DE3888652T2

DE3888652T2 - Vakzine.

Info

Publication number: DE3888652T2
Application number: DE3888652T
Authority: DE
Inventors: Steven Neville Chatfield; Gordon Dougan; Carlos Estenio Dr Hormaeche
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1987-12-23
Filing date: 1988-12-22
Publication date: 1994-07-07
Anticipated expiration: 2008-12-23
Also published as: EP0322237A1; IE65176B1; BR8807376A; ATE103331T1; NZ227472A; EP0322237B1; MY104367A; RU2114172C1; HUT55242A; ZA889605B; IL88766A; HK1000469A1; PH31428A; JPH02502785A; DK174952B1; DK412689D0; DE3888652D1; HU216449B; ES2061700T3; HU890702D0

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf orale Vakzine auf der Basis von genezisch attenuierten Mikroorganismen und auf die Mikroorganismen selbst. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf attenuierte Stämme von Salmonella.
1950 wurde von Bacon et al, (Br. J. Exp. Path. 31: 714-724) gezeigt, daß bestimmte auxotrophe Mutanten von S.typhi in Mäusen im Vergleich zu dem elterlichen Stamm attenuiert waren. Bestimmte dieser Stämme wiesen Mutationen im aromatischen anabolen Stoffwechselweg und im anabolen Purin-Stoffwechselweg auf. Es ist auch bekannt, daß andere Mutationen, wie z. B. thy A bei Bakterien eine Attenuation bewirken.
1981 beschrieben Hosiet und Stocker (Nature 241: 238-239) den Aufbau eines S.thyphimurium aro A-Mutanten vor. Die aro A-Mutation war unter Verwendung von Transposon Tn 10-Mutagenese erfolgt, um S.thyphimurium-Stämme zu bilden, die nicht-revertierende Schädigungen im aro A-Gen tragen. Dieses Gen kodiert das Enzym 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase, ein Schlüsselenzym im aromatischen anabolen Stoffwechselweg von Organismen, welches bei Säugetieren fehlt. Aro A-Mutanten sind daher zum Wachstum von exogenen aromatischen Verbindungen, einschließlich der aromatischen Aminosäuren, p-Aminobenzoesäure und 2,4-Dihydroxybenzoat abhängig. Bei Inzuchtmäusen wurde gezeigt, daß S.thyphimurium aro A-Mutanten attenuiert sind, und es stellte sich heraus, daß sie wirksame lebende Vakzine gegen Maus-Salmonellose bei Mäusen darstellen, wenn sie oral oder parenteral verabreicht werden.
Wenn ein Mikroorganismus in lebendiger Form in einer Vakzinpräparation verwendet werden soll, ist aus Sicherheitsgründen festgelegt, daß der Mikroorganismus mit mindestens zwei Mutationen vorzugsweise in separaten Teilen des Genoms, attenuiert ist. Es ist offensichtlich wichtig, daß ein derartiger Mikroorganismus nicht zu dem virulenten Elternteil revertiert. Die Wahrscheinlichkeit für dieses Ereignis wird bei einer einzigen Mutation als gering erachtet. Allerdings ist die Gefahr der Reversion, die in einem Stamm, der in zwei separaten Genen, die an verschiedenen Stellen im Genom lokalisiert sind, Mutationen beherbergt, unbedeutend. Ein doppelter Mutant dieser Sorte wird demnach als ein viel sicherer Kandidat zur Verwendung in einem Vakzin angesehen.
In der EP-A-184086 (The Board of Trustees on the Leland Stanford Junior University; Erfinder: Bruce Stocker) ist der Aufbau eines nicht-revertierenden Stamms von S.typhi beschrieben, welcher nicht-revertierende aro A- und pur A-Mutationen beherbergt. Nicht-revertierende Mutationen sind solche Mutationen, die nicht in einem einzigen Schritt repariert werden können. Genetische Mutationen dieser Sorte umfassen Inversionen und Deletionen einer DNA-Sequenz, welcher Teil eines Gens ist.
In unseren Untersuchungen haben wir gezeigt, daß eine intravenose Verabreichung von nicht-revertierenden aro A pur A-Mutanten von S.typhimurium eine nur schwache Leistung beim Schutz von BALB/c-Mäusen gegen einen intravenösen Angriff darstellt. Es zeigte sich, daß diese Mutanten beim Schutz von BALB/c-Mäusen unwirksam sind, wenn sie oral verabreicht werden (O'Callaghan et al, 1988 Infect. Immun. 56, 419-423).
Die aro A- und pur A-Mutationen können unter Verwendung von Transposons hergestellt werden. Dies sind DNA-Sequenzen von zwischen 750 Basenpaaren und viele tausend Nukleotidpaaren, welche ihr genetisches Material an verschiedenen Positionen im bakterieliem Chromosom integrieren konnen. Manche Transposon kodieren ein Gen, welches dem Organismus, der das Transposon enthält, antibiotische Resistenz verleihen kann. Wenn das Einfügen an einer Stelle erfolgt, ist die Kontinuität des Gens oft unterbrochen und dies führt zu dem Verlust der Genfunktion. Mit einer Frequenz von etwa 10&supmin; &sup8;/Zellen/Generation werden Transposons exakt aus dem Gen gestrichen. Dies bringt die Genfunktion wieder zurück; häufiger allerdings tritt eine ungenaue Ausmerzung auf. Dies bringt die Genfunktion nicht wieder zurück und führt oft zu einer nicht-revertierenden Mutation.
