DE69434680T2

DE69434680T2 - Salmonella impfstoffe

Info

Publication number: DE69434680T2
Application number: DE69434680T
Authority: DE
Inventors: III Samuel I. Brookline MILLER; John J. Cambridge MEKALANOS
Original assignee: Harvard College; General Hospital Corp
Current assignee: Harvard College; General Hospital Corp
Priority date: 1993-07-09
Filing date: 1994-07-07
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2014-07-08
Also published as: ES2262134T3; DK0717777T3; EP0717777A1; CN1130923A; TW493987B; DE69434680D1; ATE321860T1; PT717777E; WO1995002048A1; US5695983A; AU7325994A; EP0717777B1; CA2166787A1; AU694948B2; EP0717777A4

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft Vakzine.
Die Erfindung wurde mit Regierungsunterstützung unter Grant No. Al30479 und Grant No. 00917, vergeben von den National Institutes of Health, gemacht. Die Regierung hat bestimmte Rechte an der Erfindung.
Darmfieber und Durchfallerkrankungen, z. B. Typhus abdominalis und Cholera, sind wichtige Ursachen für Morbidität und Mortalität in allen Entwicklungsländern (Hook et al., 1980, in Harrison's Principles of Internal Medicine, 9. Ausgabe, 641-848, McGraw Hill, New York). Zu den herkömmlichen Ansätzen der Entwicklung von Vakzinen für bakterielle Krankheiten gehören die parenterale Injektion gereinigter Komponenten oder abgetöteter Organismen. Diese parenteral verabreichten Vakzine erfordern eine fortgeschrittene Herstellungstechnologie, sind relativ teuer und stoßen oft aufgrund von Abneigung gegenüber Injektionen durch Nadeln auf Widerstand der Patienten. Lebendige orale Impfstämme haben gegenüber parenteralen Vakzinen mehrere Vorteile: geringe Kosten, leichte Verabreichung und einfache Herstellung.
Die Entwicklung von Lebendvakzinen wurde häufig durch mangelndes Verständnis der Pathogenese der interessierenden Krankheit auf der molekularen Ebene begrenzt. Kandidaten für Lebendvakzinstämme erfordern nicht-reversible genetische Veränderungen, die die Virulenz des Organismus beeinträchtigen, aber nicht seine Auslösung einer Immunantwort. Die Charakterisierung der Mechanismen der Toxigenese von Vibrio cholerae hat es möglich gemacht, basierend auf einer Deletion der Toxingene Lebendvakzinstämme herzustellen (Mekalanos et al., 1983, Nature 306:551, Levine et al., 1988, Infect. Immun. 56:161).
Neuere Studien haben begonnen, die molekulare Basis für das Überleben von Salmonella typhimurium in Makrophagen und für die Virulenz zu definieren (Miller et al., 1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5054). Salmonella typhimurium-Stämme mit Mutationen im positiven regulatorischen Regulon phoP zeigen erheblich attenuierte Virulenz gegenüber BALB/c-Mäusen. Das phoP-Regulon besteht aus zwei als als phoP und phoQ bezeichneten Genen, die in einem Operon vorliegen. Die Genprodukte von phoP und phoQ sind anderen Mitgliedern bakterieller Zweikomponenten-Transkriptionsregulatoren, die auf Umweltreize reagieren, sehr ähnlich und kontrollieren die Expression einer großen Anzahl anderer Gene. Eine Mutation in einem dieser von der phoP-Regulationsregion regulierten Gene, pagC, verursacht einen Defekt der Virulenz. Stämme mit pagC, phoP oder phoQ-Mutation vermitteln teilweise Schutz gegen nachfolgende Infektionen durch Wildtyp-Salmonella typhimurium.
Salmonella-Arten verursachen ein Spektrum klinischer Krankheitsbilder, zu dem Darmfieber und akute Gastroenteritis gehören (Hook et al., 1980, siehe oben). Infektionen durch Salmonella-Arten sind bei immunsupprimierten Personen häufiger (Celum et al., 1987, J. Infect. Dis. 156:998). Salmonella typhi, das Bakterium, das Typhus abdominalis verursacht, kann nur Menschen infizieren (Hook et al., 1980, siehe oben). Die enge Wirtsspezifität von Salmonella typhi hat zu einer ausgedehnten Verwendung von Salmonella enteriditis typhimurium- Infektionen von Mäusen als Labormodell für Typhus abdominalis geführt (Carter et al., 1984 J. Exp. Med. 139:1189). Salmonella typhimurium infiziert ein breiteres Spektrum von Wirten, verursacht beim Menschen akute Gastroenteritis und bei Mäusen und Kühen eine dem Typhus abdominalis ähnliche Erkrankung.
Salmonella-Infektionen werden durch orale Aufnahme erworben. Nachdem sie den Magen durchquert haben, vermehren sich die Organismen im Dünndarm (Hornik et al., 1970 N. Eng. J. Med. 283:686). Salmonellen sind imstande, in die Zellen der Darmmukosa einzudringen, und Salmonella typhi kann diese Schleimhautbarriere durchdringen und sich über die Peyer'schen Plaques in die Lamina propria und die regionalen Lymphknoten ausbreiten. Nach Bakterämie erfolgt dann Besiedlung der reticuloendothelialen Zellen des Wirtes. Die Fähigkeit von Salmonella typhi, in den Zellen des menschlichen reticuloendothelialen Systems zu überleben und sich zu vermehren, ist von zentraler Bedeutung für seine Pathogenese (Hook et al., 1980, siehe oben, Hornick et al., 1970, siehe oben, und Carter et al., 1984, siehe oben).
Die Immunität gegenüber Salmonella typhi umfasst humorale und zellvermittelte Immunität (Murphy et al., 1987, J. Infect. Dis. 156:1005) und kann durch Impfung erworben werden (Edelman et al., 1986, Rev. Inf. Dis. 8:324). In jüngerer Zeit zeigten Feldversuche am Menschen eine erhebliche Schutzwirkung gegenüber Salmonella typhi-Infektion nach intramuskulärer Impfung mit teilweise gereinigtem Vi-Antigen (Lanata et al., 1983, Lancet 2:441). Eine antikörperabhängige Verbesserung der Abtötung von Salmonella typhi durch T-Zellen wurde an Personen gezeigt, die eine Salmonella typhi-Lebendimpfung erhielten, was darauf hindeutet, dass diese Antikörper möglicherweise für den Wirt notwendig sind, um eine zellvermittelte Immunantwort hervorzubringen (Levine et al., 1987, J. Clin. Invest. 79:888). Die zellvermittelte Immunantwort ist für die Immunität gegenüber Typhus wichtig, da abgetötete Vakzine, die diese Immunantwort nicht auslösen, beim Menschen keine Schutzwirkung haben (Collins et al., 1972, Infect. Immun. 41:742).
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Salmonella-Vakzin bereit, das keine vorübergehende Bakterämie hervorruft. Grundsätzlich umfasst die Erfindung eine Salmonella-Zelle, z. B. eine Zelle von Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium oder Salmonella cholerae-suis, deren Virulenz durch eine Mutation im phoP-Regulon attenuiert ist. Der Begriff „phoP-Regulon" bezeichnet hier eine DNA, die eine Einheit der Salmonella-Virulenzfaktoren umfasst, die durch zwei regulatorische Gene, phoP und phoQ, gekennzeichnet ist, sowie strukturelle Gene, deren Expression von phoP und phoQ reguliert wird, z. B. durch die regulatorische Region von phoP unterdrückte Gene („prg") oder durch die regulatorische Region von phoP aktivierte Gene („pag"). Solch eine Bakterienzelle kann als Vakzin verwendet werden, um einen Säuger gegen Salmonellose zu immunisieren.
Die Salmonella-Zelle kann von beliebigem Serotyp sein, z. B. Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Salmonella paratyphi C, Salmonella pylorum, Salmonella dublin, Salmonella heidelberg, Salmonella newport, Salmonella minnesota, Salmonella infantis, Salmonella virchow oder Salmonella panama.
Die Mutation ist eine nicht-reversible Null-Mutation im phoP/phoQ-Lokus, die eine Deletion der Nukleotide 376 bis 1322 innerhalb des phoP/phoQ-Regulationslokus umfasst.
Ein optionale zweite Mutation kann eine nicht-reversible Null-Mutation im aroA-Lokus oder eine nicht-reversible Null-Mutation im aroC/aroD-Lokus oder in einem anderen an der Biosynthese aromatischer Aminosäuren beteiligten Lokus sein.
Um die Virulenz der erfindungsgemäßen Bakterienzellen noch weiter zu attenuieren, kann die Zelle noch eine weitere Mutation, z. B. eine Deletion, in einem nicht an der Synthese aromatischer Aminosäuren beteiligten Gen enthalten, z. B. eine Mutation, die die Zelle für eine nicht-aromatische Aminosäure, z. B. Histidin, auxotroph macht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Bakterienzelle eine Salmonella typhi-Zelle mit dem Genotyp aroA^-, his^-, phoP/phoQ^-, z. B. TyLH445.
Weiterhin wird eine Salmonella-Zelle offenbart, deren Virulenz durch die konstitutive Expression eines Gens unter der Kontrolle eines Zweikomponenten-Regulationssystems attenuiert ist. In bevorzugten Ausführungsformen dieser Zelle ist die konstitutive Expression das Ergebnis einer Mutation in einem Bestandteil des Zweikomponenten-Regulationssystems. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die bakterielle Zelle eine zweite Mutation, die die Virulenz attenuiert.
Weiterhin wird ein Vakzin offenbart, in dem das Zweikomponenten-Regulationssystem die phoP-Regulationsregion ist, und das Gen unter Kontrolle des Zweikomponenten-Systems ein von der phoP-Regulationsregion reguliertes Gen ist, z. B. ein prg-Gen, z. B. prgA, prgB, prgC, prgE oder prgH, oder ein pag-Gen, z. B. pagC. Die konstitutive Expression kann das Ergebnis einer Veränderung oder Mutation sein, z. B. einer Deletion, (vorzugsweise einer nichtreversiblen Mutation) im Promotor des regulierten Gens oder der phoP-Regulationsregion, z. B. eine Mutation im phoQ- oder phoP-Gen, z. B. die phoP^c-Mutation.
Die Beschreibung offenbart ebenfalls ein Vakzin, das eine Bakterienzelle umfasst, die durch Verringerung der Expression eins Virulenzgens unter der Kontrolle der phoP-Regulationsregion attenuiert ist, z. B. ein prg-Gen, z. B. prgA, prgB, prgC, prgE oder prgH.
Weiterhin wird ein Vakzin offenbart, in dem die Salmonella-Zelle eine erste Mutation umfasst, z. B. eine Deletion, die die Virulenz attenuiert, z. B. eine Mutation in einem Gen der phoP-Regulationsregion, z. B. eine Mutation im phoP- oder phoQ-Gen, z. B. phoP^c, oder eine Mutation in einem von der phoP-Regulationsregion regulierten Gen, und eine zweite Mutation, die die Virulenz attenuiert, z. B. eine Mutation in einem Gen für die Synthese aromatischer Aminosäuren, z. B. in einem aro-Gen, eine Mutation in einem von der phoP-Regulationsregion regulierten Gen, z. B. eine Mutation in einem prg-Gen, z. B. prgA, prgB, prgC, prgE oder prgH oder in einem pag-Lokus, z. B. eine pagC-Mutation.
Weiterhin wird eine Bakterienzelle offenbart, die eine erste Mutation in einem Gen der phoP-Regulationsregion und eine zweite Mutation in einem Gen für die Synthese von aromatischen Aminosäure, z. B. einem aro-Gen, umfasst.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Vakzin dar, das eine lebendige Salmonella-Zelle umfasst, deren Virulenz durch eine nicht-reversible Null-Mutation innerhalb des phoP/phoQ-Lokus attenuiert ist, so dass der zelluläre Genotyp phoP/phoQ^- ist, wobei diese nicht-reversible Null-Mutation eine Deletion der Nukleotide 376-1322 innerhalb des phoP/phoQ-Lokus umfasst.
In bevorzugten Ausführungsformen enthält die Salmonellenzelle eine die Virulenz attenuierende Mutation in einem zweiten Gen, z. B. einem Gen für die Synthese aromatischer Aminosäuren, z. B. einem aro-Gen.
Weiterhin wird ein Vakzin offenbart, in dem die Bakterienzelle eine Salmonella-Zelle ist, das Zweikomponenten-Regulationssystem die phoP-Regulationsregion ist, und das Gen unter seiner Kontrolle ein prg-Gen, z. B. prgA, prgB, prgC, prgE oder prgH oder ein pag-Gen, z. B. das pagC-Gen, ist.
Weiterhin wird ein Vakzin, bevorzugt ein Lebendvakzin, offenbart, das eine Salmonella-Zelle umfasst, z. B. eine Salmonella typhi-, Salmonella enteritidis typhimurium- oder Salmonella cholerae-suis-Zelle, die eine erste die Virulenz attenuierende Mutation in einem Gen für die Biosynthese aromatischer Aminosäuren, z. B. einem aro-Gen, und eine zweite die Virulenz attenuierende Mutation in einem Gen der phoP-Regulationsregion, z. B. eine phoP^--Mutation, umfasst.
Weiterhin wird eine lebende Salmonella-Zelle oder im Wesentlichen gereinigte Zubereitung davon offenbart, z. B. eine Salmonella typhi-, Salmonella enteriditis typhimurium- oder Salmonella cholerae-suis-Zelle, in der in ein Virulenzgen, z. B. ein Gen der phoP-Regulationsregion, oder ein von der phoP-Regulationsregion reguliertes Gen, z. B. ein prg-Gen, z. B. prgA, prgB, prgC, prgE oder prgH oder ein pag-Lokus, z. B. pagC, ein Gen, das ein heterologes Protein kodiert, oder ein regulatorisches Element dafür eingefügt ist.
In bevorzugten Ausführungsformen trägt die lebende Salmonella-Zelle eine zweite Mutation, z. B. eine aro-Mutation, z. B. eine aroA-Mutation, z. B. aroA^- oder aroADEL407, die die Virulenz attenuiert.
Die DNA, die ein heterologes Protein exprimiert, kann unter der Kontrolle eines von Umwelteinflüssen regulierten Promotors stehen. Die lebende Salmonella-Zelle kann weiterhin eine DNA-Sequenz, die die T7-Polymerase unter der Kontrolle eines durch Umwelteinflüsse regulierten Promotors kodiert, und einen Promotor für die T7-Polymerase, wobei der T7-Promotor die Expression des heterologen Antigens kontrolliert, umfassen.
Weiterhin wird ein Vektor offenbart, der imstande ist, sich in das Chromosom von Salmonella zu integrieren, und der folgende Elemente umfasst: Eine erste DNA-Sequenz, die ein heterologes Protein kodiert; eine zweite (optionale) DNA-Sequenz, die einen Macker kodiert, z. B. einen selektiven Macker, z. B. ein Gen, das eine Schwermetallresistenz vermittelt, oder ein Gen, das eine von dem zu transformierenden Stamm getragene auxotrophe Mutation komplementiert; und eine dritte DNA-Sequenz, z. B. ein vom phoP-Regulon kodiertes Gen, z. B. ein prg-Gen, z. B. prgA, prgB, prgC, prgE oder prgH oder einen pag-Lokus, z. B. pagC, kodierend ein von der phoP-Regulationsregion reguliertes Genprodukt, das für die Virulenz erforderlich ist, wobei die dritte DNA-Sequenz durch Mutation inaktiviert ist.
In weiteren offenbarten Beispielen: Die erste DNA-Sequenz kann auf dem Vektor so positioniert sein, dass sie die dritte DNA-Sequenz mutationell inaktiviert; der Vektor kann sich in einem Wildtyp-Stamm von Salmonella nicht vermehren; das heterologe Protein steht unter der Kontrolle eines durch Umwelteinflüsse regulierten Promotors; und der Vektor umfasst weiterhin eine DNA-Sequenz, die die T7-Polymerase unter der Kontrolle eines durch Umwelteinflüsse regulierten Promotors kodiert, sowie einen Promotor für die Transkription durch die T7-Polymerase, wobei der Promotor für die Transkription durch die T7-Polymerase die Expression des heterologen Antigens kontrolliert.
Die Beschreibung offenbart auch ein Verfahren zur Impfung eines Tieres, z. B. eines Säugers, z. B. eines Menschen, gegen eine von einem Bakterium, z. B. Salmonella, verursachte Krankheit, das die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Vakzins umfasst.
Der Begriff „Zweikomponenten-Regulationssystem" bezeichnet hier ein bakterielles Regulationssystem, das die Expression mehrerer Proteine in Abhängigkeit von Umweltsignalen reguliert. Die zwei in dem Ausdruck erwähnten Komponenten sind ein Sensor, der z. B. einen Umweltparameter wahrnehmen und als Reaktion darauf die Aktivierung vermitteln kann, z. B. durch Förderung der Phosphorylierung der zweiten Komponente, des Aktivators. Der Aktivator beeinflusst die Expression von Genen unter der Kontrolle des Zweikomponenten-Systems. Ein Zweikomponenten-System kann z. B. eine Histidinproteinkinase und einen phosphorylierbaren Regulator umfassen, wie sowohl in Gram-positiven als auch Gram-negativen Bakterien gefunden. So sind z. B. bei E. coli 10 Kinasen und 11 Regulatoren identifiziert worden. Sie kontrollieren die Chemotaxis, die Stickstoffregulation, die Phosphatregulation, die Osmoregulation, die Sporenbildung und viele andere zelluläre Funktionen (Stock et al., 1989 Microbiol. Rev. 53:450-490). Ein Zweikomponenten-System kontrolliert auch die Virulenz der Pflanzentumorbildung durch Agrobacterium tumefaciens (Leroux et al. EMBO J 6:849-856). Ähnliche Virulenzregulatoren sind an der Virulenz von Bordetella pertussis (Arico et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6671-6675), und Shigella flexneri (Bernardini et al., 1990, J. Bact. 172:6274-6281) beteiligt.
