CN101720228A

CN101720228A - 用于预防或治疗病毒感染的活菌疫苗

Info

Publication number: CN101720228A
Application number: CN200780043473A
Authority: CN
Inventors: D·G·贝穆德斯
Original assignee: AVIDEX
Current assignee: AVIDEX
Priority date: 2006-09-22
Filing date: 2007-09-24
Publication date: 2010-06-02
Also published as: US8440207B2; US20160222393A1; US10626403B2; CA2700218A1; AU2007300519A1; US10087451B2; EP2081593A2; EP2081593A4; US20080124355A1; US20120142080A1; US20190017057A1; WO2008039408A3; RU2009115177A; WO2008039408A2; US20140220661A1; US9315817B2

Abstract

本发明提供了一种疫苗，其使用方法及试剂盒，它采用在在基因上隔离且稳定的减毒活菌株，其中包括沙门氏菌，所述减毒活菌株表达一或更多个禽流感病毒抗原，这些抗原用于活疫苗组合物中，所述组合物能够通过口服给予对象来防止防止禽流感。遗传稳定可以通过缺失IS200元件，细菌噬菌体和原噬菌体元件来实现。该菌株可以通过P22噬菌体阻遏物的组成型表达在遗传上与外部噬菌体感染隔离。编码抗原性血凝素和神经氨酸酶禽流感蛋白的核酸序列有至少一个经过修饰的密码子，当转移到原核生物体时，能实现所述核酸序列的最佳表达，以改善免疫原性。

Description

用于预防或治疗病毒感染的活菌疫苗

发明领域

本发明总体上属于活菌疫苗(live bacterial vaccine)用于病毒感染预防或治疗的领域。

发明背景

本文引用的参考文献中的任何引文和认定，或者本申请的任何部分，不应理解为构成本申请的现有技术。

有三种类型的流感病毒：甲型(A型)流感病毒，乙型(B型)流感病毒和丙型(C型)流感病毒。甲型和乙型病毒引起的疾病几乎流行于每一个冬天。在美国，这些冬季流感流行病可能会导致10％至20％的人感染，并且与每年平均36,000人死亡和114,000例住院治疗有关。丙型流感感染引起轻度呼吸疾病，而不会造成流行。基于病毒表面的两种蛋白质，流感甲型病毒可分为亚型。这些蛋白质被称为血凝素(H)和神经氨酸酶(N)。甲型流感病毒基于这两种蛋白质分为亚型。有16种不同的血凝素亚型H1，H2，H3，H4，H6，H7，H8，H9，H10，H11，H12，H13，H14，H15，H16和9种不同的神经氨酸酶亚型N1，N2，N3，N4，N5，N6，N7，N8，N9。所有这些都在野生鸟类的甲型流感病毒中发现。野生鸟类是甲型流感病毒所有亚型的主要天然宿主，被认为是所有其他动物中甲型流感病毒的来源。目前在人类身上发现的的甲型流感病毒亚型是A(H1N1)及A(H3N2)。乙型流感病毒没有亚型。

1918年，一种新的高致病性的H1N1型流感席卷全球，造成了估计两千万至五千万人死亡。该H1N1亚型持续到1957年，之后被H2N2亚型病毒代替，一直持续到1968年。从1968年开始，人群中发现存在H3N2病毒。由于H1N1病毒在1977年复发，两种甲型流感病毒目前正在一起传播(见Palese and Garcia-Sarstre J Clin Invest，July 2002，卷110，1号，9-13)。最初的1918年H1N1病毒的致病性都比任何之后的H1N1，H2N2或H3N2亚型病毒强，尽管一些亚型病毒造成的感染很严重并导致死亡。通过分子重建，现在已经获知包括H1和N1抗原的氨基酸序列的1918年流感的基因组(见Kaiser，Science 310：28-29，2005；Tumpey等，Science 310：77-81，2005)。

在1997年，2003年，又在2004年，抗原性不同的H5N1禽流感病毒出现，在大流行范围内威胁人类。在上述每个暴发期存在该禽流感病毒将适应在人与人之间传播的担心。此外，奥塞米韦(达菲

)对在泰国的50％的禽流感患者无效(Tran et al.N.Engl.J.Med 350：1179，2004)，并且神经氨酸酶中的一种新的突变已被确定能够对奥塞米韦耐药。神经氨酸酶基因的序列分析表明，在氨基酸274位酪氨酸替代了组氨酸(H274Y)，与在流感(N1)病毒对奥塞米韦有很强的耐药性有关(Gubareva等，Selection of influenza virus mutants inexperimentally infected volunteers treated with oseltamivir.J Infect Dis2001；13-523-531；de Jong等，Oseltamivir Resistance during Treatmentof Influenza A(H5N1)Infection.N.Engl.J.Med.353：2667-2672，2005)。这种变化可能会改变蛋白质的抗原性质并降低与新变种病毒不相匹配的疫苗的效力。其他有潜在危险的禽流感株包括H1N1，H7N7和H9N2。

最佳的处理人类大流行性病毒的方式是提供临床认可的较好匹配的疫苗(即含有新出现的人类大流行病毒株的血凝素和/或神经氨酸酶抗原)，但这在短期内不能轻易获得成功，因为在鸡卵中生产流感疫苗的传统方法非常耗时。

2.1活菌疫苗载体

减毒活菌疫苗载体提供了重要的替代传统的基于鸡卵法的疫苗生产方法。传统方法是，用作疫苗生产的流感病毒在鸡胚中生长，然后将尿囊液中的病毒纯化。最近，病毒已可以在培养的细胞系上生长，这就避免了对可以适应在鸡卵中生长的病毒株的需要，并且也避免了最终疫苗被来自鸡卵的蛋白污染。然而，因为一些疫苗病毒可能在狗的肿瘤细胞(比如狗肾细胞MDCK)中产生，人们担心疫苗被致癌因素污染。此外，所述的方法必须进行劳动密集和技术要求高的净化过程，总的生产时间为3至6个月。由于时间因素和生产规模扩大，这些疫苗生产数量很大，但批次有限。为适应在全世界范围内的需求，需要储存多个批次。因此，在流感大流行前，如果采用传统方法制备的疫苗可能是基于一年以前的禽流感病毒及其抗原，这有可能不能和新出现的变异病毒匹配并且可能导致只有部分能够保护。细菌载体在简单培养基中自我复制，能够呈指数级迅速增长并且只需要最低限度的净化，比如单次离心法或者在药学可接受的赋形剂中重悬浮。

人类的研究表明，人类流感病毒血凝素的抗体滴度是与防护作用有关的(血清样本血凝-抑制滴度约30-40时能产生大约50％的保护来免受同源病毒的感染)(见Potter&Oxford(1979)Br Med Bull 35：69-75)。抗体反应的测量通常是通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)，免疫印迹法，血凝抑制法，微量中和法，单辐射免疫扩散(SRID)，和/或单辐射溶血法(SRH)。这些检测技术是众所周知的。

沙门氏菌已被视为特别有用的口服疫苗的活“宿主”载体。因为这些细菌作为肠道微生物，当被摄入人类和动物体内时，能够在消化道(特别是肠道)感染并且持续存在。

由于很多沙门氏菌对大多数宿主是高致病性的，比如能造成人类或者其他哺乳动物伤寒或者严重腹泻，沙门氏菌菌株对接受疫苗成分的个体的毒性必须要减弱。细菌减毒不限于消除或者抑制任何特别的机制，也可通过沙门氏菌基因组中一个或多个基因突变来实现(其中可能包括染色体和非染色体遗传物质)。因此，“减毒突变”可以包括单点或多点突变，这些突变一起针对即将接受禽流感疫苗成分的具体宿主个体提供了减毒的表现型。近年来，开发了对个体(例如，人类或其他哺乳动物)致病性毒力减弱的各种各样的细菌，尤其是肠道沙门氏菌的血清变型，而且被提出用来开发各种活菌疫苗(见，例如，美国专利5389368；5468485；5387744；5424065；张-Barber等，Vaccine，17；2538-2545页(1999年)；所有参考明确地包括在此)。在沙门氏菌株的例子中，一些遗传位点的突变已被证明能减轻毒性，包括但不限于遗传位点phoP，phoQ，cdt，cya，crp，poxA，rpoS，htrA，nuoG，pmi，pabA，pts，damA，purA，purB，purI，zwf，aroA，aroC，gua，cadA，rfc，rjb，rfa，ompR，msbB及其组合。

细菌鞭毛已知是具有抗原性并且会发生抗原性变化或相变化，这被认为能帮助一小部分细菌逃避宿主的免疫应答。细菌鞭毛抗原被称为H1和H2抗原。为了避免与病毒血凝素H抗原混淆，细菌鞭毛H抗原称为fH。因为基于沙门氏菌的异种抗原的疫苗接种取决于细菌在消化道建群的能力，其可能因为原始免疫应答而减弱，第二次免疫的疫苗接种能力会由于载体的免疫应答而减小。沙门氏菌Hin转化酶属于重组酶家族，其中包括Mu噬菌体中的Gin转化酶，P1噬菌体中的Cin转化酶以及来自Tn3和的转位子的游离酶(Glasgow等，1989年，第637-659页。D.E.Berg，和M.M.Howe(编辑)，Mobile DNA。美国微生物学会，华盛顿特区)。Hin促进染色体DNA中996bp片段倒位，这个片段侧接hixL和hixR的26-bpDNA序列(Johnson和Simon，1985，Cell 41：781-791)。在鼠伤寒沙门氏菌中，以Hin介导的DNA倒位导致fH1和fH2鞭毛基因的另一种表达，被称为相变。Hin(21kDa)在溶液中以同型二聚体存在，并作为二聚体连到hix点(Glasgow等，1989年，J.Biol.Chem.，264：10072-10082)。除了Hin和两个hix点，体外有效倒位也需要顺势DNA序列(重组增强子)及其结合蛋白(Fis，11kDa)(Johnson等人，1986年，细胞46：531-539)。活沙门氏菌疫苗没有缺失hin基因，没有明确的fH1或fH2抗原，这些抗原也没能构建出，以至于它们完全缺乏fH抗原。相应的，活沙门氏菌疫苗尚未构建成用于最大化激发-加强策略，即改变或者消除fH抗原，由此第一次免疫(激发)的fH抗原的免疫应答对第二次免疫(加强)的抗原不特异。因此，加强免疫没有被免疫系统迅速消除，从而能够持续更长，更有效呈递免疫抗原。

将病毒基因注入细菌可以产生基因改造的微生物(GEMs)，对这些微生物可能有关于其环境中的导入基因的污染和再分类(reassort)能力的考虑。如果允许这些基因在一些情况下重组，而且在这些情况下细菌疫苗可以与野生型病毒感染在同一时间在同一个体出现，那么在理论上可以给非病原性或低病原性病毒株提供毒力因子。因此，减少细菌重组和增加细菌遗传隔离的方法是可取的。

插入序列(IS)是可以将自身拷贝插入到基因组不同位置的基因元件。这些元件可以介导各种染色体重排，包括倒位，缺失和环状DNA片段的融合，和改变相邻基因的表达。IS200元件在许多沙门氏菌中发现。伤寒沙门氏菌菌株LT2有六个IS200。鼠伤寒沙门氏菌株14028在中心体17.7有一个额外的IS200元件，而在其他通常用来研究的沙门氏菌株LT2和SL1344没有所述元件(Murray等人，2004年，Bacteriology，186：8516-8523)。这些作者描述了一个自发的从Cs17.7到Cs 19.9区域的缺失活跃区(高频)。活沙门氏菌疫苗没有限制这种重组活动的IS200元件的缺失。

沙门氏菌菌株拥有噬菌体和原噬菌体元件。这种噬菌体往往能够切除及感染其他易受感染的菌株，并进一步通过已知的转导作用从菌株转移基因。活沙门氏菌疫苗没有噬菌体元件缺失，所述元件如沙门氏菌中的噬菌体重组酶，由此这种噬菌体不再能够切除和感染其他易感染菌株。

沙门氏菌株已知能被细菌噬菌体感染。这种噬菌体能潜在地把遗传物质从一个沙门氏菌株携带到另一个沙门氏菌株。活沙门氏菌疫苗还没有什么机制来限制噬菌体感染，比如P22噬菌体阻遏者C2的植入和组成性表达。

Heiland和Getbing(Nature，292：581-582，1981年)以及Davis等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5376-5380)第一次描述了病毒血凝素基因的细菌表达。这些作者认为，不用考虑病毒遗传位点不适合细菌最佳表达这个事实，重组蛋白可以作为疫苗。这些作者没有建议使用或细菌载体作为疫苗载体，如本发明的遗传稳定且分离的载体，也没有建议使用所述的鞭毛抗原或者无鞭毛抗原。这些作者也没有建议使用分泌蛋白。

在活细菌载体中使用分泌蛋白已经被一些作者证实过。Holland等(美国专利5,143,830，参考明确包括于此)已经展示说明了溶血素A(hlyA)基因C端部分的融合。当在溶血素蛋白质分泌通道(hlyBD)存在下表达时，异源融合物很容易从细菌分泌。类似的，Galen等(Infection and Immunity，2004年，72：7096-7106)表明与ClyA的异源融合物可分泌并具有免疫原性。其他异源蛋白分泌系统包括使用自主转运子家族。比如Veiga等(2003 Journal of Bacteriology，185：5585-5590)论证了含有淋病奈瑟球菌中免疫球蛋白A(IgA)的蛋白酶的b-自动转运子结构域的杂合蛋白质。

病毒血凝素基因的细菌表达是最先被Heiland和Gething(Nature，292：581-582，1981年)和Davis等(Proc.Natl.Acad.Sci.美国78：5376-5380)描述的。这些作者教导，抗原可从细菌纯化以用作疫苗，而且没有建议使用减毒活细菌载体。此外，病毒基因组的密码子使用对细菌表达没有达到最佳化。因此，诸如大肠杆菌和沙门氏菌的肠杆菌科革兰阴性菌会倾向使用不同的密码子(国立医学图书馆，国家生物技术信息中心，Genbank数据库通报150.0[2005年11月25号])，而且不会发生密码子优化。此外，这些作者使用了还有抗生素的质粒，并没有使用稳定的染色体定位。这些作者也没提示异源融合物使细菌分泌抗原。

