CN110283763A - 利用甘油生产γ-氨基丁酸的重组菌及其构建方法 - Google Patents

利用甘油生产γ-氨基丁酸的重组菌及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110283763A
CN110283763A CN201910318343.5A CN201910318343A CN110283763A CN 110283763 A CN110283763 A CN 110283763A CN 201910318343 A CN201910318343 A CN 201910318343A CN 110283763 A CN110283763 A CN 110283763A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aminobutyric acid
gene
glycerol
rbs
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910318343.5A
Other languages
English (en)
Inventor
刘君
王一然
徐宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Original Assignee
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS filed Critical Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority to CN201910318343.5A priority Critical patent/CN110283763A/zh
Publication of CN110283763A publication Critical patent/CN110283763A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01006—Glycerol dehydrogenase (1.1.1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01029—Glycerone kinase (2.7.1.29), i.e. dihydroxyacetone kinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01015—Glutamate decarboxylase (4.1.1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01031—Phosphoenolpyruvate carboxylase (4.1.1.31)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一株利用甘油生产γ‑氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法。首先通过对甘油促进蛋白基因glpF，甘油脱氢酶基因dhaD和二羟丙酮激酶基因dhaK进行RBS随机突变，获得可以高效利用甘油的谷氨酸棒杆菌突变菌株。通过过表达巨大芽孢杆菌中的谷氨酸脱羧酶基因gad获得可以利用甘油生产γ‑氨基丁酸的底盘菌株。通过利用不同强度RBS来表达谷氨酸脱羧酶，高强度RBS最有利于γ‑氨基丁酸合成；然后通过提高前体物L‑谷氨酸的水平，再通过对γ‑氨基丁酸的降解途径进行敲除，对γ‑氨基丁酸的转运蛋白基因gadC进行过表达。最终以60g/L的甘油为底物，经过84h发酵，γ‑氨基丁酸含量达到10.94g/L。

