DE3588076T2

DE3588076T2 - Nichtrevertierende Salmonella-Lebendimpfstoffe

Info

Publication number: DE3588076T2
Application number: DE3588076T
Authority: DE
Inventors: Bruce A D Stocker
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1984-11-27
Filing date: 1985-11-22
Publication date: 1996-05-23
Anticipated expiration: 2005-11-23
Also published as: EP0184086B1; US4735801A; IL77166A; AU5196686A; ES8703525A1; IE72975B1; ES549285A0; DK353686A; IL77166A0; EP0184086A2; JP2610016B2; DK174969B1; CA1259934A; AU584963B2; WO1986003123A1; DE3588076D1; IE852963L; JPS62501211A; DK353686D0; ATE132901T1

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Impfung mit lebenden attenuierten Stämmen wird ausgiebig und erfolgreich zur Prävention vor verschiedenen Viruserkrankungen des Menschen, wie Polio, Pocken und Masern verwendet. Im Gegensatz dazu werden Lebendimpfstoffe nur gegen wenige bakterielle Erkrankungen des Menschen oder der Haustiere verwendet: BCG-Impfstoff zur Prävention vor Tuberkulose, Stamm19-Impfstoff gegen Rinderbruzellose und Sterne's-Sporen - Impfstoff gegen Anthrax bei Vieh. Bis jetzt haben bei vielen Untersuchungen an experimentellen Salmonella-Infektionen Lebendimpfstoffe Vorteile gegenüber abgetöteten Impfstoffen gezeigt: (i) Häufig verhindern sie die Vermehrung der Salmonella in der Leber und der Milz eher, als sie nur aufzuschieben, wobei diese Vermehrung zum Tode führen kann; (ii) sie stellen einen guten Schutz gegenüber einem immunologischen Stimulus (challenge) auf dem oralen Weg in Situationen bereit, in denen abgetöte Impfstoffe, die durch Injektion oder oral gegeben werden, relativ ineffektiv sind; (iii) in manchen Fällen verleihen Injektionen von Lebendimpfstoff die Fähigkeit, immunologisch stimulierende Bakterien schnell aus Leber, Milz, usw. zu eliminieren, vermutlich durch zellvermittelte Immunität, im Gegensatz zu abgetöteten Impfstoffen, die haupsächlich humorale Immunität hervorrufen, ohne große Fähigkeit, virulente Bakterien zu eliminieren. Die Verwendung von Salmonella Lebendimpfstoffen ist jedoch durch eine Anzahl von Faktoren erschwert. Einige Stämme, die zur Verwendung äls Lebendimpfstoffe in Erwägung gezogen werden, behalten durch Reversion oder anders einen nicht akzeptablen Grad an Virulenz. Einige Lebendimpfstoffe zeigen kurze Persistenz der Immunität, was auf das frühe Verschwinden des Impfstoffstamms vom Gewebe des Wirts und in einigen Fällen auf unvollständige Immunität zurückgeführt wird, so daß einige geimpfte Tiere nach einem großen immunologischen Stimulus mit einem Inokulum eines virulenten Stamms sterben. Die nichtvirulenten Stämme, die als Impfstoffe verwendet werden, sind auf verschiedenen Wegen erhalten worden. Der BCG- Stamm wurde durch ein empirisches Verfahren während einer verlängerten in vitro-Kultivierung gewonnen und verdankt seine Nichtvirulenz wahrscheinlich vielen, nicht identifizierten Mutationen. Sterne's Bacillus anthracis Sporenimpfstoff ist ein Stamm, der die Fähigkeit verloren hat, die Polypeptidkapsel zu synthetisieren, die als Determinante der Virulenz wichtig ist, aber nicht als "schützendes" Antigen. Einige Experimentatoren haben als Lebendimpfstoff nur eine subletale Dosis eines "Wild"-Stamms von relativ geringer Virulenz verwendet, in dem Sinne, daß die LD50 eine große Anzahl an Bakterien war--eine Situation, in der offensichtlich das Risiko von schwerer oder tödlicher Infektion, die sich in einigen Impflingen entwickelt, und von Übertragung auf andere Wirte besteht.
Vor kurzem sind Bakterienstämme für die Verwendung als Lebendimpfstoffe entwickelt worden, die Streptomycin-abhängige Mutanten von Stämmen mehrerer pathogener Arten sind. Streptomycin-abhängige Mutanten von Shigella flexneri und Shigella sonnei sind ausgiebig als Lebendimpfstoffe verwendet worden, die oral zum Schutz gegeben worden sind, und es hat sich herausgestellt, daß sie beide sowohl sicher als auch wirksam sind. Bei experimentellen Salmonella-Infektionen scheint es jedoch, daß die Streptomycin-abhängigen Mutanten nur bedingt zufriedenstellend gewesen sind. Im allgemeinen sind "rough"-Mutanten von Gram-negativen Bakterienarten, d.h. Mutanten, die nicht fähig sind normales Lipopolysaccharid herzustellen, nichtvirulent, haben sich aber als unbefriedigende Lebendimpfstoffe erwiesen, da sie keinen Schutz gewährten. Zwei Ausnahmen können zur Kenntnis genommen werden. (i) In Salmonella verhindert die Mutation des Gens ga1E die normale Lipopolysaccharidsynthese, es sei denn, dem Bakterium wird vorgeformte Galaktose bereitgestellt. Eine gale Mutante von S. typhimurium war in kleinen Labortieren praktisch nichtvirulent, rief aber gute Immunität hervor. Da Anti-O- Antikörper hergestellt wurden, müssen die ga1E Bakterien genügend Galaktose in den Geweben des Wirts für sich erhalten haben, um wenigstens einige O-spezifische Lipopolysaccharide herzustellen. Vor kurzem zeigte sich eine ga1E Mutante von S. typhi, die menschlichen Freiwilligen mit der Nahrung gegeben wurde, als nichtvirulent und verlieh vernünftigen Schutz gegenüber einem späteren oralen immunologischen Stimulus mit einem virulenten Stamm der gleichen Arten. Weiterhin zeigen erste Berichte eines Feldversuchs mit diesem Stamm, der auf oralem Weg Schulkindern in Alexandria, Ägypten, verabreicht wurde, daß er sehr guten Schutz gegenüber dem Risiko, an Typhus zu erkranken, gewährt, der eine hohe Erkrankungsquote bei solchen Kindern hat. Die Nicht-Virulenz der ga1E Stämme scheint von der Präsenz der normalen zellulären Verteidigungsmechanismen des Wirts abzuhängen, da durch Verabreichung des cytotoxischen Mittels Cyclophosphamid an Mäuse, denen vorher eine ga1E Mutante von S. typhimurium, die für nicht behandelte Tiere nicht pathogen ist, injiziert wurde, auf Grund der Vermehrung des ga1E Stamms tödliche Infektionen herbeigeführt wurden. (ii) Eine "rough"- Mutante von S. dublin wird in Großbritannien routinemäßig als Lebendimpfstoff verwendet, der durch parenterale Injektion zum Schutz von neugeborenen Kälbern gegen die häufig tödlichen Salmonella- Infektionen gegeben wird, die früher weit verbreitet waren; da der verwendete Stamm einen Mangel des O-spezifischen Lipopolysaccharidanteils zeigt, wirkt er vermutlich, indem er "nicht-spezifische Immunität" hervorruft, vielleicht indem er Aktivierung der Makrophagen verursacht.
Da Lebendimpfstoffe wesentlich größere Wahrscheinlichkeit auf Erfolg haben, einen Schutz für den Wirt gegen eine anschließende Invasion eines virulenten Wildstamms bereitzustellen, ist es wünschenswert, neue Lebendimpfstoffe zu entwickeln, die die Mängel der früher hergestellten Impfstoffe vermeiden. Da die Immunantwort des Wirbeltierwirts auf Antigene, insbesondere Oberflächenantigene, der pathogenen Mikroorganismen der grundlegende Schutzmechanismus der Impfung mit einem Lebendimpfstoff ist, sollte der antigenische Komplement des Wildtypstamms behalten werden. Der Lebendimpfstoff sollte nichtvirulent und im wesentlichen unfähig zur Vermehrung im Wirt sein und im wesentlichen keine Wahrscheinlichkeit haben, zu einem virulenten Wildstamm zu revertieren.
Ein nichtvirulenter Lebendimpfstoff kann auch als Wirt für die Expression von Antigenen dienen, die im Cytoplasma lokalisiert, zur Plasmamembran oder zur äußeren Membran transloziert oder sekretiert sein können, um Immunogene für eine Immunantwort beim Säugetierwirt bereitzustellen. Durch Verwendung eines Lebendimpfstoffs als Träger eines Immunogens, insbesondere eines invasiven Wirts, wie Salmonella typhi, kann ein starker Stimulus für das Immunsystem bereitgestelllt werden, insbesondere für das humorale Immunsystem. Auf diese Weise können viele der Vorteile der Verwendung von attenuierten lebenden Pathogenen, wie Bakterien, Pilzen, Protozoen und Viren ohne Sorge vor einer Reversion zu einer virulenten Form genutzt werden.

2. Kurze Beschreibung des Stands der Technik

Sandhu et al., Infection and Immunity (1976) 13, 527 beschreibt den Verlust der Virulenz von Aspergillus fumigatus in einer für p-Aminobenzoesäure auxotrophen Mutante. Morris et al., Brit. J. Exptl. Path. (1976) 57: 354 beschreibt die Wirkung von T und B Lymphozytendepletion auf den Schutz von Mäusen, die mit einer ga1E Mutante der Salmonella typhimurium geimpft worden sind. Lyman et al., Inf. Imm. (1977) 15:491 verglichen die Virulenz von 0:9,12 und 0:4,5,12 S. typhimurium his&spplus; Transduktanten für Mäuse. Beschreibungen der Verwendung von translozierbaren Elementen, um Deletionen oder Inversionen zu verursachen, können bei Kleckner et al., J. Mol. Biol. (1977) 116, 125; Kleckner et al., ibid 127, 89; und Kleckner et al., Genetics, 90:427-464 (1978) gefunden werden. U.S. Patent No. 4,337,314 für Oeschger et al. beschreibt die Herstellung von H. influenzae Lebendimpfstoffstämmen durch das Kombinieren von Zufallsmutationen in einem einzelnen Stamm. Hoiseth und Stocker, J. Bacteriol. (1985) 163:335-361, beschreiben die Beziehung von aroA und serC Genen des S. typhimurium.
In einer privaten Mitteilung teilte Dr. John Roth, Department of Biology, University of Utah, die Entwicklung zweier Stämme von S. typhimurium LT2 mit, wobei in jedem von diesen das Transposon Tn10, das Resistenz gegen Tetrazyklin verleiht, in ein Gen des aromatischen Biosyntheseweges eingeführt wurde, wodurch die Unfähigkeit, den gemeinsamen Vorläufer der aromatischen Aminosäuren und zweier bakterieller Metaboliten, p-Aminobenzoat (Vorläufer des essentiellen Metaboliten Folsäure) und Dihydroxybenzoat (Vorläufer der Eisenchelatverbindung Enterochelin oder Enterobaktin) zu synthetisieren, verursacht wurde. R. J. Yancey (1979) Infection and Immunity, 24, 174 berichtet, daß eine Mutation, die die Unfähigkeit Enterochelin zu synthetisieren, verursacht, die in einem Maus-virulenten Stamm von S. typhimurium sichergestellt wurde, eine sehr beachtliche Reduktion der Virulenz verursachte. Die metabolische Blockierung war zwischen Chorisminsäure und Enterobaktin, so daß die Mutation nicht den Bedarf an p-Aminobenzoat verursacht. Im Mai 1979 wurde von Stocker und Hoiseth eine Veröffentlichung mit dem Titel "Effect of Genetic Defects in Iron Assimilation on Aromatic Biosynthesis onVirulence of Salmonella typhimurium" präsentiert.

