CN105483153B

CN105483153B - 酿酒酵母代谢工程改造提高s-腺苷-l-蛋氨酸生产水平的方法

Info

Publication number: CN105483153B
Application number: CN201510691925.XA
Authority: CN
Inventors: 徐志南; 赵伟军; 杨修亮; 杭宝建; 黄磊; 李江涛; 蔡谨
Original assignee: Shandong Jin Cheng Bioceuticals Inc; Zhejiang University ZJU
Current assignee: Shandong Jin Cheng Bioceuticals Inc; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2015-10-23
Filing date: 2015-10-23
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2035-10-23
Also published as: CN105483153A

Abstract

本发明公开了一种酿酒酵母代谢工程改造提高S‑腺苷‑L‑蛋氨酸生产水平的方法：利用酵母基因敲除技术，将酿酒酵母染色体上编码腺苷蛋氨酸脱羧酶基因SPE2突变失活，得到SPE2突变菌株。与原始的酿酒酵母菌株相比，突变菌株积累SAM能力增强、生产SAM产量明显提高。特别是，在先敲除糖原支链酶基因GLC3得到酿酒酵母突变株基础上，进一步敲除再进行SPE2敲除，或者先敲除SPE2基因再敲除GLC3基因，对提高酿酒酵母菌株生产腺苷蛋氨酸产量有更明显的提高，可到达55.1%以上。

Description

酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法

技术领域

本发明属于微生物技术、代谢工程领域，涉及一种通过代谢途径改造来提高酿酒酵母菌株生产S-腺苷-L-蛋氨酸能力的方法。

背景技术

S-腺苷-L-蛋氨酸，简称SAM，广泛存在于动物、植物和微生物细胞中，是一种重要的代谢中间产物。作为胞内甲基供体，SAM在核酸、蛋白质以及脂类等分子的甲基化修饰中扮演重要角色。同时，SAM还参与胞内的转硫基反应以及聚胺的合成等重要生化反应。SAM也是一种非常有价值的医药分子，在治疗肝病、抑郁症和风湿性关节炎中发挥重要作用。

SAM在胞内是经过腺苷蛋氨酸合成酶催化，由蛋氨酸和ATP结合生成的。研究标明，胞质内过量的SAM对细胞毒害作用非常强，SAM不能在细胞液中大量贮存。然而，酵母一类微生物却能在富含蛋氨酸的环境中大量合成并积累SAM，这是因为酵母细胞的液泡中含有大量的带负电荷的聚磷酸盐，这些聚磷酸盐能固定住带正电荷的SAM。因此，酵母成为了工业生产SAM的首选宿主。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）具有遗传背景清楚、食品级安全、抗逆性强以及发酵条件容易控制等许多优良特性，因此被广泛用作食品、医药以及化工工业的生产菌株。尽管天然的酿酒酵母生产腺苷蛋氨酸能力已经很强，但还是不能满足市场日益增长的需求，寻求更多途径继续提高腺苷蛋氨酸的产量的任务迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是为满足腺苷蛋氨酸日益增长的工业生产需求，提供一种酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法。

酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法，其特征在于，对酿酒酵母菌株腺苷蛋氨酸脱羧途径进行了基因敲除。

进一步地，所述对酿酒酵母菌株腺苷蛋氨酸脱羧途径的敲除是通过敲除酿酒酵母菌株染色体上腺苷蛋氨酸脱羧酶基因SPE2来实现的。

进一步地，所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母单倍体菌株，在酿酒酵母单倍体菌株中实施所述敲除包括以下步骤：

步骤1：设计含有SPE2基因同源臂的引物，以质粒pUG6为模版进行PCR，PCR产物经过纯化得到SPE2基因的敲除框；

步骤2：通过醋酸锂（LiAC）转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母单倍体菌株中，通过G418平板筛选，挑取单菌落进行PCR验证。

进一步地，所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母双倍体菌株，在酿酒酵母双倍体菌株中实施所述敲除包括以下步骤：

步骤2：通过醋酸锂（LiAC）转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母双倍体菌株中，通过G418平板筛选以及PCR验证，得到一条SPE2等位基因被置换的杂合子；