Kahn等人(EP No 0863211)建议通过使用活细菌疫苗同时使用大肠杆菌亚硝酸盐还原酶启动子nirB在体内产生诱导。这些作者还认为，抗原决定子也许是来自病毒，包括流行性感冒病毒的一种抗原序列。然而，Khan等没有描述禽流感病毒疫苗。他们没有说明针对禽流感病毒，血凝素和神经氨酸酶的适当抗原，也没有说明如何从基因上匹配新出现的禽流感病毒。此外，已明显的是，Khan等描述的关于活禽流感疫苗的某些假设和实验设计在基因上不是隔离的，也没有改进遗传稳定性，从而不能提供一种能用于人类的禽流感活疫苗。例如，Khan等声称，任何一种具有减弱毒力的已知菌株可以通过基因改造并应用为活细菌载体(细菌载体)，这种载体表达抗原多肽以引起免疫应答，包括减毒的鼠伤寒沙门氏菌菌株，以及给人类使用的减毒伤寒沙门氏菌(即伤寒杆菌)。为了支持这种广泛的教导，他们指出“非逆转”突变的重要性，尤其是提供减毒的缺失突变。然而，非逆转只涉及到特定变异基因，而不是基因组本身及能够使得各种基因重组和/或甚至转导到其他菌株的各种IS200，噬菌体和噬菌体元件。Khan等没有描述遗传稳定性改进的菌株，也没有描述减少基因重组的方法，比如缺失IS200元件。Khan等没有描述通过细菌噬菌体和原噬菌体元件缺失来改进遗传稳定性的菌株，也没有描述限制其转导能力。Khan没有描述最小化细菌基因交换的方法，比如P22C2噬菌体阻遏物的组成型表达。

上述评论表明，Khan等人尚没有提供抗禽流感的有效疫苗。显然，需要针对禽流感病毒的基因隔离且稳定的，并且能够快速在基因上匹配新出现的致病性变异体的口服疫苗。

发明内容

本发明提供减毒活菌株，其表达病毒特别是禽流感病毒的一个或多个免疫原性多肽抗原，能有效地提高哺乳动物的免疫应答。

具体地，本发明的一个方面涉及到减毒活菌株，包括载有禽流感抗原的沙门氏菌，其可以口服给药个体引起免疫应答，以保护个体对抗禽流感。

优选细菌是沙门氏菌的血清变型。优选，该细菌与感染性细菌噬菌体遗传分离并具有改善的遗传稳定性，这可通过缺失IS200和噬菌体元件实现。优选的沙门氏菌株通过在遗传位点的突变减毒，所述突变单独或组合地提供足够的减毒作用，所述菌株还具有确定的鞭毛抗原以改善激发/加强策略。减毒突变可以是菌株中已知在人中具有一定程度安全性的那些突变，包括但不限于Ty21a，CMV906，CMV908，CMV906-htr，CMV908-htr，Ty800，holavax，M01ZH09或VNP20009或可能是新的突变组合。

虽然目前的医疗实践中使用鸡卵中的致病性禽流感毒株衍生物来提供疫苗，所述疫苗产生免疫应答，其中包括在人类或其他哺乳动物中对抗已知的致病性禽流感毒株的抗体，本发明提供的方法和组合物涉及基因隔离的且基因稳定性增强的细菌载体，其载有禽流感病毒抗原，以针对新出现的致病人毒株提供保护作用。

此外，尽管现有技术没有实现疫苗株和靶株之间的密切抗原匹配，本发明的目标是基于病毒致病性的疫苗株，并产生与出现的病原体的抗原谱更密切匹配的有效疫苗。由于本发明需要对出现的毒株的抗原谱的详细了解，所述疫苗可在需要时制备出来以降低不匹配的疫苗的风险以及人类大流行爆发中出现部分保护的可能效果。由此本发明提供了保护人类患者免受新出现的禽流感病毒毒株感染的疫苗。

优选，本发明的疫苗包含遗传稳定的细菌载体，其携带来自可导致高致病性禽流感的禽流感毒株的一或多个抗原。

本发明进一步优选提供针对奥塞米韦耐药株的疫苗。

因此，当口服给予个体时，本发明经遗传改造表达一个或多个禽流感抗原的活沙门氏菌疫苗具有这样的固有能力，其可在肠道中建立群体(感染)，并且如果适当改造，可提供理想的免疫原性禽流感抗原多肽来源，从而在个体的粘膜组织中激发免疫应答。

抗原可激发患者中的抗体反应，所述抗体反应能高效中和新出现的禽流感疫苗株，以及中等效力地中和新出现的异源禽流感疫苗株。优选，新出现的禽流感疫苗可以为与目前的致病性禽流感毒株相同的血凝素或神经氨酸酶类型(即，H1型，H5型，H5型(H274Y)，H7型或H9和/或N1，N2或N7)。

所述活疫苗组合物适合口服给予个体以提供抗禽流感保护作用。优选，疫苗组合物包含本发明所述的活细菌在生理学可接受缓冲液或盐水溶液中的悬液，其可经个体的口吞服。然而疫苗组合物经口服给予个体也包括但不限于，通过鼻饲管或胃造口管给予本发明所述的细菌疫苗株的悬液以及给予可将活细菌疫苗株释放到个体下段肠道的栓剂。本发明的疫苗可配制成通过其它各种途径递送，例如通过肌内注射，皮下递送，鼻内递送(如WO02/074336，US6635246)，皮内递送(如WO02/074336，WO02/067983，WO02/087494，WO02/0832149WO04/016281)，透真皮递送，透皮肤递送，局部途径等。注射可涉及针(包括微型针)，或可无针。

年度(annual)人流感疫苗通常包括一种以上的流感毒株，常用三价疫苗(如：两个A型流感病毒抗原，一个B型流感病毒抗原)。但是在大流行时，可使用单一的单价株。因此，上述致病性禽流感抗原可以是本发明疫苗中唯一的流感抗原，或者所述疫苗可还包括来自一或多种(例如1，2，3，4或更多种)年度流感病毒株的抗原。本发明具体的疫苗包括：(i)包含致病性禽流感抗原作为唯一流感抗原的疫苗；(ii)包含致病性禽流感抗原加上来自其他致病性禽流感株(例如，H1N1，H5N1，H7N7，H2N9，H9N2)的抗原的疫苗。

本发明的疫苗使用一个或多个禽流感抗原，以保护患者免受能人人传播的流感病毒株的感染，所述的病毒株即能在给定人群中呈几何或指数传播而不需要身体接触的毒株。患者也能受到对抗下述毒株的保护，所述毒株来自鸟类而非其他人(即鸟到人传播)并可感染并导致人类疾病。本发明对于抗大流行、新发大流行和将来出现的大流行人毒株的保护作用尤其有效，例如用于抗H5和N1流感亚型的保护作用。根据具体的季节以及包含在疫苗中的抗原的性质，本发明可针对任何血凝素亚型包括H1，H2，H3，H4，H5，H6，H7，H8，H9，H10，H11，H12，H13，H14，H15和H16或各种神经氨酸酶亚型包括N1，N2，N3，N4，N5，N6，N7，N8和N9提供保护作用。使得流感病毒能导致大流行的特性包括：(a)它包含与现在传播的人毒株的血凝素不同的新的或抗原改变的血凝素，即在人群中超过十年不显著的类型(如H2)，或以前在人群中根本没有见过(如H5，H6或H9，其一般只存在于鸟类种群)使得人群对该毒株血凝素在免疫学上处于初始状态或者是通过氨基酸序列或糖基化发生改变而具有改变的抗原性的亚型；(b)它能够在人群中水平传播；(c)能够从动物(包括禽类，狗，猪)传染给人类；和/或(d)它是对人类致病性的。

作为优选体现本发明对抗能人-人或禽-人或禽-禽传播的毒株的实施方案，本发明在这方面的一个实施方案包括来自哺乳动物(例如人)流感病毒的至少一种基因以及来自禽或非人脊椎动物的一种基因。符合本发明多个方面的疫苗由此可包括来自禽流感病毒株的抗原。该毒株通常是能导致高致病性禽流感(HPAI)的毒株。HPAI是确定的疾病(Alexander Avian Dis(2003)47(3Suppl)：976-81)的特点是突然发作，严重的疾病以及受影响的鸟类/家禽迅速死亡，死亡率可以达到100％。低致病性(LPAI)和高致病性毒株容易辨别，例如范德尔固特等(Epidemiol Infect(2003)131(2)：1003-13)进行了低和高致病禽流感H5N2病毒株的传播特点的比较研究。2004年HPAI毒株的例子是H5N1A型流感病毒，例如A/越南/I 196/04毒株(也称为A越南/3028/2004或A/越南/3028/04)。本领域技术人员能鉴定或预测未来出现的HPAI毒株以及其H和N抗原的DNA序列和氨基酸组成。禽流感毒株可能为任何合适的血凝素亚型，包括H1，H2，H3，H4，H5，H6，H7，H8，H9，H10，H11，H12，H13，H14，H15或H16。禽流感毒株还可为任何适合的神经氨酸酶亚型N1，N2，N3，N4，N5，N6，N7，N8或N9。本发明的疫苗可以包括两或两种以上的(即二，三，四或五种)禽流感血凝素和神经氨酸酶抗原。这种禽流感病毒株可能包括相同或不同的血凝素亚型和相同或不同的神经氨酸酶亚型。

优选的疫苗组合物含有足够量的表达抗原的活细菌以在患者体内产生免疫应答。因此，本发明的减毒沙门氏菌是安全和有用的活菌疫苗，可口服给予给提以提供抗禽流感免疫力，由此提供抗禽流感保护作用。

虽然不希望受任何具体机制的限制，通过口服给予遗传改造的沙门氏菌减毒株来激发人体内的有效抗禽流感抗原粘膜免疫应答可归因于所述突变毒株在肠道内的持续存在的能力。每种用于本发明的质粒携带表达抗原的质粒或者染色体整合的盒，其编码并指导存在本发明的减毒沙门氏菌内的一或多个禽流感病毒抗原的表达。如上所述，本发明中的禽流感抗原包括H1和H5，H5型(H274Y)，H7或H9抗原多肽(或免疫原性部分)，N1，N2或N7抗原多肽(或免疫原性部分)，以及包含框内连接抗原肽的异源分泌肽的融合多肽。

肠道沙门氏菌血清变型可以用作本文所述的或疫苗组合物的减毒细菌，包括但不限于活疫苗组合物，肠道沙门氏菌血清变型Typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))，蒙得维的亚沙门氏菌(Salmonella montevideo)，肠道沙门氏菌血清变形Typhi(伤寒沙门氏菌(″S.typhi″))，肠道沙门氏菌血清变型Paratyphi B(副伤寒沙门氏菌B(S.paratyphi B))，肠道沙门氏菌血清变型Paratyphi C(副伤寒沙门氏菌C(S.paratyphi C))，肠道沙门氏菌血清变型Hadar(S.hadar)，肠道沙门氏菌血清变型Enteriditis(肠炎沙门氏菌(S.enteriditis)，肠道沙门氏菌血清变型Kentucky(肯塔基沙门氏菌(S.Kentucky))，肠道沙门氏菌血清变型Infantis(婴儿沙门氏菌(S.infantis))，肠道沙门氏菌血清变型Pullorum(鸡白痢沙门氏菌(S.pullorum))，肠道沙门氏菌血清变型Gallinarum(鸡沙门氏菌(S.gallinarum))，肠道沙门氏菌血清变型Muenchen(慕尼黑沙门氏菌(S.muenchen))，肠道沙门氏菌血清变型Anaturn(鸭沙门氏菌(S.anatum))，肠道沙门氏菌血清变型Dublin(都柏林沙门氏菌(S.Dublin))，肠道沙门氏菌血清变型Derby(德比沙门氏菌S.derby″)，肠道沙门氏菌血清变型Choleraesuis变体kunzendorf(″S.cholerae kunzendorf)，以及肠道沙门氏菌血清变型Minnesota(明尼苏达沙门氏菌(S.Minnesota))。

例如，本发明的活禽流感疫苗包括已知菌株鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和伤寒沙门氏菌(S.typhi)，其经过本发明所述的进一步修饰形成适合的疫苗用于预防和治疗禽流感。这种菌株包括y21a，CMV906，CMV908，CMV906-htr，CMV908-htr，Ty800，aroA-/serC-，holavax，M01ZH09，VNP20009。

新菌株还包括那些通过多个代谢和结构基因的突变而在毒力方面减弱的那些。因此，该发明提供了活疫苗组合物用于提供抗禽流感保护作用，其中包括作为肠道沙门氏菌血清变型的减毒活细菌，所述细菌染色体的基因座中包括减毒突变，其使得所述细菌的毒力减低并且所述减毒突变是Suwwan缺失(Murray等人，2004年)或与其他已知的减毒突变的组合。沙门氏菌菌株中其他有用的减毒突变可能在选自组成的phoP，phoQ，edt，cya，crp，poxA，rpoS，htrA，nuoG，pmi，pabA，pts，damA，purA，purB，purI，zwf，purF，aroA，aroB，aroC，aroD，serC，gua，cadA，rfc，rjb，rfa，ompR，msbB及其组合的基因座中。

这项发明也可以提供一种方法来制备遗传稳定的细菌疫苗用于为人患者提供抗禽流感病毒株的保护作用，包括对来自禽流感病毒株的抗原进行遗传改造，使得高致病性的禽流感病毒包含细菌质粒表达载体或染色体定位表达载体中的细菌密码子优化的表达序列，并进一步含有改造的限制性核酸内切位点使得细菌密码子优化的表达基因包含这样的亚组分，其可容易并迅速地交换，以促进遗传亚组分的快速交换，获得与新出现的禽流感病原体较好匹配的抗原。所述质粒和/或染色体表达构建体可进一步改造以导致病毒抗原的分泌。该疫苗给予患者后激发能中和所述禽流感病毒株的抗体反应。

