CN103074357A

CN103074357A - 外源基因在沙门氏菌中表达优化的方法

Info

Publication number: CN103074357A
Application number: CN2012102987235A
Authority: CN
Inventors: 徐家华; 陈瑞爱; 张东霞; 汤钦
Original assignee: Guangdong Dahuanong Animal Health Products Co Ltd; Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Guangdong Dahuanong Animal Health Products Co Ltd; Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-08-20
Filing date: 2012-08-20
Publication date: 2013-05-01

Abstract

本发明提供了外源基因在沙门氏菌中优化表达的方法，包括如下具体步骤：从NCBI数据库中统计获得沙门氏菌密码子使用频率表；分析各密码子使用频率：克隆或者合成目的基因，并且测定其核苷酸序列，根据上述沙门氏菌密码子使用频率表和氨基酸密码子对应表，在不改变氨基酸的情况下，通过分子突变或者基因合成的方式，把所述目的基因中沙门氏菌使用频率最低和较高的密码子突变成为使用频率最高的密码子，获得新的编码目的基因的核苷酸片段；通过分子生物学方法把新的编码目的基因的核苷酸片段插入到表达载体中，而后转入基因工程大肠杆菌，对获得的克隆进行鉴定；将鉴定正确的含目的基因的表达载体导入沙门氏菌中。

Description

外源基因在沙门氏菌中表达优化的方法

技术领域

本发明涉及基因优化表达技术领域，具体地，涉及外源基因在沙门氏菌中表达优化的方法。

背景技术

在生物活性物质的生产过程中广泛用到基因克隆、表达，而基因在异源宿主中表达量受到多方面的影响，例如启动子、调控序列、终止子、密码子使用频率等等。在基因表达研究中，研究者比较注意选择合适的表达载体和宿主系统，而往往忽视基因本身是否与载体和宿主系统为最佳匹配这样一个实质性问题。基因的最佳化表达可以通过对基因的重新设计和合成来实现，如消除稀有密码子而利用最佳化密码子，二级结构最小化，调整GC含量等。

遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子。实际上用做蛋白表达或生产的每种生物（包括大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞，植物细胞和昆虫细胞等）都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。丰度高的蛋白质的基因明显避免低利用率的密码子。重组蛋白的表达可能受密码子利用的影响（尤其在异源表达系统中）的事实并不很奇怪。基因利用的密码子可能不是你正在利用的蛋白生产系统进行高水平表达所偏爱的密码子，这种情况是可能的。利用偏爱密码子并避免利用率低的或稀有的密码子可以合成基因。在同源表达系统中，同较低水平表达的基因相比，较高表达的基因可能有很不同的密码子偏爱。通过对密码子利用的归类分析，人们可以真正预测任何基因在生物中的表达水平。

在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中，密码子的使用偏向性已经有不少研究与报道。而在沙门氏菌是重要的致病性细菌，有关在少门氏菌表达蛋白质的报道很少，更不用用说基因在沙门氏菌的优化表达了。

发明内容

为了提高基因在沙门氏菌中表达量，本发明提供了异源基因在沙门氏菌中表达优化的方法，该方法通过NCBI收集3千多条沙门氏菌基因统计获得沙门氏菌密码子使用频率表，并且通过表达多个不同的外源基因验证，表明如果外源基因按照本发明所公布的沙门氏菌密码子使用频率表选用高频使用密码子，在同等条件下，外源基因表达量将提高2-10倍。

本发明的技术方案如下：外源基因在沙门氏菌中优化表达的方法，包括如下具体步骤：

1：从NCBI数据库中获得沙门氏菌基因的开放阅读框，把开放阅读框转化成为氨基酸序列，察看是否在氨基酸序中存在终止现象，剔出不能完成翻译成氨基酸的核苷酸序列，然后按照三个核苷酸编码一个氨基酸的方法，逐一统计每个沙门氏菌基因的开放阅读框的每个氨基酸对应的核苷酸，即编码氨基酸的核苷酸密码子，最终获得沙门氏菌密码子使用频率表，如表1所示；

