CN105316273B - 一株无苹果酸副产的l-天冬氨酸酶重组大肠杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株无苹果酸副产的产L‑天冬氨酸酶重组大肠杆菌，将耐铵型大肠杆菌BEW308中编码富马酸酶的基因fumA、fumB、fumC失活，再将编码L‑天冬氨酸酶基因插入到编码富马酸酶fumAC基因的位置，即得到无苹果酸副产的产L‑天冬氨酸酶重组大肠杆菌，所述的大肠杆菌耐铵型大肠杆菌BEW308，该菌株的保藏号为CCTCC NO：M2013157。本发明还公开了上述菌株的构建方法及应用。本发明可实现L‑天冬氨酸酶的组成型高活性表达，且发酵培养后获得的细胞或是粗酶液具有低富马酸酶活性。

Description

一株无苹果酸副产的L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌及其构建方 法与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

L-天冬氨酸在医药、食品和化工等方面有着广泛的用途。在医药方面，是氨基酸制剂的主要成分；在化工方面，可以作为制造合成树脂的原料，大量用于合成环保材料聚天门冬氨酸；尤其在食品工业方面，L-天门冬氨酸是一种良好的营养增补剂，也是糖代用品阿斯巴甜的主要生产原料。具有良好的市场前景。

目前L-天冬氨酸主要以富马酸为原料，采用生物酶法合成。由于采用全细胞或是细胞破碎后的粗酶液进行转化，因此转化体系中含有两种可以催化富马酸的酶，即富马酸酶和L-天冬氨酸酶，前者催化富马酸合成苹果酸，后者催化富马酸合成L-天冬氨酸。副产物苹果酸的合成不仅降低了目标产物的转化率，同时也增加了下游产物分离纯化的难度。因此构建一株具有高活性的L-天冬氨酸酶活性且无富马酸酶活性或低富马酸没活性的重组菌可有效降低L-天冬氨酸生产过程成本。

发明内容

本发明要求解决的技术问题是，提供一株无苹果酸副产的L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述无苹果酸副产的L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌的制备方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述无苹果酸副产的L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌在制备L-天冬氨酸中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一株无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌，将耐铵型大肠杆菌BEW308中编码富马酸酶的基因fumA、fumB、fumC中的一个或几个基因失活，再将编码L-天冬氨酸酶基因插入到编码富马酸酶fumAC基因的位置，即得到无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌，所述的大肠杆菌耐铵型大肠杆菌BEW308，该菌株的保藏号为CCTCC NO：M2013157。所述的CCTCC NO：M2013157菌株为一株铵根离子耐受型大肠杆菌，该菌株的具体信息在申请号为201310279778.6专利中已经公开。fumA和fumC这两个基因在基因组上是相连的。fumA、fumB、fumC的基因的EcoGene登记号分别为EG10356，EG10357，EG10358。

其中，所述的编码L-天冬氨酸酶基因其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

其中，所述编码L-天冬氨酸酶基因，其起始密码子的上游有一段信号肽，该信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

上述的无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌的制备方法，包括如下步骤：

(1)将pKD46质粒转入耐铵型大肠杆菌BEW308中，筛选出阳性转化子大肠杆菌BEW308-pKD46，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将大肠杆菌BEW308-pKD46制备成感受态细胞；

(2)以pIJ773质粒为模板，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列为引物，PCR扩增得到fumB基因敲除片段；

(3)将步骤(2)得到的fumB基因敲除片段电转化至大肠杆菌BEW308-pKD46制备成感受态细胞中，在安普抗性平板上筛选阳性重组子；

(4)将步骤(3)得到的阳性重组子制备成感受态细胞，将pCP20质粒转化其中，42℃诱导FLP重组酶表达，在安普霉素抗性平板和无抗性的平板上进行双挑实验，在物抗性的平板上生长，但不能在有安普霉素抗性的平板上生长的菌株为fumB基因失活的菌株BEW308-△fumB；

(5)人工合成在SEQ ID NO：1起始密码子ATG前添加了SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的基因敲除片段；(6)将步骤(4)得到的fumB基因失活的菌株BEW308-△fumB制备成感受态细胞，将pKD46质粒转化其中，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将其制备成感受态细胞；