Der Begriff „durch Umwelteinflüsse reguliert" bezeichnet hier ein Expressionsmuster, bei dem die Expression eines Gens in einer Zelle von dem Niveau einer Eigenschaft oder eines Bestandteils der Umgebung, in der sich die Zelle befindet, abhängt. Zu Beispielen gehören Promotoren in biosynthetischen Stoffwechselwegen, die von dem Spiegel einer spezifischen Verbindung oder spezifischer Verbindungen, z. B. Eisen, ein- oder ausgeschaltet werden, temperaturempfindliche Promotoren oder Promotoren, die in spezifischen zellulären Kompartimenten aktiver exprimiert werden, z. B. in Makrophagen oder Vakuolen.
Der Begriff „Vakzin" bezeichnet hier eine Zubereitung, die Stoffe umfasst, die einen erwünschten biologischen Effekt auslösen, z. B. eine Immunantwort, in Kombination mit einem geeigneten Trägermaterial. Das Vakzin umfasst einen lebenden Organismus, in welchem Fall es üblicherweise oral verabreicht wird. (Abgetötete Organismen oder Bestandteile davon werden üblicherweise parenteral verabreicht.) Die für das erfindungsgemäße Vakzin verwendeten Zellen sind lebend und somit imstande, die Därme des beimpften Tieres zu besiedeln.
Der Begriff „Mutation" bezeichnet hier jede Art von Veränderung (im Vergleich zu dem passenden Elternstamm) in der DNA-Sequenz eines Organismus. Diese Veränderungen können z. B. spontan, chemisch, durch Energie, z. B. Röntgenstrahlen, oder durch andere Arten von Mutagenese, durch gentechnische Veränderungen oder als ein Ergebnis einer Paarung oder anderer Formen des Austauschs genetischer Informationen entstehen. Zu Mutationen gehören z. B. Basenaustausche, Deletionen, Insertionen, Inversionen, Translokationen oder Duplikationen.
Eine Mutation "attenuiert" die Virulenz, wenn als Ergebnis der Mutation das Maß der Virulenz der mutierten Zelle im Vergleich zu dem Maß einer Zelle des Elternstamms verringert ist, wie es z. B. zum Ausdruck kommt in (a) einer signifikanten (z. B. mindestens 50 %) Verringerung der Virulenz des mutierten Stammes gegenüber dem Elternstamm, oder (b) einer signifikanten (z. B. mindestens 50 %) Verringerung der Menge des als Virulenzfaktor identifizierten Polypeptids bei dem mutierten Stamm im Vergleich zum Elternstamm.
Der Begriff „nicht-reversible Mutation" bezeichnet hier eine Mutation, die nicht durch den Austausch eines einzelnen Basenpaares revertiert werden kann, z. B. Deletions- oder Insertions-Mutationen und Mutationen, die mehr als einen Schaden umfassen, z. B. eine Mutation, die aus zwei getrennten Punktmutationen besteht.
Der Begriff „phoP-Regulationsregion" bezeichnet hier ein Zweikomponenten-Regulationssystem, das die Expression der pag- und prg-Gene kontrolliert. Sie enthält den phoP-Lokus und den phoQ-Lokus.
Der Begriff „durch die phoP-Regulationsregion regulierte Gene" bezeichnet hier Gene wie die pag- und prg-Gene.
Der Begriff „pag" bezeichnet hier ein Gen, das von der phoP-Regulationsregion positiv reguliert wird.
Der Begriff „prg" bezeichnet hier ein Gen, das von der phoP-Regulationsregion negativ reguliert wird.
Der Begriff „Gen für die Synthese aromatischer Aminosäuren" bezeichnet hier ein Gen, das ein Enzym kodiert, das einen Schritt in der Synthese einer aromatischen Aminosäure katalysiert. aroA, aroC und aroD sind Beispiele solcher Gene bei Salmonella. Mutationen in diesen Genen können ohne vollständigen Verlust der Immunogenität die Virulenz attenuieren.
Der Begriff „abnormale Expression" bezeichnet hier eine Expression, die höher oder niedriger als die im Wildtyp beobachtete ist.
Der Begriff „heterologes Protein" bezeichnet hier ein Protein, das im Wildtyp nicht exprimiert oder von einem anderen Ort auf dem Chromosom exprimiert wird, z. B. ist ein heterologes Protein eines, das von einem Gen kodiert wird, das in ein zweites Gen inseriert worden ist.
Der Begriff „Virulenzgen" bezeichnet hier ein Gen, dessen Inaktivierung zu einer Salmonella-Zelle geringerer Virulenz als eine ähnliche Salmonella-Zelle, in der das Gen nicht inaktiviert ist, führt. Zu den Beispielen gehören phoP-, pagC- und prgH-Gene.
Der Begriff „Marker" bezeichnet hier ein Genprodukt, dessen Gegenwart leicht zu messen ist, z. B. ein Genprodukt, das Resistenz gegenüber einem Schwermetall vermittelt oder ein Genprodukt, das unter einem gegebenen Satz von Bedingungen das Wachstum ermöglicht oder verhindert.
Der Begriff „gereinigte Zubereitung" bezeichnet hier eine Zubereitung, z. B. eine Zubereitung eines Proteins, gereinigt von den Proteinen, Lipiden und anderen Substanzen, mit denen es assoziiert ist. Die Zubereitung ist vorzugsweise mindestens zweifach bis zehnfach gereinigt.
Der Begriff „konstitutive Expression" bezeichnet hier eine Genexpression, die in geringerem Maße moduliert oder reguliert wird als die Expression des gleichen Gens in einem geeigneten Kontrollstamm, z. B. einem Eltern- oder Wildtypstamm. Wenn z. B. ein Gen normalerweise unter einem ersten Satz von Bedingungen reprimiert und unter einem zweiten Satz von Bedingungen dereprimiert ist, wäre die konstitutive Expression eine Expression auf gleichem Niveau, z. B. dem reprimierten Niveau, dem dereprimierten Niveau oder einem mittleren Niveau, ohne Abhängigkeit von den Bedingungen. „Teilweise konstitutive Expression" wird in die Definition der konstitutiven Expression eingeschlossen und liegt vor, wenn der Unterschied zwischen zwei Expressionsniveaus im Vergleich zu dem, was in einem geeigneten Kontrollstamm, z. B. einem Wildtyp- oder Elternstamm beobachtet wird, verringert ist.
Eine "im Wesentlichen gereinigte Zubereitung" einer Bakterienzelle ist eine Zubereitung von Zellen, in denen verunreinigende Zellen ohne den erwünschten Mutantengenotyp weniger als 10 %, vorzugsweise weniger als 1 % und insbesondere bevorzugt weniger als 0,1 % der gesamten Zellzahl in der Zubereitung darstellen.
Die Erfindung ermöglicht durch Mutationen in regulatorischen Zweikomponenten-Systemen die Attenuation der Virulenz von Bakterien und von Vakzinen, die lebende Bakterien enthalten. Die erfindungsgemäßen Vakzine sind im Hinblick auf ihre Virulenz in hohem Maße attenuiert, aber sie behalten ihre Immunogenität, so dass sie sowohl sicher als auch wirksam sind. Die hier offenbarten Vektoren erlauben die schnelle Herstellung von Stämmen, die DNA enthalten, die heterologe Proteine kodiert, z. B. Antigene. Die das heterologe Protein kodierende DNA ist chromosomal integriert und damit, im Gegensatz zu Plasmidsystemen, deren Stabilität von Antibiotikumresistenz oder anderem Selektionsdruck abhängt, stabil. Lebende Salmonella-Zellen, in denen die Expression eines heterologen Proteins unter der Kontrolle eines auf Umwelteinflüsse reagierenden Promotors steht, exprimieren kein heterologes Protein, wenn eine solche Expression unerwünscht ist, z. B. während der Kultur, Vakzinherstellung oder Lagerung, was die Lebensfähigkeit der Zellen erhöht, aber bilden große Mengen des Proteins, wenn sie Menschen oder Tieren verabreicht werden. Dies ist wünschenswert, weil eine hohe Expression vieler heterologer Proteine in Salmonella von toxischen Wirkungen gegenüber dem Bakterium begleitet sein kann. Die Verwendung einer einzelnen integrierten Kopie der das heterologe Protein kodierenden DNA trägt ebenfalls zu minimaler Expression des heterologen Proteins bei, wenn die Expression nicht erwünscht ist. In Ausführungsformen, in denen ein Virulenzgen, z. B. das pagC-Gen oder das prgH-Gen, den Integrationsort für die das heterologe Protein kodierende DNA enthält, ist die Virulenz des Organismus attenuiert.
Der Begriff „im Wesentlichen reine DNA" bezeichnet hier eine Nukleinsäuresequenz, ein Nukleinsäuresegment oder Nukleinsäurefragment, die bzw. das von den in natürlichem Zustand flankierenden Sequenzen gereinigt ist, z. B. eine DNA, die von den normalerweise an das Fragment angrenzenden Sequenzen befreit ist, z. B. von den Sequenzen, die in dem Genom, in dem es normalerweise vorkommt, angrenzen, befreit ist. Der Begriff bezieht sich auch auf eine DNA, die im Wesentlichen von anderen Komponenten, die natürlicherweise die DNA begleiten, gereinigt ist, z. B. DNA, die von den Proteinen gereinigt ist, die normalerweise mit ihr in einer Zelle vergesellschaftet sind.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen hervor.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Zunächst werden die Zeichnungen beschrieben.
Zeichnungen
1 ist eine graphische Darstellung des Überlebens von Salmonella-Stämmen in Makrophagen.
2 ist eine Karte der Restriktionsendonuklease-Schnittstellen im pagC-Lokus.
3 ist eine graphische Darstellung der DNA-Sequenz der pagC-Region (SEQ ID NO:1).
4 ist eine Karte der Position von prgH innerhalb des hil-Lokus. Die Pfeile zeigen die Richtung der Orientierung des Neomycin-Promotors der Tn5B50-Insertionen innerhalb des hil-Lokus und die Transkriptionsrichtung des prgH1::TnphoA-Fusionsproteins an. Restriktionsendonuklease-Schnittstellen sind dargestellt durch B, BamHI; H, HinDIII; X, XhoI; S, SacI; V, EcoRV.
5 ist eine DNA-Sequenz aus dem prgH-Gen (Plasmid pIB01) (SEQ ID NO:3).
6 ist ein Balkendiagramm, das einen Vergleich der Empfindlichkeit von Wildtyp (ATCC 14028), PhoP-Null-Mutanten (CS015) und pag::TnphoA-mutierten Stämmen gegenüber Defensin NP-1 zeigt. Die Y-Achse stellt den Defensin-Abtötungsindex (Defensin Killing Index, DKI) dar, bei dem es sich um ein Maß für die durch NP-1-Exposition abgetöteten Bakterien handelt. Der DKI ist als die logarithmische Funktion des Verhältnisses von Kontrollbakterien zu überlebenden Bakterien nach Inkubation mit NP-1 definiert [DKI=log (CFU ohne NP-1/CFU mit NP-1)]. Die einzelnen Balken stellen Mittelwert und Standardabweichung aus 5 getrennten Experimenten dar. Die X-Achse bezeichnet das mutierte Allel. Es wurde ermittelt, dass der durchschnittliche DKI für jeden der getesteten prgH1::TnphoA-Stämme sich nicht von dem von Wildtyp-Salmonella unterschied (p < 0,05). Im Gegensatz hierzu unterschied sich die phoP-Mutante erheblich (p < 0,0001).
7 ist ein Diagramm, das eine teilweise physische Karte der Restriktionsendonuklease-Schnittstellen in der chromosomalen Region von pagC zeigt. Die für 50 % der Mäuse letalen Dosen (LD₅₀) der Stämme mit Transposoninsertionen in pagD, envE, msgA und pagC sind über jedem Gen eingetragen. Horizontale Pfeile zeigen die Transkriptionsrichtung. Vertikale Pfeile bezeichnen TnphoA-Insertionen, und das leere Dreieck bezeichnet eine mudJ-Insertion. Unterhalb der chromosomalen Karte befindet sich eine Darstellung des DNA-Inserts im Plasmid pCAA9, das mit TnphoA und mudJ mutagenisiert wurde. Buchstabenkürzel: A, AccI; C, ClaI; E, EcoRI; H, HpaI; P, PstI; und V, EcoRV.
8 ist eine DNA-Sequenz der Region stromaufwärts von pagC einschließlich der Translation jedes offenen Leserahmens. Die HpaI- und ClaI-Restriktionsschnittstellen am Anfang und Ende der Region sind dargestellt. Shine-Dalgarno-Regionen sind unterstrichen und Stem-Loop-Strukturen (potenzielle ρ-unabhängige Terminatoren) sind mit einer Linie oberhalb und unterhalb der Sequenz markiert. Pfeilspitzen bezeichnen die Stelle der repräsentativen Transposon-Einfügung in jedem Gen. Horizontale Pfeile in den pagD- und msgA-Promotorregionen kennzeichnen die Transkriptionsinitiationsstellen, und Sterne kennzeichnen die -10- und -35-Sequenzen. Die Konsensusstelle für die Anfügung von Fettsäuren in EnvF is in Klammern eingeschlossen. Der pagD-Leserahmen beginnt bei Nukleotid 91 und endet bei Nukleotid 354 der SEQ ID NO:5; der envE-Leserahmen beginnt bei Nukleotid 1114 und endet bei Nukleotid 1650 von SEQ ID NO:5; der msgA-Leserahmen beginnt bei Nukleotid 1825 und endet bei Nukleotid 2064 von SEQ ID NO:5; und der envF-Leserahmen beginnt bei Nukleotid 2554 und endet bei Nukleotid 3294 von SEQ ID NO:5.
9 ist eine DNA-Sequenz, die die prgH-, prgI-, prgJ- und prgK-Gene enthält. Das Startcodon (ATG) jedes Gens ist unterstrichen, und das Stopcodon ist mit einem Sternchen gekennzeichnet. Der prgH-Leserahmen beginnt bei Nukleotid 688 und endet bei Nukleotid 1866 von SEQ ID NO:10; der prgI-Leserahmen beginnt bei Nukleotid 1891 und endet bei Nukleotid 2133 von SEQ ID NO:10; der prgJ-Leserahmen beginnt bei Nukleotid 2152 und endet bei Nukleotid 2457 von SEQ ID NO:10; und der prgK-Leserahmen beginnt bei Nukleotid 2454 und endet bei Nukleotid 3212 von SEQ ID NO:10.
10 ist ein Liniendiagramm, das die Wachstumsraten des Salmonella-Elternstamms (aroA^-) und des Vakzin-Stammes (aroA^-, phoP^-) zeigt.
11 ist ein Balkendiagramm, das die Defensinempfindlichkeit von Mäuse-Vakzinstämmen (Salmonella typhimurium) zeigt.
12 ist ein Balkendiagramm, das die Aktivierung von phoP, unter Verwendung des PagB:LacZ-Fusionskonstrukts als Reporter anhand der LacZ-Aktivität gemessen, darstellt.
13 ist ein Balkendiagramm, das die Defensinempfindlichkeit des Salmonella typhi-Vakzin-Stammes TyLH445 verglichen mit dem aroA^--Elternstamm zeigt.
14A ist ein Diagramm, das die relative Expression der konstitutiven Expression (610 und 617) und der phoP-regulierten (pagC und pagD) Expression von AP-Fusionsproteinen zeigt.
14B ist ein Diagramm, das die Immunreaktion auf Lipopolysaccharid (LPS) zeigt.
14C ist ein Diagramm, das die Immunantwort auf das als Modell verwendete heterologe Antigen, AP, zeigt.
15 ist eine DNA-Sequenz, die die intergene Region von pagC bis pagD zeigt. Der Translationsstart von pagC (ATG auf dem entgegengesetzten DNA-Strang) ist unterstrichen (Nukleotide 1 bis 3 der SEQ ID NO:15). Der Transkriptionsstart von pagC (Nukleotid 562) ist mit einem nach links deutenden Pfeil markiert. Der Translationsstart von pagD (ATG) ist unterstrichen (Nukleotide 815 bis 817 von SEQ ID NO:15). Der Transkriptionsstart von pagD ist mit einem nach rechts deutenden Pfeil bezeichnet (Nukleotid 776).
Hinterlegung von Stämmen
Unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zu Zwecken des Patentverfahrens wurden die folgenden Materialien bei der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, MD, USA, hinterlegt.
Der Bevollmächtigte des Anmelders, Massachusetts General Hospital, erklärt, dass die ATCC eine Hinterlegungsstelle ist, die die Dauerhaftigkeit des hinterlegten Materials und, wenn ein Patent gewährt worden ist, unproblematische Zugänglichkeit für die Öffentlichkeit gewährt. Alle Einschränkungen betreffend die Verfügbarkeit des solchermaßen hinterlegten Materials für die Öffentlichkeit werden bei Gewährung eines Patents unwiderruflich aufgehoben. Während des laufenden Anmeldungsverfahrens wird das Material demjenigen verfügbar sein, der vom Commissioner als nach 37 CFR 1.14 und 35 USC § 122 dazu berechtigt anerkannt wird. Das hinterlegte Material wird mit aller notwendigen Sorgfalt gepflegt werden, um es über einen Zeitraum von mindestens fünf Jahren nach der letzten Anforderung einer Probe des hinterlegten Plasmids und in jedem Fall über einen Zeitraum von mindestens dreißig (30) Jahren nach dem Hinterlegungsdatum oder über die durchsetzbare Lebensdauer des Patents, welcher der beiden Zeiträume jeweils länger ist, lebensfähig und unkontaminiert zu erhalten. Der Bevollmächtigte der Anmelder erkennt seine Pflicht an, das hinterlegte Material zu ersetzen, sollte aufgrund des Zustandes des hinterlegten Materials die Hinterlegungsstelle unfähig sein, auf Anfrage eine Probe zur Verfügung zu stellen.
Der PhoP^c-Stamm CS022 (unten beschrieben) ist bei der American Type Culture Collection (Rockville, MD) hinterlegt worden und hat die ATCC-Bezeichnung 55130 erhalten.
Das Plasmid pIB01, das das prgH-Gen enthält, ist am 9. Juli 1993 bei der American Type Culture Collection (Rockville, MD) hinterlegt worden und hat die ATCC-Bezeichnung 75496 erhalten. Tabelle 1: Bakterienstämme und Eigenschaften
Tabelle 2: Virulenz und Schutzwirkung von PhoP^c- und PhoP^--Salmonella-Stämmen

