CN104694432B - 缺失phoQ和rpoS基因的都柏林沙门氏菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业微生物基因工程领域，涉及一株缺失phoQ和rpoS基因的都柏林沙门氏菌及应用。利用λ噬菌体Red重组系统对亲本株都柏林沙门氏菌的phoQ、rpoS基因进行缺失，得到一株缺失phoQ和rpoS基因的重组的都柏林沙门氏菌ΔphoQ‑ΔrpoS，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC NO：M2014039)。具有如下特征：带有基因缺失标记；不含外源基因；不含抗生素标记。与都柏林沙门氏菌亲本株相比，该菌株的生长速度基本一致，生化特性没有改变，但其毒力比亲本株显著降低，具有良好的免疫原性，对都柏林沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌感染均具有良好的免疫保护力。

Description

缺失phoQ和rpoS基因的都柏林沙门氏菌及应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一株缺失phoQ和rpoS基因的都柏林沙门氏菌及应用。该菌株缺失了phoQ和rpoS基因，由于该菌株的毒力降低而保留较好的免疫原性。本发明还包括利用该重组菌制备疫苗以及该疫苗在小鼠上的应用。在小鼠模型上，都柏林沙门氏菌phoQ和rpoS双基因缺失株免疫后能对10LD50的毒力型都柏林沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌攻击均提供100％的保护。

背景技术

沙门氏菌是最常见的人和动物的重要病原菌，呈全球性分布。沙门氏菌导致牛副伤寒，主要由都柏林沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌引起，其中都柏林沙门氏菌是牛专一性沙门氏菌。犊牛副伤寒以顽固性下痢为典型症状，常引起犊牛大规模发病，死亡率较高，对养牛业造成重大损失。有报道表明，我国20世纪70～80年代，由该病引起的死亡率曾达到85％。此外，都柏林沙门氏菌是重要的人兽共患性病原菌，是引起人类沙门氏菌中毒的主要血清型之一，人食用都柏林沙门氏菌污染的动物产品及奶制品，可发生食物中毒，致死率可高达28.3％，而其他沙门氏菌中毒致死率仅为3％左右(Helms et al,2003)。

疫苗接种是预防犊牛副伤寒的最佳手段，活疫苗由于可同时诱导体液免疫和细胞免疫，因此是免疫效果最佳的疫苗。在我国，唯一的牛副伤寒活疫苗是利用醋酸铊致弱法选育出的都柏林沙门氏菌弱毒株。此疫苗采用化学诱变致弱，具有致弱的遗传背景不清、存在毒力返强风险、保留部分残留毒力、没有可用于区分疫苗株和野毒株的遗传标记等缺点。因此，利用基因工程技术缺失毒力基因的减毒途径对开发遗传背景清晰、减毒后遗传稳定性好、安全有效的都柏林沙门氏菌活疫苗意义重大。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，通过基因工程的方法，筛选获得一株都柏林沙门氏菌双基因缺失的基因工程致弱菌株。

本发明的第二个目的是利用构建的双基因缺失都柏林沙门氏菌的基因工程致弱菌株制备犊牛副伤寒基因工程疫苗。该疫苗的免疫原性强，安全性好，无抗性基因，无外源基因，遗传背景清楚，具有鉴别诊断标记。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人构建了一株都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS，该双基因缺失株被命名为都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS，Salmonella Dublin△phoQ-△rpoS，于2014年2月19日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014039。

本发明的基本构建方法是：利用λ噬菌体Red重组系统对亲本株都柏林沙门氏菌CICC21497株的phoQ、rpoS基因进行缺失，获得双基因缺失株。首先根据都柏林沙门氏菌phoQ基因(GenBank基因登录号：CP001144.1)上下游序列和模板质粒pKD3基因序列(GenBank基因登录号:AY048742)，设计同源重组phoQ基因缺失突变和鉴定引物；然后以质粒pKD3为模板，PCR扩增带有phoQ上下游同源臂的两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶基因(即氯霉素抗性基因)，同时将同源重组辅助性质粒pKD46(GenBank基因登录号：AY048746)转入都柏林沙门氏菌亲本株并经L-阿拉伯糖诱导后制备成电转化感受态，将此PCR产物转入携带质粒pKD46的感受态细胞进行电转，通过氯霉素抗性筛选，获得用带有phoQ上下游同源臂的两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶基因替换phoQ基因的单基因突变株△phoQ∷cat，37℃条件下消除辅助性质粒pKD46，PCR鉴定得到都柏林沙门氏菌△phoQ∷cat；最后在具有FLP位点专一性重组的质粒pCP20作用下将氯霉素乙酰转移酶基因和一个FRT位点消除，其操作步骤是：30℃下向重组菌导入pCP20,42℃条件下消除抗性基因，质粒也逐渐丢失，用含氯霉素与不含氯霉素、但均含氨苄青霉素的培养基平行筛选氯霉素抗性消失菌株，得到都柏林沙门氏菌△phoQ单基因缺失株。再以该菌株为基础用同样的操作过程最终获得重组的都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS(英文名为：Salmonella Dublin△phoQ-△rpoS)。