本发明还提供用于产生表达一或多种流感抗原的细菌载体的方法和组合物，其中所述细菌载体在IS200元件中具有一或多个缺失，导致遗传稳定性增强。所述组合物和方法包括具有IS200元件中的缺失的菌株，使得所述菌株不能利用IS200元件进行基因重组。所述缺失可在任何一或多个IS200元件中产生，随后利用标准基因技术确认。

本发明也可以提供用于产生表达一或多个禽流感抗原的遗传稳定的细菌载体的方法和组合物，其中所述细菌载体在细菌噬菌体或原噬菌体元件中具有一或多个缺失，所述缺失增强基因稳定性并防止噬菌体切除。所述组合物和方法包括具有在细菌噬菌体或原噬菌体元件中的一或多个缺失，使得所述细菌不能利用细菌噬菌体或原噬菌体元件进行基因重排。所述缺失在任何细菌噬菌体或原噬菌体元件中产生，随后利用标准基因技术确认。所述菌株具有降低的将基因向其他菌株转导的能力。

本发明还提供了用于产生表达一或多个禽流感病毒抗原的细菌载体的方法和组合物，其中所述细菌载体组成性表达P22噬菌体的C2抑制物，因此防止了新的噬菌体感染和可能由这些噬菌体引发的噬菌体转导。

活沙门氏菌疫苗不具有hin基因缺失和特定的fH1或fH2抗原，所述抗原也没有被构建因而所述的疫苗完全缺失fH抗原。因此，早期的活沙门氏菌疫苗没有被构建成最大化激发-加强策略，其需要改变或去除fH抗原，由此第一次免疫(激发)的fH抗原的免疫应答对于第二次免疫(加强)的抗原而言不是特异性的。因此，加强免疫没有通过免疫系统的快速消除而降低，由此能持续较长时间并更有效呈递免疫用的异源禽流感病毒抗原。

本发明一个实施方案提供了用于制备表达一种或多种禽流感抗原的细菌载体的方法和组合物，所述细菌载体含有特定的鞭毛H抗原(fH)。所述的组合物和方法包括具有在Hin重组酶基因中的缺失的细菌菌株，所述缺失使得所述细菌不再能在fH1和fH2抗原之间转变。所述缺失在fH1或fH2血清学确定的菌株中产生，并在缺失或破坏hin重组酶基因之后重新确认。本发明还提供用于制备下述细菌载体的方法和组合物，所述细菌载体缺乏通过缺失fliBC基因(即fH0)产生的鞭毛抗原。因此，提供了用于激发/加强策略的改良的组合物，其中第二次免疫包括给予其中的fH抗原组合物与第一次免疫不同的疫苗。

本发明还提供用于保护人患者抵抗禽流感毒株感染的方法，采用改进的激发/加强策略，包括以下步骤：给予患者这样的疫苗，其包含来自可导致高致病性禽流感或1918流感的禽流感病毒株的抗原，所述抗原位于表达一或多个禽流感抗原的细菌载体内，所述细菌载体具有规定的fH抗原或不具有fH抗原(即fH1，fH2，fH0)。本发明还提供了给予第二种表达一或多种禽流感抗原的第二种细菌载体的方法，包括第二个步骤，其中第二次给药这样的细菌载体，所述细菌载体具有确定的fH抗原，其是与第一次给药的fH抗原不同的fH抗原组合物或无fH抗原。第二次给药包括这样的细菌疫苗，其中第一次疫苗给药是本发明的细菌疫苗或是本发明之外的其他疫苗，例如另一种细菌疫苗或基于鸡卵的疫苗。

类似地，这项发明也同样提供了试剂盒，包括(a)第一个试剂盒，包含一种来自致病性禽流感菌株的细菌表达密码子最优化抗原，其中含有包含在细菌蛋白表达质粒或细菌染色体蛋白表达载体中的独特的基因改造限制性位点和(b)第二个试剂盒，包含具有一或多种鞭毛抗原(例如，fH1，fH2或fH0)的细菌载体。成分(a)可以通过标准的体外分子技术经基因改造后匹配新出现的禽流感病毒，并且可以和组分(b)组合以产生一种或多种含有特定的鞭毛抗原的细菌菌株，从而构成一种活疫苗。该试剂盒提供的鞭毛抗原的多样性提供了多于一种的活疫苗菌株，其中利用一种菌株的第一次免疫(激发)之后在适当的时间例如2-4周之后进行利用第二种菌株的第二次免疫(加强)，所述第二种菌株具有不同的fH抗原或不具有fH抗原。这种活疫苗组合物适合给予口服给药个体以提供抗禽流感保护。

优选，疫苗组合物包含位于生理上可接受的缓冲液或盐水溶液中的本文的活细菌混悬物，可经个体的口吞服。然而，疫苗组合物口服给予个体也包括但不限于通过鼻饲管或胃造口管给予细菌疫苗株的混悬物以及给予将活细菌疫苗株给予个体下段肠道的栓剂。

4.定义

为了让本发明更易理解，一些用语定义如下：

本发明使用的“减毒的”、“减毒作用”以及类似用语是指细菌在特定宿主如哺乳动物中的天然毒性的消除或减少。“毒性”指致病微生物在宿主生物体中产生疾病的能力程度。一种细菌可能对一种宿主生物体(如小鼠)有毒性却对另一种(如人)无毒性。因此，广泛意义上，“减毒的”细菌或菌株应当对于至少一种下述的宿主生物体毒力减弱，所述宿主生物体对于该细菌或菌株的毒力形式的感染和疾病敏感。本发明术语“基因座”是广泛的术语，并包含用语是一个很广泛的用语，包括基因组(某一生物体中所有的遗传物质)或染色体及复制性核酸分子(如质粒)的具体核苷酸序列中任何指定的位点，包括但不限于基因、(蛋白或RNA的)核苷酸编码序列、操纵子、调控子、启动子、调节位点(包括转录终止位点，核糖体结合位点，转录抑制物结合位点和转录激活物结合位点)、复制起点、顺反子间区和其中的部分。基因座可以用本领域已知的多种体内外方法鉴定和确定，包括但不限于接合研究、交换频率、转化分析、转染分析、限制性酶定位技术、核酸杂交分析、聚合酶链反应(PCR)技术、核酸酶保护测定和直接核酸序列分析。术语“感染”，具有本领域技术人员常用的含义，包括微生物于机体(“宿主”，“个体”或“病人”)体内或体表的侵入和扩增，表现或不表现为疾病(参考前述“毒性”)。感染性微生物包括致病的病毒，如感染无保护的个体时可造成严重疾病的禽流感病毒。感染可以在个体体内或体表的一个或多个部位发生。感染可以是无意的(如误食、误吸、伤口感染等)，也可以是有意的(如活疫苗给药，致病性疫苗实验性攻击)。在脊椎动物宿主如哺乳动物中，感染部位包括(但不限于)呼吸系统、消化道(肠)、循环系统、皮肤、内分泌系统、神经系统和细胞间隙。感染性生物体的一定程度和形式的复制和扩增对于其在感染部位的维持是必需的。然而在感染性微生物中，复制的差别可能很大。因此，感染性微生物的复制包括在特定部位的持续的微生物扩增和短时的微生物维持。虽然致病微生物对宿主的“感染”由于在宿主中可能致病是不可取的，用本文所述包含基因改变的减毒沙门氏菌菌株的活疫苗是可取的，这是因为所述菌株激发对导致人和其他哺乳动物中的禽流感的禽流感病毒抗原的保护性免疫应答的能力。本发明术语“疾病”和“失调”和本领域技术人员通常理解的意思相同，包含任何宿主个体功能或健康异常的情形。医师对特定的疾病如禽流感的诊断可以包括直接测试和/或综合考虑一种或多种诊断测试的结果。

“活疫苗组合物”，“活疫苗”，“活菌疫苗”以及类似的用语指含有活沙门氏菌，所述菌株表达至少一种禽流感抗原(如H抗原、N抗原或者是其组合物)的组合物，对个体用药后，所述细菌在个体内引起抗沙门氏菌所表达的禽流感抗原的免疫应答，因此产生至少是部分对禽流感病毒的保护性免疫。这样的保护性免疫可以通过一系列可观测到的情形印证，包括但不限于减轻一到多种疾病症状(如呼吸窘迫、发热、疼痛、腹泻、出血、淋巴结发炎、虚弱、萎靡)，减少病愈时间，减轻组织损伤，健康组织再生，清除体内致病微生物和增强个体舒适感。虽然人们抱有很高期望，但本领域技术人员都理解，不可能利用疫苗在每个给药个体内激发对某种疾病的完全保护，或是保护性免疫伴随个体一生而期间不需要间断地“加强”给药。另外，这样一种活疫苗也可能在医师指导下谨慎用于无禽流感症状但具有感染风险或已知已经暴露于禽流感病毒的个体，所述暴露例如接近或接触禽流感病人或病毒污染的空气、水和表面。

“口服”，“经肠”，“经肠道”，“通过口服”，“非肠外”，“非肠外地”和其他类似的用语，是指通过消化道方式对个体给药或制剂。“口服的”疫苗制剂给药途径例子包括经口吞服液态或固态疫苗组合物，通过鼻饲管或胃造口术管施加免疫组合物，经十二指肠内给予免疫组合物，和直肠给药(例如使用栓剂释放上述活细菌疫苗菌株至消化道的下段肠道部分)。

用语“重组的”被用来形容非自然改变和操纵的核酸，用外源核酸转化、电穿孔或外源的细胞，或者非自然表达产生的多肽，例如通过单独的核酸处理和细胞转化。“重组子”特别指至少是部分在体外使用基因工程技术构建的核酸分子，而用“重组子”这个词作形容词时用来描述分子、构建体、载体、细胞、多肽或多核苷酸时特别排除了自然存在形式的分子、构建体、载体、细胞、多肽或多核苷酸。

框或表达框，用来描述这样的核酸序列，包括(i)编码启动子的核苷酸序列，(ii)位于编码启动子的核苷酸序列5’端的第一个独特的限制性酶切位点和(iii)位于编码启动子的核苷酸序列3’端的第二个独特的限制性酶切位点。表达框还可以在5’和3’限制性内切酶酶切位点之间包含多克隆位点(MCS)和转录终点。所述框还包含感兴趣的克隆基因。

这里的用语“沙门氏菌”是指一种肠道沙门氏菌的血清变型。许多肠道沙门氏菌的血清变型是已知的，而本项发明中特别有用的沙门氏菌是肠道沙门氏菌的鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌的减毒菌株。而用语“菌株”和“分离株”是同义的，都是指一种特别分离出来的细菌和它的基因相同的子代。人们开发或分离的具体细菌的实例用具体的字母和数字序列指代(如：菌株Ty21a，CMV906，CMV908，CMV906-htr，CMV908-htr，Ty800，holavax，M01ZH09，VNP20009)。

其他用语的定义和这个领域内专业人士公认理解无异，或者根据语境可明显看出。本发明为防护禽流感提供了活疫苗组合物，其中含有基因改造后的活肠道沙门氏菌血清变型，可以在体内表达一种或多种禽流感抗原多肽诸如H1，H5，H5(H274Y)，H7或H9和N1，N2和N7抗原。

附图简介

图1显示修饰过的ptrc99a质粒。

图2A和B显示能够在细胞质中表达H5或N1抗原的质体载体。

图3显示经修饰的具有独特限制点的ptrc99a质粒，其中该限制位点被改造成N1基因的编码序列，用来快速交换突变，如H274Y。

图4A显示质体载体，其表达分泌形式的H5或N1抗原作为与hlyA蛋白的融合物。

图4B显示质体载体，其表达分泌HlyA和HlyA融合蛋白必需的HlyB和HlyD基因。

图5显示质体载体，用来表达作为ClyA融合物的抗原(如H5型或N1)。

图6显示质体载体，用来表达作为自主转运子融合物的抗原(如H5型或N1)。

图7显示质体载体，用来表达作为大肠杆菌素E3融合物的抗原(如H5型或N1)。

图8A显示选择5′和3′DNA片段构建pCVD442染色体整合载体。8B显示用于破坏染色体基因并能整合新基因到染色体的载体。

图9显示从A)合成的基因表达载体克隆基因到B)染色体定位载体。

图10显示PCR法测定IS20017.7和9.19重排/缺失。

图11显示在缺乏17.7 Cs IS200的菌株中实现Suwwan缺失的一种方法。

发明详述

本发明是建立在细菌载体与蛋白质表达技术的组合的基础上，产生快速应答禽流感病毒和其高致病性衍生物的独特的疫苗。本发明涉及按照细菌密码子优化的禽流感病毒和人流感病毒基因的构建，以及将其掺入沙门氏菌作为预防禽流感和其高致病性衍生物的治疗性用途。本文的细菌中的抗原表达质粒或者染色体构建体也可在与质粒上具体的核苷酸序列的3’末端相邻处包含一或多个转录终止子，以防止转录到质粒或者染色体结构上所不期望的其他区域。这样的转录终止子因此就防止了转录延伸至质粒上的其他功能区域从而潜在地干扰质粒的其他主要功能，如复制和基因表达。这里所说的抗原表达质粒中可能用到的转录终止子包括但不限于5S核糖体RNA细菌基因的T1和T2转录终止子(见例如图1-5；Brosius and Holy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6929-6933(1984)；Brosius，Gene，27(2)：161-172(1984)；Orosz et al.，Eur.J Biochem.，20(3)：653-659(1991))。