^(*)Die Organismen wurden oral verabreicht. In allen anderen Experimenten wurden die Organismen intraperitoneal verabreicht.

Der PhoP^c-Stamm ist bezüglich des Überlebens innerhalb von Makrophagen defizient
Aufgrund der Bedeutung des Überlebens innerhalb von Makrophagen für die Virulenz von Salmonella (Fields et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5189) wurden PhoP^c-Bakterien auf diese Eigenschaft getestet. Der Stamm CS022 hatte im Vergleich zu Wildtyporganismen Defekte in der Fähigkeit, in Makrophagen zu wachsen und zu persistieren (1). In 1 wird das Überleben von Stamm CS022 (PhoP^c) (Dreiecke) in kultivierten Makrophagen mit dem von Wildtyp-Salmonella typhimurium ATCC 10428 (Kreise) verglichen. Das gezeigte Experiment ist repräsentativ. Der Unterschied zwischen den beiden Stämmen nach 4 und 24 h ist signifikant (p < 0,05). PhoP^--Bakterien schienen einen den von PhoP^c-Bakterien qualitativ ähnlichen Defekt des Überlebens in Makrophagen zu haben, aber überlebten in Parallelexperimenten durchgehend 2 bis 3 Mal besser. Die erhöhte Rückgewinnung von zum PhoP^c-Phänotyp revertierten Organismen aus Mäuseorganen mit hohem Makrophagengehalt ist in Übereinstimmung mit dem reduzierten Überleben von PhoP^c-Mutanten in Makrophagen in vitro.
Verwendung des PhoP^c-Stamms als Lebendvakzin
Es wurde zuvor berichtet, dass PhoP^c-Stämme als Lebendvakzine nützlich zum Schutz gegen Mäusetyphus sind (Miller et al, 1989, siehe oben). Die Immunogenität von PhoP^c, verwendet als attenuiertes Lebendvakzin bei Mäusen, wurde mit der von PhoP^- verglichen. Dies geschah durch gleichzeitige Bestimmung des Überlebens von zuvor mit abgestuften Dosierun gen der beiden Lebendvakzin-Stämme immunisierten Mäusen nach Belastung mit abgestuften Dosierungen des Wildtypstammes ATCC 10428. CS015 phoP::Tn10d-Cam und CS022 pho-24, ebenso Kontrolle mit Kochsalzpuffer. Die Ergebnisse (Tabelle 2) legen die folgenden Schlussfolgerungen nahe: (I) kleine intraperitoneale Dosierungen des PhoP^c-Stamms (z. B. 15 Organismen) schützen Mäuse wirksam vor Belastungsdosen bis zu 5 × 10⁵ Bakterien (eine Belastungsdosis, die mehr als das 10⁴fache der LD₅₀ bei intraperitonealer Gabe darstellt), (II) oral verabreichte große Dosen von PhoP^c-Organismen schützen Mäuse vollständig vor einer oralen Belastung, die aus 5 × 10⁷ Wildtypbakterien besteht (mehr als das 200fache der LD₅₀ für Wildtyp bei oraler Gabe) und (III) verglichen hiermit gewährt eine große Dosis von PhoP^--Organismen (5 × 10⁵) keinen vergleichbaren Schutz. Die Reversion der PhoP^c-Mutation in vivo erschwert die Analyse der Verwendung dieser Stämme als Vakzine etwas, da Revertanten des CS022-Stammes (d. h. Wildtypzellen) die Immunogenität erhöhen könnten. Jedoch waren wir außerstande, in einer Untersuchung von 10 % des verfügbaren Milz- und Lebergewebes aus denjenigen Mäusen, die 10⁴ oder weniger Organismen erhalten hatten, Revertanten zu identifizieren.
Stämme, Materialien und Methoden
Die Stämme, Materialien und Methoden, die bei der oben beschriebenen Arbeit am PhoP-Regulon verwendet wurden, sind wie folgt.
Der American Type Culture Collection (ATCC)-Stamm 14028, ein glatte Kolonien bildender, virulenter Stamm von Salmonella typhimurium, war der Elternstamm für alle Virulenzuntersuchungen. Der Stamm TT13208 wurde von Nang Zhu und John Roth zur Verfügung gestellt. Der Stamm TA2367 wurde großzügigerweise von Gigi Stortz und Bruce Ames zur Verfügung gestellt (Kier et al., 1979, siehe oben). Der Bakteriophage P22HT-int wurde in Transduktionskreuzungen verwendet, um Stämme herzustellen, die mit Ausnahme der Mutationen im phoP-Lokus isogen waren (Davis et al., 1980, Advanced Bacterial Genetics, S. 78, 87. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Luria-Bouillon wurde als Vollmedium verwendet, und das Minimalmedium war M9 (Davis et al, 1980, siehe oben). Das chromogene Phosphatasesubstrat 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (XP) wurde verwendet, um die Bildung von Säure und AP auf festem Wachstumsmedium qualitativ zu bestimmen.
Derivate von Salmonella typhimurium ATCC 10428 mit der pho-24-Mutation wurden durch die Verwendung des Stammes TA2367 als Donor des purB-Gens bei einer P22-Transduktionskreuzung mit dem Stamm CS003ΔphoPΔpurB (Miller et al., 1989, siehe oben) hergestellt. Die Kolonien wurden dann anhand ihrer Fähigkeit, auf Minimalmedium zu wachsen, selektiert. Ein als CS022 bezeichneter Transduktant (Phänotyp PhoP^c), der im Vollmedium 1750 Einheiten saure Phosphatase synthetisierte (eine 9fache Steigerung gegenüber dem Wildtypniveau im Vollmedium), wurde in weiteren Untersuchungen verwendet.
Derivate der Stämme CS022 und CS023 pho-24 phoN2 zxx::6251 Tn10d-Cam, einem für saure Phosphatase negativen Derivat von CS022, die pag-Genfusionen enthielten, wurden durch Transduktionskreuzungen mittels Bakteriophage P22 hergestellt, wobei auf TnphoA- oder mudJ-kodierte Kanamycinresistenz selektiert wurde. Die Stämme wurden auf das intakte pag-Fusionsgen durch Nachweis des passenden Verlusts der Fusionsproteinaktivität nach Einführung eines phoP105::Tn10d oder phoP102::Tn10d-Cam-Allels getestet.
Messungen der sauren Phosphatase, AP und β-Galactosidase wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Miller et al, 1989, siehe oben) und sind in Einheiten angegeben, wie von Miller 1972 definiert (Miller, 1972, Experiments in molecular genetics, S. 352-355, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Bei den Virulenz- und Impfungsstudien an Mäusen wurden über Nacht in Luria-Bouillon kultivierte Bakterien in normalem Kochsalzpuffer gewaschen und verdünnt. Der Wildtyp-Elternstamm von CS022 (ATCC 10428) wurde bei allen Lebendvakzinstudien zur Belastung verwendet. Bei diesem Stamm beträgt die für 50 % der Tiere tödliche Dosis (LD₅₀) für unbehandelte erwachsene BALB/c-Mäuse weniger als 20 Organismen bei intraperitonealer (i. p.) Injektion und 5 × 10⁴ bei oraler Verabreichung in Natriumhydrogencarbonat. Die Mäuse wurden von Charles River Breeding Laboratories Inc. (Wilmington, Mass.) erhalten und waren bei der ersten Belastung 5 bis 6 Wochen alt. Alle i. p.-Inokulierungen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Miller et al., 1989, siehe oben). Orale Belastungsexperimente wurden mit in LD-Bouillon kultivierten und durch Zentrifugation konzentrierten Bakterien durchgeführt. Die Bakterien wurden in 0,1 M NaHCO₃ resuspendiert, um die Magensäure zu neutralisieren, und Tieren unter Etheranästhesie als 0,5-ml-Bolus verabreicht. Koloniezählungen wurden durchgeführt, um die Anzahl der verabreichten Organismen genau zu bestimmen. Alle Belastungsexperimente wurden 1 Monat nach der ip-Inokulierung und 6 Wochen nach der oralen Belastung durchgeführt. Die Belastungs-Inokula wurden auf dem gleichen Weg wie die Impfungen verabreicht. Die Pflege aller Tiere folgte den Institutsrichtlinien, wie von den Tierpflegekomitees im Massachusetts General Hospital und der Harvard Medical School festgelegt.
Proteinelektrophorese wurde folgendermaßen durchgeführt: Eindimensionale Proteingelelektrophorese wurde nach der Methode von Laemmli (Laemmli, 1970, Nature 227:680) mit Gesamtzell-Proteinextrakten von über Nacht in Luria-Bouillon kultivierten Zellen in stationärer Phase durchgeführt. Die Gele wurden fixiert und mit Coomassie-Brillantblau 8250 in 10 % Essigsäure/10 % Methanol gefärbt. Zweidimensionale Proteingelelektrophorese wurde nach der Methode von O'Farrell (O'Farrell, 1975, J. Biol. Chem. 250:4007) mit den gleichen Gesamtzellextrakten durchgeführt. Die isoelektrische Fokussierung unter Verwendung 1,5%iger Ampholinien von pH 3,5 bis pH 10 (LKB Instruments, Baltimore, Md.) wurde über 9600 V h durchgeführt (13 h 45 min bei 700 V). Der fertige pH-Gradient in der Gelröhre reichte von pH 4,1 bis pH 8,1, durch eine Oberflächen-pH-Elektrode (BioRad Laboratories, Richmond, Calif.) und gefärbte acetylierte Cytochrom pI-Marker (Calbiochem-Behring, La Jolla, Calif.), die in einem benachbarten Röhrchen liefen, gemessen. Die Gelblöcke wurden mit Silber gefärbt (Merril et al., 1984, Methods Enzymol. 104:441).
Die Experimente zur Untersuchung des Überlebens in Makrophagen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Miller et al., 1989, siehe oben), nach der Methode von Buchmeier (Buchmeier et al., 1989, Infect. Immun. 57:1), modifiziert nach Lissner (Lissner et al., 1983, J. Immunol. 131:3006). In der stationären Phase befindliche Zellen wurden 30 min lang in normalem Mäuseserum opsoniert, bevor sie kultivierten aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen, die BALB/c-Mäusen entnommen worden waren, ausgesetzt wurden. 1 h nach der Infektion wurde Gentamicinsulfat (8 μg/ml) zugesetzt, um extrazelluläre Bakterien abzutöten. Alle Zeitpunkte wurden jeweils dreifach gemessen und in drei getrennten Durchgängen wiederholt.
PhoP^c-mutierte Stämme sind als Lebendvakzine wirksamer
In PhoP^c mutierte Salmonella typhimurium-Zellen sind als Lebendvakzin gegen Mäusetyphus sehr wirksam und PhoP^--Bakterien überlegen. Bereits 15 PhoP^c-Bakterien schützen Mäuse vor dem 10⁵fachen der LD₅₀ (letalen Dosis für 50 % der Tiere) der Wildtyp-Organismen bei intraperitonealer Verabreichung (Tabelle 3). Dies lässt vermuten, dass pag-Genprodukte für die schützende Immunität gegen Mäusetyphus wichtige Antigene sind. Vorläufige Ergebnisse haben dokumentiert, dass zu den vom Serum chronischer Typhusträger erkannten Antigenen einige phoP-regulierte Genprodukte von Salmonella typhi gehören. Wenn protektive Antigene nur im Wirt exprimiert werden, können Totvakzine, die nur in Vollmedium kultiviert wurden, keine Immunantwort gegen diese Proteine auslösen.
Die Verwendung verschiedener Salmonella typhimurium-Totvakzinzubereitungen, die unterschiedliche Mutationen im phoP-Regulon enthielten, wurde untersucht. Wie in Tabelle 3 gezeigt, sind keine Zubereitungen toter Zellen (nicht einmal diejenigen, die Gemische aus PhoP^-– und PhoP^c-Bakterien enthalten) so effektive Vakzine wie lebende Bakterien. Dies lässt vermuten, dass es andere Eigenschaften lebender Vakzine gibt, die die Immunogenität erhöhen, oder dass wichtige nicht von phoP regulierte Antigene nicht in diesen Zubereitungen enthalten sind. Der einzige in irgendeinem Tierversuch beobachtete Schutz war bei der niedrigsten Belastungsdosis in mit PhoP^c-Bakterien immunisierten Tieren. Dies legt weiterhin nahe, dass durch phoP aktivierte Gene wichtige schützende Antigene sind.
Tabelle 3 Salmonella mit phoP-Regulon-Mutationen als Totvakzin

CS015 = phoP102::Tn 10d-Cam
CS022 = pho-24
BALB/c-Mäuse wurden im Abstand von 7 Tagen 2 Mal mit 5 × 10⁸ formalinabgetöteten Bakterien immunisiert. Drei Wochen nach der zweiten Impfung wurden die Mäuse mit Wildtyporganismen in den beiden angegebenen Dosierungen belastet. Die eingeklammerten Zahlen bedeuten keine Überlebenden nach der Belastung und geben die Anzahl der Tage bis zum Tod an.
(*) Anzahl der Überlebenden/Anzahl der belasteten Tiere.
phoP^c bezeichnet die konstitutive unregulierte Expression der phoP-aktivierten Gene und fehlende Expression der phoP-reprimierten Gene.
phoP^- bezeichnet die fehlende Expression der phoP-aktivierten Gene und Expression der phoP-reprimierten Gene.

Stämme mit Doppelmutationen in aroA und dem phoP-Regulon
Neuere Anstrengungen von Stocker, Levine und Kollegen haben sich auf die Verwendung von Stämmen mit auxotrophen Mutationen in den Stoffwechselwegen für aromatische Aminosäuren und Purinkörper als Lebendvakzine konzentriert (Hoseith et al., 1981, Nature 291:238; Stocker, 1988, Vakzine 6:141, und Levine et al., 1987, J. Clin. Invest. 79:888). Purinstoffwechselmutationen erwiesen sich als zu attenuierend für Immunogenität, wahrscheinlich deswegen, weil im Inneren eines Säugers dem Organismus keine Purinkörper zur Verfügung stehen (Sigwart et al., 1989, Infect. Immun. 57:1858). Da auxotrophe Mutationen durch homologe Rekombinationsereignisse mit von Organismen in der Umgebung gespendeten Wildtypkopien komplementiert werden können oder die benötigten Metaboliten im Wirtsorganismus verfügbar sein können, erscheint es für Lebendvakzine vernünftig, eine zweite attenuierende Mutation in einem anderen Virulenzmechanismus zu tragen (d. h. nicht nur eine zweite Mutation im gleichen Stoffwechselweg). Überdies haben die aroA-Mutanten eine gewisse Restvirulenz in Mäusen. Verschiedene Stämme mit aroA-Mutationen in Kombination mit Mutationen in phoP-Regulon wurden auf Attenuierung der Virulenz und Immunogenität untersucht. Tabelle 4 zeigt, dass eine PhoP^-– oder PhoP^c-Mutation eine aroA-Mutante von Salmonella typhimurium weiterhin um das mindestens 100fache attenuiert, und dass Immunogenität zumindest bei hohen Dosen von Impforganismen beibehalten wird. Stämme, die sowohl einen pagC^-- als auch einen phoP^c-Phänotyp besitzen, sind ebenfalls weiter attenuiert als jede Mutation für sich alleine. Daher können Mutationen im phoP-Regulon die Sicherheit von aroA-Lebendvakzinzubereitungen erhöhen. Tabelle 4A Zusätzliche Attenuierung von aroA-Mutanten durch Mutationen im PhoP-Regulon
Tabelle 4B Schutzwirkung von Salmonella mit Mutationen im aroA/phoP-Regulon

(*) Überlebende/belastete Mäuse.
(**) Bezeichnet orale Inokulation; bei allen andern Experimenten erfolgte die Inokulation intraperitoneal.
CS004 = aroA554::rn10.
SL3261 = aroAΔ407 hisG46.
CS322 = aroA554::Tn10 pho-24.
CS323 = aroAΔ407 pho-24.
CS315 = aroA554::Tn10 phoP102::Tn10d-Cam.
CS316 = aroAΔ407 hisG46 phoP102::Tn10d-Cam.
CS026 = pagC1::TnphoA pho-24 phoN2 zxx::6251TN10d-Cam.