(7)将步骤(5)中的核苷酸序列转化至步骤(6)的含有λ重组酶的感受态细胞中，在安普抗性平板上筛选阳性重组子；

(8)将步骤(8)中的阳性重组子制备成感受态细胞，将pCP20质粒转化将pCP20质粒转化其中，42℃诱导FLP重组酶表达，在安普霉素抗性平板和无抗性的平板上进行双挑实验，在物抗性的平板上生长，但不能在有安普霉素抗性的平板上生长的菌株即为无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌BEW308-△fumB-△fumAC-aspC。

上述无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌在生产L-天冬氨酸中的应用在本发明的保护范围之内。

其中，利用无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌发酵产L-天冬氨酸酶，再利用L-天冬氨酸酶发酵液催化富马酸氨转化为L-天冬氨酸。

其中，所述的发酵产L-天冬氨酸酶，其发酵培养基配方为：酵母粉24g/L，蛋白胨10g/L，K₂HPO₄36mmol/L，MgSO₄10mmol/L，微量元素[CaCl₂.6H₂O 0.74g/L，ZnSO₄.7H₂O0.18g/L，MnSO₄.H₂O 20g/L，Na₂.EDTA20.1g/L，CuSO₄0.1g/L，CoCl₂0.104g/L,FeSO₄.7H₂O2g/L]2mL/L，溶剂为水，pH用NaOH调到7.2～7.5。

其中，所述的发酵产L-天冬氨酸酶，其发酵过程中，温度为28～30℃，pH为7.2～7.8，溶氧为5～40％。

其中，利用L-天冬氨酸酶发酵液催化富马酸氨转化为L-天冬氨酸的条件为：温度30～37℃，转速为100～200r/min，反应时间为12～24小时。

其中，利用发酵液催化富马酸氨转化为L-天冬氨酸，催化体系中富马酸的浓度为150～200g/L。

有益效果：

(1)本发明可实现L-天冬氨酸酶的组成型高活性表达，且发酵培养后获得的细胞或是粗酶液具有低富马酸酶活性。

(2)微有氧培养该重组菌，将其游离细胞或是简单冻溶后的粗酶液与富马酸铵混合后，其转化产物中主要是L-天冬氨酸(底物的摩尔转化率超过99.5％)，无苹果酸积累。该方法可有效提高底物富马酸的转化收率，降低副产物的生产，有效降低生产成本。

附图说明

图1敲除fumB基因的线性片段PCR图，泳道M为marker，泳道1为线性片段

图2菌落PCR鉴定图，其中BEW308泳道为出发菌株，M为Marker，1～8为鉴定的单菌落。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

本实施例说明利用同源重组技术敲除亲本耐铵型大肠杆菌BEW308中富马酸酶fumB基因，得到消除安普霉素抗性菌株的过程。

(1)利用LB培养基，于37℃、有氧条件下培养大肠杆菌BEW308至OD₆₀₀＝0.4～0.6，制备成电转感受态；

(2)将重组质粒电转入感受态的大肠杆菌BEW308。电击条件为：200Ω，25μF，电击电压2.3kv，电击时间4～5ms。电击后迅速将菌体加入预冷1mL的SOC培养基，150r/min、30℃培养1h之后涂布于带氨苄青霉素(amp)的LB培养基平板筛选出阳性转化子BEW308(pKD46)；

(3)在LB培养基中加入10mM的L-阿拉伯糖，于30℃下诱导质粒pKD46表达出λ重组酶，制成电转感受态；

(4)以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，以质粒pIJ773为模板，并设计两端带有fumB同源片段的扩增引物，扩增出线性DNA同源片段，引物序列如下：

上游带同源臂引物H1-P1(SEQ ID NO:3)：

5’-CGGCACGCCATTTTCGAATAACAAATACAGAGTTACAGGCTGGAAGCTATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’

下游带同源臂引物H2-P2(SEQ ID NO:4)：

5’-TTACTTAGTGCAGTTCGCGCACTGTTTGTTGACGATTTGCTGGAAGAATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’