Einiges an Arbeit, das zur Bestätigung dieser Erfindung durchgeführt wurde, ist auf S.typhi, den Verursacher von menschlichem Typhus, konzentriert. S.typhi ist im wesentlichen ein menschlicher Krankheitserreger und somit für die meisten Tierexperimente nicht geeignet. Tieruntersuchungen werden unter Verwendung eines Mausmodells und des Organismus S.typhimurium einem nahen verwandten Organismus, welcher eine typhusähnliche Erkrankung bei Mäusen und Vieh hervorruft, durchgeführt. Eine Beschreibung dieses Mausmodells kann in Collings, 1974, Bacteriol Rev. 38, 371, gefunden werden.
Ein Mikroorganismus, der zur Verwendung in einem Vakzin in Frage kommt, muß die folgenden Eigenschaften aufweisen:
I) Ausreichend attenuiert, so daß er es im wesentilchen nicht schafft, die Infektion, wie mit dem unattenuierten Mikroorganismus verbunden ist, hervorzurufen;
II) im wesentlichen unfähig zur Reversion zur Virulenz;
III) fähig, eine Immunität in einem Tier, dem der Organismus eingeimpft worden ist, zu bewirken und so Schutz gegen einen nachfolgenden Angriff mit dem virulenten Stamm bereitzustellen.
Es wird angenommen, daß die lebenden Mikroorganismen, die im Stand der Technik zur Verwendung als Vakzine beschrieben sind, nicht alle obengenannten notwendigen Kriterien erfüllen konnten. Nichts desto trotz bleibt der Wunsch, ein lebendes Vakzin zu entwickeln, welches die Unzulänglichkeiten des Standes der Technik vermeidet, da es sich nämlich gezeigt hat (Collins, Bacteriol Rev. 1974), daß lebende Bakterien im allgemeinen eine größere immunisierende Wirksamkeit haben als abgetötete Bakterien. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gezeigt, daß die Einführung einer nicht-revertierenden Mutation in jedes von zwei separaten aro-Genen im aromatischen anabolen Stoffwechselweg eines Bakteriums einen zur Verwendung in einer lebenden Vakzin-Präparation geeigneten Organismus liefert.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein attenuiertes Bakterium bereitgestellt, das eine nicht-revertierende Mutation in jedem von zwei separaten aro-Genen des aromatischen anabolen Stoffwechselwegs beherbergt. Nach einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines attenuierten Bakteriums bereit, welches die Einführung einer zweiten nicht-revertierenden Mutation in ein zweites aro-Gen in ein Bakterium, das eine erste nicht-revertierende Mutation in einem ersten aro-Gen enthält, umfaßt. Es sind mindestens 10 Gene in die Synthese von Chorismat, der Verzweigungspunkt-Verbindung im Biosyntheseweg der aromatischen Aminosäure involviert. Viele von diesen liegen an weit voneinander entfernten Orten im bakteriellem Genom. Aro-Gene schließen aro A (5- Enolyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase), aro C (Chorismat-Synthase), aro D (3-Dihydrochinat-Dehydratase) und aro E (Shikimat-Dehydrogenase) ein.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung erfolgen demnach die Mutationen in dem aro A-, aro C-, aro D- oder aro E-Gen. In drei Ausführungsformen liefert die Erfindung eine aro A aro E-Bakterienmutante, eine aro A aro C-Bakterienmutante und eine aro A aro D-Bakterienmutante, obgleich andere doppelte aro-Mutanten im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen. Ein attenuiertes Bakterium der vorliegenden Erfindung kann typischerweise eine der nicht-revertiertenden Mutationen, die im aro A-Gen auftreten, enthalten. Eine-zweite nicht-revertierende Mutation kann dann typischerweise im aro C- oder aro E-Gen erfolgen.
Diese Arbeit kann insbesondere auf einen gesamten Bereich von bakteriellen Krankheitserregern (speziell invasive bakterielle Krankheitserreger, welcher in eukaryotische Zellen eindringen und dort wachsen oder sich auf muskosalen Oberflächen ansiedeln) ausgedehnt werden. Beispiele für diese umfassen Glieder der Stämme Salmonella, Bordetella und Haemophilus. Andere Beispiele sind Glieder der Gattungen Neisseria, Mycobacteria, Leptospira und Streptococcus. Besondere Beispiele sind S.typhi, der Erreger von menschlichem Typhus; S.thyphimurium, der Erreger von Salmonellose bei verschiedenen Tierarten; S.enteritidis, ein Erreger von Lebensmittelvergiftungen bei Menschen; S.cholerasuis, der Erreger von Salmonellose bei Schweinen; Bordetella pertussis, der Erreger von Keuchhusten; Haemophilus influenzae, ein Erreger von Meningitis; Mycobacterium tuberculosis, der Erreger von Tuberkulose sowie Neisseria gonorrhoeae, der Erreger von Gonorrhö, Yersinia pestas, der Erreger von Beulenpest.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein S.typhi, Stamm Ty 2, bereitgestellt, der entweder nicht-revertierende aro A aro C- oder aro A aro E-Mutationen oder nicht-revertierende aro A aro D-Mutationen beherbergt.