Mutationen im phoP-Regulon von Salmonella typhi
Das phoP-Regulon ist bei Salmonella typhi zumindest teilweise konserviert. DNA-Hybridisierungsexperimente ebenso wie Transduktionskreuzungen unter Verwendung des Bakteriophagen P22 haben gezeigt, dass die phoP-, phoQ- und pagC-Gene zwischen Salmonella typhi und Salmonella typhimurium in hohem Maße konserviert zu sein scheinen. Bei Salmonella typhi wurden Mutationen dieser Gene durchgeführt.
Salmonella-Lebendvakzine als Übertragungssysteme für heterologe Antigene
Der im Vakzinübertragungssystem verwendete Vektor ist ein Derivat von pJM703.1, beschrieben von Miller (Miller et al., 1988, J. Bact. 170:2575). Dieser Vektor ist von R6K abgeleitet, mit einer Deletion im pir-Gen. R6K-Derivate benötigen das Proteinprodukt des pir-Gens zur Replikation. E. coli-Zellen, die das pir-Gen in Form eines Prophagen des λ-Bakteriophagen tragen, können die Replikation dieses Vektors unterstützen. Zellen, die das pir-Gen nicht enthalten, können die Replikation des Vektors in Plasmidform nicht unterstützen. Dieser Vektor enthält auch die mob-Region von RP4, die eine Mobilisierung in andere gram-negative Bakterien aus E coli-Stämmen wie SM10λpir, die die Mobilisationsfunktionen in Trans zur Verfügung stellen können, durch Paarung ermöglicht.
Die pagC-Region ist in den 2 und 3 dargestellt. 2 zeigt die Restriktionsendonukleaseschnittstellen des pagC-Lokus. Der fette Balken bezeichnet die pagC kodierende Sequenz. Die Insertionsstelle von TnphoA ist durch ein umgedrehtes Dreieck bezeichnet. Die Transkriptionsrichtung wird durch den Pfeil bezeichnet und ist von links nach rechts. Die Zahlen bezeichnen die Orte der Endonukleaseschnittstellen, ausgedrückt in der Anzahl von Basenpaaren relativ zum Startcodon der vorhergesagten pagC-Translation, wobei positive Zahlen eine Position stromabwärts vom Startcodon und negative Zahlen eine Position stromaufwärts vom Startcodon anzeigen. A ist AccI, B ist BglI, C ist ClaI, D ist DraI, E ist EcoRI, H ist HpaI, N ist NruI, P ist PstI, S ist SspI, T ist StuI, U ist PvuII, V ist EcoRV und II ist BglII. 3 zeigt die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1) und Translation von pagC::TnphoA. Die fett unterstrichene Sequenz bezeichnet eine mögliche Ribosomenbindungsstelle. Die einfache und die doppelte dünne Unterstreichung bezeichnen Sequenzen, in denen zu diesen Nukleotiden komplementäre Primer zur Primer-Extension-Analyse der RNA konstruiert wurden. Der Stern bezeichnet den ungefähren Transkriptionsstart. Der Pfeil bezeichnet die Transkriptionsrichtung. Die eingerahmten Sequenzen zeigen eine Region an, die an der Polymerasebindung und -erkennung beteiligt sein kann. Das umgedrehte Dreieck ist die Stelle der sequenzierten Überschneidung der TnphoA-Insertion. Der Pfeil bezeichnet einen möglichen Ort für die Spaltung einzelner Sequenzen.
Drei Kilobasen DNA, die das pagC-Gen enthielten (von der PstI-Restriktionsschnittstelle 1500 Nukleotide 5'-wärts vom Beginn der pagC-Translation bis zu der EcoRI-Restriktionsschnittstelle 1585 Nukleotide stromabwärts vom Ende der pagC-Translation) wurden in das oben diskutierte pJM703.1-Derivat eingefügt. Die pagC-Sequenz von der ClaI-Restriktions endonukleaseschnittstelle wurde deletiert (490 Nukleotide) und durch einen synthetischen Oligonukleotidpolylinker ersetzt, der einzeln vorkommende Restriktionsendonukleaseschnittstellen schafft. DNA, die ein oder mehrere heterologe Proteine kodiert, z. B. ein Antigen, kann an diesem Ort eingefügt werden. Dies führt zu einem Vektor, der die Einfügung mehrfacher Fremdgene in die pagC umgebende DNA erlaubt.
Der Vektor kann durch Paarung oder irgendein anderes Übertragungssystem, z. B. Hitzeschock, Bakteriophagentransduktion oder Elektroporation in Salmonella eingebracht werden. Da er nicht replizieren kann, kann der Vektor sich nur durch ortsspezifische Rekombination mit der homologen DNA auf beiden Seiten des pagC-Gens in Salmonella einfügen. Dies zerstört und inaktiviert den nativen pagC-Lokus und ersetzt ihn mit der unterbrochenen pagC-DNA, die Bestandteil des Vektors ist.
Solche Rekombinationsereignisse können durch Markeraustausch und Selektionsmedien identifiziert werden, wenn die in den pagC-Lokus eingefügte fremde DNA einen Wachstumsvorteil bringt. Die Einfügung von Resistenzgenen gegen Antibiotika zur Selektion ist weniger wünschenswert, da dies zu einem Anstieg der Antibiotikumsresistenzen in der natürlichen Bakterienpopulation führen könnte. Gene, die Resistenz gegenüber anderen Substanzen als Antibiotika, z. B. Schwermetallen oder Arsen, vermitteln, können verwendet werden, um Transformanten zu identifizieren (für Quecksilberresistenz siehe Nucifora et al., 1989, J. Bact. 171: 4241-4247). Alternativ kann die Selektion durchgeführt werden unter Verwendung eines Salmonella-Empfängerstamms, der eine auxotrophe Mutation in einem metabolischen Stoffwechselweg trägt, und eines Vektors, der DNA trägt, die die auxotrophe Mutation komplementiert. Viele ursprüngliche Salmonella-Lebendvakzin-Prototypen tragen Mutationen in den Histidin- oder Purinstoffwechselwegen, somit kann die Komplementierung dieser metabolischen Auxotrophien verwendet werden, um Integranten zu selektieren. (Purinstoffwechsel-Mutanten erwiesen sich speziell als zu attenuiert für die Verwendung am Menschen.) Ein weiterer Nachweis des Markeraustauschs kann anhand des Verlusts der Ampicillin-Resistenz (Bestandteil des Plasmidrückgrats) oder durch Blot-Hybridisierungsanalyse erbracht werden.
Ein zur Selektion verwendbares Gen kann durch Komplementierung eines Vakzinstammes mit einer metabolischen Auxotrophie kloniert werden. Zu speziellen Beispielen gehört die Klonierung der DNA, die sowohl PurB als auch PhoP kodiert, durch Komplementierung eines Stammes, in dem die Funktion beider dieser Gene deletiert ist. Salmonella-Genbibliotheken sind in einem pLAFR-Cosmidvektor (Frindberg et al., 1984, Anal. Biochem. 137: 266-267) unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren konstruiert worden. pLAFR-Cosmide sind Plasmide mit breitem Wirtsspektrum, die von Salmonella in E. coli übertragen werden können. Eine ganze Bank solcher Stämme kann in Salmonella-Vakzinstämme übertragen und auf Komplementierung eines auxotrophen Defekts selektiert werden (z. B. im Fall von purB durch Wachstum auf Medium ohne Adenin). Die DNA, die imstande ist, diesen Effekt zu komplementieren, wird dann identifiziert und kann in den Antigenübertragungsvektor kloniert werden.
Wie oben beschrieben, können heterologe Gene in den Polylinker eingefügt werden, der in die pagC-Sequenz des Vektors eingefügt ist. Die heterologen Gene können unter der Kontrolle irgendeines der zahlreichen durch Umwelteinflüsse regulierten Promotorsysteme stehen, die im Wirt exprimiert und im Labor abgeschaltet werden können. Da die Expression fremder Proteine, insbesondere die Expression von Membranproteinen (wozu die meisten wichtigen Antigene gehören), auf das Bakterium häufig toxisch wirkt, wäre die Verwendung von durch Umwelteinflüsse regulierten Promotoren, die in Säugergeweben auf hohem Niveau exprimiert würden, aber das Wachstum im Labor ohne Expression der heterologen Antigene erlaubten, sehr wünschenswert. Überdies kann eine hohe Expression der Antigene in Wirtsgeweben zu einer erhöhten Attenuation des Organismus führen, indem sie die metabolischen Ressourcen des Organismus auf die Synthese der heterologen Proteine umleitet. Wenn Fremdantigene spezifisch in den phagozytischen Zellen des Wirts exprimiert werden, kann dies die Immunantwort auf diese Proteine steigern, da dies die Zellen sind, die für die Prozessierung von Antigenen verantwortlich sind.
Zu den wahrscheinlich verwendbaren Promotorsystemen gehören diejenigen nährstoffkontrollierten Promotorsysteme, für die gezeigt wurde, dass ein spezifischer Nährstoff den Bakterien im Säuger-Wirtsorganismus nicht zur Verfügung steht. Purine (Sigwart et al., 1989, Infect. Immun., 57: 1858) und Eisen (Finklestein et al., 1983, Rev. Infect. Dis. 5: S759) sind beispielsweise im Wirt nicht verfügbar. Eisenregulierte Promotoren, wie z. B. der Promotor des Aerobactin-Gens, und Promotoren für biosynthetische Gene in Purinstoffwechselwegen sind somit herausragende Kandidaten für Promotoren, die durch ein Wachstum unter hohen Konzentrationen dieser Nährstoffe abgeschaltet werden können. Zu anderen nützlichen durch Umwelteinflüsse regulierten Promotoren von Salmonella gehören Promotoren für Gene, die Proteine kodieren, die spezifisch im Inneren von Makrophagen exprimiert werden, z. B. die DnaK- und GroEL-Proteine, die durch Wachstum bei hohen Temperaturen erhöht exprimiert werden, wie auch einige von phoP aktivierte Genprodukte (Buchmeier et al., 1990, Science 248: 730). Daher ist zu erwarten, dass Promotoren wie die 5'-Kontrollsequenzen von pagC und die besser charakterisierten Promotoren für Hitzeschockgene, z. B. groEL und dnaK, spezifisch im Inneren des Makrophagen aktiviert werden. Der Makrophage ist der Ort der Antigenprozessierung, und die Expression von Hitzeschockgenen in Makrophagen und die weite Konservierung von Hitzeschockgenen in der Natur können die Immundominanz dieser Proteine erklären. Eine Konsensussequenz für den HitzeschockPromotor ist bekannt und kann in den Vektoren verwendet werden (Cowling et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 2679).
Die Vektoren können ein durch Umwelteinflüsse reguliertes T7-Polymerase-Amplifikationssystem zur Expression heterologer Proteine umfassen. Z. B. kann das T7-Polymerase-Gen (kloniert von Stan Tabor und Charles Richardson, siehe Current Protocols in Molecular Biology, Hg. Ausubel et al., 1989, (Seite 3.5.1.2) John Wiley and Sons) unter der Kontrolle eines durch Eisen regulierten Promotors in die oben beschriebenen Vektoren eingefügt werden. Wir haben den Promotor des Aerobactin-Gens von E. coli mit der Sequenz CATTTCTCATTGATAATGA GAATCATTATTGACATAATTGTTATTATTTTACG (SEQ ID NO:2), Delorenzo et al. J. Bact. 169:2624, vor dem T7-Polymerase-Gen eingefügt und eine eisenabhängige Regulation des Genprodukts gezeigt. Diese Version des Vektors enthält auch ein oder mehrere heterologe Antigene unter der Kontrolle des T7-Polymerase-Promotors. Es ist bekannt, dass RNA von synthetischen Oligonukleotiden mit T7-Promotoren und gereinigter T7-Polymerase in vitro hergestellt werden kann. Wenn der Organismus auf Eisenmangel trifft, wird T7-Polymerase synthetisiert, und eine hohe Expression von Genen mit T7-Promotoren wird erreicht.
pagC-Fusionsproteine in Salmonella typhimurium
Die Expression heterologer Antigene innerhalb von Makrophagen unter der Kontrolle von phoP-regulierten Promotoren kann als wirksame Methode verwendet werden, sowohl Salmonellen zu attenuieren als auch die Immunogenität fremder Antigene zu erhöhen. Wie oben beschrieben, wird die Expression von pagC in einer antigenprozessierenden Zelle, d. h. in einem Makrophagen, induziert. Somit ist auch anzunehmen, dass die Expression eines heterologen Antigens unter der Kontrolle des pagC-Promotors in Makrophagen gleichfalls induzierbar ist.
Um die Immunantwort auf ein unter der Kontrolle eines induzierbaren pag-Promotors exprimiertes heterologes Antigen zu untersuchen, wurden Mäuse mit Bakterien, die das Antigen AP unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen von pagC oder pagD exprimierten, inokuliert. Pag-AP-Fusionsproteine wurden in diesen Bakterien von einer einzelnen chromosomalen Kopie des AP-kodierenden Gens gebildet. Diese Bakterien wurden unter Verwendung von zwei Methoden hervorgebracht: TnphoA-Mutagenese und gentechnische Verfahren unter Verwendung eines Selbstmordvektors, die beide oben beschrieben worden sind.
Zur Kontrolle wurden Mäuse mit Bakterien inokuliert, die ein AP-Fusionsprotein unter der Kontrolle konstitutiver Promotoren exprimiert. Der konstitutive Promotor war von der Regulation durch Gene im phoP-Regulon vollkommen unabhängig. Zwei solche Bakterienstämme, Stamm 610 und Stamm 617, wurden unter Verwendung der oben beschriebenen Methoden hervorgebracht. Die AP-Expression im Stamm 610 war mäßig, während die AP-Expression im Stamm 617 hoch war (siehe 14C).
Diese Stämme wurden intraperitoneal in BALB/c-Mäuse injiziert. Drei Wochen nach der Inokulation wurden Serumproben genommen. Normales Mäuseserum (MNS) wurde als Kontrolle verwendet. Standardmäßige ELISA-Tests wurden verwendet, um die Seren auf die Gegenwart von AP-spezifischen Antikörpern zu untersuchen. Die Seren wurden auch auf LPS-spezifische Antikörper unter Verwendung von Lipopolysaccharid (LPS) von Salmonella typhimurium geprüft. Gegen LPS gerichtete Antikörper wurden in allen getesteten Mäuseseren gefunden, aber nur diejenigen Stämme, in denen AP als Pag-Fusionsprotein von einer einzelnen chromosomalen Kopie des Gens exprimiert wurden, lösten eine Immunantwort gegen das als Modell verwendete heterologe Antigen AP aus (siehe 14A und 14B).
Trotz ungefähr 10-mal höherer konstitutiver Expression des AP-Fusionsproteins im Stamm 617 wurde nur eine minimale Immunantwort auf dieses Antigen nach Immunisierung mit Stamm 617 festgestellt. Im Gegensatz hierzu wurde bei den Mäusen, die mit Stämmen, die das Pag-AP-Fusionsprotein exprimierten, inokuliert worden waren, eine starke Immunantwort beobachtet. Diese Daten zeigen, dass die phoP-Regulation, die in vivo zur Induktion der Proteinexpression im Inneren von Makrophagen führt, die Immunogenität von heterologen Antigenen, die unter der Kontrolle der pag-Promotoren exprimiert werden, erhöht. Jeder beliebige Promotor, der die zellspezifische, induzierbare Expression eines Proteins in Makrophagen oder anderen antigenpräsentierenden Zellen vermittelt, z. B. der hier beschriebene pag-Promotor, kann verwendet werden, um die Immunogenität eines in Salmonella exprimierten Antigens zu steigern.