反应体系：带同源臂的上下游引物(100pmol/μl)各0.5μl；模板DNA(100ng/μl)0.5μl；10×buffer 5μl；dNTPs(10mM)各1μl；DMSO(100％)2.5μl；Pyrobest DNA聚合酶(2.5U/μl)1μl；ddH2O 36/35.5μl；总体积50μl。

反应条件：94℃，2min；(94℃，45sec；50℃，45sec；72℃，90sec；10个循环)；(94℃，45sec；55℃，45sec；72℃，90sec；15个循环)；72℃，5min。

线性DNA片段的鉴定如图1。

(5)电转线性DNA片段至已诱导表达λ重组酶的BEW308(pKD46)感受态，并涂布于带安普霉素的LB平板筛选出阳性重组子，并进行了PCR鉴定，电泳图如图2所示。

(6)阳性重组子制备成感受态后倒入能诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，于42℃热激表达FLP重组酶后即可消除安普霉素抗性。利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的菌即为已经敲除抗性的菌株，命名为BEW308(△fumB)。

实施例2：

本实施例说明利用同源重组技术进一步敲除大肠杆菌BEW308(△fumB)中富马酸酶fumAC基因，并引入突变的高活性天冬氨酸酶基因。

整个实验操作过程与实施例1一致，仅同源序列不同。

(1)本实施例以Escherichia coli K12的L-天冬氨酸酶基因(aspC)为出发序列，同时236和249位氨基酸进行突变，即Lys236Asn，Gly249Thr，同时在启始密码子ATP上游增加了一段信号肽序列atgttgaatccgaaggttgcctacatggtctggatgacgtgcctgggtttaacgttgcccagccaggca(SEQ ID NO:2所示)，最终在两端增加fumAC的同源臂和安普霉素抗性基因序列，整段基因采用人工合成的方式合成，具体核苷酸序列见SEQ ID NO:5所示。

(2)电转人工合成的线性DNA片段至已诱导表达λ重组酶的BEW308(△fumB,pKD46)感受态，并涂布于带安普霉素的LB平板筛选出阳性重组子，并进行了PCR鉴定，阳性重组子制备成感受态后倒入能诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，于42℃热激表达FLP重组酶后即可消除安普霉素抗性。利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的菌即为已经敲除抗性的菌株，命名为BEW308(△fumB,△fumAC-aspC)

实施例3：

本实施例对比考察了出发菌株Escherichia coli BEW308和重组菌Escherichiacoli BEW308(△fumB,△fumAC-aspC)在FM发酵培养基中培养后富马酸酶、天冬氨酸酶活性的变化以及用于天冬氨酸转化时的对比数据。

具体步骤如下：

(1)采用LB培养基，按1～2％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，有氧培养10～12h，进一步按1～2％(v/v)接种量接种至摇瓶或者种子发酵罐(培养基也为LB)，种子培养过程温度控制在35～37℃，培养中不需调节pH，溶氧控制在5～40％，培养4～6h后待菌体OD₆₀₀至2.5～4之间，按5～10％接种发酵培养基FM，发酵过程温度控制在28～30℃，培养过程pH控制在7.2～7.8，溶氧控制在5～40％。收集发酵培养12h，16h，20h和24h的菌液进行酶活测定(结果见表1)并用于酶转化实验。

表1 Escherichia coli BEW308(△fumB,△fumAC-aspC)与出发菌株天冬氨酸酶和富马酸酶的酶活比较

(2)配制160g/L富马酸氨溶液，用氨水调节pH至8.5，按1:18(1ml发酵液：18ml富马酸氨)比例进行转化，在37℃，200r/min下，反应24小时。取样，沸水灭活5min，终止反应，离心，取上清液，进行适当稀释，通过HPLC测定转化液中各物质的分配情况。实验结果见表2。