Der Aufbau von S.typhi Ty2 aro A ist in MGG 207, 402 (Dougan et al) dokumentiert. Nicht-revertierende Mutationen wurden durch Transduktion von LT2 aro A:: Tn10-Marker in S.typhi Ty2-Stamm erzeugt. Tn10-Transposon trägt ein Gen, das Tetracyclinresistenz kodiert. Transduktanten, welche Tetracyclin-resistent sind, werden selektiert, indem Kolonien auf einem geeigneten Medium wachsengelassen werden. Eine weitere Selektion erfolgt durch Durchmustern nach jenen Bakterien, die das Gen der Tetracyclinresistenz verloren haben und die ebenfalls von Aromaten abhängig sind.
Ein alternatives Verfahren zur Einführung einer Deletion in das S.typhi aro A-Gen (oder andere S.typhi aro-Gene) beinhaltet eine Transposon-Mutagenese eines geklonten S.typhi aro A-Gens, Rekombination des mutierten Gens in das S.typhi-Chromosom, das das Gen des Wildtyps durch den Mutanten ersetzt, Selektion für eine ungenaue Exzision des Transposons. Dieses Verfahren eliminiert die Einführung von Nicht-S.typhi-DNA in den Vakzin-Stamm.
Im Prinzip gibt es verschiedene Wege zur Einführung der zweiten Mutation in das zweite Gen. Ein Verfahren beinhaltet Transposon-Mutagenese, d. h. die Einfügung eines versetzbaren Elements in das zweite Gen und anschließendes Verlassen auf seine ungenaue Exzision durch das Bakterium in der gleichen Weise wie es oben für den Aufbau der ersten Mutation beschrieben ist. Die Einführung einer Mutation in eine zweites aro-Gen produziert einen doppelten aro-Mutanten. Dies ist phänotypisch nicht von einem Einzel- aro-Mutanten zu unterscheiden. Um das erste mutierte aro-Gen zu vervollständigen, wird demnach eine geklonte Kopie eines der Gene an einem Plasmid in das Bakterium eingefügt und das Bakterium unter Verwendung des geeigneten Selektionsmediums auf Abhängigkeit von aromatischen Verbindungen untersucht.
Ein anderes Verfahren beinhaltet Klonen des zweiten Gens in einen Vektor, beispielsweise ein Plasmid oder Cosmid, dann Einbauen eines selektierbaren Markergens in das geklonte zweite Gen, wobei das Gen gleichzeitig inaktiviert wird. Ein Plasmid, das das inaktivierte Gen und einen anderen selektierbaren Marker trägt, können durch bekannte Techniken in das Bakterium eingeführt werden. Es ist dann durch geeignete Selektion möglich, einen Mutanten zu identifizieren, indem eine Rekombination des inaktivierten Gens in das Chromosom des Bakteriums erfolgt ist und die eigene Kopie des Bakteriums vom Gen verlorengegangen ist. Der verwendete Vektor ist insbesondere einer, der im Bakterium instabil ist und spontan verschwindet. Das mutierte Gen am Plasmid und die Bakterium-eigene Kopie des Gens an seinem Chromosom können durch ein genetisches Crossing-over ausgetauscht werden. Zusätzliche Verfahren eliminieren die Einführung von fremder DNA in Vakzin-Stämme an der Stelle von Mutationen.
Die aro A aro C- und aro A aro E- und aro A aro D-Mutanten der vorliegenden Erfindung sind ausreichend attenuiert, um im wesentlichen zur Verwendung in Vakzinen sicher zu sein, und sind ausreichend immunogen, um eine Immunantwort in einem Patienten zu erhöhen, die dem Patienten vor einem nachfolgenden Angriff durch den virolenten Stamm Schutz bieten wird.
Ein attenuiertes Bakterium der vorliegenden Erfindung kann fähig sein, ein heterologes Antigen zu exprimieren. Die Stämme der vorliegenden Erfindung können genetisch so gebaut sein, daß sie Antigene von einem oder mehreren verschiedenen Krankheitserregern exprimieren. Solche Krankheitserreger können virale, bakterielle, protozoale oder höhere parasitäre Organismen sein. Die Krankheitserreger können sowohl Menschen wie auch andere Säugetiere infizieren, können aber selektive Arten oder sogar spezifische Arten sein. Solche Stämme können dann die Basis für ein bi- oder multivalentes Vakzin bilden. Beispiele für verwendbare Antigene umfassen E.coli-wärmelabile Toxin B-Untereinheit (LT-B)-E.coli K88-Antigene, FMDV (foot and Mouth)-Peptide, virale Influenzaproteine, 69Kd-Protein von B.pertussis. Andere Antigene, die nützlicherweise exprimiert werden könnten, sind jene von Chlamydia, Plattwürmern, Mykoplasma, Rundwürmen, Bandwürmen, Tollwutvirus und Rotavirus.