Zusammenfassung der Erfindung

Lebendimpfstoffe werden zur Impfung eines Wirts gegen einen pathogenen Mikroorganismus, inbesondere Bakterien, bereitgestellt und dienen auch als Träger für Immunonogene anderer Pathogene, insbesondere Mikroorganismen, wozu Viren, Prokaryonten und Eukaryonten gehören. Die Lebendimpfstoffe werden durch Herstellung auxotropher Mutanten eines pathogenen Stamms hergestellt, wobei ein Biosyntheseweg blockiert ist, so daß die bakterielle Mutante eine Bereitstellung von wenigstens einem Nährmittel benötigt, das normalerweise nicht im Wirt in der vom Mikroorganismus benötigten Menge verfügbar ist.
Die auxotrophe Mutation ist ein Ergebnis einer genetischen Veränderung in wenigstens zwei unabhängigen Genen innerhalb des gleichen Biosyntheseweges, wobei diese Veränderungen nicht in einem einzelnen Schritt repariert werden können. Zu derartigen genetischen Veränderungen gehören Deletion und /oder Inversion eines Polynukleotidsegments des Gens, insbesondere dort, wo eine Inversion direkt benachbart zu einer eingefügten fremden Nukleotidsequenz in dem Gen auftritt. Für die erfindungsgemäßen Absichten werden diese Veränderungen als "nichtrevertierende Mutationen" bezeichnet. Normalerweise wird sich die nichtrevertierende Mutation nicht auf die antigene Konstitution des pathogenen Mikroorganismuses auswirken und es werden sich insbesondere ihre Oberflächenantigene nicht ändern, von denen einige wichtige Determinanten der Pathogenität sein könnten.
Die so erhaltenen auxotrophen Mutanten haben im wesentlichen eine Wahrscheinlichkeit von Null für die Reversion, wobei sie die gleichen oder im wesentlichen die gleichen immunogenen Charakteristiken wie der virulente Stamm haben, so daß sie eine effektive Immunantwort erzeugen.
Insbesondere werden auxotrophe Mutanten durch Verwendung eines virulenten Stamms erhalten, wünschenswerterweise hat er einen genetischen Marker, der seine Selektion erlaubt, und wenigstens eine nichtrevertierende Mutation in wenigstens zwei unabhängigen Genen erzeugt, um eine komplette Blockierung in der Biosynthese eines essentiellen Metaboliten herzustellen, der normalerweise in den Geweben des Wirbeltiers nicht verfügbar ist. Durch Isolieren der Mutante und Screening auf die Unfähigkeit zur Revertierung, auf den Mangel an Virulenz und auf die Immunisierungsfähigkeit, wenn sie als Lebendimpfstoffe verwendet werden, können Stämme, die als Lebendimpfstoff verwendbar sind, erhalten werden.

