λ-gtll-Klonen 3-2 und 7-8, wie sie in Beispiel 20. A. beschrieben wurden, werden, wie in den Fließschemata 17 und 18 angegeben, in pYA248 inseriert. Die erhaltenen rekombinanten Vektoren sind pYA1090 und pYA1091, die das Insert aus dem Klon 3-2 enthalten, sowie pYA1092 und pYA1093, die das Insert aus dem Klon 7-8 enthalten. Die Eigenschaften dieser Vektoren und ihre M. Leprae-Expressionsprodukte sind in Tabelle 6 angegeben. pYA1090 und pYA1092 haben die richtige Ausrichtung im Hinblick auf den Ptrc-Promotor und exprimieren Polypeptide, die mit den Patientenseren zu reagieren vermögen. Tabelle 6 Kennzeichnung der Subklone Rekombinantes Molekül Insertquelle Ausrichtung in bezug auf den trc-Promotor Molgew. des Polypeptids richtig umgekehrt * Reagieren mit Antikörpern in LL-Patientenseren.

21. Wirksamkeit der pYA1090 und pYA1092 enthaltenden Vakzinenstämme

Vakzinenstämme werden konstruiert durch Transformation eines avirulenten Stammes Chi4072 von S. typhimurium (s. Tabelle 1), der eine Deletionsmutante darstellt, der die Adenylatcyclase und das cyclische AMP-Rezeptorprotein fehlen, und der außerdem eine Deletionsmutation in asd enthält, mit Hilfe von pYA1090 und pYA1092.
M. leprae repliziert langsam in den Hinterpfoten von Mäusen. Die Immunreaktion auf Vakzinen gegen diesen Mikroorganismus kann entweder durch Messung des Unvermögens von M. leprae zur Replikation in der Pfote nach der Immunisierung oder durch Nachweis der delayed-type hypersensitivity (DTH) nach dem Einspritzen von Extrakten von abgetöteten M. leprae- Zellen in die Hinterpfoten immunisierter Mäuse überwacht werden (s. Shepard et al. (1980)).
Mäuse werden mit 10&sup9;-Transformanten, die wie oben beschrieben oral verabreicht werden, immunisiert, d.h. auf Chi 4072 mit pYA261 und pYA262, der das S. mutans SpaA-Protein exprimiert. IgA im Speichel und IgG im Serum gegen das M. leprae- Antigen wird wöchentlich nach der Immunisierung quantifiziert. Einen Monat nach der Immunisierung werden bestimmten Mäusen in einer ihrer beiden Hinterpfoten geeignete Mengen eines Extrakts von abgetöteten M. leprae-Zellen injiziert. Danach wird als Kontrolle in die andere Pfote abgepufferte Salzlösung injiziert. Eine Zellimmunreaktion wird durch eine DTH-Reaktion nachgewiesen, die sich in einer Schwellung der Pfote manifestiert, der der Extrakt aus M. leprae eingespritzt wurde. Eine weitere Gruppe immunisierter Mäuse wird mit 10&sup4; lebensfähigen Zellen von M. leprae in eine Hinterpfote beimpft. Sechs bis neun Monate später wurde der Titer der M. leprae-Zellen entweder durch mikroskopische Prüfung oder durch Verwendung einer für M. leprae spezifischen DNA- Sonde ermittelt. Eine Maus ohne wirksame Immunität zeigt einen Titer von 10&sup6; M. leprae-Zellen (ein 100facher Anstieg im Inokulat). Eine Maus mit wirksamer Immunität zeigt 10&sup4; Zellen oder sogar noch weniger, wenn M. leprae durch Makrophagen abgetötet und zerstört wurde.
Dieses Verfahren kann mit zahlreichen Chi4072-Derivaten wiederholt werden, welche unterschiedliche M. leprae-Antigene exprimieren, die anhand der Reaktivität mit Antikörpern in Seren aus LL- und TT-Patienten identifiziert werden. Schließlich können die besten Antigene selektiert und an Gürteltieren und dann an Menschen als Antilepravakzine bewertet werden.