本发明比较了该重组的都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS基因工程菌株(双基因缺失株)与都柏林沙门氏菌亲本株的生长速度、生化特性、免疫原性和免疫保护性等方面的生物学特性。

为深入评价都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS基因工程菌株制备的疫苗在防制犊牛副伤寒中的应用，用制备的疫苗在试验动物(小白鼠，购自湖北省疾病预防控制中心)进行了安生性(毒力)及免疫效果评价，达到了预期的效果，从而完成了本发明。

本发明的主要优点是：

本发明通过λ噬菌体Red同源重组的方法将都柏林沙门氏菌phoQ基因、rpoS基因两个基因完全缺失，降低了毒力回复突变的可能性，增加了稳定性与安全性，为犊牛副伤寒的安全和有效防制奠定了遗传学基础。

本发明所缺失的phoQ、rpoS基因均是都柏林沙门氏菌的毒力基因，动物(小鼠)实验表明该双基因缺失的菌株毒力明显降低，而对机体仍有较好的免疫力。

与传统的疫苗株比较，本发明的双基因缺失株不含抗性基因，也不含外源基因，具有可用于鉴别诊断重组菌株的遗传标记，且其遗传背景清晰。

更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是含phoQ基因上游同源臂和抗性基因上游片段上游引物P1-C1的DNA序列，(phoQ上游同源臂)。

序列表SEQ ID NO：2是含phoQ基因下游同源臂和抗性基因下游片段下游引物P2-C2的DNA序列，(phoQ下游同源臂)。

序列表SEQ ID NO：3是含rpoS基因上游同源臂的抗性基因上游片段上游引物P3-C3的DNA序列，(rpoS上游同源臂)。

序列表SEQ ID NO：4是含rpoS基因下游同源臂和抗性基因下游片段下游引物P4-C4的DNA序列(rpoS下游同源臂)。

序列表SEQ ID NO：5是鉴定phoQ基因的上游引物序列phoQ-F。

序列表SEQ ID NO：6是鉴定phoQ基因的下游引物序列phoQ-R

序列表SEQ ID NO：7是鉴定rpoS基因的上游引物序列rpoS-A1。

序列表SEQ ID NO：8是鉴定rpoS基因的下游引物序列rpoS-A2。

序列表SEQ ID NO：9是鉴定rpoS基因的下游引物序列rpoS-A3。

序列表SEQ ID NO：10是检测质粒pKD46(GenBank登录号:AY048742)中exo基因的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO：11是检测质粒pKD46(GenBank登录号:AY048742)中的exo基因的反向引物序列。

序列表SEQ ID NO：12是本发明构建的都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS或△phoQ缺失的phoQ基因的核苷酸序列,序列长度为1464bp。

序列表SEQ ID NO：13是本发明构建的都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS或△phoQ缺失的rpoS基因的核苷酸序列,序列长度为993bp。

序列表SEQ ID NO：14是质粒pKD46质粒上exo基因的核苷酸序列，序列长度为681bp。

序列表SEQ ID NO：15是质粒pKD3上的两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶基因序列，序列长度为1012bp。

图1：采用的Red重组技术进行基因敲除的步骤示意图。

图2：是pKD3质粒图谱。

图3：是pKD46质粒图谱。

图4：是pCP20质粒图谱。

图5：本发明采用的Red重组技术构建双基因缺失重组菌的整体流程示意图。

基本步骤是先扩增两端含phoQ基因同源臂的两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶(氯霉素抗性基因)基因片段，将此PCR产物电转化入都柏林沙门氏菌，在一定条件下诱导其同源重组替代靶基因，然后将抗性基因消除得到单基因缺失株(都柏林沙门氏菌△phoQ)，之后用同样的方法构建双基因缺失株(即，都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS)。

图6：含phoQ同源臂和两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶基因(cat)的PCR扩增结果。

图7：都柏林沙门氏菌△phoQ∷cat的PCR鉴定。

图8：都柏林沙门氏菌△phoQ的PCR鉴定。

图9：都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS∷cat的PCR鉴定。

图10：都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS的PCR鉴定。

图11：都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS与都柏林沙门氏菌亲本株和都柏林沙门氏菌△phoQ的OD_600nm生长曲线。(图中的△phoQ单突变株为都柏林沙门氏菌△phoQ；△phoQ-△rpoS双突变株为都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS)。

图12：都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS与都柏林沙门氏菌亲本株和都柏林沙门氏菌△phoQ的LgCFU的生长曲线(图中的△phoQ单突变株为都柏林沙门氏菌△phoQ；△phoQ-△rpoS双突变株为都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS)。

图13：都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS与都柏林沙门氏菌亲本株和都柏林沙门氏菌△phoQ对HEp-2细胞的粘附。

图14：都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS与都柏林沙门氏菌亲本株和都柏林沙门氏菌△phoQ对HEp-2细胞的侵袭。

图15：都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS和都柏林沙门氏菌△phoQ免疫后IgG抗体水平。

图16：都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS和都柏林沙门氏菌△phoQ免疫1周后IFN-γ水平。

图17：都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS和都柏林沙门氏菌△phoQ免疫1周后TNF-α水平。

图18：都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖分析。

图19：都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS免疫小鼠的CD4+淋巴细胞水平分析。

图20：都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS免疫小鼠的脾脏CD4+T细胞的流式细胞术分析。