Beschreibung der speziellen Ausführungsformen

Aus lebenden, nichtvirulenten Mikroorganismen hergestellte Impfstoffe werden bereitgestellt, die besonders nützlich zum Impfen von Wirbeltierwirten sind, die zugänglich für Krankheiten von entsprechenden pathogenen Mikroorganismen sind. Die nichtvirulenten Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, können als Träger für Antigene anderer Pathogene dienen, um eine mehrfache Immunantwort zu erzeugen und humoralen und/oder zellulären Schutz vor zwei oder mehr Pathogenen zu fördern. Die Mikroorganismen sind auxotroph und haben in wenigstens zwei Genen eine nichtrevertierende, "nicht umgehbare" Blockierung in einem Biosyntheseweg, wodurch ein Bedarf an einem Nährstoff bzw. Nährstoffen verursacht wird, der (die) in dem zu impfenden Tier nicht in ausreichenden Mengen verfügbar ist (sind), um eine Vermehrung des Mikroorganismuses zu erlauben. So können die Impfstoffstämme auf mit dem (den) Nahrungsmittel(n) ergänzten Medien wachsen und werden, wenn sie in den Wirt eingeführt werden, weiterhin leben (bis sie durch die Immunantwort des Wirts eliminiert werden), aber werden unfähig sein, sich zu vermehren.
Die nichtrevertierende Blockierung wird durch Einführen einer Mutation in Gene, die ein Enzym codieren, das für bestimmte Schritte eines Biosynthesewegs unentbehrlich benötigt wird, erzeugt. Da das Produkt dieses Weges in dem zu impfenden Wirt nicht verfügbar ist, wird der Mikroorganismus nicht fähig sein, sich zu vermehren, obwohl er lebt und seine nativen Antigencharakteristiken behält. Die Mutation ist nichtrevertierend, da die Wiederherstellung der normalen Genfunktion nur durch willkürliches und zusammenfallendes Auftreten von mehr als einem Ereignis, wobei jedes Ereignis sehr selten ist, auftreten kann.
Im Fall einer Deletions-Mutation würde die Wiederherstellung der genetischen Information viele zusammenfallende und willkürliche Nukleotidinsertionen zusammen erfordern, um die verlorene genetische Information wiederherzustellen. Im Fall einer kombinierten Insertion und Inversion würde die Wiederherstellung der Genfunktion ein Zusammenfallen einer präzisen Deletion der insertierten Sequenz und eine präzise Re- Inversion der benachbarten invertierten Sequenz erfordern, wobei jedes dieser Ereignisse eine äußerst winzige und nichtnachweisbar geringe Häufigkeit des Auftretens hat. So hat jede der beiden Sorten der "nichtrevertierend" auxotrophen Mutationen im wesentlichen eine Wahrscheinlichkeit von Null für das Revertieren zur Prototrophy.
Während eine einzelne nichtrevertierende Blockierung einen hohen Grad an Sicherheit gegen mögliche Reversion zur Virulenz bereitstellt, bleiben dennoch Ereignisse, die obwohl unwahrscheinlich, eine endliche Wahrscheinlichkeit des Auftretens haben.
Gelegenheiten zur Reversion existieren da, wo Mikroorganismen im Wirt existiren, die durch Konjugation die genetische Fähigkeit auf den nichtvirulenten Organismus transferieren können.
Zusätzlich zu den auxotrophen Mutationen, die eine Vermehrung in dem geimpften Tier verhindern, ist es wünschenswert, daß der Mikroorganismus für die Verwendung als Lebendimpfstoff eine oder mehrere genetische markierende Eigenschaft(en) "Marker" hat, die ihn von anderen Mikroorganismen der gleichen Arten, entweder Wildstämmen oder andere Lebendimpfstoffstämmen, einfach unterscheidbar machen. Günstigerweise kann der Marker ein Ernährungsbedarf sein, wie ein Histidinbedarf. Derartige Marker sind beim Unterscheiden des Impfstoffstamms von Wildtypstämmen nützlich, insbesondere wenn ein geimpfter Patient einer Salmonella Infektion als Folge einer Ansteckung, bevor die Impf-Immunität sich gebildet hat, erliegt. Nach der Manipulation des Mikroorganismus, um die nichtrevertierenden Mutationen in einige Mitglieder der Population einzuführen, läßt man die Mikroorganismen unter Bedingungen wachsen, die die Isolation der auxotrophen Mutanten erleichtern; entweder unter Bedingungen, unter denen derartige Mutanten einen selektiven Vorteil gegenüber den elterlichen Bakterien haben oder unter Bedingungen, die ihre einfache Unterscheidung von unveränderten Bakterien oder andersgearteten Mutanten erlauben. Die isolierten auxotrophen Mutanten werden kloniert und auf Virulenz, auf die Unfähigkeit zu revertieren und auf die Fähigkeit, den Wirt vor einem virulenten pathogenen Stamm zu schützen, gescreent.
Das genannte Verfahren zur Herstellung der Impfstoffe, und diese Impfstoffe, haben eine große Anzahl an Vorteilen gegenüber früheren Impfstoffen. Im Gegensatz zu anderen Impfstoffen stellt die genannte Erfindung den exakten Grund für den Verlust der Virulenz bereit. Anders als bei anderen Lebendimpfstoffstämmen, die auf Grund von Änderungen des Lipopolysaccharidcharakters nichtvirulent sind, werden die genannten Impfstoffe, sowohl im O-antigenen Charakter als auch an anderen Oberflächenantigenen, die eine Relevanz für die Virulenz und die Immunität haben können, so wie an den wichtigsten äußeren Membranproteinen, im wesentlichen unverändert sein. So würden die genannten Impfstoffe die Herstellung von anti-O-Antikörpern stimulieren, von denen bekannt ist, daß sie wichtige Komponenten für die durch Impfung erreichbare Immunität sind. Die genannten Stämme sollten in der Lage sein, für ausgedehnte Zeitspannen im Wirt auszuharren, gewöhnlich Wochen, um die Effektivität der immunisierenden Wirkung durch kontinuierliche Stimulation des Immunsystems des Wirts zu verstärken, bis das Immunsystem des Wirts alle diese Organismen beseitigt hat. Die auxotrophen Mutanten, die nichtrevertierende, "nicht umgehbare" Mutationen in unabhängigen Genen des gleichen Biosyntheseweges haben, werden im wesentlichen eine Wahrscheinlichkeit von Null für die Reversion zur Virulenz haben. Angesichts der Tatsache, daß die Nichtvirulenz von der Abwesenheit relevanter Metaboliten in den Geweben des Wirts abhängt und nicht von irgendeiner zellulären Funktion des Wirts, werden die genannten Stämme sogar in immundefizienten Wirten nichtvirulent sein.
Unter Bakterien ist die genannte Erfindung insbesondere auf eine breite Vielfalt von Salmonella Stämmen anwendbar, bevorzugt von den Gruppen A,B oder D, zu denen die meisten Arten gehören, die spezifisch pathogen für einzelne Wirbeltierwirte sind. Beispielhaft für die Salmonella, die Krankheiten verursachen, für die Lebendimpfstoffe hergestellt werden können, sind sowohl S. typhimurium; S. typhi; S. abortus-ovi; S. abortus-equi; S. dublin; S. gallinarum; S. pullorum; als auch andere, von denen bekannt ist oder von denen entdeckt werden kann, daß sie in Säugetieren Infektionen verursachen.
Zu andere Organismen, für die die genannte Erfindung auch verwendet werden kann, gehören Shigella, insbesondere S. flexneri und S. sonnei; Haemophilus, insbesondere H. influenzae, bevorzugt Typ b; Bordetella; insbesondere B. pertussis; Neisseria, insbesondere N. meningitidis und N. gonorrohoeae; Pasteuralla, insbesondere P. multocida und Yersinia, insbesondere Y. pestis.
Die Impfstoffe können sowohl für eine breite Vielfalt an Haustieren als auch für den Menschen verwendet werden. Zu den Haustieren, die heutzutage durch Impfstoffe behandelt werden oder behandelt werden könnten, wenn sie für bakterielle Krankheiten zugänglich sind, gehören Hühner, Kühe, Schweine, Pferde, Ziegen und Schafe, um die wichtigeren Haustiere zu benennen.
Um die Lebendimpfstoffe herzustellen, wählt man einen Stamm des Pathogens, der wünschenswerterweise einen Marker hat, um die auxotrophe Mutante, die hergestellt werden soll, von anderen Mitgliedern des Stamms zu unterscheiden. Alternativ kann solch ein Marker in den Impfstoffstamm eingeführt werden. Verschiedene Marker können verwendet werden, wie zum Beispiel Resistenz gegenüber antibiotischen oder synthetischen antibakteriellen Arzneimitteln, eine Blockierung in einem Biosyntheseweg, der den Bedarf an einer Aminosäure, z.B. Histidin, verursacht oder etwas ähnliches. Als Einschränkung für den speziellen Marker gilt, daß er weder den immunogenen Charakter des Mikroorganismus beeinflussen soll, noch die Weiterverarbeitung des Mikroorganismuses, um den Lebendimpfstoff herzustellen, stören soll. Der Marker wird den Phänotyp ändern, um die Wiedererkennug des genannten Mikroorganismus zu erlauben.
Der genannte Organismus wird dann weiterverarbeitet werden, um nichtrevertierende Mutationen in den unabhängigen Genen des gleichen Biosynthesewegs bereitzustellen. An jeder nichtrevertierenden Mutation wird ein Polynukleotid von mehr als fünf Nukleotiden beteiligt sein, stärker bevorzugt ein Polynukleotid von wenigstens zehn Nukleotiden, und diese werden zusammen einen Biosyntheseweg blockieren. Die Mutationen können Deletionen, Insertionen oder Inversionen oder Kombinationen davon sein. Der blockierte Biosyntheseweg sollte weder an der Herstellung der Antigene, die an der Virulenz der Mikroorganismen beteiligt sind, noch an der Immunantwort des Wirts bei Infektion durch den Mikroorganismus beteiligt sein. Verschiedene Techniken können angewendet werden, um die Deletionen oder Insertion-Inversionen einzuführen, um einen Mikroorganismus zu erhalten, der die gewünschte "nicht umgehbare", nichtrevertierende Blockierung des Biosynthesewegs hat.
Die Wahl der Gene wird durch die Fähigkeit, die Gene zu mutieren, ohne die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen zu zerstören, durch die essentielle Natur des durch das Gen exprimierten Produkts und dadurch, daß die Präsenz des Produkts im vorgesehenen Wirt unwahrscheinlich ist, bestimmt. Das blockierte Gen muß die Herstellung eines Enzyms verhindern, das im Biosyntheseweg eines für die Vermehrung, aber nicht auf andere Weise für die Lebensfähigkeit notwendigen Metaboliten, benötigt wird. Zu den Genen von besonderem Interesse gehören einige der aro Gene, pab, das an der Herstellung von p- Aminobenzoesäure beteiligt ist und die pur Gene, die an der Umwandelung von Inosinmonophosphat zu Adenosinmonophosphat beteiligt sind, wodurch ein Bedarf an Adenin oder an Adeninverbindungen verursacht wird.
Eine Technik, um eine nichtrevertierende Blockierung eines Biosynthesewegs herzustellen, ist die Verwendung von zur Transiokation fähigen Elementen, insbesondere Transposonen. Transposonen sind Segmente doppelsträngiger DNA, die aus einigen Tausend Nukleotiden aufgebaut sind, und normalerweise ein Gen für die Resistenz gegenüber einem antibiotischen oder anderen antibakteriellen Arzneimittel zusammen mit Genen umfassen, die die Insertion einer Kopie des Transposons an irgendeiner von sehr vielen verschiedenen Stellen in der DNA des Bakteriums, das das Transposon beherbergt, bewirken. Insertion eines Transposons in ein Gen, das die Aminosäuresequenz eines enzymatisch aktiven Proteins spezifiziert, verursacht den kompletten Verlust der Fähigkeit, das Protein in aktiver Form zu synthetisieren. Aber das ganze Transposon wird mit einer geringen Frequenz (zum Beispiel 10&supmin;&sup8;/Bakterium/Generation) vom Gen entfernt oder ausgeschnitten, in das es eingefügt war, wodurch als Folge dieses Gen in seinem Originalzustand wiederhergestellt ist, so daß es wieder ein enzymatisch aktives Protein spezifiziert. Eine solche präzise Exzision eines Transposons verursacht den Verlust der Resistenz gegenüber dem antibiotischen oder einem anderen antibakteriellen Wirkstoff, die sich aus der Wirkung des resistenten Gens des Transposons ergab.
Zusätzlich zu der präzisen Exzision tritt der Verlust der vom Transposon übertragenen Resistenz auch durch andere Arten an Ereignissen auf, die sehr viel häufiger als die präzise Exzision sind und nicht zu der Rekonstitution der ursprünglichen Form des Gens führen und so nicht zur Wiederherstellung der verlorenen Genfunktion führen. Zwei Arten solcher Ereignisse führen zur Herstellung einer nichtrevertierenden nichtfunktionellen Form des Gens, in das das Transposon eingefügt war: ein Ereignis ist Deletion eines DNA-Segments, das das ganze oder ein Teil des Transposons umfaßt, wozu sein Resistenzgen und ein Segment der DNA gehört, das sich auf einer Seite über die Stelle der Insertion hinaus ausdehnt und sich so ins oder manchmal ganz durch den Teil des Gens, in den das Transposon eingefügt war, ausdehnt; das andere Ereignis ist Deletion eines Teils des Transposons und simultane Inversion eines DNA-Segments, zu dem genetisches Material gehört, das sich zu einer Seite von der Stelle der ursprünglichen Insertion ausdehnt, d.h. ein Teil oder der ganze Anteil des betroffenen Gens an einer Seite der Stelle der ursprünglichen Insertion. Wiederherstellung des betroffenen Gens in seinen ursprünglichen Zustand kann dann nur durch präzise Deletion des verbleibenden Teils des Transposons zusammen mit Re-Inversion von genau dem invertierten DNA- Segment auftreten, d.h. bei dem zufälligen Auftreten zweier Ereignisse, wobei von jedem davon angenommen wird, daß es äußerst selten und wahrscheinlich unnachweisbar rar ist. Die Konsequenz aus diesen zwei Arten an Ereignissen, entweder Deletion oder Deletion plus Inversion, die in einem Bakterium mit einer Transposon-Insertion in einem Gen auftreten, das ein Biosyntheseenzym spezifiziert, ist ein Transposon enthaltendes Antibiotika-resistentes auxotrophes Bakterium mit einer genetischen Läsion, die einen Enzymdefekt verursacht, der zwar vollständig, aber noch zugänglich für die seltene Reversion ist, in ein Antibiotika-sensitives Bakterium mit dem gleichen Enzymdefekt wie zuvor, aber ohne ein intaktes Transposon, zu verwandeln, das jetzt nicht länger Korrekturen durch seltene Reversionsereignisse ausgesetzt ist. So ist, wenn das Transposon in ein Gen eingefügt wird, das ein Enzym spezifiziert, das in einem Biosyntheseweg verwendet wird, der zu einem oder mehreren für die Vermehrung des Bakteriums essentiellen Metaboliten führt, die aber in seinem Wirbeltierwirt nicht verfügbar sind, das Endergebnis ein Bakterienstamm mit einer kompletten und nichtrevertierenden Mutation, die Nichtvirulenz verursacht.
Die Isolierung von auxotrophen Mutanten kann durch Verwendung von Penicillin erleichtert werden, um die nichtauxotrophen Bakterien abzutöten und so das Verhältnis an Nahrungszusätze fordernden Mutanten in der Population zu steigern. Wenn eine Mutante mit dem gewünschten auxotrophen Charakter isoliert worden ist, kann eine große Population der Mutante auf die Anwesenheit von irgendeiner Nachkommenschaft, die in der Lage ist, ohne den relevanten Metaboliten zu wachsen, gescreent werden, um so die Wahrscheinlichkeit einer Reversion der Mutation zu testen; dieser Test wird strenger ausgeführt, wenn die Population zuerst einem mutagenen Mittel oder Mitteln, die fähig sind, eine breite Vielzahl von mutationsbedingten Veränderungen, d.h. Basensubstitutionen, frame-shift- Mutationen, usw. zu induzieren, ausgesetzt wird. Weiterhin kann, wenn ein Rekombinationssystem vefügbar ist, eine Mutante mit Deletion eines Gensegments, das die Stellen von zwei oder mehr Punktmutanten überdeckt, durch die Abwesenheit von Rekombinanten des Wildtyps erkannt werden, wenn die Deletionsmutante mit jeder der in Frage kommenden Punktmutanten gekreuzt wird. Auf diesen Wegen kann man sich absichern, daß die untersuchte auxotrophe Mutante fast sicher eine Folge einer Deletion und nicht einer Punktmutation ist.