18. Entfernung der Nalidixinsäureresistanz verleihenden gyrA1816-Allele in Vakzinestämmen

Die Behörden EPA, USDA und FDA gestatten nicht die Verwendung von Genen für Antibiotikaresistenz in Stämmen als Lebendvakzinen. Die gyrA1816-Mutation wurde in viele avirulente S. typhimurium-Mutanten als Mittel zur raschen Feststellung und Quantifizierung der Zahl der entsprechend überlebenden Stämme bei Laborversuchen an Mäusen eingeführt. Vor der Verwendung dieser Stämme als zulässige Vakzinen ist es notwendig, die gyrA1816-Mutation zu entfernen. Dies geschieht durch Verwendung des Stammes DB9031 (s. Tabelle 1), welcher das zeh-4::Tn10 aufweist, das zu 95% durch Kotransduktion mit dem gyrA&spplus;-Gen verknüpft ist.
Zuerst wird p22HTint auf DB9031 vermehrt, um nach den oben beschriebenen Verfahren ein transduzierendes Lysat herzustellen. Nach Entfernung der Bakterienbruchstücke wird das Lysat über Chloroform bei 4ºC aufbewahrt. Das auf DB9031 vermehrte P22HTint-Lysat kann zur Infektion eines Stammes mit einer gyrA1816-Allele wie Chi4072 (s. Tabelle 1) unter Einsatz einer Mehrfachinfektion von ca. 0,3 verwendet werden. Der Stamm CDhi4072 erfordert natürlich die Züchtung in mit Diaminopimelinsäure supplementierter Luria-Bouillon.
Nach 20 Minuten für die Adsorption und Injektion werden geeignete Verdünnungen auf DAP und 12,5 ug pro ml Tetracyclin enthaltendem Penassay-Agar plattiert. Danach werden diese Platten über Nacht inkubiert.
Anschließend werden 10 tetracyclinresistente Transduktanten aufgenommen und gereinigt, wonach sie getestet werden, um festzustellen, welche gegenüber Nalidixinsäure sensibel geworden sind (5 ug pro ml) und außerdem sämtliche übrigen Phänotyp-Eigenschaften, die mit den übrigen im Vakzinestamm vorliegenden Mutationen verknüpft sind, beibehalten.
Ein tetracyclinresistentes, gegenüber Nalidixinsäure sensibles Isolat wird iit auf dem Stamm Chi3000 vermehrtem P22HTint transduziert. Nachdem die Zellen im Verlaufe mehrerer Generationen im Hinblick auf Genotyp und Expression des Phänotyps homogen geworden waren, werden sie auf einem 6 ug Fusarsäure pro ml und Chlortetracyclin (autoklaviert) und die erforderlichen zusätzlichen Supplemente wie DAP enthaltenden Nähragar plattiert. Nach Halten über Nacht bei 37ºC werden isolierte Kolonien aufgenommen, gereinigt und auf den Verlust der Tetracyclinresistenz, wie oben beschrieben, getestet. Hohe Konzentrationen an Bekterien werden dann auf ihr Unvermögen, in bezug auf die Tetracyclinresistenz zu mutieren, als zusätzlichen Beweis für die Abwesenheit von Spuren des Tn10 getestet.
Obwohl die Erfindung anhand spezifischer Ausführungsformen illustriert wurde, schränken diese spezifischen Beispiele den Erfindungsumfang, wie er in den beigefügten Ansprüchen beschrieben wird, nicht ein.