Die pagC-pagD-Promotorregion: Expression heterologer Proteine
pagC und pagD werden divergierend transkribiert und beide durch PhoP aktiviert. Andere divergierend transkribierte, regulierte Gene, sind im Stand der Technik beschrieben (Beck et al., 1988, Microbiol. Rev. 52: 318-326), z. B. die pulA-malX-Region von Klebsiella pneumoniae (Chapon et al., 1985, J. Bacteriol. 164: 639-645). Die Transkription der meisten solcher Gene erfordert Hilfsproteine, wie z. B. CAP, zusätzlich zum Regulator, um die Transkription zu aktivieren. Diese beiden Gene werden divergierend transkribiert, und ihre Promotoren sind Rücken an Rücken angeordnet. Zwischen den Transkriptionsstartpunkten dieser Gene liegt eine 134 Bp lange Region, die der intergenen Region zwischen pagC und pagD ähnlich ist. Die puIAmalK-Promotorregion enthält laut Vorhersage zwei Bindungsstellen für MalT (das regulatorische Protein dieses Systems), eine für jedes Gen. Andere MalT-aktivierte Gene benötigen das CAP-Protein für ihre Expression, aber die pulA- und malX-Gene tun dies nicht, möglicherweise aufgrund der hohen lokalen Konzentrationen des MalT-Regulators. Da die Region zwischen den Transkriptionsstartstellen von pagC und pagD (den vorhergesagten -35-Sequenzen) nur 137 Bp beträgt (Nukleotide 562 bis 776 von SEQ ID NO:15), ist es wahrscheinlich, dass in der Region zwischen den Genen nur PhoP-Bindungsstellen existieren, und dass die Bindung von einem oder mehreren phosphorylierten PhoP-Molekülen beide Gene positiv reguliert. Diese pagC/pagD-Intergenregion, die die divergierenden Promotoren enthält, kann verwendet werden, um Vektoren zu konstruieren, von denen zwei heterologe Proteine exprimiert werden können, eines in jeder Richtung.
prg-Gene
Wie oben beschrieben, erhöhen konstitutive Mutationen im phoP/phoQ (Phänotyp phoP^c) die Expression von pag und reprimieren die Synthese von etwa 20 Proteinen, die von den phoP-reprimierten Genen kodiert werden (prg). phoP^c-Bakterien sind für Virulenz in Mäusen attenuiert, was vermuten lässt, dass die prg-Gene Virulenzgene sind.
Durch Verwendung des Transposons TnphoA wurden fünf nicht miteinander verbundene prg-Loci identifiziert. Im Allgemeinen reprimieren Wachstumsbedingungen, die die pag-Expression aktivieren (Hunger), die Expression von prg. Es wurde gezeigt, dass ein prg-Lokus, prgH, zur Virulenz in Mäusen sowohl bei oraler als auch bei intraperitonealer Verabreichung beiträgt. Es wurde gefunden, dass sowohl die prgH- als auch die phoP^c-Mutante von Salmonella typhimurium im Hinblick auf die Auslösung der Endozytose durch Epithelzellen defektiv war. Die Identifikation und Mutation solcher Virulenzgene kann zur Entwicklung von Vakzinen nützlich sein.
Nukleotidsequenz der prgH-, prgI-, prgJ- und prgK-Gene
SEQ ID NO:10 stellt die Nukleotidsequenz eines 5100 Bp langen HinDIII-Fragments dar, das den hil-Lokus (Hyperinvasion) enthält. Vier offene Leserahmen, die vier prg-Gene kodieren, sind auf dieser DNA gelegen (siehe 9). Das ATG-Startcodon ist unterstrichen; die Sterne bezeichnen die Positionen der Stopcodons von prgH, prgI, prgJ und prgK. Diese prg-Loci sind erforderlich für das Eindringen von Bakterien in Epithelzellen, für volle Virulenz bei Mäusen und für die Wanderung von Neutrophilen durch Epithelien. Ein durch eine Mutation in einem oder mehreren von diesen Loci attenuiertes Bakterium kann verwendet werden, um Individuen gegen Infektion durch das Wildtyp-Pathogen zu impfen.
Stämme, Materialien und Methoden
Alle Bakterienstämme, die bei der Charakterisierung der prg-Gene verwendet wurden, sind in Tabelle 5 aufgeführt.
Rolle der prg-Gene bei der Virulenz
Als Salmonella typhimurium Mäusen sowohl auf oralem als auch auf intraperitonealem Weg verabreicht wurde, stellte sich heraus, dass der prg-Lokus prgH zur Virulenz beiträgt. Es wurde weiterhin gefunden, dass prgH ebenso wie die phoP^c-Mutanten Defekte bei der von Bakterien ausgelösten Aufnahme durch Epithelzellen zeigen, was vermuten lässt, dass eine Unfähigkeit, die Epithelbarrieren zu überqueren, zu der beobachteten Attenuation der Virulenz beitragen kann. Kompetitionsversuche an Mäusen nach oraler Aufnahme von Bakterien unterstützte weiter die Annahme, dass prgH-Mutanten in Bezug auf die Transzytose über die Darmepithelbarriere defekt sind. Somit sind mindestens zwei Phasen der für bakterielle Virulenz wesentlichen phoP/phoQ-regulierten Proteinexpression definiert. In der einen Phase fördert die prg-Expression die bakterienvermittelte Endozytose durch Epithelzellen (Tabelle 10), während in der anderen Phase die Expression von pag das Überleben im Inneren von Makrophagen fördert.
Systemische Pathogene wie Salmonella können auf komplexere und unterschiedlichere Umgebungen treffen als schleimhautbewohnende Pathogene. Die Einstellung eines mittleren Maßes an pag- und prg-Expression könnte an irgendeinem Punkt des Infektionszyklus für die Virulenz wesentlich sein. In Übereinstimmung mit diesem Konzept war der Mangel an Einheitlichkeit bei der Expression von pag und prg, der bei Wachstum unter verschiedenen Sauerstoffpartialdrücken und pH-Werten beobachtet wurde. Diese Daten können auch darauf hindeuten, dass nicht die gesamte Regulation von pag und prg direkt durch PhoP und PhoQ vermittelt wird. In Anbetracht der Funktion von phoP als Transkriptionsregulator ist es wahrscheinlich, dass die Repression der prg-Loci auf dem Transkriptionsniveau geschieht.
Der Ansatz, die Gene zu definieren, die durch die pho-24-Mutation reprimiert werden, hat zur Entdeckung von mindestens einem Virulenzlokus geführt, prgH, der mutiert werden kann, um die Bakterien zu Vakzinierungszwecken zu attenuieren.
Attenuation der bakteriellen Virulenz durch konstitutive Expression von regulatorischen Zweikomponentensystemen
Die Virulenz eines Bakteriums kann durch Einführung einer Mutation, die zur konstitutiven Expression von Genen unter der Kontrolle eines regulatorischen Zweikomponentensystems führt oder durch Einführung einer Mutation, die zur Inaktivierung eines Gens unter der Kontrolle des Zweikomponentensystems führt, attenuiert werden. Für die volle Virulenz ist ein Gleichgewicht zwischen der Expression der Gene unter der Kontrolle der Zweikomponentensysteme, z. B. zwischen pag- und prg-Genexpression, und möglicherweise zwischen Genen unter Kontrolle des Zweikomponentensystems und anderen Genen erforderlich. Mutationen, die dieses Gleichgewicht stören, z. B. Mutationen, die die konstitutive Expression eines Gens unter der Kontrolle des Zweikomponentensystems verursachen, oder eine Mutation, die ein Gen unter der Kontrolle des Zweikomponentensystems inaktiviert, z. B. das pag-Gen, verringern die Virulenz.
Konstitutive Mutationen in Zweikomponentenregulatoren können durch die Verwendung eines Stamms, der ein Reportergen als Fusion mit einem von dem Zweikomponentensystem regulierten Gen enthält, identifiziert werden. Solche Fusionsgene enthalten typischerweise DNA, die das lacZ-Gen oder AP, als Fusion mit einem Gen unter der Kontrolle des Zweikomponentensystems enthält. Stämme, die Fusionen enthalten, die (im Vergleich zu Wildtyp- oder Eltern-Stämmen) auf unregulierte Weise, d. h. konstitutiv, stark exprimiert werden, können durch Zunahme der Farbe auf chromogenen Substraten für die Enzyme entdeckt werden. Um konstitutive Mutationen aufzufinden, kann ein klonierter Regulator der Virulenz mutagenisiert werden, z. B. durch Passage durch einen E. coli-Stamm mit defekter DNA-Reparatur, oder durch chemische Mutagenese. Die mutierte DNA für den Regulator kann dann in den Stamm, der das Fusionsgen enthält, transferiert werden, und konstitutive Mutationen können anhand der starken Expression des Fusionsgens identifiziert werden (im Fall einer lacZ-Fusion blaue Farbe bei Wachstum auf Medium, das X-gal enthält). Konstitutive Mutationen in einem Bestandteil eines regulatorischen Zweikomponentensystems können auch durch in vitro-Mutagenese hergestellt werden, nachdem andere konstitutive Mutationen sequenziert worden sind und ein spezifischer Aminosäurenaustausch, der für den konstitutiven Phänotyp verantwortlich ist, identifiziert worden ist. Die Verwendung mehrerer Aminosäurenaustausche, von denen jeder zu einem konstitutiven phoP-Phänotyp führt, ergibt eine verringerte Häufigkeit der Reversion durch spontanen Basenaustausch. Eine konstitutive Mutation kann auch durch Deletion desjenigen Teils des Aminoterminus des Phosphat-akzeptierenden Regulators, der die Phosphoakzeptor-Domäne enthält, z. B. durch Deletion der Sequenzen, die die Aminosäuren N-terminal von Ami nosäure 119 beim phoP-Gen kodieren, oder durch Deletion analoger Phosphat-akzeptierender Sequenzen in Genen anderer regulatorischer Zweikomponentensysteme hergestellt werden. Dies kann zu einer Konformationsänderung ähnlich der durch Phosphorylierung ausgelösten führen und gesteigerte DNA-Bindung und Transkriptionsaktivierung hervorrufen.
Attenuation der Virulenz: Deletionen im phoP/phoQ-Regulon
Wie oben beschrieben, ist das phoP-Regulon wesentlich für die volle Virulenz von Salmonella. Dieses Regulon besteht aus zwei Genen, phoP und phoQ, die in einem Operon gelegen sind, und über 40 Genen, die diese positiv und negativ regulieren (pag bzw. prg).
phoP-Nullmutanten von Salmonella typhimurium erwiesen sich als erheblich attenuiert und auch als wirksame Vakzinstämme, als sie im BALB/c-Mäusemodell des Typhus studiert wurden. Dieser Phänotyp ist wahrscheinlich das Ergebnis mehrfacher, PhoP-aktivierter Virulenzgene, da gezeigt wurde, dass Transposoninsertionen in mehreren verschiedenen PhoP-aktivierten Genen voneinander unabhängig die Virulenz von Salmonella typhimurium verringern. Salmonella typhimurium-Mutanten, in denen Gene, die essentiell für aromatische Aminsäuren sind, deletiert wurden (aroA-Nullmutanten oder aroC/aroD-Nullmutanten) sind im Mäusemodell ebenfalls erheblich attenuiert. Doch hat Prüfung von aroC/aroD-Mutanten an Menschen gezeigt, dass, obwohl diese Stämme immunogen sind, Bacterämien und Nebeneffekte wie Fieber bereits bei Dosen von 10⁵ bis 10⁷ Organismen, als einzelne orale Dosis verabreicht, beobachtet wurden (J. Clin. Invest. 90: 412-420).
Es wurde nun gefunden, dass eine große Deletion in einem globalen Regulator, nämlich dem phoP/phoP-Operon, die Virulenz der Bakterien erheblich verringert. Diese Mutation, das Ergebnis einer 1 kBp großen DNA-Deletion innerhalb des phoP/phoQ-Lokus, wurde ursprünglich in Salmonella typhimurium hergestellt und nachfolgend über homologe Rekombination auf Salmonella typhi übertragen. Um bei der Herstellung dieses Vakzins eine noch größere Sicherheitsmarge zu erreichen, wurde sie in einen Stamm mit einem genetischen Hintergrund eingebaut, in dem für aromatische Aminosäuren essentielle Gene deletiert sind und die Histidin-G46-Mutation vorliegt, eine Mutation, die den Organismus für Histidin auxotroph macht. Der resultierende Stamm, Salmonella typhi TyLH445, bietet gegenüber existierenden Kandidaten für Vakzine mehrere Vorteile, insbesondere Immunogenität ohne vorübergehende Bacterämie.
Verwendung
Die erfindungsgemäßen Salmonella-Zellen sind als Quellen immunologischen Schutzes gegen Krankheiten, z. B. Typhus und verwandte Krankheiten, in einem Tier, z. B. einem Säuger, z. B. einem Menschen, verwendbar, insbesondere als Grundlage eines Lebendvakzins, das imstande ist, den Darm des Impflings zu besiedeln und eine starke Immunreaktion auszulösen. Geeignete Dosierungen und Verabreichungsbedingungen solch eines lebenden, attenuierten Vakzins sind im Stand der Technik bekannt, wie z. B. von Holem et al., Acute Enteric Infections in Children, New Prospects for Treatment and Prevention (1981) Elsevier/North-Holland Biomedical Press, Kap. 26, S. 443ff. (Levine et al.) beschrieben, und werden in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.
Vorteile
Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die Bakterienzellen als Ergebnis einer Mutation oder mehrerer Mutationen, d. h. des phoP/phoQ-Operons, die direkt einen Virulenzmechanismus beeinträchtigen, attenuiert sind. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die Bakterienzellen Mutationen in zwei vollkommen verschiedenen attenuierenden Genen tragen, d. h. im Stoffwechselweg für die Synthese aromatischer Aminosäuren (aro) und in einem Operon, das für die Virulenz von Salmonella von Bedeutung ist (phoP/phoQ). Als Ergebnis hiervon scheinen die Bakterien extrem attenuiert zu sein; selbst Dosierungen von 1 × 10⁹ cfu (Kolonien bildenden Einheiten, colony forming units) scheinen sehr sicher zu sein. Andere in Entwicklung begriffene Vakzine wie CVD 908 haben gewisse systemische Symptome verursacht, z. B. Fieber oder Bacterämie, und dies bereits bei Dosierungen von 1 × 10⁷ cfu.
Zusätzlich zu der phoP/phoQ-Deletion und der aroA-Mutation können die erfindungsgemäßen Bakterienzellen auch eine Histidin-Mutation zur weiteren Attenuation der Virulenz enthalten, obwohl die Abwesenheit der Histidin-Mutation die Immunogenität verbessern kann. Die erfindungsgemäßen Bakterienzellen sind gegenwärtig die meistversprechenden Kandidaten für Vakzine, da sie in hohem Maße immunogen und sicher, d. h. extrem attenuiert, sind.
Beispiel 1: Konstruktion eines Vakzinstammes
