CN110229772A - 一种提高七稀甲萘醌产量的重组枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一种提高七稀甲萘醌产量的重组枯草芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种提高七稀甲萘醌产量的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明通过对枯草芽孢杆菌染色体上MK‑7生物合成途径相关基因的改造，构建得到14株重组菌BS1～BS14，其中BS6～BS14使得MK‑7的产量得到了显著提高，最高可达33.5mg/L，是原始菌株的野生型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的产量的3.53倍。本发明还提供了一种改造微生物中MK‑7生物合成途径提高MK‑7产量的方法，为构建MK‑7的高产菌株提供了理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高七稀甲萘醌产量的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。
背景技术
维生素K是一类重要的脂溶性维生素，作为γ-谷氨酸羧化酶的辅因子，通过激活基质Gla蛋白，让更多的钙沉积到骨骼里，让更少的钙沉积到软组织(尤其是血管)里，促进骨骼的发育和健康，能逆转骨质疏松。比如能帮助“骨钙素”和必要的矿物质结合起来。保护血管，防止动脉粥样硬化和心血管疾病。除了能让钙少沉在血管里，它还能让脂蛋白和白细胞少堆积在血管壁上，还能降低血管平滑肌细胞的死亡率——当得上“血管卫士”之名。
维生素K是一系列化合物的总称，其核心结构是2-甲基-1,4-甲萘醌环，但是侧链结构的长度和饱和度有所不同。维生素K在自然界中包含两种形式：维生素K1和维生素K2。其中维生素K2具有很多种亚型，特点是含有一个可变的侧链结构，由不同数量的异戊二烯基组成，这类维生素可以简称为MK-n，M代表甲萘醌，K代表维生素K，n代表异戊二烯基的数量，最常见的是MK-4和MK-7。在血液中MK-7比MK-4具有更长的半衰期，能够更好的被生物利用。因此，由于其半衰期长、生物利用度好，MK-7在食品、制药和保健行业更受欢迎，被广泛用作膳食补充剂或药物，用于治疗骨质疏松症、动脉钙化、心血管疾病、癌症和帕金森精神病等。
采用化学合成的七稀甲萘醌(MK-7)分子中的异戊二烯侧链多为顺式结构，且副产物多，原料来源受到限制，已经逐步被生物发酵法所替代。但目前生物发酵法生产MK-7多局限于利用纳豆芽孢杆菌固态发酵纳豆，此种工艺需要对纳豆进行前处理，工艺步骤多，发酵周期长，并且后期提取复杂，产品纯度不高。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)常被广泛用在食品酶制剂及重要营养化学品的生产中，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是高效合成MK-7的有效途径。然而，MK-7的合成途径十分复杂，且枯草芽孢杆菌合成MK-7的代谢流通量不足，将严重影响MK-7的合成。如何调整枯草芽孢杆菌代谢流供给，增加MK-7的合成是一个值得深入探讨的问题。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种提高七稀甲萘醌产量的重组枯草芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168为出发菌株，利用P43启动子替换染色体上甲基萘醌异分支酸合成酶基因menF和二羟基萘甲酸合成酶基因menB的天然启动子；利用Phbs启动子替换染色体上O-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶基因menE、转酮酶基因tkt的天然启动子；用P43启动子在染色体上表达外源异分支酸合酶entC基因、外源磷酸烯醇式丙酮酸合酶ppsA基因，并敲除染色体上的葡萄糖磷酸转运酶基因ptsG；所述P43启动子的序列如SEQ ID NO.3所示；所述Phbs启动子的序列如SEQ ID NO.5所示。
在一种实施方式中，所述menF基因的序列如genebank ID：937190所示；所述menB基因的序列如genebank ID：937195所示；所述menE基因的序列如genebank ID：937132所示；所述tkt基因的序列如genebank ID：937377所示；所述entC基因的序列如genebank ID：945511所示；所述ppsA基因的序列如genebank ID：946209所示；所述ptsG基因的序列如genebank ID：939255所示。
在一种实施方式中，所述重组菌是Bacillus subtilis 168,P43-menF，其是通过启动子P43替换枯草芽孢杆菌染色体上menF的天然启动子来增强甲基萘醌异分支酸合成酶(menF，genebank ID：937190)基因的表达，并将其命名为BS1。
在一种实施方式中，所述重组菌在BS1的基础上还做了如下改造：利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌168染色体上二羟基萘甲酸合成酶(menB，genebank ID：937195)基因的天然启动子，得到菌株Bacillus subtilis 168,P43-menF P43-menB，将其命名为BS2。
在一种实施方式中，所述重组菌在BS2的基础上还做了如下改造：利用Phbs启动子(序列如SEQ ID NO.5所示)替换枯草芽孢杆菌中O-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶(menE，genebank ID：937132)基因的天然启动子，得到Bacillus subtilis 168,P43-menF P43-menB Phbs-menE，将其命名为BS3。
在一种实施方式中，所述重组菌在BS3的基础上还做了如下改造：用含有P43启动子的来源于E.coli K12的异分支酸合酶(entC，genebank ID：945511)基因替换枯草芽孢杆菌染色体上的异分支酸(dhbB，genebank ID：936582)基因，得到菌株Bacillus subtilis168,P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB，将其命名为BS4。
在一种实施方式中，所述重组菌在BS4的基础上还做了如下改造：利用Phbs启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上转酮酶(tkt，genebank ID：937377)基因的天然启动子，最后得到Bacillus subtilis 168,P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt，将其命名为BS5。