具体实施方式

下面结合实例来详细描述本发明，本发明的优缺点会在描述中得以体现。但是这些实施例仅是示范性的，并不对发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但是这些修改和替换均属于本发明的保护范围。

实施例1：

都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS的构建：

利用Red重组方法(Datsenko KA,Wanner BL.One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl AcadSci U S A.2000,97(12):6640-5)，以都柏林沙门氏菌(Salmonella Dublin)(菌株编号CICC21497，购自中国工业微生物菌株保藏管理中心)为亲本株，按照图1所示步骤进行基因敲除。首先根据phoQ基因(GenBank基因登录号：CP001144.1)上下游序列和pKD3中两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶基因序列(GenBank基因登录号:AY048742)(图2)，设计同源重组phoQ基因缺失突变和鉴定引物；然后用带有phoQ上下游同源臂的两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶基因(简称氯霉素抗性基因，缩写为cat)替换phoQ基因，步骤如下：以质粒pKD3为模板，PCR扩增带有phoQ上下游同源臂的两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶基因，同时将同源重组辅助性质粒pKD46(GenBank基因登录号：AY048746)(图3)转入都柏林沙门氏菌并经L-阿拉伯糖诱导后制备成电转化感受态，将此PCR产物转入携带质粒pKD46的感受态细胞进行电转，通过氯霉素抗性筛选、PCR鉴定和37℃条件下消除辅助性质粒pKD46，得到都柏林沙门氏菌△phoQ∷cat；最后将氯霉素乙酰转移酶抗性基因和一个FRT位点消除，其操作步骤是：30℃下向重组菌导入具有FLP位点专一性重组的质粒pCP20(Doublet B,Douard G,Targant H,Meunier D,Madec JY,Cloeckaert A.Antibiotic markermodifications of lambda Red and FLP helper plasmids,pKD46and pCP20,forinactivation of chromosomal genes using PCR products in multidrug-resistantstrains.J Microbiol Methods.2008,75(2):359-61)(图4),42℃条件下消除抗性基因，质粒也逐渐丢失，得到都柏林沙门氏菌△phoQ单基因缺失株。再以该菌株为基础用同样的操作过程最终获得重组双基因缺失株都柏林沙门氏菌(Salmonella Dublin)△phoQ-△rpoS。其整体构建流程见图5。以上三个质粒均由美国宾夕法尼亚大学兽医学院DieterM.Schifferli教授赠送。

1.1引物设计

根据phoQ基因(GenBank基因登录号：CP001144.1)和rpoS基因(GenBank基因登录号:CP001144.1)上下游序列和pKD3基因序列(GenBank基因登录号:AY048742)，设计同源重组phoQ、rpoS基因缺失突变、鉴定引物。

同源重组phoQ、rpoS基因缺失突变引物分别由两部分组成：靠近5’端的56bp片段分别与phoQ、rpoS靶基因两侧序列同源，靠近3’端未的20bp与质粒pKD3上氯霉素乙酰转移酶基因FRT位点两侧序列互补。

PCR扩增产物长度均为1124bp，包括靶基因同源序列和两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶基因。引物由上海生工生物技术有限公司合成。

引物序列如下：

(1)phoQ同源臂引物

用于构建含phoQ同源臂的抗性基因片段同源臂上游引物为P1-C1(phoQ上游同源臂为下划线部分，在CP001144.1中的位置为2048256-2048311，56bp；靠近3’末端的20bp与质粒pKD3上两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶基因(cat基因)上游FRT位点外侧序列同源)：

CCGCACGATGTCATTACCACCGTACGCGGACAAGGATATCTTTTTGAATTGCGCTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC。

用于构建含phoQ同源臂的抗性基因片段同源臂下游引物为P2-C2(phoQ下游同源臂为下划线部分，在CP001144.1中的位置为2049776-2049831,56bp；靠近3’末端的20bp与质粒pKD3上两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶基因(cat基因)下游FRT位点外侧序列互补)：

TGACACCGATTATAACGGATGCTTAACGAGATGCGTGGAAGAACGCACAGAAATGTTATGAATATCCTCCTTAGTT。

扩增长度为1124bp，包括phoQ同源臂和两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶基因。

(2)phoQ基因鉴定引物：

在都柏林沙门氏菌phoQ基因同源重组区域外侧，设计引物phoQ-F、phoQ-R，用于检测phoQ基因缺失突变株。

上游引物(或称正向引物，下同)：phoQ-F：TGACGAAGCCATTCCACATC(用于鉴定phoQ)

下游引物(或称反向引物，下同)：phoQ-R：AAAGTCGGGCCAGTTAAGAGTT(用于鉴定phoQ)

都柏林沙门氏菌亲本株：扩增片段长度为1956bp。

都柏林沙门氏菌△phoQ∷cat：扩增片段长度变为1504bp。phoQ基因被两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶(cat)替代，片段长度减少452bp(phoQ基因长度为1464bp，两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶片段总长度为1012bp，扩增片段长度＝1464-452＝1012)；