Die erfindungsgemäßen Bakterienzellen wurden durch Deletion von etwa 1 kBp DNA innerhalb des phoP/phoQ-Regulons hergestellt.
Im phoP/phoQ-Bereich deletierte Selbstmordvektoren wurden unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt. Ein DNA-Fragment, das den phoP/phoQ-Lokus enthielt, wurde durch PCR unter Verwendung von chromosomaler DNA aus Wildtyp-Salmonella typhimurium als Template erhalten. PCR-Primer, die den phoP/phoQ-Lokus flankierten, wurden so hergestellt, dass sie an den Enden Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme enthielten, z. B. Erkennungsstellen für EcoRI, um die nachfolgende Klonierung zu erleichtern. Nach der Amplifikation wurde das PCR-Produkt mit EcoRI verdaut und in die EcoRI-Stelle des Polylinkers eines Vektors mit hoher Kopienzahl kloniert. Das Plasmid, das das phoP/phoQ-DNA-Fragment enthielt, wurde pLH356 bezeichnet.
Die Sequenzierung und Restriktionskartierung des phoP/phoQ-Lokus identifizierte vier HpaI-Stellen innerhalb des Lokus; im Vektor wurden keine HpaI-Stellen gefunden. Um eine interne Deletion innerhalb des phoP/phoQ-Lokus herzustellen, wurde DNA von pLH356 mit HpaI vollständig geschnitten und anschließend religiert, um eine interne Deletion von Nukleotid 376 bis 1322 zu schaffen (pLH418). Diese Deletion wurde durch einen Restriktionsverdau des Plasmids bestätigt.
Ein DNA-Fragment, das den intern deletierten phoP/phoQ-Lokus enthielt, wurde unter Verwendung der SacI- und SphI-Restriktionsschnittstellen innerhalb der Polylinkerregion des Vektors aus pLH418 ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde in kompatible Restriktionsschnittstellen im Plasmid CVD442 kloniert, das das sacB-Gen trägt, um eine positive Selektion auf den Allelaustausch zu ermöglichen. Der resultierende Selbstmordvektor wurde pLH423 bezeichnet.
pLH423 wurde in E. coli λ pir SY327 transformiert, dann anschließend in E. coli λ pir SM10 (Stamm LH425). Der E. coli-Stamm LH425 wurde mit dem Salmonella typhimurium-Stamm CS019 konjugiert. Einzelne Rekombinanten, die Integrationen von Plasmidsequenzen in das Chromosom von Salmonella typhimurium trugen, wurden durch Ausplattieren auf einen Agar, der Ampicillin und Chloramphenicol enthielt, selektiert (Stamm LH428). Es wurde sichergestellt, dass diese Stämme Ampicillin-resistent und Saccharose-empfindlich waren, d. h., auf Agarplatten mit 20% Saccharose ohne Kochsalz bei Inkubation bei 30 °C abstarben. Diese Daten bestätigen die Integration von Plasmidsequenzen in das Salmonella-Chromosom.
Ein P22-Bakteriophagenlysat wurde aus dem Stamm LH428 gewonnen; die Phagenpartikel wurden durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation aufs 20fache konzentriert und in den Salmonella typhi-Stamm 522Ty2 (einen Stamm mit einer Deletion im aroA-Gen und der G646-Mutation, die den Organismus auxotroph für Histidin macht) transduziert. Einzelne rekombinante Salmonella typhi-Organismen wurden durch Ausplattieren auf LB-Platten, die mit aromatischen Aminosäuren, Cystein, Histidin und Ampicillin versehen waren, selektiert (Stamm LH435).
Der Stamm LH453 wurde bis zu mittleren logarithmischen Wachstumsphase mit aromatischen Aminosäuren, Cystein und Histidin (aber ohne Ampicillin) kultiviert. Verdünnungsreihen wurden auf LB-Platten mit 20% Saccharose ohne Kochsalz und auf LB-Platten ohne Kochsalz ausplattiert. Die Anzahl der Bakterien, die auf Platten ohne Saccharose wuchsen, war um drei Zehnerpotenzen größer als die Anzahl derer, die auf saccharosehaltigen Platten wuchsen. Diese Daten legen nahe, dass viele Kolonien die Plasmidsequenzen, die das sacB-Gen enthielten, verloren.
Mehrere Kolonien aus der Saccharose-Selektion wurden gepickt, und es wurde sichergestellt, dass sie ampicillinsensitiv und saccharoseresistent waren. Die chromosomale DNA aus etwa 10 Kolonien wurde aufgereinigt und einer Southern-Blot-Analyse unterzogen, wobei als Sonde das 2,3 kBp lange Fragment des Wildtyp-phoP/phoQ verwendet wurde.
Das Southern-Blotting zeigte den Verlust von zwei HpaI-Restriktionssschnittstellen und einer XmnI-Restriktionsschnittstelle, von der bekannt war, dass sie in mehreren Stämmen innerhalb des 1 kB langen deletierten phoP/phoQ-Fragments lag. Einer dieser Stämme wurde TyLH445 bezeichnet.
Beispiel 2: In vitro-Charakterisierung von TyLH445
TyLH445 wurde durch standardmäßige klinische mikrobiologische Tests ausgiebig in vitro charakterisiert. Die Nährstoffanforderungen von TyLH445 wurden charakterisiert. TyLH445 wuchs auf M9-Platten nur, wenn diese um ein Gemisch aus aromatischen Aminosäuren, Cystein (Salmonella typhi wächst besser mit Cystein) und Histidin ergänzt waren. Diese Daten bestätigten, dass TyLH445 aroA^- und His^- waren.
Es zeigte sich, dass TyLH445 von polyklonalem Serum gegen Salmonella und polyklonalem Serum gegen das Vi-Antigen von Salmonella typhi agglutiniert wurde. Die Agglutination der Gruppe D erwies sich als variabel, möglicherweise infolge eines Überschusses von Vi-Antigen. TyLH445 war auch indolnegativ (wie alle Salmonellen) und bildete sehr wenig Schwefelwasserstoff (wie viele Salmonella typhi). Es wurden auch biochemische Tests unter Verwendung sowohl des VITEK-Systems als auch des BBL-Crystal-Systems zur Identifikation von Darmorganismen wurden ebenfalls durchgeführt. Diese Daten zeigten, dass der TyLH445-Stamm Salmonella typhi war.
Es wurden auch die Wachstumsmerkmale von TyLH445 charakterisiert. Es zeigte sich, dass TyLH445 genauso schnell wie sein Elternstamm mit intaktem phoP/phoQ-Lokus, 522Ty2, wuchs. Das Wachstum in vitro wurde in mit aromatischen Aminosäuren, Histidin und Cystein ergänztem Luria-Bouillon bei 37 °C gemessen. Es zeigte sich, dass die Wachstumskurven des Eltern- und des Vakzinstammes im Wesentlichen identisch waren (siehe 10).
Standardisierte klinische Testverfahren wurden verwendet, um die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika zu bestimmen. Es wurde gezeigt, dass TyLH445 und der Elternstamm 522Ty2 gegenüber Ampicillin, Trimethoprim-Sulfamethoxazol, Ciprofloxazin, Aminoglykosiden und Cephalosporinen der dritten Generation empfindlich waren. Kein Unterschied in der Hemmhofgröße wurde zwischen dem Eltern- und dem Vakzinstamm beobachtet, was nahe legt, dass durch die Einführung des mutierten phoP/phoQ-Lokus in Salmonella typhi keine anderen Antibiotikumsresistenzmechanismen, z. B. Modifikation von Transportsystemen für Antibiotika oder Modifikation der Zellwand des Bakteriums, betroffen wurden.
Die phoP/phoQ-HpaI-Deletionsmutanten wurden auf Defensinempfindlichkeit getestet, einen Phänotyp von phoP-Nullmutanten. Tests auf Defensinempfindlichkeit wurden wie beschrieben durchgeführt.
Flüssigkulturen der zu testenden Stämme wurden über Nacht kultiviert. Die Kulturen wurden dann 1:200 verdünnt und bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) von etwa 0,2 kultiviert, dann wurden die Zellen auf eine Konzentration von etwa 1 × 10⁵ Organismen pro 0,05 ml verdünnt.
Für jeden Stamm wurden zwei Reaktionen durchgeführt: (1) Trägerstoff allein (0,01 % Essigsäure in sterilem Wasser) und (2) Lösung von Defensin NP-1 (70 μg/ml in 0,01 % Essigsäure). Ein gleiches Volumen der Bakteriensuspension in Trypton wurde hinzugegeben, und die Testgefäße wurden 2 h lang bei 37 °C auf einem Roller inkubiert. Das Endvolumen in jedem Reaktionsgefäß war 0,1 ml, so dass die Endkonzentration von Defensin 35 μg/ml betrug.
Defensin wird durch die hohen Salz- und Proteinkonzentrationen in bakteriellen Wachstumsmedien, wie z. B. LB-Bouillon, inaktiviert. Deshalb wurde die Defensinwirkung durch Zugabe von 900 μl Luria-Bouillon zu jedem Reaktionsgefäß beendet. Verdünnungsreihen jedes Gefäßes wurden ausplattiert, und die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro ml wurde sowohl für das Kontrollgefäß als auch das Behandlungsgefäß jedes Stammes bestimmt. Die Resultate wurden als Logarithmus der abgetöteten Bakterien für jeden Stamm ausgedrückt. Typischerweise wurden 1,0 bis 1,5 log der Wildtypbakterien abgetötet. phoP-Nullmutanten zeigen im Allgemeinen 2 bis 4 logs Abtötung. Da Stämme mit geringerer Wachstumsrate gegenüber Abtötung durch Defensin weniger empfindlich zu sein scheinen, wurde die Wachstumsrate jedes in dem Defensinempfindlichkeits-Versuch getesteten Stammes gemessen. Stämme mit ähnlichen Wachstumsraten wurden in dem Defensinempfindlichkeits-Experiment miteinander verglichen.
Die HpaI-Deletion wurde sowohl vor einem Hintergrund von Salmonella typhimurium als auch einem Hintergrund von Salmonella typhi charakterisiert. In beiden Situationen vermittelte die Deletionsmutation Empfindlichkeit gegenüber Kaninchen-Defensin NP-1 bei einer Konzentration von 35 μg/ml. Siehe hierzu 11 und 13. Der Unterschied zwischen phoP⁺ und HpaI-deletierten phoP-Nullmutanten war in dem Salmonella typhi-Stamm weniger ausgeprägt, ein Effekt, der die geringere Wachstumsrate des verglichen mit dem Salmonella typhimurium-Stamm, dem die zusätzlichen Auxotrophien fehlen, weniger vitalen Salmonella typhi-Stammes widerspiegeln kann.
Das Niveau der phoP-Aktivierung in Bakterien mit der phoP/phoQ-HpaI-Deletion wurde unter Verwendung eines lacZ-Reportergens, das mit dem phoP-aktivierten Gen B (pagB) verknüpft war, getestet. Da die Transduktionseffizienz unter Verwendung von Bakteriophage P22 bei Salmonella typhimurium gering ist, wurden diese Untersuchungen nicht an Salmonella typhi, sondern an Salmonella typhimurium durchgeführt. Die phoP-Aktivierung wurde in Gegenwart eines intakten phoP/phoQ-Lokus auf 40 bis 60 Miller-Einheiten bestimmt (Miller et al., 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., S. 352-355) und war in Stämmen mit der HpaI-Deletion gerade über der Nachweisgrenze (3 Units, siehe 12).
Beispiel 3: In vivo-Charakterisierung des Salmonella typhimurium-Stammes mit HpaI-Deletion
Da Salmonella typhi-Stämme für Mäuse nicht pathogen sind, wurde die HpaI-phoP/phoQ-Deletionsmutation sowohl in Wildtyp- als auch aroA^--Salmonella typhimurium charakterisiert. Weiblichen BALB/c-Mäusen wurden verschiedene Verdünnungen von Salmonella typhimurium LH430, einem Wildtyp-Salmonella typhimurium mit HpaI-Deletion, intraperitoneal injiziert. Die LD₅₀ dieses Stammes wurde auf einen Wert zwischen 8,2 × 10⁵ und 8,2 × 10⁶ bestimmt. (Alle Mäuse, die 8,2 × 10⁵ cfu erhielten, überlebten, und alle, die 8,2 × 10⁶ erhielten, starben.) Diese Daten sind in Übereinstimmung mit den LD₅₀-Daten, die mit Stämmen erhalten wurden, die Transposoninsertionen im phoP/phoQ-Lokus beherbergen.
Die Immunogenität der HpaI-Deletion in phoP/phoQ wurde in Salmonella typhimurium aroA::tet charakterisiert (LH481), einem mit dem menschlichen Vakzinstamm vergleichbaren Stamm. Die Mäuse wurden intraperitoneal mit 2,3 × 10⁵ und 2,3 × 10⁶ cfu LH481 inokuliert (4 Mäuse/Vakzindosis), und 30 Tage später wurden sie mit dem 30fachen der LD₅₀ an Wildtyporganismen belastet. Mit einer Ausnahme überlebten alle Mäuse. Die Maus, die starb, war in der Gruppe, die die geringere Vakzindosis erhalten hatte. Kein Tier, das die höhere Vakzindosis erhalten hatte, erkrankte.
Beispiel 4: Phase-I-Studien am Menschen
Der Vakzinstamm wurde menschlichen Freiwilligen in Dosierungen von 1 × 10⁵ bis 1 × 10¹⁰ cfu pro einzelne Oraldosis verabreicht. Zwei Versuchspersonen erhielten jede Dosis; drei Versuchspersonen erhielten eine Dosis von 1 × 10⁸ cfu/ml. Die Versuchspersonen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung des Vakzins untersucht.
Sicherheit
Zur Detektion des Vakzinstammes im Patientenblut wurden BACTEC-Blutkulturen an den Tagen 4, 6, 8, 10 und 12 nach der Einnahme des Vakzins jeweils doppelt angefertigt. Bei keiner der Versuchspersonen wurde Bacterämie festgestellt.
13 erwachsene freiwillige Testpersonen erhielten steigende orale Einzeldosen dieses neuen attenuierten Typhusvakzins. Keine Person hatte irgendeine Art von Nebenwirkungen. Insbesondere gab es kein Fieber, keine gastrointestinalen Symptome und keine Symptome betreffend das Allgemeinbefinden. Die Testpersonen wurden seriellen Blutkulturen gemäß einem vorher festgelegten Zeitplan nach Erhalt des oralen Vakzins unterzogen, wobei an jedem der Tage 4, 6, 8, 10 und 12 jeweils 2 Gruppen von BACTEC-Blutkulturen durchgeführt wurden, und es wurden keine positiven Blutkulturen festgestellt. Die Versuchspersonen wurden nach der Einnahme des Vakzins zwei Monate lang beobachtet, und es wurden keine Spätfolgen berichtet.
Besiedlung
Stuhlproben wurden unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren auf Vorhandensein des Vakzinstammes TyLH455 geprüft. Primärstuhl wurde auf Kulturplatten auf das Vorliegen des Vakzinstammes untersucht. In einigen Fällen war es notwendig, durch Übernachtinkubation des Stuhls in BBL Selenite F-Bouillon, ergänzt mit aromatischen Aminosäuren, Histidin und Cystein, die Stuhlproben anzureichern, um die Bakterien detektieren zu können. Dieses Medium hat eine gewisse Hemmwirkung auf E. coli, aber fördert das Wachstum von Salmonella.
Die Versuchspersonen waren während verschiedener Zeiträume von 1 bis 6 Tagen nach Erhalt des Vakzins besiedelt. Nach den höchsten Dosen (10⁹ oder 10¹⁰) hatten die Versuchspersonen positive Primärkulturplatten während der ersten 1 bis 3 Tage nach der Impfung, während bei niedrigeren Dosen nur Kulturen in Selenanreicherungs-Bouillon (Selektionsmedium für Salmonella, das andere Enterobacteriaceen hemmt) für die Vakzinorganismen positiv waren. Keine bislang untersuchte Versuchsperson hatte innerhalb der 2 Monate der Verfolgung einen verlängerten Befall durch den Vakzinorganismus.
Tabelle 17