在一种实施方式中，所述重组菌在BS5的基础上还做了如下改造：将含有P43启动子的来源于E.coli K12的磷酸烯醇式丙酮酸合酶(ppsA，genebank ID：946209)基因整合到枯草芽孢杆菌染色体上的多糖脱乙酰酶C(yjeA，genebank ID：936440)基因和yjfA(genebankID：939830)基因之间，并敲除染色体上的葡萄糖磷酸转运酶(ptsG，genebank ID：939255)基因，最后得到Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbBPhbs-tkt P43-ppsAΔptsG，将其命名为BS6。
在一种实施方式中，所述重组菌在BS6的基础上还做了如下改造：将含有P43启动子的来源于E.coli K12的磷酸烯醇式丙酮酸合酶(ppsA，genebank ID：946209)基因整合到枯草芽孢杆菌染色体上的多糖脱乙酰酶C(yjeA，genebank ID：936440)基因和yjfA(genebankID：939830)基因之间，并敲除染色体上的葡萄糖磷酸转运酶(ptsG，genebank ID：939255)基因，最后构建得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr，将其命名为BS7。
在一种实施方式中，所述重组菌在BS7的基础上还做了如下改造：利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上莽草酸激酶(aroK，genebank ID：938343)基因的天然启动子，最后构建得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbBPhbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK，将其命名为BS8。
在一种实施方式中，所述重组菌在BS8的基础上还做了如下改造：利用Phbs启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上法尼基二磷酸合酶(ispA，genebank ID：938652)基因的天然启动子，最后构建得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbrP43-aroK Phbs-ispA，将其命名为BS9。
在一种实施方式中，所述重组菌在BS9的基础上还做了如下改造：利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上七聚二烯丙基二磷酸合成酶(hepS/T，genebank ID：938998)基因的天然启动子，最后构建得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menEP43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbrP43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T，将其命名为BS10。
在一种实施方式中，所述重组菌在BS10的基础上还做了如下改造：将来源于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)中的2-脱氢-3-脱氧-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(kdpG，genebank ID：33073472)基因与启动子Phbs融合后整合到枯草芽孢杆菌染色体上尿激酶(yclG，genebank ID：938292)基因和芽孢萌发响应蛋白(gerkA，genebank ID：938285)基因之间，构建得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbBPhbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr::lox72P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG，将其命名为BS11。
在一种实施方式中，所述重组菌在BS11的基础上还做了如下改造：利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶酶(dxr，genebank ID：939636)基因的天然启动子，得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr，将其命名为BS12。
在一种实施方式中，所述重组菌在BS12的基础上还做了如下改造：利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌168中1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs，genebank ID：938609)基因的天然启动子，得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpGP43-dxr P43-dxs，将其命名为BS13。
在一种实施方式中，所述重组菌在BS13的基础上还做了如下改造：利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上异戊烯焦磷酸异构酶酶(fni，genebank ID：938985)中基因的天然启动子，构建得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpGP43-dxr P43-dxs P43-fni，将其命名为BS14。
本发明的第二个目的是提供一种生产七稀甲萘醌的方法，是利用所述重组菌进行发酵生产。
在一种实施方式中，所述发酵是将所述重组菌的种子液按照10％～20％的接种量接种到发酵培养基中。
在一种实施方式中，所述发酵培养基配方(质量百分比)：大豆蛋白胨5％，葡萄糖5％，蔗糖5％，KH2PO3 0.06％。
本发明还提供所述重组菌在制备保护血管，防止动脉粥样硬化和心血管疾病的药物方面的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过对MK-7生物合成途径相关基因的改造，构建得到14株重组菌BS1～BS14，其中BS6～BS14使得MK-7的产量得到了显著提高，分别达到了15.1mg/L、16.2mg/L、17.4mg/L、19.6mg/L、21.2mg/L、24.2mg/L、26.4mg/L、28.2mg/L、33.5mg/L，是原始菌株的野生型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的产量的1.59、1.71、1.83、2.06、2.23、2.55、2.78、2.97、3.53倍。
(2)本发明提供了一种改造微生物中MK-7生物合成途径提高MK-7产量的方法，为构建MK-7的高产菌株提供了理论依据。
生物材料
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168购自美国典型微生物保藏中心，保藏编号为ATCC No.27370。
表1菌株基因型
表2序列表
附图说明
图1：BS1菌落PCR验证结果；M：marker；1：菌落PCR结果；2：菌落PCR结果。
