CN106497961B - 一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法 - Google Patents

一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法 Download PDF

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Abstract

一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，所述的芽胞杆菌为phop基因缺失的缺失株；所述的芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌，地衣芽胞杆菌或解淀粉芽胞杆菌。其制备方法如下：1)以芽胞杆菌基因组为模板，扩增phop的上下游片段，然后将该上下游片段连接起来；2)将连接好的phop上下游同源臂插入敲除载体，构建phop基因敲除载体；3)将构建的phop基因敲除载体电转化至芽胞杆菌，通过常规的基因敲除方法，得到phop缺失的芽胞杆菌。通过在相关芽胞杆菌中敲除phop，构建phop缺失重组菌株，可以显著提高芽胞杆菌生物量。其中，在液体发酵条件下，枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌的生物量分别提高了1.33倍、1.64倍和1.54倍。由此表明，phop的缺失可显著提高芽胞杆菌生物量。

Description

一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法
技术领域
本发明涉及一种提高芽胞杆菌生物量的芽胞杆菌，特别是提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法。
背景技术
芽胞杆菌是广泛存在于自然界的一种革兰氏阳性菌，大多数的芽胞杆菌被认为是生物安全性菌株(GRAS)，通过芽胞杆菌发酵可以合成多种生物产品，如：细胞分裂素、絮凝剂、杆菌肽、聚γ-谷氨酸、地衣素、乙偶姻及丁二醇等。同时，芽胞杆菌也具有良好的外源蛋白分泌能力，具备成为良好外源蛋白表达宿主菌的条件。通过代谢工程改造和发酵工艺优化，芽胞杆菌可以高效合成多种生物化工产品，满足人类的不同需求。同时部分芽胞杆菌发酵还可以抑制枯萎病的发生。因此在芽胞杆菌的发酵生产中，无论是对于菌剂还是目标化合物的合成，单位时间内获得最多的生物量具有重要的意义，而微生物生物量更是微生物生理研究及其工业应用中必不可少的监测参数。
Phop-phoR是芽胞杆菌中广泛存在一种重要的双组子调控因子，在低磷环境下，感应激酶PhoR可以自磷酸化，并且将获得的磷酸基团转移到调控因子Phop上，从而激活phop的表达水平。相关文献报道，基因phop对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株中fengycin的合成具有正调控功能；PhoQ/PhoP是序列保守的铜绿假单胞菌二元信号传导因子，其可以介导细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性。与此同时，相关研究也指出，phop也可以直接负调控氮代谢相关基因的表达，从而影响生物体对氮源的利用效率。phop的缺失可以显著提高细胞对氮源的利用水平，从而提高菌体的生物量。
发明内容
本发明提供了一种可以显著提高芽胞杆菌的生物量的基因工程改造方法。
一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，针对芽胞杆菌，敲除其基因phop，获得phop缺失的芽胞杆菌缺失株。所述的芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌，地衣芽胞杆菌或解淀粉芽胞杆菌。
制备所述提高生物量的基因工程改造芽胞杆菌的方法，其步骤如下：
1)以芽胞杆菌基因组为模板，扩增phop基因上下游片段，然后将该上下游片段连接起来，形成phop上下游同源臂；
2)将phop基因缺失片段插入敲除载体，构建phop基因敲除载体；
3)将构建的phop基因敲除载体电转化至芽胞杆菌，通过同源双交换，得到phop缺失的芽胞杆菌。
步骤1)中利用引物通过PCR的方法扩增出phop上下游同源臂序列A和B；所述的引物，其中枯草芽胞杆菌中用于上下游同源臂扩增的引物分别为Bs-phop-KF1/R1，Bs-phop-KF2/R2；地衣芽胞杆菌中用于上下游同源臂扩增的引物分别为Bl-phop-KF1/R1，Bl-phop-KF2/R2；解淀粉芽胞杆菌中用于上下游同源臂扩增的引物分别为Ba-phop-KF1/R1，Ba-phop-KF2/R2；步骤2)中通过SOE的方法将A和B连到一起，构成A+B，随后用XbaI和BamHI双酶切A+B片段，并与经相同内切酶酶切后的质粒连接；所述的质粒为T2(2)-Ori质粒；步骤3)中通过电转法将质粒电转至芽胞杆菌。之后采用验证引物T2-F/R对转化子进行菌落PCR验证，并对阳性转化子抽质粒进行双酶切和测序验证；所述的液体发酵培养条件为，发酵温度25-45℃，250mL三角瓶中装液量20-100mL，摇床转速180r/min，发酵周期48h。