Ein allgemein transduzierender Phage wie der Phage P1, der in der Lage ist, an Bakterien eines weiten Bereichs von Gattungen zu adsorbieren ( wenn notwendig nach geeigneter genetischer Modifikation ihres Lipopolysaccharidcharakters, um die notwendige Fähigkeit zur Adsorption dieses Phagen bereitzustellen) kann verwendet werden, um ein nichtfunktionales Biosynthesegen, wie ein aro oder pur Gen, das durch Insertion von einem Transposon oder auf andere Weise inaktiviert wurde, von seinem ursprünglichen Wirt zu einem pathogenen Bakterienstamm von einer anderen Art oder Gattung zu tranzduzieren, wobei es eine gewisse Wahrscheinlichkeit für die Inkorporation in das Chromosom geben wird, wo es das homologe Wildtypgen ersetzt, um eine auxotrophe Transduktante herzustellen. Aber die Häufigkeit eines derartigen Austauschs ist wahrscheinlich durch die unvollständige Basensequenzhomologie der entsprechenden Gene in Bakterien verschiedener Gattungen sehr gering. DNA-vermittelte Transformation oder bakterielle Konjugation können gleichermaßen verwendet werden, um ein aro, pur oder anderes Biosynthesegen, das durch Transposon-Insertion oder auf andere Weise inaktiviert wurde, in Bakterien einer vom ursprünglichen Stamm verschiedenen Art oder Gattung zu transferieren, um auxotrophe Bakterien zu erhalten, die jetzt wegen des Bedarfs an einem Metaboliten, der in dem Wirbeltierwirt nicht zugängig ist, nichtvirulent und auf Grund der Präsenz von entweder einer Deletion oder einer Insertion-Inversion unfähig sind, zur Prototrophie zurückzukehren.
Konjugation kann auch angewendet werden, indem eine konjugative Kreuzung eines virulenten Stamms mit einem nichtvirulenten aber zugänglichen Stamm, der das gewünschte nichtrevertierende mutierte Gen hat, einbezogen wird. Durch Anwendung eines Hfr oder F&spplus; Stamms mit einem F&supmin; virulenten Stamm kann der Transfer des mutierten Gens zum virulenten Stamm mit Rekombination auftreten, der in dem Austausch des Wildtypgens durch das mutierte Gen resultiert. Man würde dann auf Auxotrophie, wie vorstehend beschrieben, selektieren.
Die Verwendung eines transduzierenden Phagen, DNA-vermittelter Transformation und / oder Konjugation kann auch angewendet werden, um nacheinander zwei oder mehr unabhängig mutierte Gene in einen einzelnen Wirtsstamm einzuführen, der als Impfstoff verwendet wird. Die Präsenz von zwei komplett unabhängigen Mutationen, von denen jede eine extrem geringe Wahrscheinichkeit der Reversion hat, stellt eine fast absolute Sicherheit dar, daß der Impfstoffstamm nicht virulent werden kann.
In Übereinstimmung mit der Erfindung werden die Impfstoffe durch Einführen einer nichtrevertierenden Mutation in wenigstens zwei Genen hergestellt, wobei die Mutation gleichzeitig an einer ausreichenden Anzahl an Basen erfolgt, um eine Wahrscheinlichkeit von im wesentlichen Null für die Reversion und die Sicherheit für die Nichtexpression von irgendeinem mutierten Gen, in dem Sinne seiner absoluten Unfähigkeit, die Herstellung eines enzymatisch aktiven Proteins zu determinieren, abzusichern. Zusäzuch wird jedes der ausgewählten Gene in einen Biosyntheseweg einbezogen sein, auf dem Metaboliten hergestellt werden, die entweder selten in dem Wirt verfügbar oder ganz abwesend sind. Der Typ des Gens und die Anzahl, die ausgewählt wurden, wird in der Wahrscheinlichkeit, daß ein Wirt für den Impfstoff die notwendigen Nährstoffe zur Proliferation bereitstellen wird, resultieren, die ungefähr einen Wert von Null hat. Es ist gezeigt worden, daß diese Anforderungen von den aroA und purA Genen der Salmonella, insbesondere typhimurium, dublin und typhi erfüllt werden, so daß diese Gene bevorzugt werden, obwohl andere Gene, wie zuvor angezeigt, auch als Stelle für die nichtrevertierende Mutation dienen können.
Im Falle der Transduktion hat das Transposon einen Marker, der die Selektion des transduzierten Mikroorganismuses erlaubt. Zum Beispiel selektiert man, wenn das Transposon Resistenz gegenüber einem Biostatikum oder Biozid verleiht, z.B. einem antibiotischen, in dem der transduzierte Mikroorganismus in einem Nährmedium wächst, das das bioaktive Agens enthält, auf den transduktanten Stamm. Man kann dann andere Techniken anwenden, wie sie nachstehend beschrieben werden, um Mitglieder des transduktanten Stamms auszuwählen, die der Excision des Ganzen oder Teilen des Transposons unterliegen, wobei das Transposon einen Teil des Gens, in das es integriert wurde, mit sich nimmt oder Inversion eines Teil des Gens resultiert. Um den auxotrophen Stamm zu isolieren, einerlei ob er durch Transduktion, Mutagenese, Transformation oder mit anderen Mitteln hergestellt ist, ist es wünschenswert, selektiven Druck auf den behandelten virulenten Stamm auszuüben, um den Anteil des gewünschten auxotrophen Stamms zu vergrößern. Eine Technik dazu ist die Anwendung einer Substanz, z.B. eines Penicillins, die nur für Bakterien, die sich vermehren, letal ist. Durch Anwendung eines Nährmediums, das das metabolische Produkt, das vom auxotrophen Stamm auf Grund der oben eingeführten Mutation benötigt wird, nicht bereitstellt, wird der auxotrophe Stamm an der Vermehrung gehindert, während der virulente Elternstamm sich vermehren wird und so durch das Penicillin getötet wird. Normalerweise werden wenigstens ungefähr 99% und weniger als 100% der Bakterien getötet, so daß die Überlebenden, ungefähr 0,05 bis 1% der ursprüngichen Bakterien, eine stark erhöhte Konzentration des auxotrophen Stamms aufweisen. Man kann dann die überlebenden Bakterien in einem Ergänzungsmedium wachsen lassen, das die Vermehrung des auxotrophen Stamms erlaubt und das Penicillintötungsverfahren wiederholen, bis man die auxotrophen aus einer Einzelkolonie isolieren kann und die komplette Abwesenheit irgendeines virulenten Elternstamms erreichen kann.
Der resultierende auxotrophe Stamm wird ein nichtvirulenter Lebendimpfstoff sein, der die gewünschte Immunogenität hat, indem die Deletion die Herstellung der Antigene, die die natürliche Immunantwort des Wirts triggern, nicht beeinflußt. Gleichzeitig resultiert die Deletion in einem nichtvirulenten Lebendimpfstoff, der unfähig ist, im Wirt zu wachsen und unfähig, zu einem virulenten Stamm zu revertieren.
Zwei besonders wertvolle Stämme, die aroA-Deletion aufweisen, wurden im allgemeinen, wie nachstehend beschrieben, hergestellt. Ein charakterisierter Salmonella Stamm wurde einem transduzierenden Phage ausgesetzt, der auf einem anderen Salmonella Stamm, der aroA554::Tn10 war, gewachsen war, und Selektion auf gesteigerte Resistenz gegenüber Tetrazyklin wurde durchgeführt. Tetrazyklin-resistente Aromaten-abhängige Transduktanten wurden auf ein Bochnermedium inkubiert. Die Mutanten, die auf diesem Medium gut wuchsen, wurden dann gepickt und auf Unfähigkeit zur Aromaten-Unabhängigkeit zu revertieren gescreent, um eine Deletions- oder Deletion- Inversions-Mutation in aroA anzuzeigen. Die Transduktanten können gescreent werden, indem Mäuse und ein Stamm angewendet werden, der nichtvirulent ist und einen Schutz gegen Inokulation mit einem ausgewählten virulenten Stamm bietet. Als eine zweckmäßige Sache kann man einen Marker, zum Beispiel Auxotrophie, einführen, um einen spezifischen Ernährungsbedarf bereitzustellen, der dann eine schnelle Ermittlung erlaubt, ob Revertanz aufgetreten ist, falls ein Wirt sich Salmonella in der Zeit im Anschluß an die Impfung mit dem Impfstoff zuzieht, der gemäß dieser Erfindung hergestellt worden ist. Die Konstruktion von aroA&supmin;, purA&supmin; Salmonella Stämmen wird im experimentellen Teil in einem Referenzbeispiel beschrieben. Um Antigene anderer Arten als die des nichtvirulenten Wirts bereitzustellen, können ein oder mehrere Gene, die die gewünschten Antigene oder die die Enzyme für die Synthese des/der gewünschten Antigens (/gene) codieren, in den Wirt als Expressionskassetten eingeführt werden. Mit einer Expressionskassette sind die von transcriptionalen und translationalen Initations- und Terminations-Bereichen begrenzten interessierenden Strukturgene gemeint, wobei das Strukturgen unter der regulatorischen Kontrolle solcher Bereiche ist, was bedeutet, daß sie in korrektem Abstand und in 5' respektive 3' zum Strukturgen angeordnet sind. Wenn Strukturgene von Bakterien oder von Bakteriophagen betroffen sind, werden die natürlichen regulatorischen Bereiche oder die des Wildtyps gewöhnlich, aber nicht immer, genügen. Bei Strukturgenen der Eukaryonten (einschließlich Viren) und gelegentlich bei Prokaryonten wird das Strukturgen mit regulatorischen Bereichen verbunden, die vom Bakterienwirt wiedererkannt werden.
Die Expressionskassette kann ein Konstrukt sein oder kann ein oder ein Teil eines natürlich auftretenden Plasmids sein, wie das Plasmid, das die Enzyme zur Herstellung des O-spezifischen Teils des LPS von Shigella sonnei codiert. Wenn die Expressionskassette ein Konstrukt ist, kann sie mit einem Replikationssystem zur episomalen Erhaltung verbunden werden oder in das Bakterium unter Bedingungen zur Rekombination und Integration eingeführt werden. Das Konstrukt wird normalerweise mit einem Marker verbunden, z. B. einem Strukturgen und regulatorischen Bereichen, die antibiotische Resistenz oder Komplementierung in einem auxotrophen Wirt bereitstellen, so daß zum Expressionsvektor gewöhnlich ein Replikationssystem, z.B. plasmid oder viral, ein oder mehrere Marker und die Expressionskassette des interessierenden Strukturgens gehören. Interessierende Strukturgene können aus verschiedenen Quellen stammen, wie Bakterien, Viren, Pilzen, Protozoen, Metazoenparasiten oder etwas ähnlichem. Die Strukturgene können Hüllproteine, Kapsidproteine, Oberflächenproteine, Toxine wie Exotoxine oder Enterotoxine codieren oder die interessierenden Gene können Proteine, Enzyme oder andere Proteine spezifizieren, die entweder für die Synthese von einem Polysaccharid- oder Oligosaccharidantigen oder zur Modifikation eines Saccharid-enthaltenden Antigens des Wirtbakterienstamms, wie LPS, oder für die Synthese eines Polypeptidantigens, wie des Kapselantigens des Bacillus anthracis, benötigt werden. Diese Gene können auf konventionellen Wegen isoliert werden, indem Sonden angewendet werden, bei denen wenigstens eine partielle Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz bekannt ist, indem Westernblots zur Detektion der Expression verwendet werden, indem λgt11 zur Expression von Fusionsproteinen verwendet werden, um Sonden zu erhalten, indem das Antigen mittels Reaktion der transkonjugierenden Bakterienkolonien mit Antikörpern identifiziert wird und indem Komplexbildung, z.B. Agglutination, detektiert wird, usw.
Zu den spezifischen interessierenden Genen gehören solche, die die hitzelabilen und hitzebeständigen Enterotoxine der enterotoxigenen E. coli oder Vibrio cholerae Stämme, HBsAg, Oberflächen-, Hüll- oder Kapsidproteine der T. cruzi, B. pertussis, Streptococcus, z.B. S. pneumoniae, Haemophilus, z.B. H. influenzae, Neisseria, z.B. N. meningitidis, Pseudomonas, z.B. P. aeruginosa, Pasteurella, Yersinia, Chlamydia, Rickettsiae, Adenovirus, Astrovirus, Arenavirus, Coronavirus, Herpesvirus, Myxovirus, Paramyxovirus, Papovavirus, Parvovirus, Picornavirus, Poxvirus, Reovirus, Retrovirus, Rhabdovirus, Rotavirus, Togavirus usw. spezifizieren; die Gene, die Enzyme spezifizieren, die für die Synthese von Polysaccharidantigenen, z.B. Meningokokken Kapselpolysaccharid, oder für Modifikationen des Oligo- oder Polysaccharidantigens des Bakterienwirtstamms benötigt werden.
Die Konstruktion oder der Vektor können in den Wirtsstamm durch irgenweiche zweckmäßigen Mittel, wie die Konjugation (z.B. F&spplus; oder hfr Stamm), Transformation, (z.B. mit Ca ausgefällte DNA), Transfektion, Transduktion usw. eingeführt werden. Modifizierte Wirte können dann auf einem Selektionsmedium unter Anwendung des Phänotyps des Markers selektiert werden.
Die genannten Impfstoffe können für eine große Vielzahl von Wirbeltieren verwendet werden. Die genannten Impfstoffe werden insbesondere bei Säugetieren, wie den Menschen und Haustieren, Verwendung finden. Zu den Haustieren gehören Rinder, Schafe, Schweine, Pferde, Ziegen, domestiziertes Geflügel, Hasentiere z.B. Kaninchen oder andere Tiere, die in Gefangenschaft gehalten werden können, oder Vektor für eine Krankheit sein können, die auf ein domestiziertes Wirbeltier wirkt. Die Art der Anwendung des Impfstoffs kann breit variiert werden, wobei irgendeines der herkömmlichen Verfahren, einen Lebendimpfstoff zu verabreichen, anwendbar ist. Dazu gehören die orale Applikation auf einem festen, physiologisch akzeptablen Grundstoff oder in einer physiologisch akzeptablen Dispersion, die parenterale Applikation durch Injektion oder ähnliches. Die Dosis des Impfstoffes "Anzahl der Bakterien, Anzahl der Verabreichungen) wird von dem Weg der Verabreichung abhängen und wird entsprechend der zu schützenden Arten variieren. Für Mäuse mit einem Gewicht von 15-20 g erscheint eine einzige Dosis von ca. 3 x 10&sup5; lebenden Bakterien eines nichtrevertierenden aro&supmin; Impfstoffstamms der S. typhimurium, der in einem Volumen von 0,2 ml in Salzlösung durch intraperitoneale Injektion verabreicht wurde, sowohl sicher als auch effektiv zu sein, wie aus dem Ergebnis eines späteren parenteralen immunologischen Stimulus mit virulenten S. typhimurium beurteilt werden konnte. Mäusen wurden auch ca. 3 x 10&sup7; lebende Bakterien des gleichen Stamms in mit 0,1 ml Nährlösung befeuchteten Brotwürfeln gegeben, die nach sechs Stunden Entbehrung von anderem Futter bereitgestellt wurden. Diese Dosis erwies sich als harmlos und es wurde gefunden, daß sie Immunschutz bereitstellt. Beobachtungen an geimpften Kälbern legen nahe, daß die Verabreichung von lebenden Bakterien des gleichen Stamms durch intramuskuläre Injektion oder durch Füttern von Dosen, die tausendfach größer als die für Mäuse verwendeten sind, sicher sind und angemessen sein können. Eine oder mehrere zusätzliche Verabreichungen können als "booster"-Dosen gewöhnlich in zweckmäßigen Intervallen, wie zwei oder drei Wochen, bereitgestellt werden.
Die Zusammensetzungen der Lebendimpfstoffe können breit variieren, wobei die Zusammensetzung wünschenswert ist, die eine verstärkte immunogene Antwort bereitstellt. Der Lebendimpfstoff kann auf einem Zucker- oder Brotwürfel, in gepufferter Salzlösung, in einem physiologisch akzeptablen Ölvehikel oder ähnlich bereitgestellt werden.
Die folgenden Beispiele sind Referenzbeispiele.