都柏林沙门氏菌单缺失株△phoQ：扩增片段长度为574bp。两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶基因消除，通过FLP位点的专一性重组，剩余一个42bp的FRT位点(两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶片段总长度为1012bp，位于FRT位点外侧的40bp的上下游引物与一个42bp的FRT位点共82bp，两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶消除后减少930bp，扩增片段长度＝1504-930＝574)。

(3)rpoS同源臂引物：

用于构建含rpoS同源臂的抗性基因片段上游同源臂引物为P3-C3(rpoS上游同源臂为下划线部分，在CP001144.1中的位置为3109928-3109983，56bp；靠近3’端末的20bp与质粒pKD3上与氯霉素抗性基因(cat基因)上游FRT位点外侧序列同源)：

GACAAACGGTAAAAAAAAGGCCAGTCTGTCGACTGGCCTTTTTTTGACAAGGGTACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(下划线为rpoS上游同源臂)；

用于构建含rpoS同源臂的抗性基因片段下游同源臂引物为P4-C4(rpoS下游同源臂为下划线部分，在CP001144.1中的位置为3110977-3111032，56bp；靠近3’末端的20bp与质粒pKD3上氯霉素乙酰转移酶基因(cat基因)下游FRT位点外侧序列互补)：

GGAACCAGGCTTTGACTTGCTAGTTCCGTCAAGGGATCACGGGTAGGAGCCACCTTTATGAATATCCTCCTTAGTT(下划线rpoS下游同源臂)。

扩增长度为1124bp。

(4)rpoS鉴定引物

在rpoS基因同源重组区域外侧与内侧(同源重组片段长度与rpoS基因片段长度近似)，设计引物rpoS-A1、rpoS-A2、rpoS-A3，用于检测rpoS基因缺失突变株。

rpoS-A1：CTACCGAATATGTCCGTCCTG(鉴定rpoS)

rpoS-A2：CGGGCGATTATGAACCAA(鉴定rpoS)

rpoS-A3：CGATGATTACCTGAGTGCC(鉴定rpoS)

都柏林沙门氏菌亲本株和都柏林沙门氏菌单缺失株△phoQ：rpoS-A1、rpoS-A2为引物的扩增片段长度为1011bp，rpoS-A1、rpoS-A3为引物的扩增片段长度为1722bp。

都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS∷cat：rpoS-A1、rpoS-A2为引物无扩增产物，rpoS-A1、rpoS-A3为引物的扩增片段长度为1741bp。rpoS基因被两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶(cat)替代，由于rpoS-A2序列已被替代，故rpoS-A1、rpoS-A2为引物无扩增产物；rpoS-A1、rpoS-A3为引物的扩增片段增加19bp(rpoS基因长度为993bp，两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶片段总长度为1012bp)。

都柏林沙门氏菌双缺失株△phoQ-△rpoS：rpoS-A1、rpoS-A2为引物仍无扩增产物，rpoS-A1、rpoS-A3为引物的扩增片段长度为811bp(两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶基因消除，通过FLP位点的专一性重组，剩余一个42bp的FRT位点(两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶片段总长度为1012bp，位于FRT位点外侧的40bp的上下游引物与一个42bp的FRT位点共82bp，两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶消除后减少930bp)。

(5)检验pKD46消除的exo基因引物

通过检测pKD46(GenBank基因登录号:AY048746.1)中的exo基因，引物序列如下：

pKD46-F:5’ATGTCCTACTTCCACACCCTGC3’

pKD46-R:5’GCTCCCCAAATACAAAACCAAT3’

扩增长度为508bp。

相关引物编号及序列如下：

P1-C1(含phoQ同源臂的抗性基因片段上游引物)：CCGCACGATGTCATTACCACCGTACGCGGACAAGGATATCTTTTTGAATTGCGCTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(下划线为phoQ上游同源臂，靠近3’末端的20bp与质粒pKD3上氯霉素抗性基因(cat基因)上游FRT位点外侧同源序列)

P2-C2(含phoQ同源臂的抗性基因片段下游引物)：TGACACCGATTATAACGGATGCTTAACGAGATGCGTGGAAGAACGCACAGAAATGTTATGAATATCCTCCTTAGTT(下划线为phoQ下游同源臂；靠近3’末端的20bp与质粒pKD3上氯霉素抗性基因(cat基因)下游FRT位点外侧序列互补)

P3-C3(含rpoS同源臂的抗性基因片段上游引物)：GACAAACGGTAAAAAAAAGGCCAGTCTGTCGACTGGCCTTTTTTTGACAAGGGTACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(下划线为rpoS上游同源臂；靠近3’末端的20bp与质粒pKD3上氯霉素抗性基因(cat基因)上游FRT位点外侧同源序列)

P4-C4(含rpoS同源臂的抗性基因片段上游引物)：GGAACCAGGCTTTGACTTGCTAGTTCCGTCAAGGGATCACGGGTAGGAGCCACCTTTATGAATATCCTCCTTAGTT(下划线为rpoS下游同源臂；靠近3’末端的20bp与质粒pKD3上氯霉素抗性基因(cat基因)下游FRT位点外侧序列互补)

phoQ-F：TGACGAAGCCATTCCACATC(用于鉴定phoQ基因)

phoQ-R：AAAGTCGGGCCAGTTAAGAGTT(用于鉴定phoQ基因)

rpoS-A1：CTACCGAATATGTCCGTCCTG(用于鉴定rpoS基因)

rpoS-A2：CGGGCGATTATGAACCAA(用于鉴定rpoS基因)

rpoS-A3：CGATGATTACCTGAGTGCC(用于鉴定rpoS基因)