减毒细菌宿主中的突变可通过将同源重组构建体整合进入染色体或内源性沙门氏菌毒性质粒中来产生(Donnenberg and Kaper，1991；Low et al.(Methods in Molecular Medicine，2003))。在这个系统中，选用自杀性质粒通过第一次同源重组事件整合进入染色体，然后是第二次同源重组事件，其使得稳定整合进入染色体。表达抗原的染色体整合构建体包含一或多个编码一或多个多肽的核苷酸序列，从而包含一或多个禽流感抗原，诸如来自禽流感病毒或其高致病性衍生物的血凝素或神经氨酸酶多肽抗原。所述编码序列可操作连接与转录启动子，其在沙门氏菌中即使当所述菌株被摄入例如当本发明的或疫苗组合物口服给予个体时仍然有功能。多种天然存在的、重组的、和半合成的启动子已知在肠道细菌诸如大肠杆菌和沙门氏肠杆菌血清变型中有功能(见例如Dunstan et al.，Infect.Immun.，67(10)：5133-5141(1999))。在本发明中用到的启动子包括但不限于那些常见并且被广泛应用的基因表达启动子，比如天然存在的乳糖操纵子中的Plac和半合成的Ptrc(见例如Amman et al.，Gene，25(2-3)：167-178(1983))、Ptac(见例如Aniann et al.，Gene，69(2)：301-315(1988))、PpagC(见例如Hohmann et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92.2904-2908(1995))、PpmrH(见例如Gunn et al.，Infect.Immun.，68：6139-6146(2000))、PpmrD(见例如Roland et al.，J Bacteriol.，176：3589-3597(1994))、PompC(见例如Bullifent et al.，Vacccine，18：2668-2676(2000))、PnirB(见例如Chatfield et al.，Biotech.(NY)，10：888-892(1992))、PssrA(见例如Lee et al.，J Bacteriol.182.771-781(2000))、PproU(见例如Rajkumari and Gowrishankar，J Bacteriol.，183.6543-6550(2001))、Pdps(见例如Marshall et al.，Vaccine，18：1298-1306(2000))以及PssaG(见例如McKelvie et al.，Vaccine，22：3243-3255(2004))。一些启动子是可调控的，需要一些种类的活化物或诱导物分子存在以转录其可操作连接的编码序列。然而，一些启动子为在大肠杆菌中的可调节或诱导启动子，但在沙门氏菌中不可调节。所述启动子的实例是已知的trc启动子(即”Ptrc”，参考Amman et al.，Gene，25(2-3)：167-178(1983)；Pharmacia-Upjohn)。与Plac和Ptac一样，Ptrc在大肠杆菌中是可诱导启动子(诱导物例如异丙基-β-D-半乳糖苷，即”IPTG”)，然而没有LacI阻遏物的沙门氏菌中，Ptrc就成为了一个有效的组成型启动子，可以容易地转录这里所说的抗原表达质粒上的含禽流感抗原的多肽编码序列。因此，在沙门氏菌中，这样一个组成型启动子不用依靠活化物或诱导物分子的存在就能表达含有抗原的多肽。

被整合到活疫苗株中的禽流感抗原表达型染色体整合构建体也含有复制起点，使得前体质粒能在有λpir元件(lamda pir element)的细菌中维持多个拷贝。在DNA克隆过程中，许多能在沙门氏菌中复制的多拷贝质粒是技术上所熟知的，用来维持质粒多拷贝的各种复制起点也是这样。优选的、适用于本发明的多拷贝抗原表达型质粒的复制起点包括多拷贝载体pBR322的复制起点(“pBR起始位点”，参考Maniatis等，分子克隆：实验手册(冷泉港实验室，冷泉港，1982年)，479-487页；Watson，基因，70：399-403，1988)，pACYC77的低拷贝复制起点，和pUC质粒的复制起点(“pUC起始位点”)，例如在pUC18质粒上所发现的(参考Yanish-Perron et al.，Gene，33：103-119(1985))。由于高度的遗传一致性和同源性，肠道沙门氏菌的任何血清变型都可被用作禽流感活疫苗组合物的细菌宿主，条件是采用了必要的减毒突变和抗原表达质粒。因此，肠道沙门氏菌可被用于本发明的血清变型包括肠道沙门氏菌血清变型Typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))，蒙得维的亚沙门氏菌(Salmonellamontevideo)，肠道沙门氏菌血清变形Typhi(伤寒沙门氏菌(″S.typhi″))，肠道沙门氏菌血清变型Paratyphi B(副伤寒沙门氏菌B(S.paratyphi B))，肠道沙门氏菌血清变型Paratyphi C(副伤寒沙门氏菌C(S.paratyphi C))，肠道沙门氏菌血清变型Hadar(S.hadar)，肠道沙门氏菌血清变型Enteriditis(肠炎沙门氏菌(S.enteriditis)，肠道沙门氏菌血清变型Kentucky(肯塔基沙门氏菌(S.Kentucky))，肠道沙门氏菌血清变型Infantis(婴儿沙门氏菌(S.infantis))，肠道沙门氏菌血清变型Pullorum(鸡白痢沙门氏菌(S.pullorum))，肠道沙门氏菌血清变型Gallinarum(鸡沙门氏菌(S.gallinarum))，肠道沙门氏菌血清变型Muenchen(慕尼黑沙门氏菌(S.muenchen))，肠道沙门氏菌血清变型Anaturn(鸭沙门氏菌(S.anatum))，肠道沙门氏菌血清变型Dublin(都柏林沙门氏菌(S.Dublin))，肠道沙门氏菌血清变型Derby(德比沙门氏菌S.derby″)，肠道沙门氏菌血清变型Choleraesuis变体kunzendorf(″S.cholerae kunzendorf)，以及肠道沙门氏菌血清变型Minnesota(明尼苏达沙门氏菌(S.Minnesota))。

本发明的疫苗可以以任何允许组合物中的沙门氏菌保持存活并在肠中持续足够肠的时间以激发对在沙门氏菌中表达的禽流感病毒及其高致病型衍生物的一或多个禽流感病毒抗原的免疫应答。例如，本发明的活菌可以在相对简单的具有生理可接受的pH和离子含量的缓冲液或盐水溶液中给药。“生理上可接受”是指与接受疫苗的个体的正常生理机能相容。这些菌株甚至可以悬浮在重碳酸盐缓冲液、磷酸盐水(PBS)或者生理盐水等能被绝大部分个体轻易吞下的溶液中。此外，“口服”可以不只包括经口吞服液体悬浮剂或者含有活菌株的固体，也包括把悬浮剂从鼻饲管或胃导管给药以及直肠给药，如在消化道的下段肠道使用含有活菌株的栓剂以建立感染。因此，如果个体无法经口吞服疫苗，可以采用以上任意一种方法施用本发明的疫苗组合物。

在本发明优选的具体化方案中，细菌含有导致至少在一个血凝素和一个神经氨酸酶表达的基因修饰，每个基因至少有一个密码子针对细菌表达进行优化。在一个最优选的具体化方案中，血凝素和神经氨酸酶基因被更进一步地改良，以被细菌作为异源融合蛋白分泌。在另一个最优选的方案中，血凝素和神经氨酸酶的异源融合蛋白被完整地整合进了染色体δIS200位点。

在一个优选方案中，通过IS200元件的缺失降低了细菌的遗传重组可能，使得该细菌遗传稳定。

在另一个方案中，通过缺失噬菌体和前噬菌体元件降低了细菌的基因重组和转导可能性，使得该细菌遗传稳定。

另一个方案中，通过在细菌中持续表达P22C2抑制物，在基因上隔离了噬菌体侵染，降低了细菌被噬菌体感染并进而被噬菌体基因转导的能力。

另一方案中，细菌具有基因确定的鞭毛抗原或没有鞭毛抗原，以降低免疫系统对载体的消除作用，提高它在第二次免疫中的免疫能力。

在一个优选方案中，经基因修饰的细菌被用于动物，包括人类、鸟类、狗和猪，以抵御禽流感及高致病性衍生物。

在另一方案中，试剂盒使得可以针对出现的禽流感病毒或它的高致病性衍生物快速构建高度匹配的细菌疫苗。

图1显示了修饰的ptrc99a质粒。多克隆位点中的Sph I位点被缺失，使上游Sph I位点成为单一的，这在把它亚克隆到pCVD载体中时很有用。另外，Not I和Pac I位点被加到了t1t2终止子的下游，同样也是为了亚克隆到pCVD载体中。

图2A和B显示了能够在细胞质中表达H5或N1抗原的质粒载体。“Ptrc”指功能性trc启动子，可操作连接于H5抗原融合蛋白的结构编码序列上。“T1T2”是指5S细菌核糖体RNA基因的T1和T2转录终止子。“bla”是指产生氨苄青霉素抗性和羧苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。箭头标示出转录方向。细节请参考正文。

图3显示修饰的ptrc99a质粒，它有独特的限制酶位点，改造进入N1基因的编码序列中，以便快速交换突变诸如H274Y。

图4A显示质粒载体，可表达分泌型的、与hlyA蛋白融合的抗原(H5或N1)。限制性内切酶名称后的数字显示该质粒中的特异性限制位点。“ptrc”是指可操作连接于抗原融合多肽的结构编码序列上的功能性trc启动子。“ColE1 ori”是指大肠杆菌素E2复制起点。图4B显示质粒载体中溶血素分泌HlyB和HlyD蛋白和另一个复制起点“M15ori”，即M15复制起点。细节请参考正文。

图5显示的是ClyA融合。显示用于将抗原(例如，H5或N1)作为ClyA融合物表达的质粒载体。图1所示的修饰后的trc99a载体被用于克隆和表达ClyA：抗原融合蛋白。

图6显示的是自主转运子融合。显示用于将抗原作为自主转运子(转座子)融合物表达的质粒载体。图1所示的修饰后的trc99a载体被用于克隆和表达转座子：抗原融合蛋白。“S”指代疏水性信号序列。

图7显示的是大肠杆菌素E3(ColE3)融合。显示用于将抗原(例如，H5N1)作为ColE3融合物表达的质粒载体。图1所示的改造后的trc99a载体被用于克隆和表达ColE3：抗原融合蛋白。

图8显示pCVD敲除构建体。A、选择5’和3’DNA片段用于构建破坏染色体基因、整合入新基因的pCVD442染色体整合载体。5’和3’片段可能完全位于基因之内(a)，也可能部分位于基因外(b)，还有可能完全位于基因之外(c)，或者是以上几种情况的任意组合，只要保证任何情况下至少有一个核苷酸的空缺，以便重组后这一空缺作为缺失引入基因导致基因失活。当外源基因像图8B所示那样被插入后，插入的基因同样会由于整合和转变导致基因破坏。B、定位载体，5’和3’片段侧接多克隆位点(SphI/NotI)，其中的表达框含有感兴趣的基因(例如，H5N1的抗原基因，或者其他感兴趣的基因如P22噬菌体C2噬菌体阻遏物蛋白)。

图9显示序列的克隆，从A)表达载体中的合成基因到B)染色体定位载体。首先，通过基本的分子生物学手段合成基因，然后将基因克隆到表达载体上，进一步亚克隆到pCVD载体上进行染色体定位。“H274Y”指代由组氨酸到赖氨酸的突变，这产生了奥塞米韦耐受性。

图10显示对IS20017.7至19.9区段间的重排/缺失的确定。Suwwan缺失是染色体17.7区段和19.9区段间两个IS200元件之间的重组过程。如果用位于17.7区段前的正向寡聚核苷酸引物P1和位于19.9区段后的反向寡聚核苷酸引物P2进行PCR，在标准的短序列(通常500bp到10,000bp)PCR条件下没有PCT产物产生，因为两个点之间的距离太长(超过20,000bp)。但是在Suwwan敲除后，这两个位点相对接近，从而可以产生PCR产物片段。

图11显示在缺失17.7 Cs IS200元件的菌株中产生能够进行Suwwan缺失的菌株的方法。在缺少17.7 Cs IS200元件的菌株中可以通过引入IS200元件从而产生潜在的进行Suwwan缺失的可能性。正如图8所示那样，可以在载体pCVD442上通过多克隆位点(SphI/NotI)衍生出引入外源基因的染色体定位载体。为了在与鼠伤寒沙门菌的同源域DNA序列中插入IS200元件，确定ATCC 14028(A)的ybjL(1)和ybjM(2)两基因之间的部分，侧接这段基因序列的DNA被作为5’和3’区连同SphI和NotI克隆位点一起被克隆到了pCVD442载体上(B)，来自于ATCC 14028的IS200被克隆到了5’和3’区之间(C)。染色体的重组将使得IS200插入到适当的位置(D)并且有可能如图10所示那样自发地发生重组。

1.1克隆禽流感抗原以在细菌中表达

正如本发明中所描述的那样，禽流感病毒基因可以作为密码子优化的合成DNA构建体克隆并在包含但不限于沙门氏菌的细菌中表达。克隆和表达禽流感病毒基因运用标准分子生物学技术(Sambrooket al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)和传统的细菌表达质粒，如pTrc99a(Pharmacia-Upjohn)。这导致了依赖于质粒的细胞质内的抗原表达。例子请参看2.1节。禽流感抗原还可以通过进行修饰作为异源融合蛋白分泌。这些融合蛋白可与先前提到的hlyA、clyA、SPATE自主转运子蛋白融合或与大肠杆菌素E3(colE3)融合作为新的组合物。例如参看2.10节。这些细胞质和分泌的表达构件都还可以通过标准的靶向的同源重组技术(Donnenbergand Kaper，1991)插入到细菌染色体上，这些细菌表达框将被插在5’、3’侧翼序列之间，以后将会详细讲述。

1.2加强遗传稳定性

在沙门氏菌这样的细菌中有多种噬菌体和原噬菌体元件。激活这些噬菌体元件将会导致基因重排或者导致例如Gifsy、Fels噬菌体的释放，也有可能二者同时发生，释放出的噬菌体能够转染其他的细菌菌株。这些噬菌体元件可以通过全基因组的DNA测序得出。但如果不知道基因组序列，也可以通过低严谨度的DNA:DNA杂交找出噬菌体元件。在本发明中，与噬菌体或原噬菌体元件结合的DNA序列被破坏以加强基因的稳定性并减少转导的可能性。遗传稳定性可以通过IS200和噬菌体/原噬菌体元件的缺失来实现。细菌染色体里IS200和噬菌体/原噬菌体元件的缺失可以使用靶向同源重组的标准技术(Donnenberg和Kaper，1991年)来达到，在此技术中缺失靶(IS200和噬菌体/原噬菌体元素)的5′和3′侧翼序列被克隆到pCVD442载体。