步骤3：将步骤2得到的杂合子置于产孢培养基上培养至孢子大量产生，收集孢子，溶解孢子子囊壁后，分离孢子；

步骤4：将步骤3得到的分离孢子置于G418平板上培养至菌落生成，挑取单菌落进行PCR验证。

进一步地，所述步骤中设计含有SPE2基因同源臂的引物，该引物序列为：

上游引物SPE2-up（5’-3’）：

CATATAGTGTCTTACGCAAATAGGCGGACCATAGAATGACTGTCACCATACAGCTGAAGCTTCGTACGC

下游引物SPE2-down（5’-3’）：

ACAAGCGGGTTAAACTACATTAGTTATGAGTGCTAGAAAGCAAGCGAAGGGCATAGGCCACTAGTGGATCTG；

PCR验证的引物序列为：

上游引物SPE2-A：5’-CGCTCCTTGCATCAACTCTT-3’

下游引物SPE2-D：5’-GCGGCTAAACTCCCTTAGCT-3’。

为实现上述目的，本发明还可采用以下技术方案：

酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法，其特征在于，在同一酿酒酵母菌株中对糖原合成途径和腺苷蛋氨酸脱羧途径两个途径进行敲除。

进一步地，在同一酿酒酵母菌株中将糖原支链酶基因GLC3和腺苷蛋氨酸脱羧酶基因SPE2两个基因进行敲除。

进一步地，所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母双倍体菌株，以在酿酒酵母双倍体中先进行GLC3敲除然后进行SPE2敲除，敲除采用以下步骤：

步骤1：以pUG6为模版PCR模版，构建GLC3敲除框，转化至酿酒酵母双倍体菌株中，经过G418平板筛选出一条GLC3等位基因被替换的杂合子；

步骤2：将步骤1得到的杂合子经过产孢培养基培养大量生成子囊孢子，所得子囊孢子经过溶壁处理，得到分散孢子；分散孢子置于G418平板筛选，即可得到GLC3被敲除的纯合子单菌落；

步骤3：将步骤2得到的GLC3被敲除的纯合子进行标记回收；

步骤4：在标记回收了的GLC3敲除纯合子上继续进行SPE2敲除和标记回收，最终得到GLC3和SPE2两个基因都敲除掉的纯合子。

进一步地，上述步骤3中将步骤2得到的进行标记回收，该步骤具体包含以下步骤：

步骤1：将pSH65质粒通过LiAC/PEG转化到GLC3被敲除的纯合子中，用博来霉素抗性进行筛选；

步骤2：将步骤1所得到的博来霉素抗性菌株接种到YPG中，半乳糖存在条件下诱导菌株合成Cre重组酶，从而导致染色体上G418抗性基因脱落；

步骤3：将步骤3所得菌液在YPD平板上划线，待菌落长出后挑同一单菌落分别转接到YPD和含有G418 YPD平板的对应位置上，30℃下恒温培养两天；

步骤4：将YPD上生长而G418 YPD上不生长的菌落挑出来，提基因组，进行PCR验证；

上述步骤4中的标记回收具体包含以下步骤：

步骤1：将pSH65质粒通过LiAC/PEG转化到GLC3和SPE2被敲除的纯合子中，用博来霉素抗性进行筛选；

步骤4：将YPD上生长而G418 YPD上不生长的菌落挑出来，提基因组，进行PCR验证。

本发明中，先进行GLC3敲除然后标记回收，再进行SPE2敲除和标记回收，得到GLC3和SPE2都敲除的菌株，或者，先敲除SPE2基因后进行标记回收，再敲除GLC3基因后进行标记回收，得到的GLC3和SPE2都敲除的菌株，对提高酿酒酵母菌株生产腺苷蛋氨酸产量都有效。

腺苷蛋氨酸合成的直接底物只有蛋氨酸和三磷酸腺苷ATP，添加外源蛋氨酸能快速加剧酿酒酵母合成SAM，是最直接最有效率的提高SAM产量的方法。然而， SAM在胞内大量合成的同时，也被大量消耗，只有一部分被转移到液泡中存储起来。已有大量研究报道，过量表达腺苷蛋氨酸合成酶也是提高SAM合成效率的有效手段，可通过代谢改造降低SAM消耗的研究报道却几乎没有。事实上，减少胞内SAM的损耗，对提高酿酒酵母胞内积累SAM效率也是十分重要的。