图2：MK-7在枯草芽孢杆菌中的合成途径。
图3：增强MK-7合成途径中酶表达水平对产量的影响。
图4：增强分支酸途径对MK-7产量的影响。
图5：增强异戊二烯的合成对MK-7产量的影响。
图6：过表达基因的相对表达量分析。
具体实施方式
MK-7检测方法：在发酵液中加入4倍体积异丙醇和正已烷混合物(1:2V/V)，涡旋振荡提取30min后，滤出提取液，8000r/min离心15min。收集上清液，此时MK-7溶解于该相中，置于-80℃冰箱中冷冻，使脂类物质结晶除去，收集滤液，HPLC检测MK-7的含量。
HPLC检测MK-7产量：采用Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18分离柱(5μm，250×4.6mm)，检测的温度在40℃，流动相使用甲醇：二氯甲烷(9:1，v/v)，流速为1mL/min，检测波长254nm，进样量10μL。
实施例1：重组菌BS1的构建
通过组成型启动子P43替换枯草芽孢杆菌染色体上menF的天然启动子来增强甲基萘醌异分支酸合成酶(menF，genebank ID：937190)基因的表达。使用无标记的遗传修饰策略，参见文章(Yan,X.,Yu,H.-J.,Hong,Q.,Li,S.P.,2008.Cre/lox system and PCR-basedgenome engineering in Bacillus subtilis.Appl Environ Microb.74,5556-5562)，具体构建过程如下：
(1)基因的克隆
①以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，采用引物menFup.FOR和menFup.REV扩增得到menF基因的上游同源臂序列menFup(序列如SEQ ID NO.1所示)。
②人工合成含有博莱霉素基因的lox71-zeo-lox66盒(序列如SEQ ID NO.2所示)。
③以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，采用引物P43.For和P43.Rev扩增得到P43启动子序列(序列如SEQ ID NO.3所示)。
④以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，采用引物menF.FOR和menF.REV扩增得到menF基因片段(序列如SEQ ID NO.4所示)。
(2)融合片段的获得
将步骤(1)中获得的四个片段menFup、lox71-zeo-lox66盒、P43启动子序列、menF基因片段进行重叠延伸PCR，PCR条件：98℃，5min预变性，然后98℃，变性10s，55℃，退火5s，72℃，延伸2min，总共30个循环，切胶回收大小正确的片段，得到融合基因片段menFup-lox71-zeo-lox66-P43-menF。
(3)同源重组
将步骤(2)中得到的融合片段转化到野生型菌株Bacillus subtilis 168感受态细胞中。由于融合片段中存在menF的上游序列与枯草芽孢杆菌168染色体上的menF的上游序列基因同源，融合片段中存在menF基因与枯草芽孢杆菌168染色体上的menF基因同源，通过同源重组，融合片段中的博来霉素抗性基因zeo和P43启动子替换枯草芽孢杆菌168染色体上menF基因天然启动子。具体步骤为：
①将步骤(2)中构建好的融合片段电转化枯草芽孢杆菌168的感受态细胞，融合片段添加量为100-300ng，电转化条件：电压2.5kV，电击时间5ms，37℃复苏5h涂布终浓度为10μg/mL的博来霉素抗性的LB平板，37℃厌氧培养48h。博来霉素抗性呈阳性的为转化成功的枯草芽孢杆菌。
②挑选平板上长出的单菌落，利用引物BS1YZ.FOR和BS1YZ.REV进行菌落PCR验证，替换后扩增得到的片段长度为1350bp(参见图1)。并进行测序，测序正确的即为lox71-zeo-lox66-P43融合基因成功替换枯草芽孢杆菌168染色体上的menF基因天然启动子。最后通过Cre/lox重组系统，敲除博来霉素抗性基因zeo，最后得到菌株Bacillus subtilis 168,P43-menF，将其命名为BS1。
表3引物序列表
实施例2：重组菌BS2的构建
在实施例1得到的菌株BS1的基础上，采用与实施例1类似的方法，利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌168染色体上二羟基萘甲酸合成酶(menB，genebank ID：937195)基因的天然启动子，具体构建过程为：
(1)融合片段的获得
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到menB基因的上游同源臂序列menB-up、menB基因片段和P43启动子序列(序列如SEQ ID NO.3所示)，人工合成lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)，然后将四个片段menBup、lox71-zeo-lox66盒、P43启动子序列、menB基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段menBup-lox71-zeo-lox66-P43-menB。
(2)同源重组
将步骤(1)中得到的融合片段转化到BS1感受态细胞中，并涂布于博来霉素抗性的LB平板，挑选平板上长出的单菌落，进行菌落PCR验证并进行测序。最后通过Cre/lox重组系统，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，最后得到菌株Bacillus subtilis 168,P43-menFP43-menB，将其命名为BS2。
实施例3：重组菌BS3的构建
在实施例2得到的菌株BS2的基础上，采用与实施例1类似的方法，利用Phbs启动子(序列如SEQ ID NO.5所示)替换枯草芽孢杆菌中O-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶(menE，genebank ID：937132)基因的天然启动子，具体构建过程如下：
(1)融合片段的获得
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到menE基因的上游同源臂序列menEup、menE基因片段和Phbs启动子序列，人工合成lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ IDNO.2所示)。然后将四个片段menE-up、lox71-zeo-lox66盒、Phbs启动子序列、menE基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段menEup-lox71-zeo-lox66-Phbs-menE。
(2)同源重组
将步骤(1)中得到的融合片段转化到BS2感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组系统，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，得到菌株Bacillus subtilis 168,P43-menF P43-menB Phbs-menE，将其命名为BS3。