附图说明
图1为基因phop敲除载体的构建图(上下游同源臂扩增胶图)；
图2为敲除载体转化枯草芽胞杆菌168菌落PCR验证图；
图3为枯草芽胞杆菌168△phop敲除菌株构建验证PCR图；
图4为枯草芽胞杆菌168及168△phop生长曲线；
图5为地衣芽胞杆菌WX-02及WX-02△phop生长曲线；
图6为解淀粉芽孢杆菌LX-12及LX-12△phop生长曲线；
图7为枯草芽胞杆菌168及168△phop生物量；
图8为地衣芽胞杆菌WX-02及WX-02△phop生物量；
图9为解淀粉芽胞杆菌LX-12及LX-12△phop生物量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的优越性作进一步说明，但不构成对本发明的限制。
实施步骤一、芽胞杆菌中phop敲除载体的构建
以枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168(CCTCC NO：ATCC23857)为例介绍phop敲除载体的构建。根据枯草芽胞杆菌168的全基因组序列及调控因子基因phop序列，设计引物，引物分别为Bs-phop-KF1/R1，Bs-phop-KF2/R2，采用PCR的方法扩增出phop上下游同源臂序列A和B；并通过SOE的方法将A和B连到一起，构成A+B，随后用XbaI和BamHI双酶切A+B片段，并与经相同内切酶酶切后的T2(ori)质粒连接，转化DH5α。采用验证引物T2-F/R对转化子进行菌落PCR验证，并对阳性转化子克隆抽质粒进行双酶切和测序验证，最终得到phop的敲除载体。
如下图1所示为基因phop敲除载体的构建图(上下游同源臂扩增胶图)，泳道2、3分别为phop的上下游同源臂A和B。泳道1：5K DNA marker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。采用相同的方法构建了地衣芽胞杆菌WX-02，解淀粉芽胞杆菌LX-12中phop的敲除载体。
枯草芽胞杆菌敲除载体引物：
Bs-phop-KF1 GCCGAGCTCAAAGGCGGAGGCGAAATCGTG
Bs-phop-KR1 GTAGATCGGTTTTTTGGTATTGATTCTTCATCATCCACAAC
Bs-phop-KF2 GTTGTGGATGATGAAGAATCAATACCAAAAAACCGATCTAC
Bs-phop-KR2 GCTCTAGAAAATGCGGTACAAAGACTGGC
地衣芽胞杆菌敲除载体引物：
Bl-phop-KF1 GCTCTAGACAGGTGCTCAGTTATTTGAGGG
Bl-phop-KR1 GCTTTTTGCGGAGTCTTTGAAATTCCTGAAGAACCGTTATTGAC
Bl-phop-KF2 GTCAATAACGGTTCTTCAGGAATTTCAAAGACTCCGCAAAAAGC
Bl-phop-KR2 CGGGATCCTGCCTACTTTTGTGCCTTCA
解淀粉芽胞杆菌敲除载体引物：
Ba-phop-KF1 GCCGAGCTC TTATCCCGAAAGACCGTC
Ba-phop-KR1 TTGGCTCCTCCAGTTTATCGCCCTCCGCTGTCTATT
Ba-phop-KF2 AATAGACAGCGGAGGGCGATAAACTGGAGGAGCCAA
Ba-phop-KR2 GCTCTAGA CGGGACGTCATGTTTGTAT
实施步骤二、芽胞杆菌中phop敲除菌株的构建
地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02中phop敲除菌株的构建，其方法和步骤与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168中phop敲除菌株类似。芽胞杆菌感受态的制备方法如下：首先在平板上活化菌种，然后挑菌至含有5mL LB的PA瓶中，37℃过夜培养，随后以5％的接种量转接至生长培养基中，37℃，200rpm培养至OD600到0.85左右，5500rpm离心6min收集菌体，用洗涤培养基重悬菌体，5500rpm离心6min，重复三次后加入1mL洗涤培养基重悬菌体，分装至灭过菌的1.5mL EP管中，-80℃保存。
将吹干后的电转杯在冰上预冷15min，然后将100μL的枯草芽胞杆菌168的感受态细胞与10μL重组载体混匀后加入电转杯中，冰上预冷3-5min后，2.4kV条件下点击，电击时间4.8-5.2ms，随后立即加入800μL恢复培养基并转移至1.5mLEP管中。37℃，100rpm培养3h后涂LB平板(20μg/mL卡纳抗生素)。待长出转化子后挑菌进行菌落PCR验证和抽质粒验证，验证正确后保存菌种。验证引物为T2-F/R。