遗传稳定性是否改进可通过检测表型或基因型属性来获知，如抗氯酸盐造成的自发重排IS200因素(Murray等人，2004年)。重排IS200元件和造成自发缺失的能力可通过检测在含氯酸盐的LB培养基上的自发氯酸盐抗性菌群来确定。这些菌群通过PCR分析基因组，结合DNA测序，确认针对17.7-19.9 Cs区域某一特定基于IS200的缺失(见图8)。这和其他的DNA重排，复制和缺失也可用脉冲场凝胶电泳确定，其中比较亲株(对照株)DNA带型和待确定其中的重排的株(测试株)中的DNA带型。

1.3细菌载体与噬菌体的基因隔离

作为禽流感抗原载体的细菌可以经改变达到与噬菌体遗传隔离。遗传隔离的实现可以通过由P22噬菌体阻遏物的组成型表达限制噬菌体整合。当外源噬菌体进入阻遏物，抑制其融入染色体。在某些情况下，抑制物可能被RecA蛋白进行蛋白水解。这可通过定点突变消除RecA蛋白裂解位点来达到规避(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，1989年)。P22阻遏物克隆到细菌表达载体，如trc99a载体并产生组成型表达。表达框可进一步修饰然后使用靶向同源重组的标准技术(Donnenberg和Kaper，1991年)整合到染色体，其中重组trc99a表达框克隆在pCVD442载体中的缺失靶(例如，IS200或噬菌体/噬菌体元件)的5′和3′侧翼序列之间。基因隔离通过用噬菌体实验性感染通常对其敏感的细菌来检测。基因隔离株的成功构建通过与亲株相比大大降低感染率(例如，降低10倍以上)来确认，其中感染率是由诸如P22的噬菌体的噬菌斑形成单位(PFU)确定。此外，这些细菌的转导能力也使用本领域标准技术检测，如比较来自相对于修饰株为亲株的菌株的代谢基因(例如purI)和缺失相同代谢基因(如delta purI)的相同受体菌株的转导能力。基因隔离株与亲株相比，其将代表性基因转导到另一菌株的能力大大降低(如低于10倍或以上)。

1.4细菌构建：具有基因确定的鞭毛抗原(fH)或没有fH抗原的细菌的构建。

在另一实施方案中，菌株具有基因确定的鞭毛抗原，或根本没有鞭毛抗原，从而降低了载体免疫系统消除，提高其在第二免疫中的致免疫能力。具有确定鞭毛抗原的菌株的构建首先要选择表达H1或fH2抗原的亚株，所述抗原由细菌通过由hin重组酶介导的一部分基因倒位自发产生。要选择表达fH1或fH2的菌株，细菌被铺于标准生长培养基上，并使用硝酸纤维素或同等膜结合基质转移其菌落(colony lift)，接着是溶解和膜封闭。使用fH1和fH2抗体选择fH1和fH2。然后相应的克隆被净化。这些克隆进一步通过使用标准同源重组技术缺失hin重组酶基因，包括lamda红色重组酶或特异性破坏hin的pCVD载体，因此修复它们的鞭毛抗原表达。此外，无任何鞭毛抗原的菌株的建造可通过使用标准同源重组缺失fliBC基因来实现。这些基因改变株有稳定的fH1，fH2或没有鞭毛抗原(fH0)的表达，当用于第二次免疫时减少免疫系统对其的消除，而第一次免疫接利用具有不同鞭毛抗原或没有鞭毛抗原的菌株，或者第一次免疫利用包括基于鸡卵的疫苗的非细菌性疫苗。

1.5使用经基因修饰的细菌抗禽流感及其高致病性衍生物

按照本发明所描述的，载有禽流感及其高致病性衍生物的H和N抗原的菌株可用作疫苗，能产生抗感染流感毒株保护作用。

1.6快速产生经基因修饰的细菌以对抗禽流感及其高致病性衍生物的试剂盒

根据本发明的试剂盒包括1)菌株，2)pTrc99a表达载体，其载有A)神经氨酸酶和B)血凝素抗原，其具有独特的限制性内切酶的序列，允许迅速交换小片段(如N1氨基酸274)和3)多种独特的染色体定位载体，其靶向多种基因，包括IS200，噬菌体因子(尤其是Gifsy和Fels)以及代谢基因(例如purI，AroA等)，用于插入具有修饰的H和N抗原的pTrc99a表达框。

为了更全面的描述这项发明，提供以下非限定性实施例：

H和N型抗原的细菌表达，掺入遗传稳定且隔离的具有明确鞭毛抗原的隔离株，以及其对抗禽流感病毒及其高致病性衍生物的用途

2.1获得具有适当遗传背景的菌株的方法的实施例

本发明中的有效菌株都是对人体安全的，包括Ty21a，CMV906，CMV908，CMV906-htr，CMV908-htr，Ty800，holavax，M01ZH09，VNP20009等。这些菌株在细菌的特定血清变型中包含确定的突变。本发明还包括包含在菌株可选血清变型中的这些相同突变组合的用途。每种突变都可利用本领域技术人员已知的染色体缺失技术产生。通常突变组合包含至少两种突变。所述突变依次产生并通常涉及抗生素抗性标记物的缺失。该过程的第一个步骤是基于已知的种属特异性选择适当的血清变型(例如伤寒沙门菌只能感染人类，而鼠伤寒沙门菌的种属特异性很广，包括人、鸟、猪及其他脊椎动物)。因此，如果免疫靶物种限于人，伤寒沙门氏菌较合适。如果希望免疫更多物种，包括人，鸟，猪，马和其他脊椎动物，则需使用其他血清变型。一个优选方案中，选用鼠伤寒沙门菌和S.motevidio亚沙门氏菌，因为它们没有相同的O抗原表达(鼠伤寒沙门菌为O-1，4，5，伤寒沙门氏菌为Vi，而蒙得维的亚沙门氏菌为O-6，7)。因此在激发-加强免疫策略中，鼠伤寒沙门菌是合适的血清变型，其中鼠伤寒沙门氏菌可用作激发疫苗，或在激发疫苗为另一种血清变型如伤寒沙门菌或蒙得维的亚沙门氏菌时可作为加强疫苗。此外，鼠伤寒沙门菌可用于人、猪和鸟类。血清变型选择后第二个步骤是诱导首次基因突变。该过程可能会使用抗生素抗性标记物，之后这些抗生素抗性标记物会被移除，然后进行第三个步骤：诱导第二次基因突变，其同样涉及抗生素抗性标记物的使用和移除。重复基因敲除和抗生素标记物的移除可以产生另外的变异。重复敲除染色体和抗生素抗性标记物的方法都是本领域技术人员熟知的，包括缺失TN10转座子，而后通过博赫纳选择去除抗四环素标记物；缺失λRed重组酶，之后翻转重组酶移除抗生素抗性标记物，和包含蔗糖酶基因的自杀基因载体(例如pCVD442，Donnenberg and Kaper，1991)。本发明中以pCVD442载体为例产生特定的基因缺失。首先选择适合的细菌血清变型，如鼠伤寒沙门菌。然后选择适合的遗传背景，如AroA-，AroD-，htrA-，这些都是安全有效的变异组合。接下来，按照Donnenberg和Kaper在1991所描述的方法，用pCVD442载体将基因依次缺失。缺失载体的构建需要使用目标基因或5’、3’端侧翼区的DNA序列。这些序列可能是数据库中可查的已知序列，也可能是待测的未知序列，测序方法是本领域熟知的低严谨度杂交。AroA，AroD，htrA等分离基因和沙门氏菌血清变型的其他已知减毒突变(DNA序列未知)都是通过携带在大肠杆菌或沙门氏菌LT25010中的沙门氏菌基因组DNA库进行低严谨度DNA/DNA杂交实现的(例如，萨姆布鲁克等人，1989分子克隆：实验室手册(第二版.)，冷泉港实验室出版社；楼欧等人，1999自然-生物技术)。所需基因和其他已知减毒突变的探针都是通过PCR技术，从AroA，AroD，htrA或其他任何减毒突变的已知同源基因和相应的DNA序列合成的。这个片段由³²P-dCTP标记，用来在低严谨度条件下(6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，2XDenhardts溶液，0.5％脱脂牛奶55℃过夜)在沙门氏菌基因库中探查。

本领域已知，严格程度取决于温度(过量结合出现时，温度越高，严谨程度越高)和SSC溶液浓度(过量结合出现时，缓冲液浓度越低，严谨程度越高；结合不足以出现信号是，浓度越高，严谨度越低)。对高度杂交的菌群进行纯化，提取质粒，进行DNA测序。新出现同源基因两侧的DNA序列可用作5’和3’端的蔗糖酶载体，特异性缺失相对应的基因片段。

接下来，利用标准化技术将代表5’和3’端的侧翼DNA序列克隆到蔗糖酶载体上，这样，这些区域的融合表示靶基因内缺失至少一个核苷酸。优选，大多数或所有基因都被缺失(见图8)。用该载体转化合意的菌株，然后进行抗生素(氨苄青霉素)耐受性筛选。如Donnenberg和Kaper在1991年所述，将细菌平铺在含有蔗糖酶的琼脂培养基上，通过筛选蔗糖酶基因缺失的特性来去除氨苄青霉素耐受的菌株。将上述步骤重复应用于其他基因会得到有理想基因背景的多种突变。

2.2产生新突变组合的实施例

本发明中所用菌株还包括新的突变组合，包括phoP，phoQ，cdt，cya，crp，poxA，rpoS，htrA，nuoG，pmi，pabA，pts，damA，purA，purB，purI，zwf，aroA，aroC，aroD，gua，cadA，rfc，rjb，rfa，ompR，msbB以及Suwwan缺失。新组合通过实验分析，依据减毒性和免疫原性进行筛选。理想的减毒性指标是，正常免疫活性小鼠(如，CD1)在服用后LD50介于10⁵和10⁹之间，和/或静脉注射后LD50介于10⁴和10⁸之间。因为符合这样减毒性指标的药剂在人体中既不会因药性过强，造成药物过量和/或产生副作用，也不会由于减毒过度，而使需要服用的药量过多，超过生产能力。首先在小鼠中测定安全剂量(LD₀)，然后在根据每公斤体重或每平方米表面积的需要量推算其他物种的安全剂量。安全剂量即非致死剂量，是采用标准方法，经毒性试验测定出来的(Welkos和O’Brian Taylor等人，美国科学院学报.84：202833-2837)。在非实验动物如人中，先试验1∶100或1∶1000的安全剂量，而后逐步增大到最大耐受剂量(MTD，非致死性的最大毒性剂量)。也可能使用比MTD略高或略低的剂量。免疫原性的测定方法是本领域熟知的，包括野生型菌株攻击和/或特异性抗原的免疫应答分析，如LPS的ELISA试验(如，

Labor Diagnostik，莱比锡，德国)，以及对基因工程抗原的分析，如例2.15和2.16所述。减毒性在理想范围之内，在ELISA试验和利用已知方法进行的野生型免疫攻击中具有相对最高免疫应答的菌株使我们优先选择的。例如下列三组组合1)aroA和purI，2)aroA和Suwwan，3)aroA，purI和Suwwan。已知鼠伤寒沙门氏菌aroA和purI的DNA序列。2004年，莫里等人曾对Suwwan缺失有过描述。Suwwan缺失可通过含有氯酸盐的琼脂平板在ATCC菌株14028中筛选得到。用两个IS200元件的引物经PCR扩增后可知，大约有1/3的耐受菌株有Suwwan缺失(图.8)。在引入Suwwan缺失后，抗生素敏感性不会恢复，因为氯酸盐没有临床相关性，在整个过程中也没有插入抗生素耐受基因。因此，使用实施例2.1中提及的方法(Donnenberg和Kaper 1991)及Suwwan缺失就会生成以下三种变异组合：1)aroA和purI，2)aroA和Suwwan，3)aroA，purI和Suwwan。用标准方法(Welkos和O’Brian Taylor等人，美国科学院学报84：2833-2837)测定这些组合的LD₅₀，对符合上述减毒性指标的组合再做进一步分析。在野生型的免疫攻击实验中，先让小鼠据个体差异口服安全剂量的菌株(即以先前实验所确定的LD₅₀为参照，LD0_剂量或小于LD₁₀的剂量)。注射亚致死量的菌株应该使小鼠获得对致死性野生菌株的免疫。在一次性给LD₁₀后，间隔适当的时间(例如，2到6周，1到12周，或1到53周)，或是给小于LD₁₀的加强剂量，再等两周，或是进行免疫攻击试验。免疫攻击，即口服给予致死剂量的野生型菌株，通常10个或大于10个菌落形成单位(CFU)，然后实时监测存活率。免疫效能最强的菌株会使小鼠获得免疫而存活最长的时间。免疫效果还取决于对O抗原，H抗原或LPS等沙门氏菌抗原的免疫应答情况。用可商购的ELISA试剂盒来测定抗LPS。减毒性适中，免疫性最强的菌株被用作疫苗载体。

2.3在缺少17.7IS200元件的菌株中构建Suwwan缺失的实施例

2004年，莫里等人曾对如何在鼠伤寒沙门氏菌株ATCC 14028中筛选获得Suwwan缺失进行描述。因为其他沙门氏菌株缺乏Cs.17.7的IS200元件，因此不会有这种特异性的染色体缺失。这项发明中还提出了一种在其他沙门氏菌株中也能诱导Suwwan缺失的方法，即如上所述，构建蔗糖酶缺失，其中包含其他沙门氏菌株中的3’和5’侧翼区，然后用同源引物分离，形成一个多克隆位点。由于这个蔗糖酶载体的多克隆位点有IS200空位点的侧翼序列，所以可经PCR将IS200 Cs 17.7克隆到这个蔗糖酶载体的多克隆位点。这样经同源重组，IS200就填补了原先的空位点。接下来进行Suwwan缺失的操作，就形成了具有同源Cs 17 Cs 19缺失的菌株。

