CN105755013A - 一种红霉素的合成调控基因phoP及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种红霉素的合成调控基因phoP及其制备方法和应用。所述合成调控基因phoP的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO:1所示核苷酸编码相同蛋白(其蛋白序列为SEQ ID NO:2所示)的核苷酸序列，或是编码将SEQ ID NO:2蛋白经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO:2相同功能的蛋白突变体的核苷酸序列。本发明通过高表达phoP基因，提高了红霉素合成相关基因的转录水平，增加了红霉素合成效率，具有广阔的应用前景。

Description

一种红霉素的合成调控基因phoP及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种红霉素的合成调控基因phoP及其制备方法和应用。
背景技术
红霉糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)是一种革兰氏阳性丝状细菌，它最初被认为属于链霉菌属，曾一度被称为“红色链霉菌”(Streptomyceserythraeus)，但是后来进一步研究发现它其实是属于糖多孢菌属。
糖多孢红霉菌在工业上广泛用于红霉素(erythromycin,Er)的规模化生产。红霉素是一种抗革兰氏阳性细菌的天然广谱抗生素,在医药畜牧业上都得到了应用,尤其是在抗菌治疗上有着重要意义。这种大环内酯类的广谱抗生素自J.M.McGurie最初发现至今已有逾六十年历史。然而红霉素因其高效的治疗效果和使用的安全性至今仍然在医药界被广泛应用。红霉素的组要活性组分是红霉素A。此后，人们对红霉素A的分子结构进行改造并由此演变出丰富多样更加有效的衍生物。迄今，红霉素的应用和改造可以分为三代。第一代的红霉素不耐酸，易被胃酸降解成了其致命缺点。半合成的第二代衍生物比如克拉霉素(Clarithromycin)和阿奇霉素(Azithromycin)和第三代衍生物酮内酯类抗菌药(ABT-773和HMR-3647)不仅具有更好的疗效作用，也增加了红霉素A作为初始原料的使用需求，从而推动了整个红霉素在医药市场的发展。
传统的菌株改造采用的是突变-筛选模式来获得高产菌株，提高红霉素产量。这种突变-筛选模式主要基于对野生菌的多轮随机诱变，进而大量筛选得到高产的突变菌株。这种近乎暗箱操作的菌株优化方法不仅耗时耗力且往往效率低下。70年代以来工业微生物的基因改造技术为工业微生物的理性改造提供了巨大潜力。随着测序技术的进步，2007年剑桥大学的研究者们完成了对红霉糖多孢菌野生株(S.erythraeaNRRL23338)全基因组的测序工作。加之清晰的红霉素生物合成的分子生物学过程，使得通过基因工程的手段来提高红霉素产量、优化组分或合成新型抗生素，显示出了广阔的前景。
通过基因工程改造红霉糖多孢菌以提高红霉素产量有两个策略：一是在对红霉素合成生化途径的了解的基础上，通过理性改造提高红霉素合成前体丙酰辅酶A(propionyl-CoA)和甲基丙二酰辅酶A(methylmalonyl-CoA)的代谢流；二是高表达红霉素合成调控基因，提高红霉素合成相关基因的转录水平，增加红霉素合成效率。但是，不同于其他抗生素生产菌，红霉糖多孢菌基因组中尚未发现红霉素合成的直接高效调控基因。因此，现在研究的重点仍然是红霉素合成途径和前体供给回路。这些现状都直接提出了对于抗生素合成调控相关基因的研究的紧迫性，这也是目前对于放线菌领域研究的重要部分。
基于上述研究，本发明通过生物信息学及分子生物学研究发现红霉糖多孢菌磷代谢调控基因phoP编码的双组分调控蛋白PhoP直接激活红霉素合成基因的转录。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种新的促进红霉素生物合成的调控基因phoP及其制备方法和应用。并且，提供一种使用该调控基因phoP促进红霉素合成并提高红霉素产率的方法，利用该方法获得红霉素高产菌株。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种红霉素的合成调控基因phoP，所述合成调控基因phoP的核苷酸序列选自下列三种中的一种：
(1)序列表中的序列SEQIDNO:1；
(2)与SEQIDNO:1所示核苷酸编码相同蛋白的核苷酸序列，所述编码相同蛋白的序列为SEQIDNO:2所示；
(3)编码将SEQIDNO:2蛋白经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNO:2相同功能的蛋白突变体的核苷酸序列。
所述合成调控基因phoP的制备方法，该合成调控基因phoP来源于放线菌，通过过表达红霉糖多孢菌基因组中的phoP基因，得到突变菌。
所述phoP基因的过表达通过重组整合插入基因组内的方法实现。
所述制备方法还包括双交换同源重组基因敲除的方法，步骤如下：
1)在过表达质粒pIB139的MCS内插入预过表达基因phoP的CDS基因编码序列，得到phoP基因过表达的pIB139-phoP质粒；