再对其进行单交换菌株的获得及鉴定，以枯草芽胞杆菌(B.subtilis)168中phop基因敲除的方法为例：首先挑取阳性枯草芽胞杆菌转化子接种于含20μg/mL卡纳抗生素的液体LB中45℃培养，对液体培养物稀释106倍涂布含卡纳抗性的平板，放置45℃培养箱直至长出单菌落；挑选单菌落在卡纳抗性的平板划线，进行PCR的验证，此时所用引物为T2-F和双交换的下游引物或T2-R和双交换的上游引物。PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
对上面所得到的单交换菌株进行双交换传代培养，培养温度为37℃，培养时间每代8h，不加抗生素，将第6代培养物稀释106倍涂布LB平板，放置37℃培养箱中直至长出单菌落，随后将单菌落分别对应点种于含卡纳霉素和不含卡纳霉素的LB平板上，对在LB上长，卡纳不长的单菌落采用双交换引物进行PCR验证，筛选双交换菌株，对于阳性克隆进行PCR验证并进行测序。
图2为敲除载体转化枯草芽胞杆菌168菌落PCR验证图，泳道1为载体构建中的菌落PCR验证胶图，泳道2：5K marker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，所用引物为载体上的验证引物T2-F/R；图3为枯草芽胞杆菌168中phop的敲除验证胶图。泳道2：野生菌的双交换验证的菌落PCR胶图，泳道3：缺失株的双交换验证的菌落PCR胶图，泳道1：5K marker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，泳道1和2所用引物为双交换验证引物Bs-phop-KYF/KYR。从图中可以看出，phop已经从基因组中敲除。采用同样的方法，成功的敲除了地衣芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌中的phop，构建了相关芽胞杆菌中的基因phop缺失株。
用于转化子验证的引物为：
T2-F ATGTGATAACTCGGCGTA
T2-R GCAAGCAGCA GATTA CGC
芽胞杆菌中用于phop敲除验证引物分别为：
枯草芽胞杆菌中验证引物：
Bs-phop-KYF TGATACGGCAAGATTCAGAACA
Bs-phop-KYR AATGGCAAGGCTGTTCATCGC
地衣芽胞杆菌中验证引物：
Bl-phop-KYF AAAAACATCGTCGATGCACACA
Bl-phop-KYR TCTTGACTTGTGAGGTGGCATCT
解淀粉芽胞杆菌中验证引物：
Ba-phop-KYF GTTCCTCTCGTCCGTTATTCC
Ba-phop-KYR TGCGTAACCGCTGTAGGA
实施步骤三：phop缺失对芽胞杆菌生物量的影响
检测phop敲除后的芽胞杆菌的表达，主要是在相关菌株的液体发酵，其流程依次为：将枯草芽胞杆菌，地衣芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌及其相应的缺失株分别接种于液体发酵培养基中，检测phop缺失对其生物量的影响，其测定步骤如下：
(1)种子培养：
种子培养基为LB培养基：10g/L蛋白胨；5g/L酵母浸出粉；10g/L氯化钠；pH 7.0-7.2；固体培养基加琼脂18g/L；
种子培养条件：培养温度为37℃，250mL三角瓶中装液量为50mL，摇床转速180r/min，培养时间为10h；
(2)液体发酵培养：
所用的液体发酵培养基：
LB培养基：8-10g/L蛋白胨；3-5g/L酵母浸出粉；8-10g/L氯化钠；pH7.0-7.2；
ME培养基：20-25g/L一水合谷氨酸钠；10-12g/L二水和柠檬酸三钠；5-7g/L氯化铵；0.5-0.8g/L磷酸氢二钾；0.2-0.5g/L硫酸镁；0.02-0.04g/L氯化亚铁；0.05-0.15g/L氯化钙；0.1-0.3g/L硫酸锰；pH7.0-7.2；
液体发酵培养条件：发酵温度为25-45℃，250mL三角瓶中装液量20-100mL，摇床转速180r/min，发酵周期48h。
以枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168及其phop缺失株的液体发酵为例。在平板上活化野生菌及其缺失株，挑菌接至含有50mL液体LB的250mL三角瓶中，37℃，180rpm培养10h，随后以1％的接种量接种至发酵培养基中，37℃，180rpm培养48h。在此期间每4h取样绘制菌株生长曲线，以此研究菌体生物量的生成情况。采用同样的方法，测定phop缺失对地衣芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌生物量的影响。