2.4在沙门氏菌的细胞质中，构建合成的、密码子优化的细菌血凝素基因的实施例

密码子优化的基因可利用沙门氏菌优化密码子和退火重叠的正负nus链寡核苷酸构建的合成基因，通过禽流感基因或其高致病性衍生物的反向翻译(反翻译)获得。为使其在细胞质中表达，在ATG的起始位点后要再加上GCT密码子，这两个密码子与上游的CC一起构成了限制性核酸内切酶位点NcoI(CCATGG)。在最后的密码子TGA后加上限制性核酸内切酶位点HindIII，由此含有该序列的核酸可被NcoI和HindIII限制性消化并克隆到细菌表达质粒trc99a(Pharmacia/Upjohn)的NcoI/HindIII位点。为方便，我们对trc99a载体进行修饰，去掉sphI、pstI位点，添加NotI和PacI位点(图.1)。这样就可以直接对含有trc启动子及其核糖体结合位点、多克隆位点内的任意给定的克隆基因以及下游核糖体RNA终止信号的基因表达框进行亚克隆。用PstI和HindIII进行限制性消化将SphI和PstI从trc99a上切除，对已被限制性消化的质粒(不包括被限制性酶剪切掉的小DNA序列)进行琼脂分析和凝胶纯化，并连接人工合成的寡核苷酸，序列IDNO：001 AGCTTGCA。通过限制性内切酶分析或DNA测序进一步确认克隆。利用反转录PCR添加NotI和PacI位点，其引物为

INVNOTF1 SEQ ID NO：002

5′-GATCGCGGCCGCTTAATTAACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAG-3′和INVNOTR1 SEQ ID NO：003

5′-GATCGCGGCCGCGTATTTAGAAAAATAAACAAAAAGAGTTTG-3′

正向引物引入了NotI和PacI位点，反向引物引入了第二个NotI位点。PCR的线性产物经限制性内切酶NotI消化后自身连接，而后转入大肠杆菌。要确定克隆是否正确，可使用DNA测序或限制性分析，因为此时的分离质粒包含有NotI和PacI两个位点。

细菌表达的检测可通过多种本领域熟知的检测技术完成，例如ELISA或免疫印迹。这样的质粒通过标准化转化技术转入合适的沙门氏菌株中，得到能在细胞质中表达H5并诱发免疫应答的沙门氏菌株。

表1

鼠伤寒沙门氏菌LT2[gbbct]：4696 CDS′s(1477317密码子)

领域：[三重][频率：每1000]([数目])

UUU 23.3(34407)UCU 7.2(10665)UAU 17.1(25288)UGU 4.8(7154)

UUC 15.3(22562)UCC 150.1(14953)UAC 11.6(17079)UGC 6.6(9817)

UUA 13.2(19499)UCA 6.2(9186)UAA 1.9(2781)UGA 1.0(1466)

UUG 12.4(18352)UCG 9.5(14062)UAG 0.3(452)UGG 15.2(22479)

CUU 11.8(17442)CCU 7.2(10564)CAU 13.3(19643)CGU 18.8(27700)

CUC 10.4(15425)CCC 6.9(10235)CAC 9.6(14171)CGC 23.3(34474)

CUA 4.9(7257)CCA 5.8(8501)CAA 12.7(18796)CGA 3.6(5268)

CUG 53.6(79180)CCG 24.7(36447)CAG 31.0(45726)CGG 6.9(10266)

AUU 29.3(43251)ACU 6.7(9935)AAU 17.8(26263)AGU 7.3(10831)

AUC 24.4(36114)ACC 23.3(34480)AAC 20.1(29752)AGC 17.4(25762)

AUA 5.3(7886)ACA 5.8(8515)AAA 31.7(46882)AGA 2.3(3451)

AUG 27.4(40490)ACG 18.8(27756)AAG 11.3(16630)AGG 1.6(2422)

GUU 15.5(22914)GCU 12.8(18891)GAU 31.6(46740)GGU 17.4(25643)

GUC 18.2(26821)GCC 29.1(42983)GAC 20.3(30060)GGC 35.3(52100)

GUA 11.4(16792)GCA 13.0(19160)GAA 35.4(52232)GGA 8.7(12841)

GUG 25.2(37210)GCG 42.5(62843)GAG 20.7(30586)GGG 12.0(17784)

编码GC 53.36％第一字母GC 59.34％第二字母GC 41.20％第三字母GC 59.53％

表2

伤寒杆菌[gbbct]：397 CDS′s(116164密码子)

领域：[三重][频率：每1000]([数目])

UUU 23.8(2767)UCU 11.8(1372)UAU 18.9(2192)UGU 6.3(727)

UUC 15.5(1804)UCC 10.4(1209)UAC 13.2(1538)UGC 5.6(652)

UUA 15.3(1783)UCA 14.3(1656)UAA 1.7(193)UGA 1.3(155)

UUG 12.3(1434)UCG 9.6(1119)UAG 0.4(49)UGG 12.8(1491)

CUU 15.8(1834)CCU 10.0(1165)CAU 11.4(1319)CGU 15.2(1765)

CUC 10.7(1247)CCC 6.7(783)CAC 7.2(839)CGC 12.5(1456)

CUA 6.5(754)CCA 8.7(1012)CAA 13.9(1618)CGA 6.3(729)

CUG 35.4(4110)CCG 14.5(1689)CAG 27.4(3183)CGG 7.8(908)

AUU 27.7(3214)ACU 14.2(1647)AAU 26.6(3086)AGU 12.6(1467)

AUC 20.5(2382)ACC 20.5(2377)AAC 22.6(2629)AGC 16.5(1921)

AUA 9.5(1107)ACA 13.5(1568)AAA 35.8(4156)AGA 5.7(666)

AUG 26.1(3037)ACG 15.9(51845)AAG 17.1(1989)AGG 4.5(520)

GUU 20.1(2339)GCU 17.5(2036)GAU 34.0(3947)GGU 19.7(2286)

GUC 15.6(1817)GCC 22.0(2559)GAC 20.1(2332)GGC 22.5(2612)

GUA 12.8(1484)GCA 20.5(2382)GAA 35.1(4080)GGA 12.2(1414)

10GUG 19.6(2274)GCG 21.2(2461)GAG 21.1(2446)GGG 13.2(1532)

编码GC 48.16％第一字母GC 53.73％第二字母GC 40.62％第三字母GC 50.14％

密码子优化的序列产生于逆向或者反翻译，即由氨基酸序列转变为适当的DNA序列。由于冗余的遗传密码子，许多氨基酸有多个转录为适当氨基酸的密码集。识别序列表述使用标准缩写代表多义性(欧洲生化杂志，150：1-5，1985年)。

R＝G或A

Y＝C或T

M＝A或C

K＝G或T

S＝G或C

W＝A或T

B＝非A(C或G或T)

D＝非C(A或G或T)

H＝非G(A或C或T)

V＝非T(A或C或G)

N＝A或C或G或T

基于密码子使用表，其显示较高百分比的使用偏好和最佳的密码子，可反翻译完整的序列。

H5型血凝素基因有一些已知序列，例如见Genbank数据库LOCUS NC_007362，于1996年在中国广东省的一只鹅身上分离；或更最好的例子，最近的于2006年在印尼一位26岁感染禽流感的女性身上获得的CY019432，明确将其纳入以供参考。

如下所示的是CY019432反向翻译成沙门氏菌密码子优化序列的结果(序列ID号：004)。

GATCCCATGGCTGAGAAAATTGTGCTGCTGCTGTCCATTGTGTCGCTG

GTCAAAAGCGATCAGATCTGCATTGGCTACCATGCGAACAATAGCACCGAACAGGTTGAT

ACCATTATGGAGAAAAACGTCACCGTGACCCATGCGCAGGACATCCTGGAAAAAACCCAT

AATGGCAAACTGTGCGATCTGGATGGCGTCAAACCGCTGATCCTGAAAGATTGCAGCGTG

GCGGGTTGGCTGCTGGGCAACCCGATGTGCGATGAATTTATCAATGTTCCGGAATGGAGC

TATATTGTGGAAAAAGCGAATCCGACCAACGATCTGTGTTATCCGGGTTCGTTTAACGAT

TACGAAGAACTGAAACACCTGCTGAGCCGTATTAATCATTTTGAAAAAATCCAGATTATT

CCGAAATCGAGCTGGTCGGACCACGAGGCGAGCTCGGGCGTTTCCTCCGCCTGCCCGTAT

CTGGGTAGCCCGAGCTTTTTTCGTAATGTGGTCTGGCTGATCAAAAAAAATTCCACGTAC

CCGACCATTAAAAAAAGCTATAACAACACCAACCAGGAAGATCTGCTGGTGCTGTGGGGC

ATTCATCATCCGAACAATGAAGAAGAACAGACCCGCCTGTACCAGAATCCGACCACCTAT

ATTAGCATTGGCACCAGCACCCTGAATCAGCGTCTGGTTCCGAAAATTGCGACCCGCAGC

AAAGTGAACGGCCAGTCCGGTCGTATGGAATTTTTTTGGACCATTCTGAAACCGAATGAT

GCCATCAACTTTGAATCCAATGGCAATTTTATCGCGCCGGAATACGCGTATAAAATCGTG

AAAAAAGGCGATAGCGCCATTATGAAAAGCGAACTGGAATACTCCAACTGCAATACGAAA

TGTCAGACGCCGATGGGCGCGATCAACAGCTCGATGCCGTTTCACAACATCCATCCGCTG

ACCATTGGCGAGTGTCCGAAATATGTCAAAAGCAGCCGCCTGGTGCTGGCCACCGGCCTG

CGCAATTCGCCGCAGCGTGAAAGCCGTCGCAAAAAACGTGGCCTGTTTGGCGCGATTGCG

GGCTTCATTGAAGGCGGCTGGCAGGGTATGGTCGACGGCTGGTACGGTTATCATCATAGC

AACGAACAGGGTAGCGGCTATGCGGCGGATAAAGAATCCACCCAGAAAGCCATCGATGGT

GTCACGAATAAAGTGAATAGCATTATTGACAAAATGAACACCCAGTTCGAGGCGGTCGGC

CGCGAGTTTAATAATCTGGAACGCCGCATTGAAAATCTGAATAAAAAAATGGAAGATGGC

TTTCTGGACGTTTGGACCTATAACGCGGAACTGCTGGTCCTGATGGAGAACGAACGCACG

CTGGACTTTCATGATTCCAACGTGAAAAATCTGTACGATAAAGTTCGTCTGCAGCTGCGC

GACAATGCCAAAGAACTGGGCAACGGCTGTTTCGAGTTTTATCATAAATGTGATAACGAA

TGCATGGAATCCATTCGTAACGGTACCTACAACTATCCGCAGTATAGCGAAGAAGCGCGC

CTGAAACGTGAAGAGATTTCGGGTGTGAAACTGGAATCCATTGGCACCTATCAGATTCTG

TCCATTTATAGCACCGTCGCCAGCTCCCTGGCCCTGGCCATTATGATTGCGGGCCTGAGC

CTGTGGATGTGCTCCAACGGCTCCCTGCAGTGTCGCATCTGCATCTGAAAGCTTGATC

序列从四个间隔密码子开始，其用于限制性消化和克隆。Genbank数据库中的序列有第二个插入密码子(GCT)，这个密码子是革兰氏阴性菌中强翻译第二密码子。起始密码子ATG以及终止密码子TGA加有下划线，接着终止密码子TGA的是限制位点HindIII和四个间隔子的核苷酸。

2.5在沙门氏菌中构建合成的密码子优化的神经氨酸酶基因以胞浆形态用于细菌的例子

密码子优化的N1orf(序列ID号：005)由禽流感基因反向转录而产生，其使用了沙门氏菌优化的密码子和如上述实施例中所描述的通过退火正链和负链重叠寡核苷酸链构建的合成基因。为在胞浆表达，编码丙氨酸的第二个密码子GCT加入编码起始蛋氨酸的ATG起点后，两个密码子连同上游CC构成了限制性内切酶位点NcoI。进一步在上游加入核苷酸GACT，以增加限制酶切位点到末端的距离，提高酶切割接近(cut close)末端的能力。在最后的氨基酸密码子之后加入一个TGA终止密码子，限制性内切酶位点HindIII，因此，含有这种序列的核酸可以用NcoI和HindIII限制性消化，并且克隆到细菌表达质粒trc99a的NcoI/HindIII位点(Pharmacia/Upjohn)。细菌表达可以用任何本领域已知的可用技术比如ELISA或免疫印迹法进行检测。这种质粒可以通过标准转化技术被转移到合适的沙门氏菌株中，以包含这样的沙门氏菌菌株，其通过在细胞质中表达H5抗原，并且如例子7.15所述，当给予动物时能够引起免疫应答。

N1神经氨酸酶基因序列已知，见Genbank数据库LOCUSNC_007361，明确将其纳入以供参考。

使用沙门氏菌密码子偏好的反向转录产生如下DNA序列。(序列编号：005)