1.2含phoQ同源臂氯霉素乙酰转移酶基因的获得

以质粒pkD3为模板，以P1-C1、P2-C2分别为上下游引物扩增出1124bp的特异性片段(电泳图见图6)。PCR反应条件为：94℃10min，94℃45s，60℃45s,72℃90s，30cycles，72℃10min，hold in 4℃。反应体系为50μL：Taq DNA Polymerase 0.5μL，10×buffer 5.0μL，1mmol/L dNTP 8.0μL，Template1.0μL，10mmol/L P1-C11.0μL，10mmol/L P2-C21.0μL，H₂O33.5μL。第一次PCR产物以1：100的比例稀释，取1μL作为模板加入到新的反应体系中，进行第二次PCR，以消除模板质粒的影响。PCR产物取5μL电泳检测扩增效果，其片段大小为1124bp，与预期相符。

1.3Red重组功能的诱导和携带质粒pKD46的电转化感受态细胞的制备

将编码Red重组系统的温敏质粒pKD46转化都柏林沙门氏菌亲本株(菌株编号CICC21497)，接种到氨苄青霉素(50ng/mL)LB液体培养基，30℃培养过夜。次日按(V/V)1：50接种于5mL LB培养基，30℃培养至OD₆₀₀达0.2-0.3时，加入终浓度为30mmol/L的L-阿拉伯糖诱导1h，使pKD46上介导重组的蛋白(Exo、Bet和Gam三个蛋白)充分表达。

电转化感受态的制备：将5ml经过诱导的菌液冰浴30min，4℃6000r/min离心15min，弃上清，用预冷的5mL去离子水重悬菌体。用无菌去离子水洗涤2次后，继续用等体积10％甘油洗涤3次，最后于4℃7500r/min离心15min收获细胞。加入50μL10％甘油重悬细胞，立刻用于电转化。

1.4电转化同源重组

将100ng含phoQ同源臂的氯霉素抗性基因电击携带质粒pKD46的电转化感受态细胞，电击参数为：电压2.0KV，电容25μF和脉冲电阻200Ω。电击产物立刻加入1mL预热的LB培养基于30℃摇床复苏1h。涂布氯霉素LB平板(34ng/mL)上筛选phoQ基因缺失突变株。37℃培养消除质粒pKD46，得到第一次同源重组菌△phoQ∷cat。利用phoQ-1、phoQ-2引物鉴定△phoQ∷cat，分别用都柏林沙门氏菌(或称都柏林沙门氏菌亲本株；菌株编号CICC21497，购自中国工业微生物菌株保藏中心，北京)和第一次同源重组获得的单基因缺失株都柏林沙门氏菌△phoQ∷cat(S.dublin△phoQ∷cat)作为模板，phoQ野生型(即都柏林沙门氏菌亲本株)扩增片段为1956bp，△phoQ∷cat重组菌为1514bp，与预期大小相符(如图7中的箭头所示)。PCR反应条件为：94℃10min，94℃45s，57℃45s,72℃2min，30cycles，72℃10min，hold in 4℃。反应体系为20μL：2×Mix 10.0μL，10mmol/L phoQ-11.0μL，10mmol/L phoQ-21.0μL，Tempiate1.0μL，H₂O 7.0μL。

1.5FLP位点专一性重组

将重组菌△phoQ∷cat制成感受态细胞，导入编码FLP位点专一性重组酶的质粒pCP20，30℃培养条件下于含((34ng/mL))氯霉素和(50ng/mL)氨苄青霉素的抗性平板上筛选阳性转化子。阳性转化子分别转接至无抗性固体LB平板和含氯霉素(34ng/mL)和氨苄青霉素(50ng/mL)的抗性平板上，42℃过夜。挑取无抗性平板上生长且抗性平板上不生长的单菌落，获得丢失氯霉素乙酰转移酶基因(cat)的重组菌，该重组菌株即为单基因缺失株△phoQ。利用phoQ-1、phoQ-2为引物鉴定△phoQ，分别用都柏林沙门氏菌亲本株和都柏林沙门氏菌△phoQ(即都柏林沙门氏菌单基因缺失株)作为模板，得到phoQ野生型扩增片段长度为1956bp，都柏林沙门氏菌单基因缺失株△phoQ(或称重组菌)为574bp，与预期大小相符(如图8箭头所示)。PCR反应条件同S.dublin△phoQ∷cat的制备。

1.6都柏林沙门氏菌单基因缺失株△phoQ中rpoS基因的缺失

在都柏林沙门氏菌△phoQ单基因缺失株的基础上利用以上Red同源重组系统缺失rpoS基因，具体方法是：以引物P3-C3、P4-C4扩増含rpoS同源臂氯霉素乙酰转移酶基因，得到长度为1124bp的片段，与预期相符，制备方法同1.1和1.2。