表1：沙门氏菌密码子使用频率表

密码子	密码子数量（个）	密码子占总分析密码子的比例
			UUU	45815	2.28
UCU	16084	0.80
			UAU	34398	1.71
UGU	9865	0.49
			UUC	30610	1.52
UCC	20961	1.04
			UAC	23762	1.18
UGC	12895	0.64
			UUA	26471	1.32
UCA	14715	0.73
			UAA	3661	0.18
UGA	2147	0.11
			UUG	24813	1.24
UCG	19007	0.95
			UAG	664	0.03
UGG	30130	1.50
			CUU	24575	1.22
CCU	15013	0.75
			CAU	25798	1.26
CGU	36181	1.80
			CUC	21240	1.06
CCC	13973	0.70
			CAC	18822	0.94
CGC	43839	2.18
			CUA	10196	0.51
CCA	12505	0.62
			CAA	25479	1.27
CGA	8027	0.40
			CUG	102377	5.10
CCG	46630	2.32
			CAG	61131	3.05
CGG	14758	0.74
			AUU	57260	2.85
ACU	16166	0.81
			AAU	37687	1.88
AGU	16157	0.80
			AUC	48396	2.41
ACC	46420	2.31
			AAC	42284	2.11
AGC	34823	1.731
			AUA	12391	0.62
ACA	14385	0.72
			AAA	64111	3.19
AGA	5873	0.29
			AUG	53108	2.65
ACG	36788	1.83
			AAG	24523	1.22
AGG	4339	0.22
			GUU	32911	1.64
GCU	27968	1.39
			GAU	64353	3.21
GGU	36142	1.80
			GUC	35458	1.77
GCC	56630	2.82
			GAC	41807	2.08
GGC	66723	3.32
			GUA	22980	1.14
GCA	28857	1.43
			GAA	70492	3.51
GGA	18523	0.92
			GUG	49051	2.44
GCG	78624	3.92
			GAG	41695	2.08
GGG	24085	1.20

2：分析表1可知，其中密码子UAA、UGA、UAG、CGA、AGA、AGG、UGU使用的频率最低，其占总分析密码子的比例均小于0.5；而CUA、UCU、UGC、UCA 、CCU、CCC、CCA、CGG、AGU、AUA、ACA、GGA、CAC和ACU密码子使用频率较高，其使用比例占总分析密码子的比例在0.5-0.9之间，其余密码子使用频率均大于0.9；

3：克隆或者合成目的基因，并且测定其核苷酸序列，根据上述沙门氏菌密码子使用频率表，即表1，和氨基酸密码子对应表，如表2所示，在不改变氨基酸的情况下，通过分子突变或者基因合成的方式，把所述目的基因中沙门氏菌使用低频率的密码子突变成为高频率密码子，获得新的编码目的基因的核苷酸片段；例如：从表2可知编码脯氨酸的密码子有：CCU、CCA、CCC、CCG，从表1可知在沙门氏菌这些密码子的使用频率分别为0.75、0.62、0.70、2.32，因此如果目的基因中出现编码脯氨酸的低频率密码子，如CCU、CCA、CCC、就可以通过基因突变或者合成的方式将其全部改为高频率密码子，如CCG；

表2：20种氨基酸密码子表

4：通过分子生物学方法把新的编码目的基因的核苷酸片段插入到表达载体中，而后转入基因工程大肠杆菌，对获得的克隆进行鉴定；

5：将步骤4鉴定正确的含目的基因的表达载体导入沙门氏菌中，并在沙门氏菌中对目的基因进行诱导表达。

目的基因诱导表达后，通过SDS-PEGA电泳或Westen-Blot对表达情况进行鉴定。

本发明的有益效果为：本发明所述异源基因在沙门氏菌中优化表达的方法，通过统计3千多条沙门氏菌基因序列获得沙门氏菌密码子使用频率表，并且通过表达多个不同的外源基因验证，表明如果外源基因按照本发明所公布的沙门氏菌密码子使用频率表选用高频使用密码子，在同等条件下，外源基因表达量将提高2-10倍。