腺苷蛋氨酸胞内降解途径主要有两条：一条是去甲基途径，细胞依赖此途径对DNA、蛋白质等分子进行甲级修饰，是无可取代的必需途径；另一条是脱羧基途径，细胞利用此途径合成精胺、亚精胺以及聚胺，这一类胺类物质对细胞生长代谢有调节作用。研究报道，敲除了SAM脱羧途径的关键酶类，细胞不能在没有外源添加胺类物质的培养基上生存，却能在此胺类物质少量补充的培养基上正常生长。由此启发，敲掉SAM脱羧酶类，利用酵母粉补充细胞生长所需少量精氨及亚精氨等胺类，能减少SAM损耗，对细胞积累SAM有促进作用。

由于采用本发明的技术方案，本发明取得的优点和有益效果是：本发明能够适用于各种酿酒酵母菌株；本发明采用了标记回收技术，实现用少数抗性标记对工业菌株进行多个基因进行操作，并从新的角度对该菌株进行了代谢途径的改造，结果表明，糖原途径和SAM脱羧途径缺失突变菌株的腺苷蛋氨酸产量达到了9.98g/L，比原始菌株提高了44.7%，从而可以提高SAM的工业生产效率。另外，本发明采用了孢子分离技术来得到纯合的二倍体敲除菌株，可以避免先单倍体分开敲除再融合的繁琐过程，提高了二倍体的敲除效率，且其为酿酒酵母工业菌株，其本身具有的强腺苷蛋氨酸积累能力、优良的发酵特性以及食品安全的生物性能，都是其它微生物不能比拟的，具有更好的技术效果。

附图说明

图1为PCR验证的核酸凝胶电泳图。Target gene即为目标基，A、B、C、D表示所用引物，W表示野生型（本实例即为HD），Δ表示突变型（本实例即为HD-GS）；本电泳图表明HD-GS中GLC3基因和SPE2基因均被敲除，且去除了标记。

图2为10L发酵罐中，HD与HD-spe2的发酵生产SAM数据图。SAM Concentration即为SAM浓度，Time为时间，在腺苷蛋氨酸粉末第一次加入时刻开始计时。

图3为10L发酵罐中，HD-GS的生产SAM发酵数据图。Concentration即为SAM浓度，Glucose feeding rate即为葡萄糖流加速率，DCW即为细胞干重，Time即为时间。

具体实施方式

实施例一：以双倍体酿酒酵母菌株HD为例，构建SPE2基因敲除的纯合子并与HD比较SAM产量。

1、PCR构建敲除框。方法如下：以质粒pUG6为模版，用引物对SPE2-up和SPE2-down进行PCR反应，PCR产物利用DNA纯化试剂盒纯化回收，经过DNA电泳确认，最终作为SPE2基因敲除用的敲除框。

2、LiAC转化。方法如下：挑原始菌株HD单菌落置于20mL YPD摇瓶中，转速200rpm，30℃过夜培养，然后转接2mL到50mL YPD摇瓶中继续培养3-4个小时，OD₆₀₀大约为1的时候离心收集菌体。用20mL无菌水洗涤一次，离心，去掉上清；再用0.1 M LiAC洗涤一次，离心，去掉上清；用1mL 0.1M LiAC重悬菌体，转移到2mL离心管，再加入0.5mL 0.1M LiAC重悬菌体；分装为每管50 μL，取两管，分别离心去上清，得到感受态细胞；按顺序加入240μL PEG、36μL1 M LiAC、50μL ssDNA和 34μL SPE2敲除框，然后混匀，放置室温15min，再进行42℃热激20min；离心，去上清，再加入1mL YPD培养基，30℃预培养2h；离心，去上清，加入2mL无菌水重悬，取50-100μL涂布到200μg/mL G418 YPD平板上，30℃培养36-48h。

3、PCR验证。方法如下：在上述G418平板上挑菌落4-6个，进行PCR验证，DNA凝胶电泳得到双条带的菌株即为敲除杂合子。

4、将所得敲除杂合子涂布到麦氏产孢培养基（葡萄糖1g/L、KCl 1.8g/L、醋酸钠8.2 g/L以及琼脂15 g/L）上培养3-4天，显微镜下确认孢子产率超过95%；收集少量孢子，加入400μL蜗牛酶反应液（来自上海生工酵母基因组提取试剂盒），悬浮孢子，再加入10微升蜗牛酶溶液，37℃下水浴3h；离心，用500μL无菌水重悬，再100W超声振荡处理5s，间歇7s，振荡5个周期；最后，显微镜下确认孢子比较充分地分离（分离率大于80%），用接种环取少量菌液划线到200μg/mL的G418 YPD平板上，30℃下培养36-48h。挑取4-6个菌落，用引物对SPE2-A和SPE2-D进行PCR验证。DNA凝胶电泳只得到一条含敲除框大小的条带的菌株即为敲除纯合子，命名为HD-spe2。