Diese Antigene können durch Einführung des Gens oder der Gene, die sie kodieren, in Expressionskassetten hergestellt werden. Expressionskassetten werden zusätzlich zu DNA-Sequenzen, die das Strukturgen kodieren, DNA-Sequenzen enthalten, welche eine Transkriptions- und Translations-Initiation sowie Terminationsbereiche kodieren. Die Expressionskassette kann auch Regulationsbereiche umfassen. Derartige Expressionskassetten sind auf dem Fachgebiet bekannt, und der Fachmann auf diesem Gebiet weiß sie zu konstruieren. Die Expressionskassette kann ein konstruiertes oder ein natürlich vorkommendes Plasmid sein. Ein Beispiel für ein genetisch aufgebautes attenuiertes Salmonella, welches ein fremdes Antigen exprimiert, kann in der EP-A-0 127 153 (SSVI/Wellcome) gefunden werden. Die Expressionskassette kann auch so aufgebaut sein, daß sie den Einbau des heterologen Gens in das bakterioelle Chromosom zuläßt.
Ein weiteres bivalentes Vakzin, das ein attenuiertes Salmonella typhi, enthält, welches fähig ist, die E. coli-hitzelabile Enterotoxin-Untereinheit B zu exprimieren, wurde von Clements et al (Infection and Immunity, 46, Nr. 2, Nov. 1984, S. 564-569) offenbart. Ty21a wurde verwendet, um andere Antigene wie z. B. das Shigella sonnei-Form-I-Antigen (Formal et al, Infection and Immunity 34, S. 746-750) zu exprimieren.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein attenuiertes Bakterium - wie es hier beschrieben ist - bereitgestellt, das mit einer Expressionskassette, die ein Antigen eines Krankheitserregers kodiert, transformiert ist, wobei dieses Antigen im Gebrauch durch das attenuierte Bakterium exprimiert wird.
Nach einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, welche ein attenuiertes Bakterium - wie es hier beschrieben ist - im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Arzneimittelträgerstoff enthält. Vorzugsweise ist die pharmazeutische Zusammensetzung eine Vakzinzusammensetzung.
Das Vakzin liegt vorteilhafterweise in lyophilisierter Form, beispielsweise in Form von Kapseln, zur oralen Verabreichung an einen Patienten vor. Derartige Kapseln können mit einer enteralen Beschichtung versehen sein, die z. B. Eudragat "S", Eudragate "L", Celluloseacetat, Cellulosephthalat oder Hydroxypropylmethylcellulose umfaßt. Diese Kapseln können als solche verwendet werden, oder alternativ kann das lyophilisierte Material vor der Verabreichung wieder aufbereitet werden, beispielsweise als Suspension. Eine Aufbereitung wird vorteilhafterweise in einem Puffer bei einem geeigneten pH durchgeführt, um die Lebensfähigkeit des Organismus zu gewährleisten. Um die attenuierten Bakterien und das Vakzin vor Magensäure zu schützen, wird vor jeder Verabreichung des Vakzins vorteilhafterweise eine Natriumbicarbonat-Präparation verabreicht. Alternativ kann das Vakzin für parenterale Verabreichung, intranasale Verabreichung oder intramammäre Verabreichung zubereitet sein.
Ein Verfahren zur prophylaktischen Behandlung einer bakterielien Infektion umfaßt die Verabreichung einer wirksamen Menge eines attenuierten Bakteriums der vorliegenden Erfindung an einen Patienten. Die verwendete Dosis wird von verschiedenen klinischen Faktoren abhängen, einschließlich von Größe und Gewicht des Patienten sowie dem Typ des hergestellten Vakzins. Für attenuiertes S.typhi ist eine Dosierung, die eine Verabreichung von 10&sup9; bis 10¹¹ S.typhi-Organismen pro Dosis für einen erwachsenen menschlichen Patienten mit einem Körpergewicht von 70 kg angemessen.
In den folgenden Beispielen werden experimentelle Details, die mit der vorliegenden Erfindung im Zusammenhang stehen, angegeben. Es ist selbstverständlich, daß diese Beispiele die Erfindung in keiner Weise beschränken sollen. Fig. 1, die sich auf die Beispiele bezieht, stellt die Persistenz von S.typhimurium SL3261, SL1344 aro C und SL1344 aro A aro C in der Milz von Mäusen dar. Log&sub1;&sub0; lebender Organismus/Organ ist gegen Tage nach der Infektion aufgetragen.
Aufbau von S.typhi aro A aro E- und Aro A aro C- und aro A aro D-Vakzinstämmen.
Alle Stämme wurden unter Verwendung des Stammes S.typhi Ty2 aro A, der vorher im Detail beschrieben wurde und Gegenstand des Artikels von Dougan et al Mol. Gen. Genet. (1987) 207: 402-405 ist, als Starter aufgebaut.