Experimentelles

1. Konstruktion von aro&supmin; Stämmen

Ein vom Salmonella typhimurium abgeleiteter Lebendimpfstoff wurde wie im folgenden beschrieben hergestellt. Als Elternstamm wurde Maus-virulentes S. typhimurium SL4522 angewendet, das ein Nachkomme eines "wilden" S. typhimurium Stamms M7471 der S. typhimurium Untergruppe ist, die FIRN genannt wird (Morgenroth und Duguid, Gent. Res. (1968), 11:151-169). Diese Untergruppe wird durch ihre Unfähigkeit, Rhamnose oder Inositol zu fermentieren und ihr Versagen, Typ 1 Pili oder Fimbrien herzustellen, definiert. Dem Stamm M7471 wurde ein Plasmid, ColEl-K30, durch Konjugation gegeben, dann wurde er durch aufeinanderfolgende Mutagenexpositionen Maltose-negativ, Leucin-benötigend und Cystein-benötigend gemacht, gefolgt davon, daß er durch Hineintransduzieren der Mutation hisC527 (eine amber Mutation) Histidin-benötigend gemacht wurde. Die genetische Konstitution des Ausgangsstamms, SL4522, ist auf diese Weise S. typhimurium M7471 (ColEl-K30) malB479 leu-1051 cysI1173 hisC527 (Macphee et al., J. Gen. Microbiol. (1975) 87:1-10). Dieser Stamm, der seine Maus-Virulenz behält, wurde von einer Maus reisoliert, die an einem geringen Inokulum starb und das Reisolat wurde mit SL3201 bezeichnet. S. typhimurium, der ein Transposon enthält, das Resistenz gegenüber Tetrazyklin vermittelt und im Gen aroA vorhanden ist, als Stamm TT1455 bezeichnet wird und die genetische Konstitution S. typhimurium LT2 aroA554::Tn10 hat, wurde als Quelle für das Transposon verwendet, das in der genannten Herstellung verwendet wurde. Dieser Stamm ist von Dr. John Roth, Department of Biology, University of Utah, Salt Lake City entwickelt worden und von ihm erhältlich und ist am ATCC mit der Hinterlegungsnummer 33275 hinterlegt. Die Stelle der Insertion des Transposons Tn10 liegt im Gen aroA, das an der Position 19 der Kopplungskarte lokalisiert ist und das Enzym 3- Enolpyruvylshikimat-5-phosphat-Synthetase spezifiziert.
Der Stamm TT1455 kann nicht auf chemisch definierten Medien wachsen, es sei denn, er wird mit den essentiellen Metaboliten, die von der Chorisminsäure abgeleitet werden, versorgt, d.h. den aromatischen Aminosäuren Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan, und zwei unbedeutenderen aromatischen Metaboliten, dem p-Aminobenzoat, das als Vorläufer der Folsäure benötigt wird, und der 2,3-Dihydroxybenzoesäure als Vorläufer der Eisenchelatverbindung Enterobaktin (Enterochelin).
Für die Transduktion wurde eine hoch-transduzierende Mutante, HT105/L (Schmiger, Mol. Gen. Genet. (1972) 119:75-88), des allgemein transduzierenden Phagen P22 verwendet, die eine zusätzliche int-Mutation aufweist, die Lysogenisierung verhindert und die Herstellung von hochtitrigen Phagenstammkulturen vereinfacht. In Übereinstimmung mit üblichen Techniken wuchs dieser Phage auf dem Stamm TT1455, das so erhaltene Lysat, nachdem alle Bakterien durch Zentrifugieren entfernt worden sind, wurde weiter durch Membranfiltration behandelt. Eine Platte mit Nähragar ( Oxoid-Blutagarbasis No. 2, code CM55), ergänzt mit Tetrazyklin (25ug/ml), wurde mit einer Nährmediumkultur des Rezipientenstamms SL3201 überschwemmungsinokuliert; Tropfen des Phagenlysats mit einem Volumen von ungefähr 0,01 ml wurden auf die Platte aufgetragen und die Platte wurde bei 37º für ungefähr 18 h inkubiert. Nach der Inkubation zeigt jede Tropfenfläche viele große (ungefähr 2 mm Durchmesser) Kolonien der Tetrazyklin-resistenten "kompletten" Transduktanten (auch sehr viele kleine Kolonien abortiver Transduktanten), wohingegen der Agar zwischen den Tropfen kein Wachstum zeigt. Zwei Tetrazyklin-resistente Transduktantenklone wurden erhalten, die aus Einzelkolonien reisoliert wurden, und getestet, um die Abwesenheit des Phagen P22 zu bestätigen, und dann als Stämme SL3217 und SL 3218 bezeichnet. Sie zeigten den erwarteten Phänotyp, in dem sie zum Wachstum die Zugabe von Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, p- Aminobenzoat und 2,3 Dihydroxybenzoat benötigten. Die Stämme SL3217 und SL3218 zeigten den erwarteten Verlust der Maus- Virulenz, vorausgesetzt, daß sie in Gegenwart von Tetrazyklin wuchsen, um die Akkumulation Aromaten-unabhängiger Revertanten zu vermeiden.
Die Isolierung von Tetrazyklin-sensitiven Varianten wird durch die Tatsache erleichtert, daß Tetrazyklin in geeigneten Konzentrationen die Vermehrung der Tetrazyklin-sensitiven Bakterien verhindert, sie aber nicht tötet, wohingegen Penicillin die sich vermehrenden Bakterien tötet, aber die sich nicht vermehrenden Bakterien verschont. Die Technik der Penicillin-Selektion wurde für die Isolierung Tetrazyklinsensitiver Varianten des aroA::Tn10 Stamms SL3218 verwendet. Der Stamm wurde zuerst in einer Nährlösung ohne Tetrazyklin bis zu einer Konzentration von ungefähr 9x10&sup8; cfu/ml wachsen gelassen; diese Kultur wurde dann mit Nährlösung, die 5 ug/ml Tetrazyklin enthält, 1:10 verdünnt und die verdünnte Kultur wurde bei 37º für 75 min unter Belüftung inkubiert; 2,5 ug/ml Ampicillin wurden hinzugefügt und Inkubation unter Schütteln wurde für 290 min fortgesetzt, die Kultur wurde dann bei Raumtemperatur ohne Schütteln über Nacht gehalten. Überlebende Bakterien wurden auf einem Membranfilter gewaschen, um Ampicillin zu entfernen, und dann auf einem Indikatormedium ausgestrichen, das Farbstoffe und eine sehr geringe Konzentration an Tetrazyklin enthielt. Auf diesem Medium produzieren Tetrazyklin-sensitive Bakterien kleine, dunkle Kolonien, wohingegen Tetrazyklin-resistente Bakterien große, blasse Kolonien produzieren. Die Ampicillinbehandlung reduzierte die Anzahl an lebensfähigen Bakterien um ungefähr 10&supmin;&sup5;. Sechs von 386 überlebenden Kolonien wurden getestet und zeigten, daß sie Tetrazyklin-sensitiv sind. Von zwei derartigen Isolaten, die mit SL3235 und SL3236 bezeichnet wurden, wurde gezeigt, daß sie ihrem Elternstamm SL3218 in den Ernährungseigenschaften ähneln, aber sich von ihm nicht nur durch ihre Tetrazyklin-Sensitivität unterscheiden, sondern auch durch ihr Versagen, irgendwelche Aromaten-unabhängigen Revertanten in Tests herzustellen, bei denen die Reversion bei einer Häufigkeit von einem unter 10¹¹/Bakterium/Generation detektiert worden wäre. Einer dieser Stämme, SL3235, zeigte, wenn er als Lebendimpfstoff in Mäusen oder Kälbern verwendet wurde, keine Reversion zur Aromaten- Unabhängigkeit der Virulenz. Ein anderer nichtrevertierender aro Impfstoffstamm wurde aus S2357/65 hergestellt, einem Salmonella typhimurium Stamm, von dem aus andernorts durchgeführten Experimenten bekannt ist, daß er hochvirulent für Kälber ist. Der Stamm S2357/65 ist prototroph: um einen Markercharakter bereitzustellen, wurde er erst durch Transduktion hiSD8557::Tn10 ( daher phänotypisch mit einem Histidin-Bedarf, der nicht durch Histidinol gedeckt wird, und Tetrazyklinresistent) und dann durch eine zweite Transduktion hisD&spplus; his G46 (also phänotypisch mit Bedarf an Histidin oder Histidinol, und Tetrazyklin-sensitiv) hergestellt. Es wurde gezeigt, daß dieser Abkömmling SL1323 tödliche Infektion verursacht, wenn er an ein Kalb verfüttert wird. Der Kalb-passagierte Stamm, der mit SL1344 bezeichnet wird, wurde als nächstes aroA554::Tn10 durch Transduktion aus TT1455 gemacht, wie vorstehend beschrieben; der so erhaltene hisG46 aroA544::Tn10 Stamm, wurde mit SL1346 bezeichnet. Eine Tetrazyklin-sensitive Mutante, die noch Aromaten benötigt, aber jetzt nicht fähig ist, zur Aromaten-Unabhängigkeit zu revertieren, wurde als nächstes aus SL1346 durch ein neues Verfahren isoliert, d.h. Selektion auf Nähragar, das 50ug/ml Chlortetrazyklin, welches vor dem Autoklavieren zugefügt wurde, und 12ug/ml Fusarinsäure, die nach dem Autoklavieren zugefügt wurde, enthält. Dieses Medium verhindert oder retardiert wenigstens erheblich das Wachstum von Tetrazyklin-resistenten Bakterien, ermöglicht aber gutes Wachstum der Tetrazyklin-sensitiven Bakterien. Sowohl von diesem Stamm, als auch von zwei aroA::Tn10 Stämme, SL3217 und SL3218, die mit Tetrazyklin wuchsen, um die Akkumulation Tetrazyklin-sensitiver aro&spplus; und daher virulenter Revertanten zu verhindern, wurde gezeigt, daß sie als Lebendimpfstoff effektiv sind, wenn sie Mäusen auf intraperitonealem Weg verabreicht wurden. (i) Experimente mit den Stämmen SL3217 und SL3218: CF1 Mäusen wurden ca. 2 x 10&sup5; Bakterien des Lebendimpfstoffstamms intraperitoneal (i.p.) gegeben, i.p. immunologischer Stimulus zwei Monate später mit 2 x 10&sup6; Bakterien (d.h. mehr als 20 000 LD50) des virulenten S. typhimurium Stamms SL3201: kein Tod innerhalb von zwei Monaten Beobachtung. (ii) CBA/N x DBA/LN F&sub1; weiblichen Mäusen wurden 10&sup6; oder 10&sup5; des Lebendimpfstoffstamms SL3235 i.p. gegeben: fünf Wochen später wurden diese mit 10&sup6; Bakterien (ca. 100 LD50) des virulenten S. typhimurium Stamms TML i.p. immunologisch stimuliert : kein Tod innerhalb von fünfzehn Tagen Beobachtung. In anderen Experimenten wurde von dem stabilen aro&supmin; Impfstoffstamm SL3235 gezeigt, daß er keinen Tod verursacht (und auch keinerlei offensichtliche Krankheitseffekte), sogar wenn er intraperitoneal in Mäuse injiziert wurde, die außergewöhnlich zugänglich für Salmonella typhimurium Infektionen sind, entweder als Konsequenz einer vorhergehenden intravenösen Injektion von Silicamakroteilchen, um so die Phagocytosefunktion der Makrophagen zu zerstören, oder in Mäusen, die auf Grund eines genetischen Defekts der Fähigkeit auf Lipopolysaccharid zu reagieren, z.B. Stamm C3H/Heg, außergewöhnlich zugänglich sind.Von einem so erhaltenen, nichtrevertierenden Aromaten-abhängigen Abkömmling der Nummer SL3261 wurde gezeigt, daß er auf parenteralem oder oralem Weg nichtvirulent für Mäuse und Kälber ist. Zusätzlich wurde von einem Abkömmling vom Typ aroA::Tn10, der auf ähnliche Weise durch Transduktion aus einem Kalb-virulenten Stamm der Rinder-pathogenen Art, Salmonella dublin, gewonnen wurde, gezeigt, daß er nichtvirulent für Mäuse ist; und vermutlich nichtvirulente aroA::Tn10 Abkömmlinge wurden durch Transduktion aus mehreren kürzlich isolierten Stämmen des Humanpathogens Salmonella typhi gemacht.