表2 Escherichia coli BEW308(△fumB,△fumAC-aspC)发酵液对富马酸氨的催化效率

实施例4：

本实施例对比考察了重组菌Escherichia coli BEW308(△fumB,△fumAC-aspC)在酶转化过程中对底物富马酸铵的耐受性及其对底物转化率的影响。配制一定浓度马酸氨溶液，用氨水调节pH至8.5，按1:18(1ml发酵液：18ml富马酸氨)比例进行转化，在37℃，200r/min下，反应24小时。取样，沸水灭活5min，终止反应，离心，取上清液，进行适当稀释，通过HPLC测定转化液中各物质的分配情况。实验结果见表3。

表3 Escherichia coli BEW308(△fumB,△fumAC-aspC)对富马酸氨的耐受性

Claims (9)

1.一株无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌，其特征在于，将耐铵型大肠杆菌BEW308中编码富马酸酶的基因fumA、fumB、fumC失活，再将编码L-天冬氨酸酶基因插入到编码富马酸酶fumAC基因的位置，即得到无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌，所述的耐铵型大肠杆菌BEW308的保藏号为CCTCC NO：M2013157；

所述编码L-天冬氨酸酶基因，其起始密码子的上游有一段信号肽，该信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌，其特征在于，所述的L-天冬氨酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.权利要求1所述的无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 将pKD46质粒转入耐铵型大肠杆菌BEW308中，筛选出阳性转化子大肠杆菌BEW308-pKD46，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将大肠杆菌BEW308-pKD46制备成感受态细胞；

(2) 以pIJ773质粒为模板，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列为引物，PCR扩增得到fumB基因敲除片段；

(3) 将步骤(2)得到的fumB基因敲除片段电转化至大肠杆菌BEW308-pKD46制备成感受态细胞中，在安普霉素抗性平板上筛选阳性重组子；

(4) 将步骤(3)得到的阳性重组子制备成感受态细胞，将pCP20质粒转化其中，42℃诱导FLP重组酶表达，在安普霉素抗性平板和无抗性的平板上进行双挑实验，在物抗性的平板上生长，但不能在有安普霉素抗性的平板上生长的菌株为fumB基因失活的菌株BEW308-△fumB；

(5) 人工合成在SEQ ID NO：1起始密码子ATG前添加了SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的基因敲除片段，该片段还包括安普霉素抗性基因序列，并在两端添加了fumAC的同源臂，具体序列见SEQ ID NO：5；

(6) 将步骤(4)得到的fumB基因失活的菌株BEW308-△fumB制备成感受态细胞，将pKD46质粒转化其中，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将其制备成感受态细胞；

(7) 将步骤(5)中的核苷酸序列转化至步骤(6)的含有λ重组酶的感受态细胞中，在安普霉素抗性平板上筛选阳性重组子；

(8) 将步骤(7)中的阳性重组子制备成感受态细胞，将pCP20质粒转化其中，42℃诱导FLP重组酶表达，在安普霉素抗性平板和无抗性的平板上进行双挑实验，在无抗性的平板上生长，但不能在有安普霉素抗性的平板上生长的菌株即为无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌BEW308-△fumB- △fumAC-aspC。

4.权利要求1所述的无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌在生产L-天冬氨酸中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，利用无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌发酵得到发酵液，再利用发酵液催化富马酸氨转化为L-天冬氨酸。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的发酵产L-天冬氨酸酶，其发酵培养基配方为：酵母粉24g/L，蛋白胨10g/L，K₂HPO₄ 36mmol/L，MgSO₄ 10 mmol/L，微量元素2 mL/L，溶剂为水，pH用NaOH调到7.2～7.5；

所述的微量元素按照如下方法配置：CaCl₂·6H₂O 0.74 g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.18 g/L，MnSO₄·H₂O 20 g/L，Na₂·EDTA 20.1 g/L，CuSO₄ 0.1 g/L，CoCl₂ 0.104 g/L,FeSO₄·7H₂O2 g/L，溶剂为水。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的发酵产L-天冬氨酸酶，其发酵过程中，温度为28~30℃，pH为7.2~7.8，溶氧为5～40%。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，利用发酵液催化富马酸氨转化为L-天冬氨酸的条件为：温度30～37℃，转速为100～200 r/min，反应时间为12～24小时。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，利用发酵液催化富马酸氨转化为L-天冬氨酸，催化体系中富马酸氨的浓度为150～200 g/L。