5、将的双倍体酿酒酵母菌株HD和spe2基因突变的HD-spe2菌株发酵生产SAM，方法如下：

、将HD和HD-spe2分别接种到50mL YPD液体培养基，在200rpm、30℃恒温摇床培养18小时后，分别转接到若干个50mL YPD摇瓶，每个摇瓶转接3mL，继续培养12小时，作为发酵罐的种子液。

、10L发酵罐经过空消确定发酵罐性能良好以后，加入7L产SAM发酵培养基，115℃实消灭菌30min，然后冷却控温到30℃；产SAM发酵培养基成分如下：10g/L 葡萄糖、 3g/L酵母粉、5g/L (NH₄)₂SO₄、10g/L KH₂PO₄、3g/L MgSO₄、0.1g/L MnSO₄·7H₂O、0.6 g/L ZnSO₄·7H₂O、 0.55g/L FeSO₄、 0.5g/L NaCl、0.5g/L CaCl₂、1.6mg/L CuSO₄、4.84mg/L (NH₄)₂MoO₄、0.3mg/L 生物素、3.6mg/L 泛酸钙、3.6mg/L 维生素B₁、3.6mg/L 维生素B₆。

、按照5%接种量将上述种子液分别接种到发酵罐中；整个过程中温度控制在30℃，用氨水调节pH为5，调节搅拌速率控制溶氧在20%以上，调节流加速率控制葡萄糖浓度小于5g/L；整个过程中每隔两小时取样测定一次，记录溶氧、pH、搅拌速率、OD₆₀₀、葡萄糖浓度等，反应阶段分别保存菌液离心后的上清和菌体，用于测定乙醇浓度、细胞干重以及SAM产量等；培养8-10个小时后，葡萄糖耗尽，开始流加葡萄糖和酵母粉混合液；继续培养22-24个小时后，OD₆₀₀趋于稳定，分四次添加蛋氨酸粉末，每次20g；反应24个小时后，发酵结束。

、从上述保存菌体中萃取出SAM，并测定其含量：按每克湿菌体加入乙酸乙酯和水各0.24mL，剧烈震荡处理30min；然后加入1.12mL 0.35M H₂SO₄，继续处理1.5h；萃取结束后，离心收集上清，过滤后用于HPLC检测；HPLC检测条件为：安捷伦C18柱，检测波长为256nm，流动相由40mM 磷酸二氢铵、2mM 庚烷磺酸钠、18%甲醇组成。HD和HD-spe2发酵过程中生产SAM的比较如图2。

实施例二：在模式菌株BY4741中进行SPE2基因的敲除，并验证其产量。

方法如下：

2、LiAC转化及PCR验证。方法如下：挑原始菌株BY4741单菌落置于20mL YPD摇瓶中，转速200rpm，30℃过夜培养，然后转接2mL到50mL YPD摇瓶中继续培养7-8个小时，OD₆₀₀大约为1的时候离心收集菌体。用20mL无菌水洗涤一次，离心，去掉上清；再用0.1 M LiAC洗涤一次，离心，去掉上清；用1mL 0.1M LiAC重悬菌体，转移到2mL离心管，再加入0.5mL 0.1MLiAC重悬菌体；分装为每管50 μL，取两管，分别离心去上清，得到感受态细胞；按顺序加入240μL PEG、36μL 1 M LiAC、50μL ssDNA和 34μL SPE2敲除框，然后混匀，放置室温30min，再进行42℃热激90min；离心，去上清，再加入1mL YPD培养基，30℃预培养4h；离心，去上清，加入2mL无菌水重悬，取50-100μL涂布到200μg/mL G418 YPD平板上，30℃培养48h；挑取4-6个单菌落，用引物对SPE2-A和SPE2-D进行PCR验证得SPE2敲除菌株BY4741-spe2。