附图说明

图1、SDS-PEGA电泳检测E基因和E突变基因在沙门氏菌中的表达量对比。 E基因表达蛋白的分子量为10.6K而表达载体上表达标签的分子量为20K左右，因此E基因表达的目的条带大小约为30.6K左右。从图1，可以看出基因正常表达。M为蛋白Marker；NC为空白对照组（4h），1，2为E基因表达组分别为2h，4h取样；3，4为突变的E基因表达组分别为2h，4h取样；

图2：SDS-PEGA电泳检测葡萄球菌核酸酶基因和葡萄球菌核酸酶突变基因在沙门氏菌中的表达量对比。葡萄球菌核酸酶基因表达蛋白的分子量为25K，而表达载体上表达标签的分子量为20K左右，因此葡萄球菌核酸酶基因表达的目的条带大小约为45K左右。分析图2可知葡萄球菌核酸酶基因正常表达。M为蛋白Marker；NC为空白对照组（4h），1，2为葡萄球菌核酸酶基因表达组分别为2h，4h取样；3，4为突变的葡萄球菌核酸酶基因表达组分别为2h，4h取样。

具体实施方式

实验一：噬菌体E基因在沙门氏菌中的优化表达

1、首先设计并合成噬菌体E基因特异性引物

E 1S: ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGA 3'

E 1A: TCACTCCTTCCGCACGTAATTTTTG 3'

2、通过PCR扩增获得E基因并测序，其序列为：ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGTTTATTGCTGCCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAACGGCCTGTCTCATCATGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCGCGTTTACCTTGCGTGTACGCGCAGGAAACACTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACGTGCGTCAAAAATTACGTGCGGAAGGAGTGA。

3、然后根据沙门氏菌密码子使用频率表，即表1和氨基酸密码子表，即表2对E基因进行点突变，使其低频率使用密码子变为高频率使用密码子，E基因突变后的序列为：ATGGTGCGCTGGACGTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGCTTATTGCTGCCGTCGTTGCTGATTATGTTCATCCCGTCGACGTTCAAACGCCCGGTCTCGTCGTGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGCTTAAAACCGCTGAATTGCTCGCGTTTACCGTGCGTGTATGCGCAGGAAACGCTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACATGCGTCAAAAATTATGTGCGCAAAGAGTGA。

注：红色碱基为突变了的碱基。

4、使用特异性引物：

E 2S: （Sac I）5' GGGCGAGCTCATGGTGCGCTGGACGTTGTGGGA，

E 2A: （BamH I）5' GGGCGGATCCTCACTCTTTGCGCACATAATTTTTG；

把PCR扩增的E基因和突变后的E基因，分别与pMD-18T 载体相连接，然后转入Top10感受态细胞，并取100μl该培养液均匀涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB 琼脂平板上。正向放入37℃培养箱，等培养板干了之后，倒置培养10～14 h 。挑白色单菌落进行扩大培养，并提取质粒。使用Sac I和BamH I分别对含有E基因和E突变基因的质粒进行双酶切。E基因和E突变基因的双酶切产物与使用Sac I和BamH I双酶切后的pET32a+载体连接在一起，然后转入Top10感受态细胞，挑取阳性菌落，扩大培养后提取质粒。因而获得表达性质粒pET32a-E基因和pET32a-突变的E基因。然后把pET32a-E基因和pET32a-突变的E基因分别转入同一株沙门氏菌中，同时进行诱导表达。取1ml相同OD的含有pET32a-E基因和pET32a-突变的E基因的沙门氏菌加入100ml含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB中进行培养，培养条件为37℃，150转/分。培养3-4小时后分别加入IPTG 至终浓度为1 mmol/L，进行37℃诱导表达，同时设定非诱导对照组。在加入IPTG后的2h、4h时分别对诱导组和4h对照组取样1ml然后离心收集菌液，直接煮沸变性后（5min,100℃），用12%十二烷基黄酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析重组蛋白的表达产物。其结果如图1，其表明按照沙门氏菌密码子使用频率表把E基因的低频率使用的密码子突变为高频率使用的密码子后， E基因的表达效率提高2倍以上。