* Gemessen durch Ganzzell- und LPS-ELISAS und Widal-Test auf flagelläres H-Antigen. In allen Tests wurden die Seren in Verdünnungen von 1:40 und höher gemessen.
** Eine dieser Versuchspersonen erhielt einen Monat nach der primären Impfung eine Auffrischungsdosis von 10¹⁰ Organismen (Serologie in Arbeit).

Immunogenität
Die Auslösung einer Immunantwort auf die Vakzinstämme wurde durch standardmäßige ELISA-Assays gemessen. Die Seren wurden von den Versuchspersonen 0, 7, 14, 21 und 28 Tage nach Erhalt einer einzelnen oralen Dosis des Vakzins gewonnen. ELISA-Messungen wurden unter Verwendung von ganzen Bakterien des Stammens TyLH445 und von Salmonella typhi-Lipopolysaccharid (SIGMA, St. Louis, MO) als Antigen durchgeführt. Das am Tag 0 von jeder Testperson gewonnene Serum wurde als interne Negativkontrolle verwendet. Rekonvaleszenzseren von zuvor mit Wildtyp-Salmonella typhi infizierten Patienten (hauptsächlich aus Mexiko) wurden als Positivkontrollen verwendet.
Einige Testpersonen zeigten 21 Tage nach Erhalt des Vakzins Serokonversion, wie durch ELISAs festgestellt, in denen IgG-Antikörper gegen vollständige Vakzinorganismen oder gegen Salmonella typhi-Lipopolysaccharid detektiert wurden. Von Patienten vor der Verabreichung des Vakzins gewonnene Seren (Prä-Immunseren) wurden geprüft, und die Daten wurden verwendet, um eine Grundlinie zu etablieren. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Impfung abgenommene Patientenseren wurden als positiv betrachtet, wenn die Testergebnisse 0,2 ELISA-OD-Einheiten größer waren als die des Prä-Immunserums.
Sequenzprotokoll
Tabelle 12