BEISPIEL 1

S.typhi Ty2 aro A aro E

Stamm S typhimurium LT2 aro E::Tn10 wurde vom Salmonella Stock Centre in Calgary erhalten. Er war ursprünglich von J. Roth. isoliert worden. Phage P22 war auf LT2 aro E::Tn10 gewachsen, um ein Lysat herzustellen. Das P22-Phagen-Lysat wurde verwendet, um S.typhi Ty2 aro A zu transduzieren, wobei auf Tetracclin-Resistenz selektiert wurde. An diesem Punkt wurde ein Plasmid, das ein geklontes aro A von S.typhimurium C5 kodiert, in den Stamm S.typhi aro A eingeführt, um die aro A-Mutation zu vervollständigen. S.typhi aro A aro E::Tn10, das das geklonte aro A-Gen trug, war phänotypisch von aromatischen Verbindungen abhängig normalerweise von aro-Mutanten gefordert) . Das Tn10-Element wurde aus dem aro E-Gen entfernt, indem Tetracyclin-sensitive Varianten auf Bochner-Medium selektiert wurden, wobei eine bekannte Technik verwendet wurde (Bochner et al, J Baceriol, 143, 929-933) .S.typhi aro A aro E-Mutanten, die das geklonte aro A-Gen beherbergten, wurden unter Verwendung eines Minimalmediums auf aromatische Anhängigkeit untersucht. Kolonien, die von Aromaten abhängig sind, wurden selektiert und Intensiv auf aro E-Reversion untersucht, indem 10¹¹-Organismen auf ein Minimalmedium, das keine aromatischen Verbindungen aufwies, aufgetragen wurden und das Medium bei 37ºC inkubiert wurde und 5 Tage lang auf revertierende Kolonien untersucht wurde. Kolonien, welche trotz erschöpfenden Durchmusterns aro E-stabil waren, wurden vermehrt, um Varianten, welche spontan das geklonte aro A-Gen verloren hatten, zu selektieren. Es wurde ein S.typhi aro A aro E-Mutant selektiert. Dieser wurde gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei der National Collection of Type Cultures, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT unter der Zugriffsnummer 12164, mit Datum vom 15. November 1987, hinterlegt.

BEISPIEL 2: S.typhi Ty2 aro A aro C

Als Starterstamm wurde der Stamm S.typhi Ty2 aro A verwendet. Das aro C-Gen von S. typhi Ty2 wurde unter Verwendung von Cosmiden geklont, um unter Verwendung der Verfahren von Hohn und Colling (Gene 11: 291-298 (1978)) E.coli aro C zu ergänzen. Das aro C-Cosmid wurde einer Transposon Tn 5- Mutagenese unterworfen und unterkloniert, um ein kleines DNA-Fragment, das das klonierte aro C-Gen kodiert, unterzubringen. Das geklonte aro C-Gen wurde inaktiviert, indem ein Gen der Quecksilbermetallresistenz in den kodierenden Bereich für aro C kloniert wurde. Ein Plasmid, der das inaktivierte aro C trug, wurde in S.typhi aro A eingeführt. Dieses Plasmid enthält auch ein Gen für Ampicillin-Resistenz. Durch Selektieren der Quecksilberresistenz und der Anpicillin-Empfindlichkeit war es möglich, einen Mutanten zu identifizieren, indem ein inaktiviertes aro C in dem S.typhi- Chromosom rekombiniert war, wobei ein S.typhi aro A aro C-Mutant hergestellt worden war.
Es wurde ein alternativer Aufbau durchgeführt, welcher die Verwendung eines Kanamycin-Resistent-Gens (Km-R) anstelle des Gens für Quecksilbermetall-Resistenz beinhaltete.
S.typhi Ty2 aro A aro C Km-R wurde bei der National Collection of Type Cultures, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT unter der Zugriffsnummer 12165 mit Datum vom 25. November 1987 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt.

BEISPIEL 3: Aufbau eines Salmonella typhi aro A aro D-Doppelmutanten

S.typhi aro A wurde als Starterstamm verwendet. Der Aufbau des S.typhi aro D wurde erreicht, indem der Stamm mit einem P22-Phage-Lysat, das unter Verwendung des Donorstamms LT2 aro D553::Tn10 hergestellt worden war, transduziert wurde und indem nach Tetracyclin-Resistenz selektiert wurde. Ein Isolat wurde gereinigt und zur Herstellung von Tecracyclin-sensitiven Derivaten durch Selektion auf Bochner-Medium verwendet. Einige von diesen wurden gereinigt und mit Plasmid pAB51 (aro A&spplus;) transformiert, um die aro A-Deletion zu ergänzen. Eines der Tetracyclin-sensitiven Isolate, das stabil von aromatischen Verbindungen abhängig war, wenn es dieses Plasmid beherbergte, wurde als S.typhi Ty2 aro A aro D bezeichnet.
Alle konstruierten S.typhi-Stämme, die Mutationen in verschiedenen aro-Genen beherbergten, die noch Vi-Antigen produzierten, waren "0" inagglutinabel, 09 agglutinabel im Anschluß an Kochen und gehörten zum Flagelien-Typ Hd. Ein derartiger aro A aro D-Stamm wurde bei der National Collection of Type Cultures, 61 Colldale Avenue, London, unter Nr. NCTC 12209 mit Datum vom 15. Dezember 1988 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt.

BEISPIEL 4: Aufbau von doppelten aro-Mutanten in S.typhimurium, S.dublin und S.cholerasuis

Es wurde eine aro A-Deletion in S.typhimurium SL1344, S.dublin, S.cholerasius eingeführt, und zwar unter Verwendung des Verfahrens von McFarland und Stocker. Zur Umwandlung der gesamten Salmonella-stämme wurde ein Phagen-Lysat, das aus dem Stamm TT472 hergestellt worden war, verwendet, wobei Tetracyclin-resistente Kolonien selektiert wurden. Stamm TT442 trägt Tn10, in sec C, welches stromaufwärts von und im selben Operon wie aro A ist, eingefügt. Tetracyclin-resistente Transduktionskeime waren von aromatischen Verbindungen, Serin und Pyridoxin abhängig. Ein zweites P22- Lysat wurde hergestellt, auf SL5254, welches eine bekannte Delektion in aro A hat, wachsengelassen. Dies wurde verwendet, um die Tetracylin-resistenten Stämme umzuwandeln, welche ser C::Tn10 waren; dann wurden Transduktanten auf Minimalmedium, dem Serin und Pyridoxin fehlten, das aber aromatische Verbindungen enthielt, selektiert. Kolonien, die auf Minimalmedium mit zugesetzten aromatischen Verbindungen, aber in Anwesenheit von Serin und Pyridoxin wuchsen, waren Tetracyclin-sensitiv und von aromatischen Verbindungen abhängig.