3、摇瓶发酵生产SAM。方法如下：挑BY4741-spe2单菌落到50mL YPD培养基，200rpm，30℃下培养24h；然后转接到50mL 产SAM培养基，每瓶接种3mL，同样条件下培养24h；每瓶加入L-蛋氨酸粉末0.1g，摇匀，继续培养24h，离心，收集菌体，测量菌体干重并萃取SAM，测量其浓度。其中产SAM培养基组分包括：30g/L 葡萄糖、5g/L酵母粉、5g/L (NH₄)₂SO₄,、5g/L K₂HPO₄,、10g/L KH₂PO₄、0.1g/L MnSO₄·7H₂O、0.1g/L ZnSO₄·7H₂O、0.2g/LMgCl₂、0.1g/L CaCl₂和0.1g/L C₆H₅Na₃O₇·2H₂O。

4、BY4741与BY4741-spe2生产SAM能力的比较。如下表格

菌株	SAM浓度（g/L）	SAM胞含量（mg/g DCW）
			BY47471	0.051	25.8
BY4741-spe2	0.058	31.5

由上表可见，SPE2基因突变菌株比其出发菌株BY4741的SAM生产能力有提高，进一步说明了本发明公布的提高腺苷蛋氨酸的方法行之有效。

实施例三，以双倍体酿酒酵母菌株HD为例，构建GLC3和SPE2都敲除的菌株，并比较SAM产量。

1、跟实例一步骤相似，先敲除GLC3基因：以pUG6为模版PCR构建GLC3敲除框，经过LiAC转化、G418平板筛选和PCR验证得到GLC3敲除杂合子，然后将杂合子进行产孢培养，分离孢子，进过G418平板筛选得到GLC3敲除的纯合子，并进行PCR验证确认。

2、回收标记基因。方法如下：将GLC3敲除的纯合子单菌落置于20mL YPD摇瓶中，转速200rpm，30℃过夜培养，然后转接2mL倒50mL YPD摇瓶中继续培养3-4个小时，OD600大约为1的时候离心收集菌体。用20mL无菌水洗涤一次，离心，去掉上清；再用0.1 M LiAC洗涤一次，离心，去掉上清；用1mL 0.1M LiAC重悬菌体，转移到2mL离心管，再加入0.5mL 0.1MLiAC重悬菌体；分装为每管50 μL，取两管，分别离心去上清，得到感受态细胞；按顺序加入240μL PEG、36μL 1 M LiAC、50μL ssDNA和 34μL pSH65质粒，然后混匀，放置室温15min，再进行42℃热激20min；离心，去上清，再加入1mL YPD培养基，30℃预培养2h；离心，去上清，加入2mL无菌水重悬，取50-100μL涂布到50μg/mL 博来霉素抗性 YPD平板上，30℃培养36-48h。上述博来霉素平板中挑单菌落置于20mL YPG摇瓶中，转速200rpm，30℃过夜培养，然后取1微升加水稀释后涂布到YPD平板上，30℃培养36h；待菌落长出后，每一菌落分别接种到YPD和G418 YPD上（注意接种到标记好的对应位置），30℃培养36h；在YPD上生长，而在G418上生长受抑制的菌落挑出来，进行PCR验证。

3、质粒pSH65的去除。方法如下：将验证去除好标记的菌落接种到20mL YPD摇瓶中，200rpm，30℃培养24h；取100微升转接到20mL YPD中继续培养24h；重复上如转接和培养两次后，取1微升菌液加无菌水稀释到100微升后涂布到YPD平板上，30℃培养36h；挑取同一菌落分别接种到YPD和博来霉素抗性YPD（注意接种到标记好的对应位置），30℃培养36h；在YPD上生长，而博来霉素上生长受抑制的菌落即可认为质粒pSH65去除成功。

4、继续敲除SPE2基因，构建HD-GS。继续利用实例1的策略敲除SPE2基因，并利用本实例步骤2和3相同策略回收敲除SPE2时所引进的标记基因，成功得到GLC3和SPE2都敲除的无抗性标记的HD-GS菌株，最后用引物GLC3-A、GLC3-B、GLC3-C、GLC3-D以及SPE2-A、SPE2-B、SPE2-C、SPE2-D对HD-GS进行PCR最终验证，如附图1。