实施例4：重组菌BS4的构建
在实施例3得到的菌株BS3的基础上，采用与实施例1类似的方法，用含有P43启动子的来源于E.coli K12的异分支酸合酶(entC，genebank ID：945511)基因替换枯草芽孢杆菌染色体上的异分支酸(dhbB，genebank ID：936582)基因。具体构建过程如下：
(1)融合片段的获得
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到dhbB基因的上游同源臂序列dhbB-up、dhbB下游同源臂序列dhbB-down、P43启动子序列；人工合成lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)；以E.coli K12基因组为模板，扩增得到entC基因序列，然后将五个片段dhbB-up、lox71-zeo-lox66盒、P43启动子序列、entC基因序列、dhbB-down基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段dhbBup-lox71-zeo-lox66-P43-entC-dhbBdown。
(2)同源重组
将步骤(1)中得到的融合片段转化到BS3感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组系统，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，得到菌株Bacillus subtilis 168,P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB，将其命名为BS4。
实施例5：重组菌BS5的构建
在实施例4得到的菌株BS4的基础上，采用与实施例1类似的方法，利用Phbs启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上转酮酶(tkt，genebank ID：937377)基因的天然启动子，具体构建过程为：
(1)融合片段的获得
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到tkt基因的上游同源臂序列tkt-up、tkt基因片段和Phbs启动子序列；人工合成lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)。然后将四个片段tkt-up、lox71-zeo-lox66盒、Phbs启动子序列、tkt基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段tktup-lox71-zeo-lox66-Phbs-tkt。
(2)同源重组
将步骤(1)中得到的融合片段转化到BS4感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组系统，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，最后得到Bacillus subtilis 168,P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt，将其命名为BS5。
实施例6：重组菌BS6的构建
在实施例5得到的菌株BS5的基础上，采用与实施例1类似的方法，将含有P43启动子的来源于E.coli K12的磷酸烯醇式丙酮酸合酶(ppsA，genebank ID：946209)基因整合到枯草芽孢杆菌染色体上的多糖脱乙酰酶C(yjeA，genebank ID：936440)基因和yjfA(genebankID：939830)基因之间，并敲除染色体上的葡萄糖磷酸转运酶(ptsG，genebank ID：939255)基因。具体构建过程为：
(1)融合片段的获得
以E.coli K12基因组为模板，扩增得到ppsA基因，以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到yjeA基因和yjfA基因、P43启动子序列(序列如SEQ ID NO.3所示)；人工合成lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)。然后将五个片段yjeA、lox71-zeo-lox66盒、P43、ppsA、yjfA进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段yjeA-lox71-zeo-lox66-P43-ppsA-yjfA。
以枯草芽孢杆菌168的基因组为模板分别扩增ptsG上游同源臂ptsGup和下游同源臂ptsGdown，将ptsGup、lox71-zeo-lox66、ptsGdown进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段ptsGup-lox71-zeo-lox66-ptsGdown。
(2)同源重组
将步骤(1)中得到的融合片段yjeA-lox71-zeo-lox66-P43-ppsA-yjfA和ptsGup-lox71-zeo-lox66-ptsGdown均转化到BS5感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组系统，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，最后得到Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG，将其命名为BS6。
实施例7：重组菌BS7的构建
在实施例6得到的菌株BS6的基础上，采用与实施例1类似的方法，将人工合成的aroGfbr基因(序列如SEQ ID NO.6所示)与启动子Phbs融合后整合到枯草芽孢杆菌染色体上应激蛋白(ytxj，genebank ID：937308)基因和3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚磺酸盐7-磷酸合成酶酶(aroA，genebank ID：937853)基因之间，具体构建过程为：
(1)融合片段的获得
人工合成aroGfbr基因(序列如SEQ ID NO.6所示)；以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到ytxj基因和aroA基因、Phbs启动子序列。然后将五个片段ytxj、lox71-zeo-lox66、Phbs、aroGfbr、aroA进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段ytxj-lox71-zeo-lox66-Phbs-aroG fbr-aroA。
(2)同源重组
将步骤(1)中得到的融合片段转化到BS6感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组系统，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，最后构建得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menFP43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr，将其命名为BS7。