BEISPIEL 4a: Aufbau von S.typhimurium aro A aro C

S.typhimurium aro A aro C wurde konstruiert, indem zuerst eine stabile aro C-Mutation aus dem avirulenten S.typhimurium-stamm SA2018 in den Maus- virulenten S.typhimurium-Stamm SL1344 gebracht wurde, wobei die folgenden Transduktionsserien verwendet wurden. Ein P22-transduzierendes Lysat, das unter Verwendung von S.typhimurium-Stamm SGSC592 zei608::Tn10 hergestellt worden war, wurde zur Transduktion von Tn10 in Stamm SA2018 verwendet. Tn10 in Stamm SGSC592 ist zu 40 % an das aro C-Gen des Wildtyps gekoppelt, wohingegen Stamm SA2018 eine stabile aro C-Mutation beherbergt. Tetracyclin resistente Transduktanten wurden auf Minimalmedium ausgewahlt und es wurde festgestellt, daß verschiedene Kolonien von Aromaten abhängig sind. Eines dieser Isolate wurde gereinigt und zur Herstellung eines Zweiten P22- Phagen-Lysats Verwendet. Dieses Lysat wurde zur Transduktion von S.typhimurium SL1344 verwendet; es wurden wieder verschiedene Tetracyclinresistente von Aromaten abhängige Transduktionskeime identifiziert. Ein Isolat wurde verwendet, um Tetracyclin-sensitive Derivate durch Selektion auf Bochner-Medium herzustellen. Ein Tetracyclin-sensitives, von aromatischen Verbindungen abhängiges Isolat wurde gereinigt, dann eine aro A-Deletion in das eingeführt, wobei die vorher beschriebene Methode von McFarland und Stocker verwendet wurde. Um zu bestätigen, daß dieses Isolat aro A aro C war, wurde es entweder mit Plasmid pAB51 (aro A&spplus;) oder pTMC12H (aro C&spplus;) transformiert; es stellte sich heraus, daß es von aromatischen Verbindungen abhängig ist, wenn es eins von diesen Plasmiden beherbergt.

BEISPIEL 4b: Aufbau von S.typhimurium aro A aro D

S.typhimurium aro A aro D wurde durch Einführung einer aro D-Deletion im SL1344 aro A-Stamm konstruiert. Dies wurde erreicht, indem der Stamm mit einem P22-Phagen-Lysat, das unter Verwendung eines Donorstamms LT2 aro D 554::Tn10 hergestellt worden war und Selektieren nach Tetracyclinresistenz, transduziert wurde. Ein Isolat wurde gereinigt und zur Herstellung von Tetracyclin-sensitiven Derivaten durch Selektion auf Bochner-Medium verwendet. Einige von diesen wurden gereinigt und zur Vervollständigung der aro A-Deletion mit Plasmid pAB51 (aro A&spplus;) transformiert. Eins der Tetracyclinsensitiven Isolate, das, wenn es dieses Plasmid beherbergt, stabil von aromatischen Verbindungen abhängig war, wurde als SL1344 aro A aro D bezeichnet.

BEISPIEL 4c: Aufbau von S.typhimurium aro A aro E

S.typhimurium aro A aro E wurde durch Einführung einer aro E-Deletion in den Stamm SL1344 aro A konstruiert. Dies wurde durch Transduktion des Stamms mit einem P22-Pagen-Lysat, das unter Verwendung von Donorstamm LT2 aro E::Tn10 hergestellt worden war, und Selektion nach Tetracyclin-Resistenz erreicht. Ein Isolat wurde gereinigt und zur Herstellung von Tetracyclin-sensitiven Derivaten durch Selektion auf Bochner-Medium verwendet. Einige von diesen wurden gereinigt, dann mit Plasmid pAB51 (aro A&spplus;) zur Vervollständigung der aro A-Deletion transformiert. Eines der Tetracyclin- sensitiven Isolate, das stabil von aromatischen Verbindungen abhängig ist, wenn es dieses Plasmid beherbergt, wurde als SL1344 aro A aro E bezeichnet.

BEISPIEl 5:

S.dublin und S.cholerasius aro A aro D-Derivate wurden in der gleichen Weise wie das in Beispiel 4b dargestellte SL1344 aro A aro D-Derivat konstruiert.