GATC cc ATG (GCT)AAT CCG AAC CAG AAA ATT ATC ACC ATT

GGC TCT ATT TGC ATG GTG GTA GGG ATC ATT

TCC CTG ATG TTA CAG ATC GGC AAC ATT ATC

TCG ATC TGG GTG TCC CAT TCT ATT CAG ACC

GGC AAC CAG CAT CAG GCC GAA CCG TGC AAT

CAA AGC ATT ATC ACC TAC GAA AAT AAC ACC

TGG GTA AAT CAG ACC TAT GTT AAT ATT TCA

AAC ACC AAC TTC CTG ACC GAA AAA GCG GTG

GCA AGT GTA ACC CTC GCC GGT AAC AGC TCG

CTG TGT CCT ATT TCT GGC TGG GCG GTA CAC

AGC AAA GAT AAT GGC ATT CGC ATC GGC TCT

AAA GGC GAC GTT TTT GTG ATC CGC GAA CCC

TTT ATT TCG TGT AGC CAT CTG GAG TGC CGT

ACC TTT TTC TTG ACC CAG GGG GCG CTG CTT

AAC GAT AAG CAT TCG AAT GGC ACG GTT AAA

GAT CGC AGT CCG CAC CGC ACG CTG ATG AGC

TGC CCA GTG GGG GAG GCC CCA TCC CCA TAC

AAC TCG CGC TTC GAA TCC GTC GCT TGG AGC

GCC AGC GCG TGC CAC GAT GGT ACG TCT TGG

CTG ACG ATC GGC ATT AGC GGT CCG GAC AAC

GGT GCG GTT GCT GTC CTG AAA TAT AAT GGT

ATT ATC ACG GAC ACC ATT AAA TCG TGG CGC

AAC AAT ATC TTA CGG ACC CAG GAG TCA GAA

TGC GCC TGC GTG AAT GGC TCT TGC TTT ACG

GTC ATG ACC GAT GGC CCG AGT AAT GGC CAA

GCG TCC TAT AAA ATT TTT AAA ATG GAA AAA

GGG AAA GTT GTG AAG TCA GTG GAA CTT AAC

GCC CCG AAC TAT CAC TAT GAA GAG TGT TCG

TGT TAC CCT GAC GCA GGC GAA ATC ACG TGT

GTC TGC CGT GAT AAC TGG CAT GGC AGC AAC

CGC CCG TGG GTG TCC TTT AAC CAG AAT TTG

GAA TAT CAG ATC GGC TAT ATT TGT TCT GGG

GTC TTC GGC GAT AAC CCG CGT CCT AAT GAC

GGC ACC GGC AGC TGT GGC CCG GTA TCC CCC

AAT GGT GCG TAT GGC GTT AAG GGT TTC AGT

TTC AAA TAC GGT AAT GGC GTG TGG ATT GGT

CGC ACC AAA TCA ACC AAC TCG CGG TCG GGT

TTT GAA ATG ATC TGG GAT CCG AAT GGC TGG

ACC GGT ACC GAT AGC TCA TTC TCC GTG AAG

CAA GAC ATC GTC GCA ATT ACG GAT TGG TCC

GGC TAC AGT GGC AGC TTT GTG CAA CAT CCG

GAG CTG ACC GGG CTG GAT TGC ATT CGC CCC

TGT TTT TGG GTT GAA CTG ATT CGT GGG CGT

CCG AAG GAG TCA ACG ATC TGG ACG AGC GGC

AGC AGT ATT AGC TTT TGC GGC GTC AAC AGC

GAC ACG GTC GGC TGG AGT TGG CCG GAT GAC

GCG GAG CTC CCT TTT ACC ATT GAT AAA TAG AAGCTT GATC

加入适当的限制位点用于克隆来进一步优化所述序列用于细菌表达。利用起始密码子以及第二个密码子GCT改造NcoI位点，并在最终的氨基酸密码子之后加入终止密码子以及改造的HindIII位点和末端间隔子。这种合成衍生的DNA序列可随后克隆入细菌表达质粒pTrc99a的NcoI/HindIII位点并转化入沙门氏菌菌株，可以产生表达病毒抗原的疫苗。

2.6构建合成的密码子优化的基因的实施例，所述基因具有独特的限制内切酶位点以快速匹配新出现的病原体

抗奥塞米韦神经氨酸酶是抗原氨基酸序列的改变导致改变抗原性的例子。在实施例2.5中所述包含限制位点的上述合成构建体进一步修饰，其中该合成序列包含代表奥塞米韦抗性突变，诸如氨基酸位置274的组氨酸到酪氨酸的突变(H274Y)。首先，包含具有H274Y突变的N1序列的trc99a表达构建体通过合成构建获得并连接入先前制备的基因的限制内切酶靶位点。该质粒转染进适当的细菌载体。由此，更快产生新的构建体，并且在细菌载体中表达时导致与新出现的奥塞米韦抗性菌株抗原性匹配的疫苗。

2.7利用HlyA融合的禽流感抗原分泌以及高致病性抗原衍生物的分泌

通过抗原表达质粒表达出来的禽流感抗原多肽或在本发明疫苗株中染色体构建体并不需要连接到信号多肽或其他用于膜定位或者跨越细胞膜的肽。然而，通过进一步优选的实施方案，编码本发明中使用的H5-HlyA融合多肽的核苷酸序列是本领域已知的，并且对应的编码的H5-HlyA多肽具有相应的氨基酸序列。本发明所用的抗原表达质粒可适于在宿主沙门氏菌细胞内表达禽流感抗原多肽。优选，本发明的抗原表达质粒或染色体表达构建体适于用于在细胞外表达分泌形式的禽流感抗原多肽。因此，本发明疫苗株中的抗原表达质粒所表达的禽流感抗原多肽优选连接信号肽或其他用于膜定位或分泌穿过细胞膜的肽。

溶血素A(hlyA)与H5核苷酸序列融合物的构建将导致hlyA分泌的融合肽。HlyA是利用提供HLYA的60C末端氨基酸的质粒通过暴露于已知的方法产生的，并连接入hlyA融合载体产生编码H5::HLYA融合肽的核酸序列。该融合物也可作为完整的合成DNA构建体入对血凝素和神经氨酸酶基因所述那样产生。

下面显示了可操作融合于HlyA的60C末端氨基酸的CY019432密码子优化的H5基因。

GATCCCATGGCTGAGAAAATTGTGCTGCTGCTGTCCATTGTGTCGCTG

GTCAAAAGCGATCAGATCTGCATTGGCTACCATGCGAACAATAGCACCGAACAGGTTGAT

ACCATTATGGAGAAAAACGTCACCGTGACCCATGCGCAGGACATCCTGGAAAAAACCCAT

AATGGCAAACTGTGCGATCTGGATGGCGTCAAACCGCTGATCCTGAAAGATTGCAGCGTG

GCGGGTTGGCTGCTGGGCAACCCGATGTGCGATGAATTTATCAATGTTCCGGAATGGAGC

TATATTGTGGAAAAAGCGAATCCGACCAACGATCTGTGTTATCCGGGTTCGTTTAACGAT

TACGAAGAACTGAAACACCTGCTGAGCCGTATTAATCATTTTGAAAAAATCCAGATTATT

CCGAAATCGAGCTGGTCGGACCACGAGGCGAGCTCGGGCGTTTCCTCCGCCTGCCCGTAT

CTGGGTAGCCCGAGCTTTTTTCGTAATGTGGTCTGGCTGATCAAAAAAAATTCCACGTAC

CCGACCATTAAAAAAAGCTATAACAACACCAACCAGGAAGATCTGCTGGTGCTGTGGGGC

ATTCATCATCCGAACAATGAAGAAGAACAGACCCGCCTGTACCAGAATCCGACCACCTAT

ATTAGCATTGGCACCAGCACCCTGAATCAGCGTCTGGTTCCGAAAATTGCGACCCGCAGC

AAAGTGAACGGCCAGTCCGGTCGTATGGAATTTTTTTGGACCATTCTGAAACCGAATGAT

GCCATCAACTTTGAATCCAATGGCAATTTTATCGCGCCGGAATACGCGTATAAAATCGTG

AAAAAAGGCGATAGCGCCATTATGAAAAGCGAACTGGAATACTCCAACTGCAATACGAAA

TGTCAGACGCCGATGGGCGCGATCAACAGCTCGATGCCGTTTCACAACATCCATCCGCTG

ACCATTGGCGAGTGTCCGAAATATGTCAAAAGCAGCCGCCTGGTGCTGGCCACCGGCCTG

CGCAATTCGCCGCAGCGTGAAAGCCGTCGCAAAAAACGTGGCCTGTTTGGCGCGATTGCG

GGCTTCATTGAAGGCGGCTGGCAGGGTATGGTCGACGGCTGGTACGGTTATCATCATAGC

AACGAACAGGGTAGCGGCTATGCGGCGGATAAAGAATCCACCCAGAAAGCCATCGATGGT

GTCACGAATAAAGTGAATAGCATTATTGACAAAATGAACACCCAGTTCGAGGCGGTCGGC

CGCGAGTTTAATAATCTGGAACGCCGCATTGAAAATCTGAATAAAAAAATGGAAGATGGC

TTTCTGGACGTTTGGACCTATAACGCGGAACTGCTGGTCCTGATGGAGAACGAACGCACG

CTGGACTTTCATGATTCCAACGTGAAAAATCTGTACGATAAAGTTCGTCTGCAGCTGCGC

GACAATGCCAAAGAACTGGGCAACGGCTGTTTCGAGTTTTATCATAAATGTGATAACGAA

TGCATGGAATCCATTCGTAACGGTACCTACAACTATCCGCAGTATAGCGAAGAAGCGCGC

CTGAAACGTGAAGAGATTTCGGGTGTGAAACTGGAATCCATTGGCACCTATCAGATTCTG

TCCATTTATAGCACCGTCGCCAGCTCCCTGGCCCTGGCCATTATGATTGCGGGCCTGAGC

CTGTGGATGTGCTCCAACGGCTCCCTGCAGTGTCGCATCTGCATCCCCGGGTCAACTTAT

GGGAGCCAGGACTATCTTAATCCATTGATTAATGAAATCAGCAAAATCATTTCAGCTGCA

GGTAATTTGGATGTTAAGGAGGAAAGATCTGCCGCTTCTTTATTGCAGTTGTCCGGTAAT

GCCAGTGATTTTTCATATGGACGGAACTCAATAACTTTGACAGCATCAGCATAAAAGCTTGATC

序列以四个间隔密码子开始，其用于消化和克隆。Genbank序列具有插入H5基因中的第二个密码子(GCT)，这是革兰氏阴性菌中的强翻译第二密码子。启动性密码子ATG加下划线。加入SmaI限制内切酶位点取代H5终止密码子以促进克隆和肽融合，然后是框内连接编码HlyA基因的60C末端氨基酸的框内编码序列，所述基因终止密码子是TAA(加下划线)，然后是限制位点HindIII和四个间隔密码子的核苷酸。HlyA中存在的天然存在的PacI限制性内切酶位点经保守改变以辅助PacI潜在地作为编码序列之外的限制位点。

hlyA融合物的分泌需要存在HlyBD基因产物。为了提供HlyBD基因，需要使用含有所述基因的质粒(图4)，或优选，将HlyBD基因克隆在蔗糖酶载体如IS200噬菌体重组酶，鞭毛，或hin pCVD缺失载体。整个输出框可作为NotI消化片段从pVDL9.3切除并克隆到蔗糖载体中的Not1位点，当其与染色体重组时，导致IS200噬菌体重组酶，鞭毛或hin缺失以及HlyBD插入染色体。

2.8利用ClyA融合分泌禽流感抗原及高致病性衍生物的实施例。

clyA与血凝素和神经氨酸酶抗原的融合物的构建根据Galen等的方法(2004年感染与免疫72：7096-7106)。

2.9利用自主转运子融合物分泌禽流感抗原及高致病性衍生物的实施例。

构建自主转运子与血凝素和神经氨酸酶抗原的融合物。自主转运子嵌合蛋白能够在细菌外自我转移和分泌。血凝素和神经氨酸酶与淋病奈瑟球菌IgA蛋白酶自主转运蛋白的融合物根据Veiga等，2003 J.Virol.300277：13396-13398和Oomen等，2004 EMBO Journal23：1257-1266所述的方法构建。产生的融合构建体转染入细菌载体，产生分泌神经氨酸酶和血凝素抗原的疫苗株。

2.10利用大肠杆菌素E3融合分泌禽流感抗原和高致病性衍生物。

大肠杆菌素E3(ColE3)是一种细菌核糖体RNA灭活毒素。ColE3在表达它的细胞中被抑制抗核糖体活性的抗毒素中和。灭活的ColE3克隆自含有colE3的菌株(例如，ColE3-CA38)。PCR引物包括克隆起始密码子和第二个加入的密码子提供NcoI克隆位点的正向引物以及含有SmaI(平末端)克隆位点的反向引物组成。PCR引物位于序列下段足够远处(far down)，使得蛋白C末端部分缺失，由此灭活毒性而保持分泌活性。血凝素和神经氨酸酶抗原用NcoI和HindIII切割，末端钝化并框内连入截短的ColE3蛋白的SmaI位点。DNA定向随后通过限制分析和DNA测序证实。当转化进入细菌载体时，DNA构建体导致血凝素或神经氨酸酶抗原分泌。

2.11通过缺失IS200元件稳定基因。

利用常规的pCVD442法同源重组技术，利用载体pCVD442(Donnenberg and Kaper，1991)，可以缺失IS200元件。在鼠伤寒沙门氏菌株LT2中的所述元件包括LOCUS NC_003197，具有本领域已知的序列。IS200元件包含具有已知氨基酸序列的转座酶。

其它IS200元件，在不知道DNA序列的情况下，可以通过低严谨度杂交分离。通过沙门氏菌LT2 5010中携带的沙门氏菌基因组DNA文库的低严谨度的DNA/DNA杂交从沙门氏菌分离IS200元件(例如，Low等，1999 Nature Biotechnology)。IS200的探针利用已知的IS200元件通过PCR产生。该片段利用32P-dCTP标记并用于在低严谨度条件下检测沙门氏菌的文库，所述低严谨度条件包括：6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，2XDenhardts，0.5％非乳脂肪，55℃过夜。强杂交菌落被纯化，并用于提取质粒来进行DNA测序。侧接新的IS200元件的DNA序列用于产生可用于特异性缺失IS200元件的蔗糖酶载体的5′和3′区。

在具体的实例中，位于17.7Cs中的IS200可利用通过PCR引物2415F1产生的5’部分缺失，(IS200 5′F，具有SacI)SEQ ID：006GATCGAGCTCGGCTTAATTATTGCCCAGCTTGCGCTGG和2415R1(IS200 5′R，具有多接头)SEQ ID：007 CCCCGCATGCGGGGCTCGAGGGGGCCATATAGGCCGGGGATTTAAATGGGGCGG5CCGCAAAAAAAATCCTGGCGCAGGGCCAGG和3′部分利用引物2413F1(IS200 3′F具有多接头)SEQ ID：008 CCCCGCATGCGGGGAGATCTGGGGTTAATTAAGGGGTCTAGAGGGGGCGGCCGCAGGACTATATTTAGGGCGAAACAGC和2413R1(IS2003′R，具有SalI)SEQ ID：009GATCGTCGACGACTAAACATGATTCCAACAATCACG。5′片段使用Sac1和SphI克隆到pCVD442载体，并在分离和鉴定合适的克隆之后，利用限制性内切酶SphI和SphI加入3’片段。所述引物也提供了多克隆位点，包含Not1，Pac1，BstY1，SphI，SfiI，Swa1，其可被用于递送外源基因，如下文所述的H5和N1，lamda阻遏物C1，或hlyBD(蛋白通道)。