2)将phoP基因过表达的质粒pIB139-phoP质粒通过原生质体转化方法导入到预先制备的红霉糖多孢菌野生株原生质体中，得到phoP基因过表达的突变菌；
3)在含安普霉素抗性平板上筛选突变菌，并通过PCR和RT-PCR的方法验证突变菌。
所述合成调控基因phoP用于正向调控红霉素的生物合成。
所述正向调控是通过基因工程手段提高红霉糖多孢菌phoP基因或同源基因的转录表达水平，提高红霉素合成产率。
所述红霉糖多孢菌是红霉素合成菌。
通过敲除所述合成调控基因phoP的phoP基因得到突变株。
所述突变株用于调控红霉素产量。
本发明利用转座插入基因技术构建了phoP基因过表达工程菌株，检测其与红霉素生物合成的关系；与未过表达的野生型菌株相比，phoP基因过表达工程菌株的红霉素产量明显提高。
附图说明
图1是phoP基因编码调控蛋白PhoP结合红霉素合成基因启动子的EMSA实验图；
图2是phoP基因过表达突变菌的PCR和RT-qPCR验证图；
图3是phoP基因过表达提高了红霉素合成基因转录水平；
图4是phoP基因过表达菌与野生菌的生长和红霉素合成效果对比图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案进行具体描述，但实施例只用于对本发明进一步说明，并不限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中培养基配方如下：
LB培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeastextract)5g/L，氯化钠10g/L，将pH调节至7.0，121℃高温高压灭菌20分钟，烘箱干燥后置于常温备用。
TSB液体培养基：称取商品化的TSB培养基干粉30g溶于800ml去离子水定容至1L，分装所需小玻璃摇瓶(对于所有放线菌的培养需加入一定量的玻璃珠)，于115℃高压灭菌，烘箱干燥后置于常温备用。
R3M固体培养基：蔗糖103g，硫酸钾0.25g，氯化镁10.12g，葡萄糖10g，酵母提取物4g，酪蛋白氨基酸水解物(Casaminoacids)4g，胰蛋白胨4g，琼脂粉22g,用双蒸水830ml溶解后，分装200ml/瓶，121℃高压灭菌20min。在使用前加以下进行灭菌处理的溶液：4.0mL50％Glucose，4.0mL2.5mol/LCaCl2，4.0mL2.5mol/LMgCl2，2.5mL2mol/LTris-HCl(pH7.0)，0.5mL1mol/LNaOH，74μL0.5mol/LKH2PO4，40μL微量元素。
微量元素混合液(Traceelementsolution)：氯化锌40mg，氯化铁200mg，氯化铜10mg，氯化锰10mg，硼酸钠10mg，钼酸铵10mg，溶解到1L去离子水。
实施例1
利用凝胶迁移实验(EMSA)验证PhoP蛋白和红霉素合成相关基因的启动子结合能力，如图1所示，PhoP直接结合红霉素合成基因簇中4个启动子调控区，证实了PhoP能直接调控红霉素合成基因的转录。
利用重组整合技术构建phoP基因过表达工程菌
phoP基因过表达质粒的构建：
pIB139质粒是以整合型质粒pSET152为基础，在其多克隆位点插入链霉菌常用的强启动子PermE*构建而成；pIB139是链霉菌基因工程操作较为常用的质粒。为了过表达红霉糖多孢菌基因组中的phoP基因，分别用GphoP-f和GphoP-r为引物，以红霉糖多孢菌基因组为模板，PCR扩增phoP基因的DNA片段。
扩增phoP基因DNA片段所用引物为：
GphoP-f:5'-GGAATTCCATATGGTGACCAGGGTGCTGATCGTG-3'
GphoP-r:5'-GACGATATCCTACACCTCGAACTTGTAGCCGA-3'
分别将上述DNA片段连接到pIB139质粒的强启动子PermE*后，构建完成敲除质粒pIB139-phoP。
红霉糖多孢菌原生质体制备方法：
1)按1％接种红霉糖多孢菌野生株于50mlTSB(含0.4g甘氨酸)液体培养基，30℃摇床振荡培养至生长对数期，镜检观察菌体是否有杂菌污染；
2)3000rpm离心10min收集菌体，用事先灭菌的20ml蔗糖溶液(10.3％)吹打洗涤一次，再用10ml改P缓冲液洗涤两次；
3)用10ml改P缓冲液充分悬浮菌丝体后，加入配置好的溶菌酶(Sigma，50mg/ml)使其终浓度为0.55mg/ml，温和混匀后置于30℃恒温水浴锅中孵育65min，过程中需用无菌枪头轻轻吹打2～3次，镜检观察菌体的酶解情况；
4)将溶菌酶处理后的菌液全部转移至事先灭菌处理过的孢子过滤器中，过滤下来的液体即为原生质体，然后3000rpm低温离心约7min；
5)用适量的改P缓冲液轻柔地将原生质体悬浮，然后分装到1.5ml的无菌离心管(每管50μl)保存于-80℃冰箱备用。
原生质体转化步骤：
将上述制备好的敲除质粒pIB139-phoP通过PEG介导的方法导入到上述制备好的红霉糖多孢菌原生质体中，其具体步骤如下：
1)向红霉糖多孢菌原生质体中加入约20μl事先构建好的pIB139-phoP过表达质粒，然后迅速加入200μlPEG-T缓冲液；