5、HD-GS发酵罐培养生产SAM。与本发明实例1中步骤5相似，按照5%接种量将HD-GS种子液接种到发酵罐中；整个过程中温度控制在30℃，用氨水调节pH为5，调节搅拌速率控制溶氧在20%以上；整个过程中每隔俩小时取样测定一次，记录溶氧、pH、搅拌速率、OD600、葡萄糖浓度等，反应阶段分别保存菌液离心后的上清和菌体，用于测定乙醇浓度、细胞干重以及SAM产量等；约培养8-10个小时后，葡萄糖耗尽，开始流加葡萄糖和酵母粉混合液，如附图3所示，每个小时调节一次流加速率；继续培养24个小时后，OD₆₀₀趋于稳定，开始添加蛋氨酸和葡萄糖混合液；反应20个小时后，发酵结束。将所得数据整理，如附图3。

最终，在500 L的发酵罐上进行了腺苷蛋氨酸的中试生产，HD-GS生产SAM的量也能达到10.71g/L，比原始菌株HD提高了55.1%，为工业化发酵生产腺苷蛋氨酸奠定了基础。

实施例四：以单倍体模式菌株BY4741为例，构建GLC3和SPE2都敲除的菌株，并比较SAM产量。

1、跟实例二步骤相似，先敲除GLC3基因：以pUG6为模版PCR构建GLC3敲除框，经过LiAC转化、G418平板筛选和PCR验证得到GLC3敲除菌株。

2、回收标记基因。方法如下：将GLC3敲除菌株单菌落置于20mL YPD摇瓶中，转速200rpm，30℃过夜培养，然后转接2mL倒50mL YPD摇瓶中继续培养3-4个小时，OD₆₀₀大约为1的时候离心收集菌体。用20mL无菌水洗涤一次，离心，去掉上清；再用0.1 M LiAC洗涤一次，离心，去掉上清；用1mL 0.1M LiAC重悬菌体，转移到2mL离心管，再加入0.5mL 0.1M LiAC重悬菌体；分装为每管50 μL，取两管，分别离心去上清，得到感受态细胞；按顺序加入240μLPEG、36μL 1 M LiAC、50μL ssDNA和 34μL pSH65质粒，然后混匀，放置室温30min，再进行42℃热激90min；离心，去上清，再加入1mL YPD培养基，30℃预培养4h；离心，去上清，加入2mL无菌水重悬，取50-100μL涂布到50μg/mL 博来霉素抗性 YPD平板上，30℃培养36-48h。上述博来霉素平板中挑单菌落置于20mL YPG摇瓶中，转速200rpm，30℃过夜培养，然后取1微升加水稀释后涂布到YPD平板上，30℃培养36h；待菌落长出后，每一菌落分别接种到YPD和G418 YPD上（注意接种到标记好的对应位置），30℃培养36h；在YPD上生长，而在G418上生长受抑制的菌落挑出来，进行PCR验证。

4、继续敲除SPE2基因，构建BY4741-GS。继续利用实例二的策略敲除SPE2基因，并利用本实例步骤2和3相同策略回收敲除SPE2时所引进的标记基因，成功得到GLC3和SPE2都敲除的无抗性标记的BY4741-GS菌株，最后用引物GLC3-A、GLC3-B、GLC3-C、GLC3-D以及SPE2-A、SPE2-B、SPE2-C、SPE2-D对HD-GS进行PCR最终验证。

5、摇瓶发酵生产SAM。方法如下：挑BY4741-GS单菌落到50mL YPD培养基，200rpm，30℃下培养24h；然后转接到50mL 产SAM培养基，每瓶接种3mL，同样条件下培养24h；每瓶加入L-蛋氨酸粉末0.1g，摇匀，继续培养24h，离心，收集菌体，测量菌体干重并萃取SAM，测量其浓度。其中产SAM培养基组分包括：30g/L 葡萄糖、5g/L酵母粉、5g/L (NH₄)₂SO₄,、5g/LK₂HPO₄,、10g/L KH₂PO₄、0.1g/L MnSO₄·7H₂O、0.1g/L ZnSO₄·7H₂O、0.2g/L MgCl₂、0.1g/LCaCl₂和0.1g/L C₆H₅Na₃O₇·2H₂O。