Gewerbliche Verwendbarkeit

Die wirksame Immunität mit rekombinanten bivalenten avirulenten Salmonella-Stämmen macht erforderlich, daß der avirulente Mikroorganismus im GALT-Gewebe bzw. in den Peyer- Haufen des immunisierten Individuums über längere Zeit aufrechterhalten bleibt. Die fortgesetzte Besiedelung und/oder die fortgesetzte Produktion des Virulenzantigens, das von den Genen aus einem anderen pathogenen Organismus bestimmt wird, ist erforderlich, um einen hohen Grad an Schutzimmunität gegenüber dem pathogenen Organismus hervorzurufen. Frühere Untersuchungen unter Verwendung traditioneller Expressionsvektoren mit Antibiotikaresistenz-Markern ergaben, daß avirulente, aus immunisierten Tieren isolierte Salmonellastämme nach einer Woche das das Immunisierungsgen kodierende rekombinante Plasmid verloren hatten und daher nicht weiter in der Lage waren, die Schutzimmunität gegenüber dem pathogenen Organismus hervorzurufen. Die Verwendung eines eine δ-asd-Mutation enthaltenden Salmonellastammes und eines das asd&spplus;-Gen von S. mutans oder S. typhimurium enthaltenden Ezpressionsvektors gewährleistet die beständige Aufrechterhaltung der klonierten Gene. So besiedelt der Stamm Chi4072 zusammen mit pYA262 das GALT-Gewebe in Balb c- Mäusen, so daß die Titer der 10&sup4; bis 10&sup5; SpaA produzierenden Zellen auch noch eine Woche nach der oralen Immunisierung aufrechterhalten werden. Diese Titer entsprechen jenen, die mit Chi4064 von S. typhimurium (der asd&spplus;-δ-cya-δ-crp-Elter von Chi4072, s. Tabelle 1) erhalten werden. Die gelegentliche Lyse einer Zelle, die den asd&spplus; enthaltenden Vektor verloren hat, ist insofern günstig, als dadurch das erwünschte Antigen freigesetzt und die Immunreaktion gegen das Antigen gesteigert wird.
Die biotechnologische Industrie vermag heute eine große Zahl technisch wichtiger Nebenprodukte herzustellen, die von gentechnisch veränderten Mikroorganismen synthetisiert werden. Die beständige Aufrechterhaltung dieser gentechnisch veränderten Mikroorganismen unter den Züchtungsbedingungen eines Bioreaktors wird durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Zellen erleichtert, und zwar durch die Zellen, welche δ-asd-Mutationen und Polynucleotidinserts in derselben Zelle enthalten, die ein asd&spplus;-Gen als selektierbaren Marker aufweist. Die einzigen Zellen, die gezüchtet werden können und Proteine exprimieren, sind solche, welche das erwünschte Antigen kodieren. Auf diese Weise kann die Ausbeute an erwünschtem Produkt gesteigert werden.
Die erfindungsgemäßen Zellen sind außerdem geeignet als Mikroorganismen, die in die Umwelt zwecks Abbau von Umweltgiften, Vernichtung von Schadinsekten oder um bestimmten Pflanzenarten Vorteile zu verleihen, freigesetzt werden. In allen Fällen werden durch die Erfindung Zellen erzeugt, bei denen die Lebensfähigkeit mit der Expression eines erwünschten klonierten Genprodukts verknüpft ist.

Claims

1. Verfahren zur Erzeugung und Isolierung von Bakterien mit einer Mutation in einem Gen, das ein Enzym kodiert, das eine Stufe in der Biosynthese einer wichtigen Zellwandkomponente katalysiert, wobei diese aus DAP synthetisiert wird, das folgende Stufen umfaßt:

a) Züchtung und Mutagenisierung der elterlichen Bakterien in DAP enthaltenden Medien und

b) Selektion auf Bakterienmutanten unter Verwendung eines Züchtungsmediums, welches die Expression der Auxotrophie erlaubt, jedoch DAP und ein Antibiotikum enthält, welches die Zellwandbiosynthese in den Bakterien stört.

2. Rekombinantes Plasmid, das geeignet ist für die Komplementation eines Bakterienstammes mit einem Asd-Phänotyp, der ein erstes Asd kodierendes rekombinantes Gen und Restriktionsenzymsites enthält, wobei ein zweites, ein erwünschtes Produkt kodierendes rekombinantes Gen inseriert werden kann, wobei das erste rekombinante Gen aus S. mutans oder S. typhimurium stammt und wobei das Plasmid pYA248, wie es bei ATCC unter der Nr. 67538 hinterlegt wurde, und funktionell gleichwertige Mutanten davon oder pYA292, wie es bei ATCC unter der Nr. 67813 hinterlegt wurde, und funktionelle gleichwertige Mutanten davon darstellt.