实验二：葡萄球菌核酸酶基因在沙门氏菌中的优化表达

1、首先设计并合成葡萄球菌核酸酶基因的特异性引物

snA orf 1S: ATGACAGAATACTTATTAAGTG 3' ；

snA orf 1A: TTATTGACCTGAATCAGCGTT 3'。

2、通过PCR扩增获得葡萄球菌核酸酶基因并测序，其序列为：ATGACAGAATACTTATTAAGTGCTGGCATATGCATGGCAATTGTTTCAATATTACTTATAGGGATGGCTATCAGTAATGTTTCGAAAGGGCAATACGCAAAGAGGTTTTTCTTTTTCGCTACTAGTTGCTTAGTGTTAACTTTAGTTGTAGTTTCAAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAGTGGTTCTGAAGATCCAACAGTATATAGTGCAACTTCAACTAAAAAATTACATAAAGAACCTGCGACATTAATTAAAGCGATTGATGGTGATACGGTTAAATTAATGTACAAAGGTCAACCAATGACATTCAGACTATTATTAGTTGATACACCTGAAACAAAGCATCCTAAAAAAGGTGTAGAGAAATATGGCCCTGAAGCAAGTGCATTTACGAAAAAAATGGTAGAAAATGCAAATAAAATTGAAGTCGAGTTTGACAAAGGTCAAAGAACTGATAAATATGGACGTGGCTTAGCGTATATTTATGCTGATGGAAAAATGGTAAACGAAGCTTTAGTTCGTCAAGGCTTGGCTAAAGTTGCTTATGTTTATAAACCTAACAATACACATGAACAACTTTTAAGAAAAAGTGAAGCACAAGCGAAAAAAGAGAAATTAAATATTTGGAGCGAAGACAACGCTGATTCAGGTCAA。

3、然后根据氨基酸密码子表（见表2）和沙门氏菌密码子使用频率表（见表1）对葡萄球菌核酸酶基因进行点突变使其低频率使用密码子变为高频率使用密码子，葡萄球菌核酸酶基因突变后的序列为：

ATGACAGAATACTTATTAAGCGCTGGCATCTGCATGGCAATTGTTTCCATCTTACTTATCGGGATGGCTATCAGCAATGTTTCGAAAGGGCAATACGCAAAGCGCTTTTTCTTTTTCGCTACCAGCTGCTTAGTGTTAACCTTAGTTGTAGTTTCCAGCCTTAGCAGCTCCGCAAATGCATCCCAAACAGATAACGGCGTAAATCGCAGCGGTTCTGAAGATCCGACAGTATATAGCGCAACCTCCACCAAAAAATTACATAAAGAACCGGCGACATTAATTAAAGCGATTGATGGTGATACGGTTAAATTAATGTACAAAGGTCAACCGATGACATTCCGCCTTTTATTAGTTGATACACCGGAAACAAAGCATCCGAAAAAAGGTGTAGAGAAATATGGCCCGGAAGCAAGCGCATTTACGAAAAAAATGGTAGAAAATGCAAATAAAATTGAAGTCGAGTTTGACAAAGGTCAACGCACCGATAAATATGGCCGTGGCTTAGCGTATATTTATGCTGATGGCAAAATGGTAAACGAAGCTTTAGTTCGTCAAGGCTTGGCTAAAGTTGCTTATGTTTATAAACCGAACAATACACATGAACAACTTTTACGCAAAAGCGAAGCACAAGCGAAAAAAGAGAAATTAAATATTTGGAGCGAAGACAACGCTGATTCCGGTCAA。