Der aro&supmin; Lebendimpfstoff S. typhimurium SL1479 wurde wie folgt hergestellt. Der Elternstamm war S. typhimurium UCD108-11 (Dr. Bradford Smith, University of California at Davis). Einem Kalb- passagierten Reisolat des Stamms UCD108-11 wurde die Stammkulturnummer SL1420 zugewiesen, und es wurde ernährungsmäßig als nicht anspruchsvoll charakterisiert, als resistent gegenüber verschiedenen Antibiotika, einschließlich Tetrazyklin, und als "smooth", aber resistent, gegenüber O- spezifischen allgemein transduzierenden Phagen, einschließlich P22. Der Stamm SL1420 wurde einem transduzierenden Phage ausgesetzt, der auf einem aroA554::Tn10 Stamm des S. typhimurium gewachsen war und an dem Selektion auf erhöhte Resistenz gegenüber Tetrazyklin durch Ausstreichen auf einem Nähragarmedium mit Tetrazyklin (50 mg/ml) durchgeführt wurde. Repräsentative Transduktanten von erhöhter Tetrazyklin- Resistenz, Aromaten-abhängig und unverändert im Muster der Phagensensitivität, wurden selektiert, und eine wurde ausgewählt und als SL1421 bezeichnet. Der Elternstamm wuchs gut auf Bochnermedium (Bochner et al. (1980) J. Bact. 143:926-933), was nahelegt, daß die Tetrazyklin-Resistenz durch einen anderen Mechanismus bestimmt wurde, als die durch Tn10 verliehene. Der Resistenzstamm SL1421 wuchs schlecht auf Bochnermedium und erlaubte die Selektion der Kolonien, die sich auf Platten des mit Dihydroxybenzoesäure ergänzten Bochnermediums entwickelten. Von einer derartigen Variante wurde festgestellt, daß sie Aromaten-abhängig und unverändert im Phagenmuster ist und keine Aromaten-unabhängigen Revertanten mit einer nachweisbaren Häufigkeit erzeugt (Null-Ausbeute des Aro&spplus; in einer Endpopulation von ungefähr 9 x 10¹&sup0; Bakterien auf Platten eines Mediums mit einem wachstumsbeschränkenden Gehalt an Tryptophan). Diese als SL1452 bezeichnete Mutante wurde auf Virulenz getestet. Von fünf BALB/c Mäusen (männlich, ungefähr 18 Wochen alt) erhielt jede ungefähr 8,5 x 10&sup6; lebende Bakterien des Stamms SL1452 durch intraperitoneale (i.p.) Injektion.
Die verwendeten Mäuse waren aus einer Kolonie der Inzuchtlinie BALB/c, Kaiserschnitt-geboren und in Isolation gehalten, mit einer definierten Darmflora, aus dem Department of Radiology, Stanford University School of Medicine. Die Mäuse dieser Linie sind bekannt für eine hohe Empfänglichkeit gegenüber S. typhimurium Infektion und bekannt für die Unfähigkeit, gegen eine solche Infektion durch Immunisierung mit hitzegetötetem Impfstoff geschützt zu werden (Robson and Vas (1972) J. Infect. Dis. 126:378-386). Alle überlebten bis zum Tage 50 und sahen rundherum gesund aus.
Um die Immunisierungsfähigkeit des Stamms SL1452 zu testen, wurden fünf Überlebende der i.p. Injektion sieben Wochen nach der Impfung durch i.p. Injektion von ungefähr 5 x 10&sup5; Bakterien des Stamms SL1420 (virulenter Ausgangs-Stamm) immunologisch stimuliert. Vier Kontrollmäuse (nicht geimpft) starben an den Tagen 4, 4, 4, und 5 nach dem immunologischen Stimulus. Eine von den fünf geimpften Mäusen starb durch S. typhimurium Infektion und die anderen vier geimpften Mäuse überlebten bis zum Tage 14 nach dem immunologischen Stimulus und sahen gesund aus.
Eine genetisch "markierende"Eigenschaft wurde dann in den Impfstoffstamm SL1452 eingeführt, um die Identifikation zu ermöglichen. Der Stamm SL1452 wurde mit einem transduzierenden Phagen, der auf einem S. typhimurium Stamm wuchs und hisD8557::Tn10 trägt, behandelt, und es wurde eine Selektion auf erhöhte Tetrazyklin-Resistenz durchgeführt. Von repräsentativen Transduktanten wurde gefunden, daß sie die erwarteten Ernährungseigenschaften haben, Aro&supmin; HisD&supmin; (d.h. ein Bedarf an Histidin, der durch Histidinol nicht gedeckt wird). Die ausgewählte Transduktante wurde als Stamm SL1474 bezeichnet. Dieser Stamm wurde einem transduzierenden Phagen ausgesetzt, der auf einer hisC527 Linie von S. typhimurium wuchs und es wurde Selektion auf einem definierten Medium mit Aromaten und mit Histidinol als Histidinquelle durchgeführt. Einige Transduktanten waren noch Aromaten-abhängig und benötigten Histidin, aber sie waren fähig, Histidinol anstatt von Histidin zu verwenden (d.h. sie hatten Ernährungseigenschaften, wie sie nach dem Austausch von hisD::Tn10 hisC&spplus; des Rezipienten durch hisD&spplus; hisC527 des Donors erwartet werden). Eine derartige als SL1479 bezeichnete Transduktante der Konstitution UCD108-111 aroA554::Tn10/DI hisC527, wurde für Tests in Kälbern angewendet (DI Deletion- Inversions-Ereignis).
Zehn Kälbern im Alter von zwei Wochen wurde der S. typhimurium Lebendimpfstoffstamm SL1479 durch intramuskuläre (i.m.) Injektion, gewöhnlich ungefähr 1,5 x 10&sup9; lebende Bakterien, als ihre Erstimpfung gegeben. Keines von ihnen verlor den Appetit oder wurde ernsthaft krank und nur eins entwickelte Diarrhoe. Keines lieferte eine positive Stuhlkultur von Salmonella. Drei Kälbern im Alter von zwei Wochen wurden ungefähr 1,5 x 10¹¹ lebende Bakterien des Stamms SL1479 oral als ihre Erstimpfung gegeben. Keines von ihnen verlor den Appetit, aber eines entwickelte Diarrhoe; alle drei gaben wie erwartet positive Stuhlkulturen. Die Reaktionen auf eine zweite Dosis des Lebendimpfstoffs, i.m. oder auf oralem Weg, waren nicht schwerer als die auf die erste Dosis.
Um den Schutz, der durch Impfung verliehen wurde, zu testen, wurden Gruppen von Kälbern im Alter von fünf Wochen, entweder nichtgeimpfte (Kontrollen) oder zweifach mit lebenden S. typhimurium SL1479 i.m. oder auf oralem Weg geimpfte, durch orale Verabreichung von 1,5 x 10¹¹ lebenden Bakterien eines kalbvirulenten S. typhimurium Stamms immunologisch stimuliert, gewöhnlich der Stamm UCD108-111, aber einigen Kälbern wurde der Stamm SL1323 gegeben.
Alle 16 immunologisch stimulierten Kontrollkälber zeigten Anorexie und Schwächung; 15 hatten Diarrhoe und 14 starben. Von sieben Kälbern, die zwei Dosen des Lebendimpfstoffs auf dem i.m. Weg erhalten hatten, hatten drei Diarrhoe nach dem immunologischen Stimulus, zwei wurden anorexisch und geschwächt und eins starb. Die Unterschiede zwischen Kontrollkälbern und solchen, die i.m. geimpft waren, sind in Hinsicht auf den Tod (14 von 16 gegenüber 1 von 7) und auf Anorexie und Schwächung (16 von 16 gegenüber 2 von 7) statistisch signifikant (p [Wahrscheinlichkeit] - kleiner als 0,001 beim einzelnen Vergleich). Von drei Kälbern, die zwei Dosen des SL1479 Lebendimpfstoffs auf oralem Weg erhielten, hatten zwei nach dem immunologischen Stimulus Diarrhoe und eins war anorexisch und geschwächt; keins starb. Die Unterschiede zwischen Kontroll- und oral geimpften Kälbern in Hinsicht auf Tod (14 von 16 gegenüber 0 von 3) und auf Anorexie und Schwächung (16 von 16 gegenüber 1 von 3) sind statistisch signifikant (p ist kleiner als 0,01 beim einzelnem Vergleich).
Die Entwicklung des S. dublin Stamms SL1438 folgte im wesentlichen dem für S. typhimurium beschriebenen Verfahren, wie vorstehend beschrieben. Von dem Ausgangsstamm S. dublin S4454 (Dr. Clifford Wray, Central Veterinary Laboratory of the British Ministry of Agriculture, Weybridge, England) wurde gefunden, daß er die erwarteten Ernährungseigenschaften hat (d.h. mit einer unvollständigen Abhängigkeit von Nikotinsäure, sonst nicht anspruchsvoll), "smooth", aber resistent oder nur etwas sensitiv gegenüber den allgemein transduzierenden O- spezifischen Phagen P22, P22h, KB1 und A3 und sensitiv gegenüber allen getesteten Antibiotika, wozu Tetrazyklin gehört, ist. Dem Stamm wurde die Nummer SL1363 zugeteilt und von ihm wurde durch intraperitoneale Injektion von 4 x 10&sup4; lebenden Bakterien in BALB/c Mäusen gezeigt, daß er virulent ist.
Der Stamm SL1363 wurde dem transduzierenden Phagen, der auf S. typhimurium TT47 mit dem Genotyp hisD8557::Tn10 wuchs, ausgesetzt, und Tetrazyklin-resistente Transduktanten wurden selektiert. Eine Transduktante des HisD&supmin; Ernährungsphänotyps und mit unverändertem Muster der Phagensensitivität wurde ausgewählt und mit SL1365 bezeichnet und Phagen ausgesetzt, die auf dem S. typhimurium Stamm des Genotyps hisG46 hisD&spplus; wuchsen. Transduktanten wurden auf einem Medium mit Histidinol als einziger Histidinquelle selektiert, und eine Transduktante wurde auf unverändertes Phagenmuster und auf den Bedarf nach entweder Histidin oder Histidinol (d.h. hisD&spplus;hisG46) selektiert und ihr wurde die Bezeichnung SL1367 zugeteilt. Wenn drei BALB/c Mäusen, denen zuvor das Futter für mehrere Stunden entzogen worden war, ungefähr 3 x 10 &sup7; Bakterien des Stamms SL1367 auf einem Brotwürfel verabreicht wurden, starben alle drei ungefähr sieben Tage später. Wenn der gleiche Stamm einem Kalb gefüttert wurde, verursachte er eine unvermittelt tödliche Infektion und von einem Reisolat wurde gezeigt, daß es unverändert im Ernährungsphänotyp war. Der Stamm SL1372 wurde dann mit einem Phagen behandelt, der auf einem aroA554::Tn10 Stamm von S. typhimurium wuchs, und eine Selektion auf Tetrazyklin-Resistenz wurde durchgeführt. Eine selektierte Transduktante, die sowohl aromatische Zusätze als auch Histidin und Nikotinsäure benötigte und ein unverändertes Phagenmuster hatte, wurde mit SL1437 bezeichnet. Tetrazyklin-sensitive Mutanten des Stamms SL1437 wurden durch Inkubation auf Platten von mit 2,3-Dihydroxybenzoesäure ergänztem Bochnermedium selektiert, um so die Synthese von Enterobaktin zu ermöglichen. Eine Tetrazyklin-sensitive aber noch Aro&supmin; Variante wurde selektiert und mit SL1438 bezeichnet und von ihr wurde gezeigt, daß sie keine Aromaten-unabhängigen Revertanten mit nachweisbarer Häufigkeit herstellt.
Der Stamm SL1438 wurde in verschiedenen Mengen drei Gruppen von fünf Mäusen aus einer bei 370 nicht geschüttelten Übernachtkultur i.p gegeben. Keine der geimpften Mäuse zeigte irgendwelche offensichtliche Krankheitseffekte, auch nicht nach 3 x 10&sup6; Bakterien, der größten verabreichten Dosis.
Um das Immunisierungspotential des Stamms SL1438 zu testen, wurden die Mäuse aus dem vorstehend beschriebenen Experiment - und auch eine Kontrollgruppe von fünf nichtgeimpften Mäusen- 30 Tage nach der Impfung durch i.p. Injektion von 3 x 10&sup5; Bakterien des Stamms SL1372 (d.h. des virulenten S. dublin Stamms, der hisG46 gemacht und aus einem durch Füttern infizierten Kalb reisoliert wurde) immunologisch stimuliert .
Die Ergebnisse wurden 93 Tage nach dem immunologischen Stimulus zusammengestellt: aus der Kontrollgruppe starben 5 von 5 an den Tagen 4, 4, 5, 5 und 6. Von denen, die mit einem Spiegel von 3 x 10&sup4; geimpft worden waren, starben 3 von 5 an den Tagen 5, 8 und 8, und 2 von 5 waren krank, erholten sich aber wieder. Von denen, die mit einem Spiegel von 3 x 10&sup5; geimpft worden waren, starben 2 von 5 an den Tagen 7 und 13, und 3 von 5 sahen krank aus, erholten sich aber wieder. Von denen, die mit einem Spiegel von 3 x 10&sup6; lebenden Bakterien des Stamms SL1438 geimpft worden waren, starben 0 von 5 und 5 sahen rundum gesund aus. Bei einem Gehalt von 3 x 10&sup6; lebenden Bakterien des Stamms SL1438 wurde von einer einzelnen i.p. Dosis gefunden, daß sie den sehr zugänglichen Stamm der BALB/c Mäuse schützt.
Fünf Wochen alte Kälber, entweder geimpfte oder als Kontrolle nichtgeimpfte, wurden dann benutzt, um die Zulänglichkeit des S. dublin Stamms SL1438 als Lebendimpfstoff zu testen. Die Impfung erfolgte mit zwei i.m. Dosen von 1,5 x 10&sup9; Bakterien des genannten Stamms. Alle Kälber wurden dann durch Verabreichung von 1,5 x 10¹&sup0; Bakterien eines kalbvirulenten S. dublin Stamms SL1367 immunologisch stimuliert. Alle drei Kontrollkälber starben. Keins der fünf geimpften Kälber starb.