3. Lebender bakterieller Träger, der ein avirulentes Derivat eines pathogenen Stammes eines Vertreters der Familie Enterobacteriaceae, umfaßt, der gekennzeichnet ist durch:

a) das Fehlen eines funktionsfähigen, nativen, β-Aspartat- Semialdehyddehydrogenase kodierenden chromosomalen Gens, wobei die Funktion der defektiven β-Aspartat-Semialdehyddehydrogenase nicht durch ein anderes im Wirtschromosom kodiertes natives Enzym dupliziert ist;

b) die Anwesenheit eines ersten, die β-Aspartat-Semialdehyddehydrogenase kodierenden rekombinanten Gens, wobei dieses erste, die β-Aspartat-Semialdehyddehydrogenase kodierende rekombinante Gen gewöhnlich nicht mit dem defektiven chromosomalen β-Aspartat-Semialdehyddehydrogenase-Gen rekombiniert werden kann;

c) die Anwesenheit eines zweiten rekombinanten, ein erwünschtes Polypeptid kodierenden Gens und

d) die physikalische Verknüpfung zwischen dem ersten rekombinanten Gen und dem zweiten rekombinanten Gen, wobei der Verlust des ersten rekombinanten Gens Enterobacteriaceae in einem Medium, das zum Überleben der Zelle die Expression des ersten rekombinanten Gens erfordert, zur Lyse veranlaßt.

4. Bakterieller Träger nach Anspruch 3, bei dem das avirulente Derivat des pathogenen Stammes eines Vertreters der Familie Enterobacteriaceae ein Vertreter der Gattung Salionella ist.

5. Bakterieller Träger nach Anspruch 3 oder 4, bei dem das erste rekombinante Gen die aus S. mutans stammende β-Aspartat-Semialdehyddehydrogenase kodiert.

6. Bakterieller Träger nach Anspruch 3 oder 4, bei dem das erste rekombinante Gen die aus S. typhimurium stammende β- Aspartat-Semialdehyddehydrogenase kodiert.

7. Bakterieller Träger nach einem der Ansprüche 3 bis 6, bei dem das zweite rekombinante Gen Antigene aus M. leprae kodiert.

8. Bakterieller Träger nach einem der Ansprüche 3 bis 6, bei dem das zweite rekombinante Gen mit spaA von S. mutans kodierte Antigene kodiert.

9. Gemisch, das einen lebenden bakteriellen Träger nach einem der Ansprüche 3 bis 8 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.

10. Gemisch nach Anspruch 9 zur Verwendung in einem Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort bei einem Individuum.

11. Gemisch nach Anspruch 9 zur Verwendung als Impfstoff.

12. Verfahren zur Herstellung eines bakteriellen Trägers für einen Impfstoff für die Immunisierung eines Individuums, wobei dieses Verfahren folgende Stufen umfaßt:

a) Bereitstellung eines avirulenten Derivats eines pathogenen Stammes eines Vertreters der Familie Enterobacteriaceae nach einem der Ansprüche 3 bis 8;

b) Bereitstellung eines geeigneten pharmazeutischen Trägers und

c) Mischen der Bakterien mit dem Träger in einer geeigneten pharmakologischen Dosis.

13. Plasmid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus pYA248, wie es bei ATCC unter der Nr. 67538 hinterlegt wurde, oder pYA292, wie es bei ATCC unter der Nr. 67813 hinterlegt wurde, Plasmiden, die davon durch Insertion eines ein Polypeptid kodierenden Gens in einen Restriktionsenzymsite abgeleitet sind, und funktionellen gleichwertigen Mutanten davon.

14. Mit dem Plasmid nach Anspruch 13 transformierter Bakterienstamm.

15. Bakterienstamm, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus ATCC Nr. 67537, ATCC Nr. 53679, ATCC Nr. 53681, ATCC Nr. 67538, ATCC Nr. 53680, ATCC Nr. 53678 und ATCC Nr. 67813.