³ Behlau et al., 1993, J. Bacteriol., 175:4475-84
¹⁸ Lehrer et al., 1991, Cell, 64:229-30
²⁵ Miller et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5054-58
²⁶ Miller et al., 1990, J. Bacteriol., 172:2485-90
³⁷ Taylor et al., 1989, J. Bacteriol., 171:1810-78

Tabelle 13 Vergleich der pag::phoA-Aktivitätin Stämmen mit Wildtyp- und Null-phoP^--Loci.

^a Die AP-Aktivitätswerte sind in den von Miller für β-Galaktosidase definierten Einheiten dargestellt. Die Werte sind repräsentativ für Experimente (Doppelmessungen), die zu drei verschiedenen Zeitpunkten wiederholt wurden. PhoP⁺ bezeichnet die pag::TnphoA-Insertion in dem einen Wildtyp-phoP-Locus enthaltenden Stamm CS019. PhoP^- bezeichnet isogene Stämme, die das phoP105::Tn10-Allel tragen.
^b Das Ausmaß der Verringerung der enzymatischen Aktivität stellt die Senkung der AP-Aktivität durch Erwerb des Null-phoP105-Allels dar. Diese Werte wurden aus Kulturen in der logarithmischen Wachstumsphase berechnet und auf die nächste ganze Zahl gerundet.

Tabelle 14 Die Wirkung von pag::phoA-Genfusionen auf die Virulenz von von Salmonella gegenüber Mäusen

^a Die für 50 % letale Dosis wurde durch intraperitoneale Injektion in 10 Mäuse pro Verdünnung nach dem Verfahren von Reed & Muench (31) bestimmt.
^b Der Makrophagen-Überlebens-Index (Macrophage Survival Index, MSI) wurde bestimmt, indem man die durchschnittliche CFU-Zahl der 24 h nach dem Zusatz von Gentamicin aus Makrophagenkulturen gewonnenen Salmonellen (Dreifachmessung) durch die durchschnittliche CFU-Zahl der 1. Stunde nach Gentamicin-Zusatz aus Makrophagen gewonnenen Salmonellen dividierte.
¹⁶ Kier at al., 1979, J. Bacteriol., 138: 155-161
²⁵ Miller et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86: 5054-5058

Tabelle 15 Plasmide, Stämme und relevante Eigenschaften

^a Der Makrophagen-Überlebens-Index (MSI) wird berechnet, indem man die Anzahl der 24 h nach der Infektion überlebender Organismen durch die Anzahl der nach der 30minütigen Infektionsphase zellassoziierte Organismen dividiert.
^b MGH, Massachusetts General Hospital, ATCC, American Type Culture Collection, FDA, Food and Drug Administration: VRI, Virus Research Institute
⁴ Belden et al., 1989, Infect. Immun., 57:1-7
³¹ Miller et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5054-58
³⁴ Miller et al., 1988, J. Bacteriol., 170:2575-83
³⁶ Pulkkinen et al., 1991, J. Bacteriol., 173:86-93

Tabelle 16 Alkalische Phosphatase und β-Galaktosidase

^a (A) AP (Alkalische Phosphatase) or (B)β-gal (β-Galactosidase)

Claims

Salmonella-Zelle, deren Virulenz durch eine nicht-reversible Null-Mutation innerhalb des phoP/phoQ-Lokus attenuiert worden ist, so dass der Zell-Genotyp phoP/phoQ^- ist, wobei diese nicht-reversible Null-Mutation eine Deletion der Nukleotide 376-1322 innerhalb des phoP/phoQ-Lokus umfasst.
Zelle nach Anspruch 1, wobei diese Salmonella-Zelle eine Salmonella typhi-Zelle, eine Salmonella enteriditis-Zelle oder eine Salmonella typhimurium-Zelle ist.
Vakzin, umfassend lebende Salmonella-Zellen, deren Virulenz durch eine nicht-reversible Null-Mutation innerhalb des phoP/phoQ-Lokus attenuiert worden ist, so dass der Zell-Genotyp phoP/phoQ^- ist, wobei diese nichtreversible Null-Mutation eine Deletion der Nukleotide 376-1322 innerhalb des phoP/phoQ-Lokus umfasst.
Vakzin nach Anspruch 3, wobei diese Salmonella-Zelle eine Salmonella typhi-Zelle, eine Salmonella enteriditis-Zelle oder eine Salmonella typhimurium-Zelle ist.