2. Konstruktion von aro&supmin; pur&supmin; Stämmen Transduktionsverfahren

Jeder der verschiedenen Schritte der Transduktion wurde durch Verwendung eines "hoch-transduzierenden" nicht lysogenisierenden Abkömmling des Phagen P22 (P22 HT105/1 int) bewirkt. Dieser Phage wurde durch Standardverfahren auf dem S. typhimurium Stamm vermehrt, der als Donor verwendet wurde. Das verwendete Lysat war bakteriologisch steril und hatte einen Titer des P22-sensitiven Indikatorstamms S. typhimurium SL1027 von wenigstens 3 x 10&sup9; Plaque-bildenden Einheiten/ml. Transduktanten wurden durch das "Tropfen auf Rasen" -Verfahren erhalten, wobei Platten eines für den Phänotyp der Transduktante selektiven Mediums durch Überschwemmen mit einer Nährlösungskultur des rezipienten Stamms inokuliert wurden, überschüssige Flüssigkeit wurde abpipettiert und die Oberfläche des Agars konnte durch Verdampfen trocknen. Tropfen des Phagenlysats, pur und angemessen verdünnt, wurden dann angewendet und konnten trocknen, gefolgt von einer Inkubation bei 37º.
Tetrazyklin-resistente Transduktanten wurden auf "Oxoid"- Blutagarbasis selektiert, Code CM55, die mit 25 ug/ml Tetrazyklin ergänzt war. Für rezipiente Stämme, die defizitär in der Biosynthese für Aromaten sind, wurde dieses Medium mit 2,3-Dihydroxybenzoesäure (DBA) ergänzt, um die Synthese von Enterobaktin zu erlauben, die zum Einfangen von Eisen (III) benötigt wird. Zur Selektion von Transduktanten mit veränderten Ernährungseigenschaften wurde ein einfaches, definiertes Medium, durch Tryptophan und Cystein (Bedürfnisse des Wildtyps S. typhi) ergänzt, verwendet.
Die Transduktionsplatten wurden 1, 2, 3 und 4 Tage nach der Inkubation geprüft und Kolonien, die in den Tropfenflächen erschienen, wurden gepickt und gereinigt mittels Ausstreichen und Selektion diskreter Kolonien auf dem gleichen Medium, auf dem die Selektion durchgeführt worden war. Im allgemeinen entwickelten sich Transduktantenkolonien später und in viel geringer Anzahl, z.B. mit einem Faktor von 10³, bei Kreuzungen, bei denen der Rezipient S. typhi war, im Vergleich zu solchen, in denen es S. typhimurium, wie der Donor, war. Dies ergab sich vermutlich aus der unvollständigen genetischen Homologie von den Genen des S. typhimurium Donors mit den entsprechenden Genen des S. typhi Rezipienten, wodurch die Häufigkeit von Crossing-over Ereignissen und damit die Integration der Donorgene in das Rezipientenchromosom stark reduziert wurde. Gereinigte Transduktantenklone wurden getestet, um sicherzustellen, daß sie S. typhi und keine atmosphärischen Verunreinigungen waren, und um zu bestätigen, daß sie vom gesuchten Phänotyp waren.

Einführen der aroA Deletion

Das Einführen der aroA Deletion wurde durch zwei Transduktionsschritte bewirkt. In dem ersten Schritt wurde der Elternstamm (CDC80-10) mit dem Phagenlysat G2077 behandelt, welches dem Phagen P22HT 105/1 int entspricht, der auf dem S. typhimurium Stamm TT472, aroA (serC) 1121::Tn10 wuchs. Von den gewünschten Transduktanten würde man erwarten, daß sie Tetrazyklin-resistent und auxotroph sind und sowohl aromatische Metaboliten (auf Grund des Verlusts der Funktion des aroA-Gens) als auch Serin plus Pyridoxin (auf Grund des Verlusts der Funktion des serC-Gens) benötigen, als eine Folge der Insertion des Transposons Tn10 in das Chromoson in den Promotor-nahen Teil des serC aroA Operons. Nach der Reinigung wurden Tetrazyklin-resistente Transduktanten auf ihre Ernährungseigenschaften getestet, um zu sehen, ob sie die erwarteten Bedürfnisse angenommen hatten. Die aro&supmin; serC&supmin; Transduktante des CDC10-80 Elternstamms wurde mit 511Ty bezeichnet.
Die 510Ty, 511Ty Transduktanten wurden als Rezipienten in einer zweiten Transduktion verwendet, in der Phagenlysat G2013 verwendet wurde, gewachsen auf S. typhimurium SL5253, der Deletion DEL407 hat, die sich vom bei aroA554::Tn10 insertierten Transposon Tn10 nach rechts weit genug ausdehnt, um das Tetrazyklin-Resistenzgen des Transposons, eines seiner zwei konstituierenden IS10 Elemente, und den benachbarten Teil des Gens aroA, der die Stellen der aro Punktmutationen 1, 89, 102, 55, 46 und 30 umfaßt, zu entfernen, von denen alle mit jeder anderen rekombinieren können, um aro&spplus; herzustellen und so verschiedene Stellen im Gen aroA definieren. Von den gewünschten Transduktanten würde erwartet werden, daß sie eine Deletion eines Teils von aroA, aber mit normaler serC Funktion, haben, und daher aromatische Metaboliten, aber nicht Serin oder Pyridoxin, benötigen. Von gefundenen Transduktantenklonen, die noch aromatische Metabolite beanspruchen, aber Tetrazyklinsensitiv sind und Serin und Pyridoxin nicht benötigen, wurde gefolgert, daß sie sich durch Austausch des aroA(serC)::Tn10 des Rezipienten durch die serC&spplus; aroA Deletion des Donors gebildet haben. Die aus 511Ty abgeleitete Transduktante wurde mit 515Ty bezeichnet.

Einführen eines Histidinbedarfs als Marker

Der erste verwendete Donorstamm war der Stamm SL5173, der S. typhimurium hisD8557::Tn10 ist, bei dem Tn10 im Gen hisD insertiert ist, wodurch die Unfähigkeit, den letzten Schritt in der Histidinbiosynthese zu bewirken, verursacht wird und ein Bedarf an Histidin bewirkt wird, der nicht durch die Versorgung mit Histidinol gedeckt wird. Lysat G2023 eines auf dem Stamm SL5173 gewachsenen Phagen wurde auf den S. typhi Stamm 515Ty angewendet, der die vorstehend beschriebene aroA Deletion hat. Tetrazyklin-resistente Transduktanten wurden selektiert und nach Reinigung auf ihre Ernährungseigenschaften getestet. Ein Klon mit einem Histidinbedarf, der nicht durch die Versorgung mit Histidinol gedeckt wird, wurde selektiert und mit 521Ty bezeichnet.
Die Transduktante wurde dann mit Lysat des Phagen G1715, der auf dem S. typhimurium Stamm hisG46 wuchs, behandelt, der eine andere Mutation in einem Gen des his (Histidinbiosynthese) Operon als hisD hat und so einen Bedarf an Histidin bereitstellt, der durch Versorgung mit Histidinol gedeckt werden kann. Selektion wurde auf definiertem Medium, das mit Cystein und aromatischen Metaboliten zusammen mit Histidinol (100 ug/ml) ergänzt ist, durchgeführt. Eine Transduktante, die sowohl aromatische Metabolite als auch Histidin oder Histidinol benötigt, wurde mit 523Ty bezeichnet.