制备△phoQ电转化感受态细胞，第一次同源重组得到△phoQ-△rpoS∷cat，方法同1.4。由于rpoS基因片段与含rpoS同源臂及氯霉素抗性基因片段的长度相似，故以rpoS-A1/rpoS-A2、rpoS-A1/rpoS-A3为引物鉴定。通过PCR检测(按常规方法)，获得如图9所示的结果：以rpoS-A1、rpoS-A3为引物，扩增得到rpoS野生菌(即：都柏林沙门氏菌亲本株)1722bp片段，以及重组菌△phoQ-△rpoS∷cat 1751bp片段；以rpoS-A1、rpoS-A2为引物，得到rpoS野生菌扩增片段1011bp，△phoQ-△rpoS∷cat重组菌无扩增产物，与预期片段大小相符。重组菌△phoQ-△rpoS∷cat进行FLP位点专一性重组，操作方法同1.5，得到都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS。以rpoS-A1、rpoS-A3为引物进行PCR检测(按常规方法)，得到rpoS野生菌扩增片段1722bp，都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS(或称重组菌)的扩增片段为811bp，与预期片段大小相符，具体结果如图10所示。

本实施例rpoS基因的相关信息还可参阅本说明书末尾的《附录》部分。

实施例2：

都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS的生物学特性鉴定：

本发明通过对△phoQ-△rpoS双基因缺失株的生长曲线测定、生化试验、小鼠LD₅₀比较、对细胞的粘附力与侵袭力等试验证明了△phoQ-△rpoS双基因缺失株与都柏林沙门氏菌亲本株生长速度基本一致、生化特性没有改变，而毒力比都柏林沙门氏菌亲本株显著降低。

2.1都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS的生长曲线测定

都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS与都柏林沙门氏菌(或称亲本株，或称都柏林沙门氏菌亲本株，菌株编号CICC21497，购自中国工业微生物菌株保藏管理中心，北京)和都柏林沙门氏菌单基因缺失株△phoQ的单菌落接种LB液体培养基(胰蛋白胨10.0g，酵母浸出物5.0g，NaCl 5.0g，溶于1000mL ddH2O中，pH7.0-7.2)上，37℃，180r/min培养，12h后以体积比为1:1000转接于100mL LB液体培养基中，于37℃同步培养，每隔1h取样测OD₆₀₀值并计数菌落形成单位。生长曲线显示：都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS与都柏林沙门氏菌亲本株以及都柏林沙门氏菌单基因缺失株△phoQ的生长速度无明显差异(见图11、图12)。

2.2都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS的生化特性鉴定

以常规的无菌操作方法将都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS与都柏林沙门氏菌亲本株、都柏林沙门氏菌单基因缺失株△phoQ分别接种麦芽糖发酵管、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、蔗糖发酵管、甘露糖发酵管、半乳糖发酵管、阿拉伯糖发酵管、木糖发酵管、尿素发酵管，H₂S发酵管(上述发酵管购自杭州天和微生物试剂有限公司)。37℃恒温培养箱中静置培养24-48h。生化反应结果表明：都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS与都柏林沙门氏菌亲本株以及都柏林沙门氏菌单基因缺失株△phoQ的生化特性一致，符合沙门氏菌属的特征(见表1)。

表1 都柏林沙门氏菌双基因缺失株、单基因缺失株与亲本株生化反应特性的比较

2.3都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS对小鼠的毒力试验

将重组菌都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS双基因缺失株单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃180r/min培养，12h后1:1000转接于10mL液体LB中，37℃180r/min继续培养7h，收集菌体，浓缩或稀释成不同的浓度，每只Balb/c小鼠腹腔注射100μL。同时以△phoQ单基因缺失株和亲本株为对照，攻毒途径同都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS。观察14天，统计小鼠死亡情况，根据Korbor法计算出都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS的半数致死量(LD₅₀)为8.48×10⁷CFU，都柏林沙门氏菌单基因缺失株△phoQ的LD₅₀为6.67×10⁷CFU，柏林沙门氏菌亲本株LD₅₀为3.32×10⁶CFU。如表2所示，说明都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS比都柏林沙门氏菌亲本株毒力降低约26倍。

表2 都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS的LD₅₀检测结果

2.4都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS双基因缺失株对细胞的粘附力与侵袭力试验

将人喉癌上皮细胞系HEp-2细胞(这是一个常见的商业化传代细胞系，由喉癌细胞驯化而来，购自于美国典型培养物保藏中心，ATCC编号，CCL-23^TM，从Dieter M.Schifferli引进)连续传代培养三代，然后，将第四代长满单层的新鲜HEp-2细胞用胰酶消化分散成单个细胞，按每孔2.5×10⁵个细胞的密度加至24孔细胞培养板中，置37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养过夜，待长成单层，每孔约含4×10⁵个细胞。都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS双基因缺失株培养条件同毒力试验，离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液(PBS)(8.0g NaCl，0.2gKCl，2.9gNa₂HPO₄·12H₂O，0.2gKH₂PO₄，加ddH₂O定容至1000mL)洗三遍，最后用不含血清和双抗的RPMI-1640(购自Sigma公司)重悬菌体，调整细菌浓度，以MOI＝10的感染比分别粘附和侵袭HEp-2细胞。计数4℃作用30min后粘附的细菌量以及37℃作用1h后侵袭的细菌量。同时以都柏林沙门氏菌单基因缺失株△phoQ和都柏林沙门氏菌亲本株为对照，制备方法同都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS。结果表明：都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS对HEp-2细胞的粘附力较都柏林沙门氏菌亲本株有明显降低，差异极显著(P<0.01)，如图9所示；都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS对HEp-2细胞的侵袭力较都柏林沙门氏菌亲本株和都柏林沙门氏菌单基因缺失株△phoQ均有明显降低，差异极显著(P<0.01)，如图14所示。