实施例8：重组菌BS8的构建
在实施例7得到的菌株BS7的基础上，采用与实施例1类似的方法，利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上莽草酸激酶(aroK，genebank ID：938343)基因的天然启动子，具体构建过程为：
(1)融合片段的获得
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到aroK基因的上游同源臂序列aroK-up和aroK基因片段、P43启动子序列；人工合成lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ IDNO.2所示)。然后将四个片段aroKup、lox71-zeo-lox66盒、P43启动子序列、aroK基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段aroKup-lox71-zeo-lox66-P43-aroK。
(2)同源重组
将步骤(1)中得到的融合片段转化到BS7感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组系统，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，最后构建得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menFP43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK，将其命名为BS8。
实施例9：重组菌BS9的构建
在实施例8得到的菌株BS8的基础上，采用与实施例1类似的方法，利用Phbs启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上法尼基二磷酸合酶(ispA，genebank ID：938652)基因的天然启动子，具体构建过程为：
(1)融合片段的获得
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到ispA基因的上游同源臂序列ispA-up和ispA基因片段、Phbs启动子序列；人工合成lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQID NO.2所示)。然后将四个片段ispAup、lox71-zeo-lox66盒、Phbs启动子序列、ispA基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段ispA up-lox71-zeo-lox66-Phbs-ispA。
(2)同源重组
将步骤(1)中得到的融合片段转化到BS8感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组系统，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，最后构建得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menFP43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbrP43-aroK Phbs-ispA，将其命名为BS9。
实施例10：重组菌BS10的构建
在实施例9得到的菌株BS9的基础上，采用与实施例1类似的方法，利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上七聚二烯丙基二磷酸合成酶(hepS/T，genebank ID：938998)基因的天然启动子，具体构建过程为：
(1)融合片段的获得
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到hepS/T基因的上游同源臂序列hepS/T-up和hepS/T基因片段、P43启动子序列；人工合成lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)。然后将四个片段hepS/T up、lox71-zeo-lox66盒、P43启动子序列、hepS/T基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段hepS/Tup-lox71-zeo-lox66-P43-hepS/T。
(2)同源重组
将步骤(1)中得到的融合片段转化到BS8感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组系统，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，最后构建得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menFP43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbrP43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T，将其命名为BS10。
实施例11：重组菌BS11的构建
在实施例10得到的菌株BS10的基础上，采用与实施例1类似的方法，将来源于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)中的2-脱氢-3-脱氧-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(kdpG，genebank ID：33073472)基因与启动子Phbs融合后整合到枯草芽孢杆菌染色体上尿激酶(yclG，genebank ID：938292)基因和芽孢萌发响应蛋白(gerkA，genebank ID：938285)基因之间，具体构建过程为：
(1)融合片段的获得
以运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)基因组为模板，合成kdpG基因；以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到yclG基因、Phbs启动子序列和gerkA基因；人工合成lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)。然后将五个片段yclG、lox71-zeo-lox66盒、Phbs启动子序列、kdpG、gerkA进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段yclG-lox71-zeo-lox66-Phbs-kdpG-gerkA
(2)同源重组