Einführen einer purA Deletion

Die Stämme SL5475 und SL5505 sind beide S. typhimurium LT2 purA155Δ zjb-908::Tn10 Abkömmlinge des S. typhimurium Stamms LT2, die eine Deletions-Mutation (purA155) im Gen purA haben und das Transposon Tn10 an einem stillen Ort (zjb-908) insertiert haben, dicht genug bei purA, um ca. 80% Kotransduktion des purA155 mit zjb-908::Tn10 zu ermöglichen, wenn der transduzierende Phage P22 HT105/1 int, der auf dem Stamm SL5475 oder Stamm SL5505 wuchs, auf einen Tetrazyklin sensitiven pur&spplus; S. typhimurium Rezipienten angewendet wird. Der Stamm SL5475 wurde mit einer Standardmethode konstruiert (Kleckner et al. (1977) J. Mol. Biol. 116:125), um eine Transposon-Insertion an einer Stelle des Chromosoms dicht am interessierenden Gen zu fördern, wie im folgenden beschrieben. Der Stamm LT2 purA155 (von dem bekannt ist, daß er eine Deletion eines Teils des Gens purA hat) wurde mit dem transduzierenden Phagen, der auf einem Pool von mehreren tausend Tetrazyklin-resistenten Klonen gewachsen war, behandelt, von denen jeder aus einer unabhängigen Insertion des Transposons Tn10 an irgendeinem Punkt im Chromoson eines Wildtypstamms des S. typhimurium erhalten wurde. Mehrere hundert Tetrazyklin-resistente Transduktanten, die so aus dem Stamm purA155 hervorgerufen wurden, wurden gescreent, um irgendeinen zu entdecken, der Purin-unabhängig geworden ist. Ein solcher Klon wurde gefunden und mit SL5464 bezeichnet. Es wird angenommen, daß er ein transduziertes chromosomales Fragment, das das Gen purA&spplus; umfaßt, inkorporiert hat und eine benachbarte Tn10 Insertion aufweist. Nach der Konvention, die ungefähr die chromosonale Stelle der Insertionen anzeigt, wird dieser Stamm mit zjb-908::Tn10 bezeichnet. Ein Lysat eines transduzierenden Phagen des Stamms SL5464 (LT2 purA&spplus;zjb- 908::Tn10) wurde als nächstes benutzt, um Tetrazyklinresistente Transduktanten des Stamms LT2 purA155 hervorzurufen. Von zwölf derart erhaltenen, Tetrazyklin-resistenten Klonen, waren nur drei Purin-abhängig wie ihre Eltern. Von ihnen wurde angenommen, daß sie aus der Inkorporierung eines transduzierten zjb-908::Tn10 ohne Inkorporierung des benachbarten purA&spplus; Gens des Donors resultieren. Einer dieser drei Klone mit der Konstitution purA155 zjb-908::Tn10 wurde mit SL5475 bezeichnet und als Donor für die zwei eng gekoppelten Gene verwendet. Um die purA155 Deletion in 523Ty einzuführen, wurde ein Phagenlysat des Stamms SL5475 auf die Tetrazyklin-sensitiven S. typhi Rezipientenstämme angewendet und Selektion auf Tetrazyklin-resistente Transduktanten wurde mit dem gleichen Verfahren durchgeführt, wie vorstehendend zum Einführen der aroA(serC)::Tn10 Mutation beschrieben. Nach der Einzelkolonie- Reisolierung wurden Tetrazyklin-resistente Transduktantenklone auf den Bedarf an Adenin getestet (zusätzlich zu ihren früheren Bedürfnissen nach aromatischen Metaboliten und Histidin). Eine zjb906::Tn10 Transduktante mit purA155 Deletion wurde erhalten und mit 531Ty bezeichnet.

Entfernen der Tetrazyklin-Resistenz

Tetrazyklin-sensitive Mutanten von 531Ty wurden durch Sprühen einer verdünnten Nährlösung auf ein Medium erhalten, das das Wachstum von Stämmen, die Tetrazyklin-resistent sind, auf Grund der Anwesenheit von Tn10, verhindert (Bochner et al. (1980) J. Bacteriol. 143:926). Dieses Medium wurde durch Zugabe von ungefähr 1 ug/ml 2,3- Dihydroxybenzoesäure wegen des aro Defekts des verwendeten S. typhi Stamms modifiziert. Die so erhaltenen Tetrazyklin-sensitiven Mutanten, die durch Deletion des Teils des Transposons, das Tetrazyklin-Resistenz verursacht, erhalten wurden, wurden überprüft, um zu bestätigen, daß sie unveränderte Ernährungseigenschaften und daß sie die antigenen Eigenschaften ihrer S. typhi Wildtypvorfahren hatten. Eines dieser Isolate, das mit 541Ty bezeichnet wurde, konstituiert einen Vi-positiven aro (Deletion) his purA (Deletion) Tetrazyklin-sensitiven Lebendimpfstoffstamm in der CDC10-80 Linie.

Herstellung der aro&supmin; pur&supmin; Vi&supmin; Stämme

Vi-negative Mutanten werden aus 531Ty durch Abstreichen von Kolonien Phagen-resistenter Mutantenbakterien erhalten, die sich in Regionen des Lysats entwickeln, die durch die Anwendung des Vi-Phagen I, II (Adaptation A oder E1) oder IV oder einer Mischung aus allen vier Phagen hervorgerufen werden. Die Phagen-resistenten Mutanten wurden nach der Einzelkolonie- Reisolierung auf die An- oder Abwesenheit des Vi-Antigens mittels "slide agglutination tests", in denen kommerziell erhältliches anti-Vi-Serum verwendet wurde, und durch Untersuchen der Sensitivität gegenüber jedem der Vi- spezifischen Phagen getestet. Eine Mutante, die sich in beiden Tests Vi-negativ zeigte, und die Ernähungseigenschaft ihrer Eltern und die O-antigene Eigenschaft der Vorfahren behielt, wurde mit 543ty bezeichnet und konstituierte als ein Vi- negativer Lebendimpfstoffstamm.
Beide, 541Ty und 543Ty wurden Freiwilligen mit allgemein zufriedenstellenden Ergebnissen zu essen gegeben. Es traten keine Krankheitseffekte bei irgendeinem Freiwilligen auf, und einige Freiwillige zeigten serologische Beweise einer Immunantwort. Zusätzlich schieden einige Freiwillige den Impfstoffstamm für einen Tag oder auch zwei aus, was wenigtens kurzzeitige Lebensfähigkeit anzeigte.
Clements und El-Morshidy, Infect. Immun. (1984) 46:564-569, berichten von der Herstellung des Plasmid pJC217, das das Gen zur Expression der 56kD B- Region des hitzelabilen Enterotoxin- Operons von E. coli. enthält. Das Plasmid pJC217 wird in die Stämme 541Ty und 543Ty transformiert, wie bei Clements und El- Morshidy beschrieben. Die Expression von LT-B wird durch eine ELISA Prüfung bestätigt. Mikrotiterplatten sind erst mit 7,5 u g/Well vermischter Ganglioside (Typ III) vorbeschichtet und dann mit 1ug pro Well gereinigtem LT-B. Reagentien und Antisera sind von Sigma Chemical Co. erhältlich. Die Proben werden seriell in PBS (pH 7,2) - 0,05% Tween-20 verdünnt. Ampicillinresistente Kolonien werden auf LT-B getestet. Die LT-B positiven Transformanten werden dann zur Immunisierung für beides, S. typhi und hitzelabiles Enterotoxin, wie vorstehend beschrieben, verwendet.
Das genannte Verfahren kann mit einer breiten Vielfalt pathogener Organismen durch Anwendung des geeigneten Transposons, um aro&supmin; oder andere Mutantenderivate zu erhalten, verwendet werden. Andere Organismen von besonderem Interesse sind Escherichia, insbesondere E. coli, Klebsiella, insbesondere K. pneumoniae oder Shigella. Durch Anwendung eines geeigneten Transposons, das in ein geeignetes Gen der aromatischen Biosynthese insertiert wird, können Techniken wie die Transduktion mit einem allgemein transduzierenden Phagen, z.B. P1, angewendet werden, um für aro&supmin; oder andere Mutanten nichtvirulente, pathogene Organismen, die nichtrevertierend sind, bereitzustellen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines lebenden nichtvirulenten Impfstoffs aus einem virulenten pathogenen zellulären Mikroorganismus, wobei dieser Impfstoff im wesentlichen unfähig ist, in einem Wirbeltierwirt, der für diesen Mikroorganismus zugänglich ist, zur Virulenz zu revertieren, während er eine starke Immunantwort bereitstellt; dieses Verfahren umfaßt das Einbringen einer nichtrevertierenden Mutation in wenigstens zwei unabhängigen Genen in einem Biosyntheseweg, um eine nichtvirulente Mutante zu bilden, die auxotroph für einen Metaboliten ist, der normalerweise in diesem Wirbeltierwirt nicht verfügbar ist und

die Isolierung dieser nichtvirulenten Mutante, die auxotroph für diesen Metaboliten ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem dieser Mikroorganismus ein Bakterium ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem dieses Bakterium Salmonella ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem dieser Biosyntheseweg aro, pur oder pab Gene umfaßt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, das den zusätzlichen Schritt, eine Expressionskassette in diesen pathogenen Mikroorganismus oder diesen nichtvirulenten Mikroorganismus einzuführen, einschließt, wobei diese Expressionskassette ein Antigen eines anderen Pathogens als dieser pathogene Mikroorganismus codiert, wobei dieses Antigen von dem Mikroorganismus hergestellt wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem dieses Antigen ein Membranprotein ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem dieses Antigen ein Bakterienprotein ist.

8. Mikroorganismus, der gemäß irgendeinem der Verfahren der Ansprüche 1 bis 7 hergestellt wird.

9. Lebender nichtvirulenter zellulärer Mikroorganismus, der eine nichtrevertierende Mutation in wenigstens zwei unabhängigen Genen in einem Biosyntheseweg umfaßt, wobei dieser nichtinfektiöse Mikroorganismus auxotroph für einen Metaboliten ist, der normalerweise in einem Wirbeltierwirt nicht verfügbar ist.

10. Mikroorganismus gemäß Anspruch 9, der ein Bakterium ist.

11. Mikroorganismus gemäß Anspruch 10, wobei dieses Bakterium Salmonella ist.

12. Mikroorganismus gemäß Anspruch 9, wobei dieser Biosyntheseweg aro, pur oder pab Gene umfaßt.

13. Mikroorganismus gemäß Anspruch 9, der weiterhin eine Expressionskassette umfaßt, die ein Antigen eines anderen Pathogens als dieser Mikroorganismus codiert, wobei dieses Antigen von diesem Mikroorganismus hergestellt wird.

14. Mikroorganismus gemäß Anspruch 13, worin dieses Antigen ein Membranprotein ist.

15. Mikroorganismus gemäß Anspruch 13, worin dieses Antigen ein Bakterienprotein ist.

16. Impfstoff, der einen lebenden zellulären Mikroorganismus gemäß irgendeinem der Ansprüche 9 bis 15 umfaßt, in einer Menge und in einer Konzentration, die ausreicht, um eine Immunantwort mit einem physiologisch akzeptablen Träger herbeizuführen.