2)轻柔吹吸充分混匀后，将EP管中的菌液全部均匀涂布于无抗的R3M平板上；
3)在30℃恒温培养箱中培养约24h至表面稍为干燥时，加入1ml稀释的筛选抗生素(apr的终浓度为30μg/mL)；
4)培养3～5天后，待平板上长出单克隆菌落后即可进入后续的筛选工作。突变株的筛选和验证：
在上述长出转化子的抗性平板上挑取单克隆菌落，接种到安普抗性TSB培养基中培养48h，抽提基因组，分别用安普抗性基因验证引物A1/A2，及重组质粒接头引物Y1/Y2通过PCR验证和测序验证突变株构建成功(见图2A和图2B)，突变菌命名为OphoP。
验证引物为：
A1：5'-GTGCAATACGAATGGCGA-3'
A2：5'-GCCAATCGACTGGCGAGC-3'
Y1：5'-TGGCGAGAGGTGCGGG-3'
Y2：5'-GTTGTGTGGAATTGTGAGCGG-3'
实施例2
phoP基因过表达工程菌的生长、基因转录及红霉素产量的测定
菌体生长量的测定：
红霉糖多孢菌野生型菌株和OphoP菌在R2YE平板上活化，分别到TSB液体培养基中。30℃，200rpm恒温振荡培养箱培养，分别在20h、40h、60h、80h、100h时取样，稀释到一定范围，测定OD600，每个时间点每个菌株收集3个样，读取OD值时也重复三次，并用荧光定量PCT(RT-PCR)分析红霉素合成基因的表达情况。
如图3所示，phoP的过表达提高了红霉素相关基因的转录水平。
结果如图4A所示，phoP的过表达对敲除菌的生长并没有太大影响，野生株和过表达菌株的生长速度和生物质积累量无明显差别，表明phoP的缺失对菌体的生长并无太大影响。
红霉素的测定：
红霉素的含量采用生物法测定。留存80h取样的菌液，高速离心，其上清中含有红霉素，沉淀的菌体烘干称其干重。取6ul垂直点加在于预涂有枯草杆菌(检测菌)的LB固体检测平板表面，并置于恒温培养箱培养至枯草杆菌生长出一层菌苔。并用同体积的标准浓度抗生素制作标准曲线。
由于扩散作用，在琼脂块附近的培养基含有抗生素使检测菌枯草杆菌无法生长，从而形成圆形的透明抑菌圈，测定透明圈的直径即可判定上清液中抗生素的浓度，通过计算，便可得知单位产量。
红霉素合成的测定结果如图4B，比较单位菌体产生的红霉素水平，phoP过表达株比野生株红霉素产量高；说明在营养丰富的TSB培养基中生长，phoP的过表达会导致红霉素合成提高，phoP对于红霉素的合成具有激活作用。
表明，phoP基因过表达会提高红霉糖多孢菌的红霉素产量，是红霉素合成的正向调控基因。
综上所述仅为发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (9)

1.一种红霉素的合成调控基因phoP，其特征在于，所述合成调控基因phoP的核苷酸序列选自下列三种中的一种：
(1)序列表中的序列SEQIDNO:1；
(2)与SEQIDNO:1所示核苷酸编码相同蛋白的核苷酸序列，所述编码相同蛋白的序列为SEQIDNO:2所示；
(3)编码将SEQIDNO:2蛋白经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNO:2相同功能的蛋白突变体的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的合成调控基因phoP的制备方法，其特征在于，所述合成调控基因phoP来源于放线菌，通过过表达红霉糖多孢菌基因组中的phoP基因，得到突变菌。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述phoP基因的过表达通过重组整合插入基因组内的方法实现。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括双交换同源重组基因敲除的方法，步骤如下：
1)在过表达质粒pIB139的MCS内插入预过表达基因phoP的CDS基因编码序列，得到phoP基因过表达的pIB139-phoP质粒；
2)将phoP基因过表达的质粒pIB139-phoP质粒通过原生质体转化方法导入到预先制备的红霉糖多孢菌野生株原生质体中，得到phoP基因过表达的突变菌；
3)在含安普霉素抗性平板上筛选突变菌，并通过PCR和RT-PCR的方法验证突变菌。
5.权利要求1所述的合成调控基因phoP的应用，其特征在于，所述合成调控基因phoP用于正向调控红霉素的生物合成。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述正向调控是通过基因工程手段提高红霉糖多孢菌phoP基因或同源基因的转录表达水平，提高红霉素合成产率。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述红霉糖多孢菌是红霉素合成菌。
8.权利要求1所述的合成调控基因phoP的应用，其特征在于，通过敲除所述合成调控基因phoP的phoP基因得到突变株。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述突变株用于调控红霉素产量。
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