实施例3：

重组的都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS的免疫原性和免疫保护力：

本发明通过小鼠血清抗体水平、细胞因子水平和免疫保护等试验证明，都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS保留了良好的免疫原性和免疫保护力。

3.1都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS的免疫原性试验

都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS以1×10⁷CFU/mL剂量腹腔注射Balb/c小鼠，同时以都柏林沙门氏菌单基因缺失株△phoQ和磷酸盐缓冲液(PBS)组为对照，剂量和方法同都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS。一免后1周捕杀部分小鼠，眼眶采血收集血清，检测血清中细胞因子水平。剩余小鼠2周后用相同剂量二免。每次免疫后1周、2周后尾静脉负压采血，将血清进行抗体滴度测定。二免后2周捕杀剩余小鼠，取脾进行淋巴细胞增殖试验和脾细胞CD4+T细胞阳性率检测。

上述免疫小鼠的血清IgG抗体效价结果显示，都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS二免后2周达到最高水平，可有效刺激机体产生相应的体液免疫反应，如图15所示。免疫1周后小鼠血清中IFN-γ和TNF-α水平，二免后2周脾细胞增殖指数和CD4+T细胞阳性率均显著高于对照组(P<0.05)，表明都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS能够诱发机体产生高水平的细胞免疫应答，表现为免疫后IFN-γ浓度升高(见图16)、TNF-α浓度升高(见图17)、脾淋巴细胞增殖增加(见图18)、CD4+T淋巴细胞比例增加(见图19、20)。

3.2都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS免疫保护力试验

都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS以1×10⁷CFU/mL剂量腹腔注射Balb/c小鼠，二免后2周用不同剂量都柏林沙门氏菌亲本株攻毒，同时以都柏林沙门氏菌单基因缺失株△phoQ和磷酸盐缓冲液(PBS)组为对照，剂量和方法同都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS。

结果如表3显示，都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS免疫针对10LD₅₀的都柏林沙门氏菌亲本株攻击能提供100％保护，而都柏林沙门氏单基因缺失株△phoQ仅提供83％的保护；但两者均不能对100LD₅₀和1000LD₅₀的都柏林沙门氏菌亲本株攻击提供保护。

表3 都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS和△phoQ免疫小鼠保护试验结果

对都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS免疫保护效果进一步探索显示，都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS能够对50LD₅₀都柏林沙门氏菌亲本株提供83％的保护，且小鼠活力下降及病理变化等异常均明显比对照组轻微，如表4所示，证明都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS有较好的免疫保护力。

表4 都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS免疫小鼠保护试验结果

利用不同剂量鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌腹腔攻毒免疫过的小鼠，结果显示，都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS双基因缺失株能100％保护10LD₅₀鼠伤寒沙门氏菌攻击和33％保护10LD₅₀肠炎沙门氏菌攻击，结果如表5，说明都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS双基因缺失株同时有一定的交叉保护力。

表5 都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS免疫小鼠交叉保护试验结果

综上所述，本发明制备的都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS免疫能对10LD₅₀的都柏林沙门氏菌提供100％保护，对和10LD₅₀的鼠伤寒沙门氏菌攻击提供100％的交叉保护，对50LD₅₀都柏林沙门氏菌亲本株提供83％的保护，但10LD₅₀肠炎沙门氏菌攻击只能提供33％保护。

附录：

1、名词、术语解释在本说明书中：

(1)都柏林沙门氏菌双基因缺失株△phoQ-△rpoS有时简写为都柏林沙门氏菌双基因缺失株，双基因缺失株，或双缺失株或△phoQ-△rpoS，为同一菌株；

(2)都柏林沙门氏菌单基因缺失株△phoQ，有时会简写为都柏林沙门氏菌单基因缺失株或单基因缺失株，或单缺失株，为同一菌株；

(3)单基因缺失株或双基因缺失株在试验期间一般统称为重组菌(但标明菌名的除外)；

(4)都柏林沙门氏菌亲本株即都柏林沙门氏菌(菌株编号CICC21497，购自中国工业微生物菌株保藏中心)，有时会简写为亲本株、都柏林沙门氏菌、野生株、野生型、都柏林沙门氏菌，实质上为同一菌株；

(5)本说明书中的上游引物等同正向引物，下游引物等同反向引物；

(6)氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyl transferase)简称氯霉素抗性基因，英文缩写cat。

2、相关基因和引物插入位点的说明(引物序列说明)