In vivo-Eigenschaft von attenuierten S.thyphimurium-Stämmen

Einzelheiten über die S.thyphimurium-Stämme, die in dieser Arbeit verwendet wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Infektion von Mäusen und Aufzählung von Bakterien in Mäuseorganen

Zur Bestimmung der Zahl von Organismen in verschiedenen Organen nach einer tnt-i.v.-Inokulation von S.typhimurium, wurden Leber und Milz homogenisiert, wie es in Hormaeche, CE, Immunology, 37, 311-318 beschrieben ist. Mit diesen Homogenaten wurden Lebend-Keimzahlen gebildet, indem L-Agar als Wachstumsmedium verwendet wurde. Diese Keimzahlen wurden in Fig. 1 in geometrischer Form dargestellt, wobei jeder Punkt für vier Mäuse gilt und die Standardabweichung ± 2 ist.
Von Natur aus für Salmonella empfindliche BALB/c-Mäuse mit einem Alter von 8 bis 10 Wochen wurden in den Beispielen 6, 7 und 8 verwendet. Die intravenöse (i.v.) LD&sub5;&sub0; für virulente Stämme wurde bestimmt, indem Gruppe von 5 Mäusen in Reihen mit zehnfachen Verdünnungen, die in Phosphat-gepufferter Salzlösung mit einem pH 7,2 (PBS) hergestellt wurden, von Kulturen, die nach einem Wachstum von einer Nacht von Kulturnährböden durch Zentrifugation geerntet worden waren und in PBS resuspendiert worden waren, wobei eine Endkonzentration von 10&sup9; bis 10¹¹ Bakterien pro ml erreicht wurden, injiziert wurden. Diese Konzentration wurde in Reihe zehnfach in PBS verdünnt, die verabreichte Spitzendosis, die 0,2 ml der Rindersuspension beträgt, wurde intravenös oder oral 8 bis 10 Mäusen pro Gruppe gegeben. Die Todesfälle wurden über die folgenden vier Wochen aufgezeichnet und die LD&sub5;&sub0; wurde unter Verwendung des Verfahrens von Reed und Muench Am. J. Hyg. 27: 493-497 (1983) berechnet. Für i.v.-Inokulation wurden 0,2 ml bakterielle Suspension in die Schwanzvene injiziert. Zur oralen Inokulation wurden Bakterien in 0,2 ml-Volumen den mit Ether leicht anästhesierten Mäusen verabreicht, und zwar durch eine Magensonde, wie es vorher beschrieben wurde (Microbial Pathogenesis 2: 211-221).

BEISPIEL 6

Attenuierung von virulenten S.typhimurium-Stämmen durch Einführung von stabilen aro-Mutationen und anderen auxotrophen Mutationen.

S.thyphimurium HWSH und SL1344 sind beides Maus-virulente Stämme, mit einer LD&sub5;&sub0; von weniger als 10 Organismen nach einem i.v.-Angriff in BALB/c- Mäusen. Intravenöse LD&sub5;&sub0; wurden für selektierte auxotrophe Derivate dieser Stämme in BALB/c-Mäusen (Tabelle 2) bestimmt. Alle aro A- und pur A-Mutanten wurden im Vergleich zu den Elternstämmen gut attenuiert. HWSH-aro A und SL3261 (SL1344 aro A) hatten LD&sub5;&sub0;s von Log 7,4 bzw. Log 7,1 in guter Übereinstimmung mit veröffentlichten Daten. Die pur A- und aro A pur A-Derivate waren sogar weiter attenuiert. Der HWSH pur E-Stamm war beträchtlich weniger attenuiert, obgleich festgestellt wurde, daß die gemessene LD&sub5;&sub0; zwischen den Experimenten beträchtlich Variierte. So starben manchmal Mäuse, denen etwa nur 100 Organismen verabreicht worden waren, während andere bei bis zu 10&sup4; bis 10&sup5; Organismen überlegten. Die aro C aro A-Mutante war weniger attenuiert als die aro A pur A-Mutante, die einen LD&sub5;&sub0; von 6,5 hatte. Das gleiche war bei dem einzelnen er C-Mutanten. Oral verabreichte aromatische oder Purin-Muntanten töteten dIe Mäuse nicht, selbst wenn Dosen in einer Höhe von 10¹&sup0; Organismen gegeben wurden.

BEISPIEL 7

Persistenz von einzelnen oder doppelten aro-Mutanten von S.thyphimurium nach i.v.-Inokulation von BALB/c-Mäusen.

Alle S.thyphimurium-Stämme wiesen ein ähnliches Muster der Persistenz ohne nach 56 Tage nachweise Salmonellen in der Leber (Fig. 1).
Attenuierte Stämme von S.thyphimurium als oral verabreichte Vakzine.

BEISPIEL 8

Die Fähigkeit von oral verabreichten auxotrophen S.thyphimurium-Stämmein zum Schutz von BALB/c-Mäusen gegen einen oralen Angriff mit virulenten S.thyphimurium (SL1344) wurde behandelt. Mäuse wurde anfangs oral mit zwischen 10&sup9; bis 10¹&sup0; auxotrophen Mutanten infiziert und dann wurden die immunisierten Mäuse 4 Wochen später mit dem parentalen virulenten Stamm angegriffen.
Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen klar, daß weder pur A- noch aro A pur A-Mutanten irgendeinen bedeutenden Schutz gegen einen oralen Angriff angaben, wohingegen die aro A-, aro C- und aro A aro C-Mutanten bedeutenden Schutz gegen oralen Angriff sowohl 28 wie 70 Tage nach der Immunisierung zeigten.