2.12通过缺失噬菌体元件遗传稳定的实施例。

含有噬菌体或噬菌体元件的菌株可使噬菌体进入裂解周期中，从而其可能进行重组倒位。菌株如沙门氏菌包含Fels和Gifsy原噬菌体。在Fels噬菌体重组酶/转化酶可利用上文所述针对IS200元件的pCVD442同源重组系统缺失。缺失的结果是导致无法切割噬菌体DNA，因此不能进入裂解周期或基因重组。

在Fels-1转化酶具有已知的氨基酸和DNA序列。Fels-2重组酶/转化酶也具有已知的氨基酸序列和DNA序列。

2.13通过组成型表达P22噬菌体C2阻遏物进行基因隔离的实施例

见：Donnenberg和Kaper，1991年；Low等。(Methods inMolecular Medicine，2003年)，包含在内作为参考。

2.14合成构建的禽流感血凝素基因和神经氨酸酶基因的染色体整合的实例

2.15确定对H5N1表达型细菌的免疫应答的实施例

实验测定疫苗活动是众所周知的的技术。举例说明了抗体反应的测定作为非限制性实施例。

1)对脊椎动物包括小鼠，鸟，狗，猫，马，猪或人类的选择标准是没有任何已知的当前或最近的(一年内)流感感染或疫苗接种。预先对动物取血与H5和N1抗原的背景结合。

2)表达H5和N1的沙门氏菌在LB琼脂上37°培养过夜。也可使用表达其它H或N抗原的细菌。

3)第二天细菌转移到LB肉汤，调整浓度到OD600＝0.1(∽2×10⁸CFU/ml为)，并保持进一步的增长。在37°在转子上生长至OD600＝2.0，置于冰块上，浓度相当于约4×10⁹CFU/ml。

4)生长之后，离心，重悬于1/10原始体积的药学可接受的缓冲液诸如PBS，并将其稀释到浓度为10⁴至10⁹CFU/ml，加热到室温，并以适合目的动物大小的体积口服或经鼻内给药，例如对于小鼠给药50μl，对于人给药10至100ml。以总cfu测定的实际剂量通过本发明其他部分中所述的安全剂量确定。

5)2周后，取血液样本与治疗前样本进行比较。可给予加强剂量。加强给药可与首次给药相同，针对不同的物种，不同血清变型，或不同鞭毛抗原(H1或H2)或没有鞭毛抗原。。

6)经过额外的2至4周，可取额外血样用于与处理前和处理后2周的样本进行比较。

7)通过免疫印迹法或ELISA比较免疫前和免疫后的抗体反应。比背景/免疫前测定高两倍的相对数值表示阳性免疫应答。

2.16用H5N1细菌疫苗株进行免疫

可进行实验测定沙门氏菌株H5N1有否能力提供抗野生型菌株攻击保护作用。4周龄鸭口服5×10⁹cfu的细菌，6周龄时给予禽流感的标准攻击模型进行攻击。

A组鸟类用空载体免疫。B组接受沙门氏菌H5N1。C组用表达达菲(Tamiflu)抗性神经氨酸酶突变的沙门氏菌免疫。D组鸟类没有被免疫。每组再分为+/-达菲治疗。这些实验的结果可以用来证明疫苗对抗达菲菌株的有效性，其中利用或不利用达菲进行治疗。

其他实施方案

其他实施方案在下述权利要求范围内。例如，宿主细菌(细菌的染色体经改造编码异种抗原)可为大肠杆菌或任何其他肠道细菌，包括沙门氏菌，博德特氏菌(bordetella)，志贺氏菌，耶尔森氏菌(Yersenia)，枸橼酸杆菌，肠杆菌，克雷伯氏菌，摩根菌(Morganella)，变形杆菌(Proteus)，普罗维菌(Providencia)，沙雷氏菌(Serratia)，邻单胞菌(Serratia)，和气单胞菌，所有这些都具有已知类似大肠杆菌和沙门氏菌的启动子。还可能有用的是bacille Calmette-Guerin(BCG)疫苗株，经改造编码异源启动子(即来自除外宿主细菌的种属)。利用与上述技术类似的技术，连接相同或不同启动子序列的多异源抗原编码序列可插入给定染色体，产生多价疫苗株。

原核基因表达领域技术人员将理解，当优选天然存在的启动子序列时，合成序列或两或多个序列的杂合子将被预期可用于本发明的染色体中，天然存在启动子序列中的一或多个核苷酸的改变、添加或缺失通常不影响其有用性。本发明由此包括具有所述无意义的(inconsequential)改变的启动子。

Claims

1.保护动物抗禽流感感染的活疫苗组合物，包括减毒活沙门氏菌，所述减毒活沙门氏菌包括：

所述细菌染色体基因座中的减毒突变，所述突变减弱所述细菌的毒力；

抗原表达型DNA构建体，包括

编码包含禽流感H或N抗原的免疫原性多肽的核苷酸序列，

所述H或N抗原的免疫原性部分，或

其组合，

其中所述核苷酸序列可操作连接于启动子，所述启动子允许所述免疫原性多肽从所述DNA构建体表达；编码所述免疫原性多肽的基因具有至少一个针对细菌表达优化的密码子，并且所述活疫苗组合物在口服给予动物时激发针对至少一种禽流感抗原的免疫应答。

2.根据权利要求1的活疫苗组合物，其中所述减毒活沙门氏菌选自下组：肠道沙门氏菌血清变型Typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))，肠道沙门氏菌血清变形Typhi(伤寒沙门氏菌(S.typhi))，肠道沙门氏菌血清变型Paratyphi B(副伤寒沙门氏菌B(S.paratyphi B))，肠道沙门氏菌血清变型Paratyphi C(副伤寒沙门氏菌C(S.paratyphi C))，肠道沙门氏菌血清变型Hadar(S.hadar)，肠道沙门氏菌血清变型Enteriditis(肠炎沙门氏菌(S.enteriditis)，肠道沙门氏菌血清变型Kentucky(肯塔基沙门氏菌(S.Kentucky))，肠道沙门氏菌血清变型Infantis(婴儿沙门氏菌(S.infantis))，肠道沙门氏菌血清变型Pullorum(鸡白痢沙门氏菌(S.pullorum))，肠道沙门氏菌血清变型Gallinarum(鸡沙门氏菌(S.gallinarum))，肠道沙门氏菌血清变型Muenchen(慕尼黑沙门氏菌(S.muenchen))，肠道沙门氏菌血清变型Anaturn(鸭沙门氏菌(S.anatum))，肠道沙门氏菌血清变型Dublin(都柏林沙门氏菌(S.Dublin))，肠道沙门氏菌血清变型Derby(德比沙门氏菌S.derby)，肠道沙门氏菌血清变型Choleraesuis变体kunzendorf，以及肠道沙门氏菌血清变型Minnesota。

3.根据权利要求2的活疫苗组合物，其中所述减毒活沙门氏菌是肠道沙门氏菌血清变型Typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))。

4.根据权利要求1的活疫苗组合物，其中所述减毒突变位于选自下组的基因座中：phoP，phoQ，Mt，cya，crp，poxA，rpoS，htrA，nuoG，pmi，galE，pabA，pts，damA，purA，purB，purI，zwf，gua，cadA，rfic，rjb，rfa，ompR，Suwwan和其组合。

5.根据权利要求4的活疫苗组合物，其中所述减毒突变是缺失突变。

6.根据权利要求5的活疫苗组合物，其中所述减毒突变包括phoP的至少部分缺失突变。

7.根据权利要求1的活疫苗组合物，其中所述沙门氏菌包括致死突变，其包含asd基因中的缺失，并且所述免疫原性多肽包含融合蛋白，所述融合蛋白包含V抗原或其免疫原性部分，其连接于F1抗原或其免疫原性部分，编码在抗原表达型多拷贝质粒上。

8.根据权利要求7的活疫苗组合物，其中所述多拷贝质粒的复制起点是ColE1，pUC，M15，或者pBR322质粒复制起点。

9.根据权利要求1的活疫苗组合物，其中所述活疫苗组合物包括多种活沙门氏菌血清变型。

10.根据权利要求1的活疫苗组合物，其中所述减毒活沙门氏菌相对于同一血清变型的野生型沙门氏菌是遗传稳定的。

11.根据权利要求1的活疫苗组合物，其中所述减毒活沙门氏菌相对于同一血清变型的野生型沙门氏菌在与其他生物体进行基因交换方面是遗传稳定的。

12.活疫苗组合物，其中包括这样的沙门氏菌，其表达至少一种禽流感H或N抗原以及所述H或N抗原的免疫原性部分。

13.根据权利要求12的活疫苗组合物，其中所述沙门氏菌包括鼠伤寒沙门氏菌。

14.根据权利要求1的活疫苗组合物，其自下述试剂盒制备而来，所述试剂盒包括(a)第一个容器，包含来自致病性禽流感病毒株的细菌表达密码子优化的抗原，其中在至少一个细菌蛋白表达质粒或细菌染色体蛋白表达载体中含有独特的基因改造的限制位点，其允许小片段的快速交换；(b)第二个容器，包含有至少一个细菌鞭毛抗原的细菌鞭毛载体，其中沙门氏菌包括多个独特的染色体定位载体，其靶向至少IS200、噬菌体元件以及用来插入表达密码子的代谢基因。

15.对动物进行抗禽流感免疫的方法，包括给予活疫苗组合物，所述活疫苗组合物含有表达至少一种禽流感H或N抗原和所述H或N抗原的免疫原性部分的沙门氏菌。

16.根据权利要求15的方法，其中活疫苗组合物适于保护动物抗禽流感感染，其中所述沙门氏菌包括在所述细菌染色体基因座中的减毒突变，该突变减弱所述细菌的毒力；抗原表达DNA构建体，包括编码免疫原性多肽的核苷酸序列，所述多肽含有禽流感H或N抗原，所述H或N抗原的免疫原性部分，或其组合，其中所述核苷酸序列可操作连接于启动子，所述启动子允许所述免疫原性多肽从所述DNA构建体表达；编码免疫原性多肽的基因具有至少一个针对细菌表达优化的密码子，并且所述活疫苗组合物在口服给予动物时激发针对至少一种禽流感抗原的免疫应答。

17.根据权利要求16的方法，其中所述沙门氏菌选自下组：肠道沙门氏菌血清变型Typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))，肠道沙门氏菌血清变形Typhi(伤寒沙门氏菌(S.typhi))，肠道沙门氏菌血清变型Paratyphi B(副伤寒沙门氏菌B(S.paratyphi B))，肠道沙门氏菌血清变型Paratyphi C(副伤寒沙门氏菌C(S.paratyphi C))，肠道沙门氏菌血清变型Hadar(S.hadar)，肠道沙门氏菌血清变型Enteriditis(肠炎沙门氏菌(S.enteriditis)，肠道沙门氏菌血清变型Kentucky(肯塔基沙门氏菌(S.Kentucky))，肠道沙门氏菌血清变型Infantis(婴儿沙门氏菌(S.infantis))，肠道沙门氏菌血清变型Pullorum(鸡白痢沙门氏菌(S.pullorum))，肠道沙门氏菌血清变型Gallinarum(鸡沙门氏菌(S.gallinarum))，肠道沙门氏菌血清变型Muenchen(慕尼黑沙门氏菌(S.muenchen))，肠道沙门氏菌血清变型Anaturn(鸭沙门氏菌(S.anatum))，肠道沙门氏菌血清变型Dublin(都柏林沙门氏菌(S.Dublin))，肠道沙门氏菌血清变型Derby(德比沙门氏菌S.derby)，肠道沙门氏菌血清变型Choleraesuis变体kunzendorf，以及肠道沙门氏菌血清变型Minnesota。

18.根据权利要求17的方法，其中所述沙门氏菌包含肠道沙门氏菌血清变型Typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))。

19.根据权利要求16的方法，其中所述减毒突变位于选自下组的基因座中：phoP，phoQ，Mt，cya，crp，poxA，rpoS，htrA，nuoG，pmi，galE，pabA，pts，damA，purA，purB，purI，zwf，gua，cadA，rfic，rjb，rfa，ompR，Suwwan和其组合。

20.根据权利要求19的方法，其中所述减毒突变包括phoP的至少部分缺失突变。

21.根据权利要求16的方法，其中所述沙门氏菌包括致死突变，其包含asd基因中的缺失；并且所述免疫原性多肽包含融合蛋白，所述融合蛋白包含V抗原或其免疫原性部分，其连接于F1抗原或其免疫原性部分，编码在抗原表达多拷贝质粒上。

22.根据权利要求16的方法，其中所述沙门氏菌相对于同一血清变型的野生型沙门氏菌是遗传稳定的。

23.根据权利要求16的方法，其中所述减毒活沙门氏菌通过缺失IS200元件以及细菌噬菌体和原噬菌体元件达到遗传稳定，并且通过组成型表达P22噬菌体阻遏子与外部噬菌体感染在遗传上隔离。

24.适合用于制备活疫苗组合物的试剂盒，包含表达至少一个禽流感H或N抗原以及所述H或N抗原免疫原性部分的沙门氏菌，所述试剂盒包括(a)第一个容器，包含来自致病性禽流感病毒株的细菌表达密码子优化的抗原，其中在至少一个细菌蛋白表达质粒或细菌染色体蛋白表达载体中含有独特的基因改造的限制位点；(b)第二个容器，包含有至少一个细菌鞭毛抗原的细菌鞭毛载体。

25.根据权利要求23的试剂盒，还包括细菌菌株；其中细菌表达密码子允许小片段的迅速交换，其中所述细菌菌株包含多个独特的染色体定位载体，其靶向至少IS200、噬菌体元件以及用来插入表达密码子的代谢基因。