注：红色碱基为突变了的碱基。

4、使用特异性引物：

snA orf 2S: （Sac I）5' GGGCGAGCTC ATGACAGAATACTTATTAAGTG 3'；

snA orf 2A: （BamH I）5' GGGCGGATCC TTATTGACCTGAATCAGCGTT 3'；

把PCR扩增的葡萄球菌核酸酶基因和突变后的葡萄球菌核酸酶基因，分别于pMD-18T 载体相连接，然后转入Top10感受态细胞，并取100μl该培养液均匀涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB 琼脂平板上。正向放入37℃培养箱，等培养板干了之后，倒置培养10～14 h 。挑白色单菌落进行扩大培养，并提取质粒。使用Sac I和BamH I分别对含有E基因和E突变基因的质粒进行双酶切。葡萄球菌核酸酶基因和葡萄球菌核酸酶突变基因的双酶切产物与使用Sac I和BamH I双酶切后的pET32a+载体连接在一起，然后转入Top10感受态细胞，挑取阳性菌落，扩大培养后提取质粒。因而获得表达性质粒pET32a-葡萄球菌核酸酶基因基因和pET32a-突变的葡萄球菌核酸酶基因。然后把pET32a-葡萄球菌核酸酶基因和pET32a-突变的葡萄球菌核酸酶基因分别转入同一株沙门氏菌中，同时进行诱导表达。取1ml相同OD的含有pET32a-葡萄球菌核酸酶基因和pET32a-突变的葡萄球菌核酸酶基因的沙门氏菌加入100ml含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB中进行培养，培养条件为37℃，150转/分。培养3-4小时后分别加入IPTG 至终浓度为1 mmol/L，进行37℃诱导表达，同时设定非诱导对照组。在加入IPTG后的2h、4h时分别对诱导组和对照组取样1ml然后离心收集菌液，直接煮沸变性后（5min,100℃），用12%十二烷基黄酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析重组蛋白的表达产物。其结果如图2，其表明按照沙门氏菌密码子使用频率表把葡萄球菌核酸酶基因的低频率使用的密码子突变为高频率使用的密码子后，葡萄球菌核酸酶基因的表达效率提高3倍以上。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims

1.外源基因在沙门氏菌中优化表达的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

步骤1：从NCBI数据库中获得沙门氏菌基因的开放阅读框，将开放阅读框转化成为氨基酸序列，然后按照三个核苷酸编码一个氨基酸的方法，逐一统计每个沙门氏菌基因的开放阅读框的每个氨基酸对应的核苷酸，即编码氨基酸的核苷酸密码子，最终获得沙门氏菌密码子使用频率表；

步骤2：分析沙门氏菌密码子使用频率表可知，其中密码子UAA、UGA、UAG、CGA、AGA、AGG、UGU使用的频率最低；而CUA、UCU、UGC、UCA 、CCU、CCC、CCA、CGG、AGU、AUA、ACA、GGA、CAC和ACU密码子使用频率较高；其余密码子使用频率最高；

步骤3：克隆或者合成目的基因，并且测定其核苷酸序列，根据上述沙门氏菌密码子使用频率表和氨基酸密码子对应表，在不改变氨基酸的情况下，通过分子突变或者基因合成的方式，把所述目的基因中沙门氏菌使用频率最低和较高的密码子突变成为使用频率最高的密码子，获得新的编码目的基因的核苷酸片段；

步骤4：通过分子生物学方法把新的编码目的基因的核苷酸片段插入到表达载体中，而后转入基因工程大肠杆菌，对获得的克隆进行鉴定；

步骤5：将步骤4鉴定正确的含目的基因的表达载体导入沙门氏菌中，并在沙门氏菌中对目的基因进行诱导表达。

2.如权利要求1所述的外源基因在沙门氏菌中优化表达的方法，其特征在于，还包括步骤6：目的基因诱导表达后，通过SDS-PEGA电泳或Westen-Blot对表达情况进行鉴定。