图7-9分别为枯草芽胞杆菌168、地衣芽胞杆菌WX-02、解淀粉芽胞杆菌LX-12及其phop缺失株在液体发酵条件下的生物量。再对芽胞杆菌液体发酵进行生长曲线的绘制，如图4-6分别为枯草芽胞杆菌168、地衣芽胞杆菌WX-02、解淀粉芽胞杆菌LX-12及其phop缺失株在液体发酵条件下的生长曲线。其步骤为，取2mL发酵液于2mL EP管中，10000rpm离心5min后上清转移至另外一个2mL EP管中，按照相应的稀释倍数测得OD600数值。如下图7-9所示：地衣芽胞杆菌，枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌phop缺失菌的生物量相比于野生菌分别提高了1.33倍，1.64倍和1.54倍，表明phop缺失后生物量显著提高。
当然，以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。除上述实施例外，本发明还可以有其它实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (8)

1.一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，其特征在于：针对芽胞杆菌，敲除其基因phop，获得phop缺失的芽胞杆菌缺失株，所述的芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌，地衣芽胞杆菌或解淀粉芽胞杆菌。
2.根据权利要求1所述一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，其步骤如下：
1)以芽胞杆菌基因组为模板，扩增基因phop上下游片段，然后将该上下游片段连接起来，形成phop上下同源臂片段；
2)将phop上下同源臂片段插入敲除载体中，构建phop基因敲除载体；
3)将构建好的phop基因敲除载体电转化至芽胞杆菌中，通过同源双交换，得到基因phop缺失的芽胞杆菌。
3.根据权利要求2所述一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，其特征在于，步骤1)中利用引物通过PCR的方法扩增出phop上下游同源臂序列A和B。
4.根据权利要求3所述一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，其特征在于，所述的引物，其中枯草芽胞杆菌中用于上下游同源臂扩增的引物分别为：
Bs-phop-KF1GCCGAGCTCAAAGGCGGAGGCGAAATCGTG
Bs-phop-KR1GTAGATCGGTTTTTTGGTATTGATTCTTCATCATCCACAAC
Bs-phop-KF2GTTGTGGATGATGAAGAATCAATACCAAAAAACCGATCTAC
Bs-phop-KR2GCTCTAGAAAATGCGGTACAAAGACTGGC；
地衣芽胞杆菌中用于上下游同源臂扩增的引物分别为：
Bl-phop-KF1GCTCTAGACAGGTGCTCAGTTATTTGAGGG
Bl-phop-KR1GCTTTTTGCGGAGTCTTTGAAATTCCTGAAGAACCGTTATTGAC
Bl-phop-KF2GTCAATAACGGTTCTTCAGGAATTTCAAAGACTCCGCAAAAAGC
Bl-phop-KR2CGGGATCCTGCCTACTTTTGTGCCTTCA；
解淀粉芽胞杆菌中用于上下游同源臂扩增的引物分别为：
Ba-phop-KF1GCCGAGCTC TTATCCCGAAAGACCGTC
Ba-phop-KR1TTGGCTCCTCCAGTTTATCGCCCTCCGCTGTCTATT
Ba-phop-KF2AATAGACAGCGGAGGGCGATAAACTGGAGGAGCCAA
Ba-phop-KR2GCTCTAGA CGGGACGTCATGTTTGTAT。
5.根据权利要求3所述一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，其特征在于，步骤2)中通过SOE的方法将A和B连到一起，构成A+B，随后用XbaI和BamHI双酶切A+B片段，并与经相同内切酶酶切后的质粒连接。
6.根据权利要求5所述一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，其特征在于，所述的敲除质粒为T2(2)-Ori质粒。
7.根据权利要求2所述一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，其特征在于，步骤3)中通过电转化将质粒电转至芽胞杆菌。
8.根据权利要求2所述一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，其特征在于，采用验证引物T2-F/R对转化子进行菌落PCR验证，并对阳性转化子抽质粒进行双酶切和测序验证，所述验证引物T2-F/R的基因序列为：
T2-F ATGTGATAACTCGGCGTA
T2-R GCAAGCAGCA GATTA CGC。
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