(1)都柏林沙门氏菌(Salmonella Dublin)phoQ基因序列

来源：菌株str.CT_02021853(GenBank:Accession:CP001144.1)

phoQ在基因组中的位置：2048312..2049775

具体序列如下：

注：1)下划波浪线部分为phoQ基因序列，序列长度共1464bp，如序列表SEQ ID NO：12的序列相同。

2)双划线字体为含phoQ基因两端的同源臂引物部分(长度各为56bp)。

3)单划线字体部分为phoQ缺失前后相应的鉴定引物。

(2)都柏林沙门氏菌(Salmonella Dublin)rpoS基因相关序列及引物：

来源：菌株str.CT_02021853(GenBank:Accession:CP001144.1)

rpoS在基因组中的位置：(3109984..3110976),/gene＝"rpoS"

注：1)下划波浪线部分为rpoS基因序列，共993bp，如序列表SEQ ID NO：13的序列相同。

2)下双划线部分为含rpoS基因两端的同源臂引物部分(各56bp)。

3)下单划线字体部分为rpoS缺失前后相应鉴定引物。

(3)pKD46质粒上exo基因检测

基因序列来源：pKD46(GenBank基因登录号:AY048746)

pKD46质粒上exo基因检测引物，序列如下

pKD46-F:5’ATGTCCTACTTCCACACCCTGC3’

pKD46-R:5’GCTCCCCAAATACAAAACCAAT3’

扩增长度为508bp。

exo基因在基因组中的位置：2448-3128

exo基因序列(长度为681bp)如下(如序列表SEQ ID NO：14的序列相同)：

注：黑体下划线序列为exo基因上、下游引物位置

(4)模板质粒pKD3上的两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶基因(chloramphenicol acetyl transferase,简称cat基因)和引物

基因序列来源：pKD3(GenBank基因登录号:AY048742)

氯霉素乙酰转移酶基因位置：134-772(639nt)(下划波浪线标出)

FRT位置：51-84(34nt)；981-1022(42nt)(下双划线标出)

引物位置(用黑体字下单划线标注)，引物的序列如下：

上游引物(C1，C3)：5’GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC3’(31-50)

下游引物(C2，C4)：5’TATGAATATCCTCCTTAGTT3’(1023-1042)

cat基因序列如下(如序列表SEQ ID NO：15所示的序列相同)

31 GTGTAGGCTG GAGCTGCTTC GAAGTTCCTA

61 TACTTTCTAG AGAATAGGAA CTTCGGAATA GGAACTTCAT TTAAATGGCG CGCCTTACGC

121 CCCGCCCTGC CACTCATCGC AGTACTGTTG TATTCATTAA GCATCTGCCG ACATGGAAGC

181 CATCACAAAC GGCATGATGA ACCTGAATCG CCAGCGGCAT CAGCACCTTG TCGCCTTGCG

241 TATAATATTT GCCCATGGTG AAAACGGGGG CGAAGAAGTT GTCCATATTG GCCACGTTTA

301 AATCAAAACT GGTGAAACTC ACCCAGGGAT TGGCTGAGAC GAAAAACATA TTCTCAATAA

361 ACCCTTTAGG GAAATAGGCC AGGTTTTCAC CGTAACACGC CACATCTTGC GAATATATGT

421 GTAGAAACTG CCGGAAATCG TCGTGGTATT CACTCCAGAG CGATGAAAAC GTTTCAGTTT

481 GCTCATGGAA AACGGTGTAA CAAGGGTGAA CACTATCCCA TATCACCAGC TCACCGTCTT

541 TCATTGCCAT ACGTAATTCC GGATGAGCAT TCATCAGGCG GGCAAGAATG TGAATAAAGG

601 CCGGATAAAA CTTGTGCTTA TTTTTCTTTA CGGTCTTTAA AAAGGCCGTA ATATCCAGCT

661 GAACGGTCTG GTTATAGGTA CATTGAGCAA CTGACTGAAA TGCCTCAAAA TGTTCTTTAC

721 GATGCCATTG GGATATATCA ACGGTGGTAT ATCCAGTGAT TTTTTTCTCC ATTTTAGCTT

781 CCTTAGCTCC TGAAAATCTC GACAACTCAA AAAATACGCC CGGTAGTGAT CTTATTTCAT

841 TATGGTGAAA GTTGGAACCT CTTACGTGCC GATCAACGTC TCATTTTCGC CAAAAGTTGG

901 CCCAGGGCTT CCCGGTATCA ACAGGGACAC CAGGATTTAT TTATTCTGCG AAGTGATCTT

961 CCGTCACAGG TAGGCGCGCC GAAGTTCCTA TACTTTCTAG AGAATAGGAA CTTCGGAATA

1021 GGAACTAAGG AGGATATTCA TA

说明：本基因的序列长度共1012bp，包含FRT位点(以下双划线标注)和氯霉素乙酰转移酶基因(以下波浪线标注)和引物的序列(以下单划线标注)。

Claims (2)

1.一株都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)减毒力突变株S.dublinΔphoQ-ΔrpoS，其特征在于，该菌缺失全长phoQ和rpoS基因，不含外源基因,所述的都柏林沙门氏菌保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2014039。

2.一种预防犊牛副伤寒的基因工程疫苗，其特征在于该疫苗包含有权利要求1所述的都柏林沙门氏菌突变株S.dublinΔphoQ-ΔrpoS。