将步骤(1)中得到的融合片段转化到BS10感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组系统，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，构建得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menFP43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr::lox72P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG，将其命名为BS11。
实施例12：重组菌BS12的构建
在实施例11得到的菌株BS11的基础上，采用与实施例1类似的方法，利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶酶(dxr，genebank ID：939636)基因的天然启动子，具体构建过程为：
(1)融合片段的获得
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到dxr基因的上游同源臂序列dxr-up和dxr基因片段、P43启动子序列；人工合成lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)。然后将四个片段dxrup、lox71-zeo-lox66盒、P43启动子序列、dxr基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段dxrup-lox71-zeo-lox66-P43-dxr。
(2)同源重组
将步骤(1)中得到的融合片段转化到BS11感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组系统，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr，将其命名为BS12。
实施例13：重组菌BS13的构建
在实施例12得到的菌株BS12的基础上，采用与实施例1类似的方法，利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌168中1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs，genebank ID：938609)基因的天然启动子，具体构建过程为：
(1)融合片段的获得
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到dxs基因的上游同源臂序列dxsup和dxs基因片段、P43启动子序列；人工合成lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)。然后将四个片段dxsup、lox71-zeo-lox66盒、P43启动子序列、dxs基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段dxs up-lox71-zeo-lox66-P43-dxs。
(2)同源重组
将步骤(1)中得到的融合片段转化到BS12感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组系统，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr P43-dxs，将其命名为BS13。
实施例14：重组菌BS14的构建
在实施例13得到的菌株BS13的基础上，采用与实施例1类似的方法，利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上异戊烯焦磷酸异构酶酶(fni，genebank ID：938985)中基因的天然启动子，具体构建过程为：
(1)融合片段的获得
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到fni基因的上游同源臂序列fni-up和fni基因片段、P43启动子序列；人工合成lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)。然后将四个片段fniup、lox71-zeo-lox66盒、P43启动子序列、fni基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段fniup-lox71-zeo-lox66-P43-fni。
(2)同源重组
将步骤(1)中得到的融合片段转化到BS13感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组系统，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，构建得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menFP43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr P43-dxs P43-fni，将其命名为BS14。
实施例15：菌株发酵生产MK-7
种子培养基配方(质量百分比)：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％。
发酵培养基配方(质量百分比)：大豆蛋白胨5％，葡萄糖5％，蔗糖5％，KH2PO30.06％。
(1)种子液制备
将野生型菌株枯草芽孢杆菌168及实施例1～14中构建得到的重组菌BS1～14分别接种到种子培养基中，在37℃、220rpm下培养12h得到枯草芽孢杆菌种子液。
(2)发酵培养
将步骤(1)中得到的种子液以15％的接种量转入发酵培养基，于41℃，220rpm条件下培养6天后，取发酵液测定MK-7的含量(参见表4)。
表4菌株发酵生产MK-7
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 南通励成生物工程有限公司
江南大学
<120> 一种提高七稀甲萘醌产量的重组枯草芽孢杆菌及其应用
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 846
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 1
gcattcatcg tcatatcatc atagctgagc ggagggtttt ccatatcctg cggcgtttgt 60
gagttcccat atttttcgac atcctgatag gaatcctcac tgtcatatgg cgctctgatt 120
tcttcatcat catcaaattc aaattgcccg aatggtgttt cttcttcaat cggacggtct 180
ttggaaacca cgtcctgtga cgaatactcc gcgagggttg tggcagtcgg aagcgcttca 240
agtcgttcga aagggatttc ctttccgctg acttcacaaa tgccatacgt accgttttct 300