BEISPIEL 9: Rezept

Ein S.typhi-Organismus der vorliegenden Erfindung liegt vorzugsweise in oraler Tablettenform vor. Ingredienz mg/Tablette 1) Gefriergetrockneter Arzneimittelträgerstoff enthaltend 10&sup9; bis 10¹&sup0; Salmonella typhi. Core-Tabletten 2) Siliziumdioxid 3) Dipac (97 % Saccharose) 4) Vernetztes Povidon (Kollidon CL) 5) Mikrokristalline Cellulose (Avicel pH 102) 6) Magnesiumstearat Beschichtung 7) Opadry Enteric, OY-P-7156 (Polyvinylacetatphthalat + Diethylphthalat
Es wird ein Trägerstoff, der 5 % Saccharose, 1 % Natriumglutamat und 1 % Bactocasiton in einem wäßrigen Lösungsmittel enthält, hergestellt. Ein S.typhi-Organismus wird in diesem Trägerstoff suspendiert und dann der Gefriertrocknung unterworfen.
Das gefriergetrocknete Material wird mit Aeosril 200 vermischt und das Gemisch wird durch ein Sieb gesiebt. Das gesiebte Pulver wird mit Dipac, Kolidan CL, Aricel pH 102 und Magnesiumstearat in einem Mischer vermischt. Diese Mischung wird zur nachfolgenden enterischen Beschichtung in Tabletten gepreßt.
Dem Fachmann auf diesem Gebiet ist klar, daß viele der Ingredenzien in dieser Rezeptur durch in der Funktion äquivalente pharmazeutisch akzeptable Arzneimittelträgerstoffe ersetzt werden können. Tabelle 1 Stämme von S.typhimurum, die in dieser Untersuchung verwendet wurden. Stamm Auxotrophie Prototroph * Ein mausvirulenter, kalbvirulenter Stamm, der aus einem Kalb, das an Salmonellose gestorben ist, isoliert wurde. Tabelle 2 LD&sub5;&sub0;-Werte, die erhalten wurden, indem BALB/c-Mäuse intravenös mit verschiedenen auxotrophen Derivaten von zwei hoch virulenten S.typhimurium- Stämmena infiziert wurden. Log LD&sub5;&sub0; a Alle LD&sub5;&sub0;s wurden nach 28 Taben errechnet, außer HWSH pur E, der nach 56 Tagen errechnet wurde. Tabelle 3 Immunisierender Stamm Angriff Tag nicht immunisiert Anmerkung: SL3261 ist aro A

Claims

1. Attenuiertes Bakterium, das eine nicht-revertierende Mutation in jedem von zwei separaten aro-Genen des aromatischen anabolen Stoffwechelswegs beherbergt.

2. Attenuiertes Bakterium nach Anspruch 1, bei dem eine der nicht- revertierenden Mutationen in dem aro A-Gen auftritt.

3. Attenuiertes Bakterium nach Anspruch 2, bei dem eine zweite nicht-revertierende Mutation in einem der Gene: aro C-Gen und aro E-Gen auftritt.

4. Attenuiertes Bakterium nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Mikroorganismus unter den Gattungen Salmonella, Bordetella und Haemophilus ausgewählt ist.

5. Attenuiertes Bakterium nach Anspruch 4, wobei das Bakterium S.typhi ist.

6. Attenuiertes Bakterium S.typhi, Stamm Ty2, das entweder aro A aro C- oder aro A aro E- nicht-revertierende Mutationen beherbergt.

7. Attenuiertes Bakterium nach Anspruch 5, welches ein Stamm von S.typhi ist, wie er in der National Collection of Type Cultures unter der Zugriffsnummer 12 164 oder 12 165 hinterlegt ist.

8. Attenuiertes Bakterium nach einem der vorangehenden Ansprüche, das fähig ist, ein heterologes Antigen zu exprimieren.

9. Attenuiertes Bakterium nach Anspruch 8, das eine Expressionskassette mit einer DNA-Sequenz enthält, die ein Antigen eines Krankheitserregers kodiert.

10. Attenuiertes Bakterium nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verwendung in der prohpylaktischen Behandlung einer bakteriellen Infektion.

11. Attenuierter s.typhi-Organismus nach einem der Ansprüche 5 bis 7 zur Verwendung in der prophylaktischen Behandlung von Thyphus bei Menschen.

12. Vakzin umfassend ein attenuiertes Bakterium nach einem der vorangehenden Ansprüche im Gemisch mit einer pharmazeutisch akzeptablen Arzneimittelträgersubstanz.

13. Verfahren zur Herstellung eines attenuierten Bakteriums, welches die Einführung einer zweiten nicht-revertierenden Mutation in ein zweites aro-Gen in einem Bakterium, das eine erste nicht-revertierende Mutation in einem ersten aro-Gen enthält, umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die zweite Mutation durch Transposon-Mutagenese eingeführt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13, umfassend Klonierung des zweiten aro-Gens in einen Vektor; Einbauen eines selektierbaren Markergens in das geklonte Gen, um dadurch das geklonte Gen zu inaktivieren: Einführen eines Plasmids, das das inaktivierte Gen und ein anderes selektierbares Markergen trägt, in das Bakterium sowie Selektieren eines Mutanten dieses Bakteriums, in dem eine Rekombination des inaktivierten Gen in das Chromosom des Bakteriums erfolgt ist.