6、BY4741与BY4741-GS生产SAM能力的比较。如下表格

由上表可见，GLC3基因和SPE2基因都突变的菌株比其出发菌株BY4741的SAM生产能力有提高，进一步说明了本发明公布的提高腺苷蛋氨酸的方法行之有效。

<110> 山东金城生物药业有限公司

浙江大学

<120> 酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catatagtgt cttacgcaaa taggcggacc atagaatgac tgtcaccata cagctgaagc 60

ttcgtacgc 69

<210> 2

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acaagcgggt taaactacat tagttatgag tgctagaaag caagcgaagg gcataggcca 60

ctagtggatc tg 72

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgctccttgc atcaactctt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcggctaaac tcccttagct 20

Claims

1.酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法，其特征在于，在同一酿酒酵母菌株中将糖原支链酶基因GLC3和腺苷蛋氨酸脱羧酶基因SPE2两个基因进行敲除。

2.如权利要求1要求所述酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法，其特征在于所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母双倍体菌株，在酿酒酵母双倍体中先进行GLC3敲除然后进行SPE2敲除，敲除采用以下步骤：

步骤3：将步骤2得到的GLC3被敲除的纯合子进行标记回收以及去除质粒pSH65；其中标记回收包括以下步骤：

步骤3-1：将pSH65质粒通过LiAC/PEG转化到GLC3被敲除的纯合子中，用博来霉素抗性进行筛选；

步骤3-2：将步骤3-1所得到的博来霉素抗性菌株接种到YPG中，半乳糖存在条件下诱导菌株合成Cre重组酶，从而导致染色体上G418抗性基因脱落；

步骤3-3：将步骤3-2所得菌液在YPD平板上划线，待菌落长出后挑同一单菌落分别转接到YPD和含有G418 YPD平板的对应位置上，30℃下恒温培养两天；

步骤3-4：将YPD上生长而G418 YPD上不生长的菌落挑出来，提基因组，进行PCR验证；

步骤4：在标记回收及去除质粒pSH65了的GLC3敲除纯合子上继续进行SPE2敲除和标记回收以及去除质粒pSH65，最终得到GLC3和SPE2两个基因都敲除掉的纯合子；其中标记回收包括以下步骤：

步骤4-1：将pSH65质粒通过LiAC/PEG转化到GLC3和SPE2被敲除的纯合子中，用博来霉素抗性进行筛选；

步骤4-2：将步骤4-1所得到的博来霉素抗性菌株接种到YPG中，半乳糖存在条件下诱导菌株合成Cre重组酶，从而导致染色体上G418抗性基因脱落；

步骤4-3：将步骤4-2所得菌液在YPD平板上划线，待菌落长出后挑同一单菌落分别转接到YPD和含有G418 YPD平板的对应位置上，30℃下恒温培养两天；

步骤4-4：将YPD上生长而G418 YPD上不生长的菌落挑出来，提基因组，进行PCR验证。

3.如权利要求1所述的酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母单倍体菌株，在酿酒酵母单倍体菌株中实施所述敲除包括以下步骤：

步骤2：通过醋酸锂(LiAC)转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母单倍体菌株中，通过G418平板筛选，挑取单菌落进行PCR验证。

4.如权利要求1所述的酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母双倍体菌株，在酿酒酵母双倍体菌株中实施所述敲除包括以下步骤：

步骤2：通过醋酸锂(LiAC)转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母双倍体菌株中，通过G418平板筛选以及PCR验证，得到一条SPE2等位基因被置换的杂合子；

5.如权利要求3或4所述的酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法，其特征在于，所述步骤中设计含有SPE2基因同源臂的引物，该引物序列为：

上游引物SPE2-up(5’-3’)：

CATATAGTGTCTTACGCAAATAGGCGGACCATAGAATGACTGTCACCATACAGCTGAAGCTTCGTACGC

下游引物SPE2-down(5’-3’)：

ACAAGCGGGTTAAACTACATTAGTTATGAGTGCTAGAAAGCAAGCGAAGGGCATAGGCCACTAGTGGATCTG；

PCR验证的引物序列为：

上游引物SPE2-A：5’-CGCTCCTTGCATCAACTCTT-3’

下游引物SPE2-D：5’-GCGGCTAAACTCCCTTAGCT-3’。

6.如权利要求1所述的酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法，其特征在于，先进行GLC3敲除然后标记回收，再进行SPE2敲除和标记回收，得到GLC3和SPE2都敲除的菌株，或者，先敲除SPE2基因后进行标记回收，再敲除GLC3基因后进行标记回收，得到的GLC3和SPE2都敲除的菌株，对提高酿酒酵母菌株生产腺苷蛋氨酸产量都有效。