atcgccttca atgaatgctc aatgtcccga aggtgctctc tctcatgcaa gtctagagcg 360
atgtctttct cacgctcgta aagttctgtc gcctgatcgc cgggatggtt gtcgtatgcc 420
gaaagctcac cccacgaatc ataaggaaag gctgagttaa gctgaaaatg atcattgtct 480
ttgaaacggt ttaagatatc ttttttcgtt tgttccagtt cattttttaa atgctgaagc 540
tgttctttcg taagcaatgt gatcgcctcg tttctctgtg atgcatacct ttagtatgaa 600
cagatcgcct gagaactttc ataaatggcg ggtggaggaa tataggaggt tttcctttta 660
tggtaagcgg atacaacctt tgctatcagt ggagaaagaa atttaagctt tgtttctttt 720
tcatttctga aattaggttt ataataggta aggcaggcca tttggactgc atgatctgtg 780
tttgacacaa aggagacaca ggtgtatggt attaaaagca ttttaaggat tatggaggaa 840
tgtctc 846
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
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tacccgggga tcctctagag ataccgttcg tatagcatac attatacgaa gttatcttga 120
tatggctttt tatatgtgtt actctacata cagaaaggag gaactaaaca tggccaagtt 180
gaccagtgcc gttccggtgc tcaccgcgcg cgacgtcgcc ggagcggtcg agttctggac 240
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ctgggtgtgg gtgcgcggcc tggacgagct gtacgccgag tggtcggagg tcgtgtccac 420
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gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420
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Claims (10)
1.一种提高七稀甲萘醌产量的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168为出发菌株，利用P43启动子替换染色体上甲基萘醌异分支酸合成酶基因menF和二羟基萘甲酸合成酶基因menB的天然启动子；利用Phbs启动子替换染色体上O-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶基因menE、转酮酶基因tkt的天然启动子；用P43启动子在染色体上表达外源异分支酸合酶entC基因、外源磷酸烯醇式丙酮酸合酶ppsA基因，并敲除染色体上的葡萄糖磷酸转运酶基因ptsG；所述P43启动子的序列如SEQ ID NO.3所示；所述Phbs启动子的序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述menF基因的序列如genebank ID：937190所示；所述menB基因的序列如genebank ID：937195所示；所述menE基因的序列如genebank ID：937132所示；所述tkt基因的序列如genebank ID：937377所示；所述entC基因的序列如genebank ID：945511所示；所述ppsA基因的序列如genebank ID：946209所示；所述ptsG基因的序列如genebank ID：939255所示。
3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组菌在权利要求1的基础上做了如下改造：利用启动子Phbs在染色体上表达外源aroGfbr基因；所述aroGfbr基因序列如SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求3所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组菌在权利要求3的基础上做了如下改造：利用P43启动子替换染色体上莽草酸激酶基因aroK的天然启动子。
5.根据权利要求4所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组菌在权利要求4的基础上做了如下改造：利用Phbs启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上法尼基二磷酸合酶基因ispA的天然启动子。
6.根据权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组菌在权利要求5的基础上做了如下改造：利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上七聚二烯丙基二磷酸合成酶(hepS/T，genebank ID：938998)基因的天然启动子。
7.根据权利要求6所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组菌在权利要求6的基础上做了如下改造：用Phbs启动子在染色体上表达外源2-脱氢-3-脱氧-磷酸葡萄糖酸醛缩酶基因kdpG。
8.根据权利要求7所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组菌在权利要求7的基础上做了如下改造：利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶酶基因dxr的天然启动子。
9.根据权利要求8所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组菌在权利要求8的基础上做了如下改造：利用P43启动子替换染色体上1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因dxs的天然启动子。
10.根据权利要求9所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组菌在权利要求9的基础上做了如下改造：利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上异戊烯焦磷酸异构酶酶(fni，genebank ID：938985)中基因的天然启动子。
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