Description

利用甘油生产γ-氨基丁酸的重组菌及其构建方法
技术领域
本发明属于合成生物学和代谢工程技术领域，以食品安全级微生物谷氨酸棒杆菌为宿主菌，通过代谢工程策略构建一株可以利用甘油生产γ-氨基丁酸的菌株。
背景技术
γ-氨基丁酸广泛存在于植物、微生物和动物中，目前已经广泛应用于饲料、食品、保健品和工业等领域。通过化学法合成GABA会有部分化学试剂残留，安全性差，不利于在食品及医药行业使用，微生物发酵法条件温和，操作简单，污染小，有利于工业化生产，可以通过微生物细胞中的GAD把L-谷氨酸转化为GABA。
谷氨酸棒杆菌是短小棒状，单个或八字排列的革兰氏阳性菌，是产生异源蛋白质的有效宿主。谷氨酸棒状杆菌是食品安全级菌株，工业领域常用于产氨基酸类、核酸类和有机酸类产品，也可用于生产食品添加剂或医药原料。
近年来，由于生物柴油的需求量不断增长，其副产物甘油达到生物柴油的10％，甘油产量随之也出现了供大于求的现在，所以把甘油转化为高价值产品成为当今研究热点。目前有研究表明可以将甘油转化为丁二醇、琥珀酸、富马酸等，但转化为GABA的研究仅有一项。相关研究在大肠杆菌中开展，但是由于产量较低且需要外源添加L-谷氨酸，无法满足实际生产需求。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一株利用甘油生产γ-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法。主要步骤如下：
(1)本发明选择食品安全微生物谷氨酸棒杆菌为宿主菌株。
(2)本发明首先通过对甘油转运蛋白基因glpF、甘油脱氢酶基因dhaD和二羟丙酮激酶基因dhaK进行RBS随机突变，提高了菌株对甘油的利用效率。
(3)在(2)获得的菌株的基础上，通过过表达巨大芽孢杆菌中的谷氨酸脱羧酶基因gad，获得可以从甘油生产γ-氨基丁酸的菌株。
(4)在(3)获得的菌株的基础上，比较不同强度RBS来表达gad对γ-氨基丁酸产量的影响，获得最适合γ-氨基丁酸合成的谷氨酸脱羧酶(GAD)活性。
(5)在(4)获得的菌株的基础上，通过敲除丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶基因pknG，过表达自身的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，并对基因ppc的表达强度进行调整，促进前体物L-谷氨酸的积累。
(6)在(5)获得的菌株的基础上，通过敲除γ-氨基丁酸氨基转移酶基因gabT，琥珀酸-半醛脱氢酶基因gabD，γ-氨基丁酸逆向转运蛋白基因gabP，从而减少γ-氨基丁酸的降解。
(7)在(6)获得的菌株的基础上，通过过表达谷氨酸/γ-氨基丁酸转运蛋白基因gadC，促进γ-氨基丁酸的转运能力。
(8)将获得的谷氨酸棒杆菌工程菌株接种到3mL LBHIS液体培养基(酵母提取物2.5g/L，胰蛋白胨0.5g/L，氯化钠0.5g/L，D-山梨醇91g/L，脑心浸液18.5g/L，pH7.0)中过夜培养，然后取1mL菌液转接至含有20mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养12-14h。然后转接至含有40mL发酵培养基的500mL三角瓶中，起始OD600为1.0。发酵条件为30℃，200rpm。种子培养基为：葡萄糖25g/L，发酵专用玉米粉30g/L，尿素8g/L，K2HPO4·3H2O 1.31g/L，MgSO4·7H2O 0.41g/L，pH为7.0。发酵培养基为：甘油60g/L，发酵专用玉米浆粉3g/L，尿素8g/L，FeSO4·7H2O 0.29g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MnSO4·H2O 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.82g/L，CaCO3 10g/L作为发酵培养基的缓冲剂，pH为7.0，发酵84h，γ-氨基丁酸含量达到10.94g/L。
附图说明
图1为一株利用甘油生产γ-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌构建策略示意图；
图2为RBS随机突变提高甘油利用率；
图3为底盘细胞γ-氨基丁酸的产量；
图4为不同强度RBS表达谷氨酸脱羧酶GAD对γ-氨基丁酸产量的影响；
图5为敲除pknG基因对γ-氨基丁酸的影响及高强度RBS过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc对γ-氨基丁酸的影响。
图6为不同强度RBS表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶对γ-氨基丁酸产量的影响。
图7为敲除降解途径gabTDP基因对γ-氨基丁酸产量的影响及过表达γ-氨基丁酸转运蛋白基因gadC对γ-氨基丁酸产量的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例汇总所用的材料、试剂等，无特殊说明。均可从商业途径得到。
实施例1提高甘油利用效率的谷氨酸棒杆菌的菌株构建
(1)对甘油利用途径中的三个基因glpF、dhaD、dhaK基因及pEC-XK99E质粒进行RBS随机突变引物设计。使用引物序列分别为：
glpF-F：5’-caccaggtctcacacaaaaggannnnnnnnatgagtcaaacatcaaccttgaaag-3’
glpF-R：5’-caccaggtctcagactgcttacagcgaagctttttgttctg-3’
dhaD-F：5’-caccaggtct caagtcaaaggannnnnnnnatgctaaaagttattcaatctccagc-3’
dhaD-R：5’-caccaggtctcacctgggttaacgcgccagccactgctgtc-3’
dhaK-F：5’-caccaggtctcacaggaaaggannnnnnnnatgtctcaattcttttttaaccaacg-3’
dhaK-R：5’-caccaggtctcacgttacccttagcccagctcactctccgccag-3’
pEC-XK99E-F：5’-caccaggtctcaaacgggcggagagtgagctgggc-3’
pEC-XK99E-R：5’-caccaggtctcatgtgaaattgttatccgctcacaattcc-3’
以pEC-XK99E-glpFDK质粒为模板，用上述引物进行PCR扩增，得到glpF片段、dhaD片段、dhaK片段和pEC-XK99E载体片段。用Golden Gate组装技术对片段进行连接。PCR体系：glpF片段4μL、dhaD片段2μL、dhaK片段2μL和pEC-XK99E载体片段1μL，10×T4 ligaseBuffer 1.5μL，10×BSA 1.5μL，BsaI 1μL，T4 ligase 1μL。PCR程序：37℃3min，16℃4min，25个循环；50℃5min，80℃5min，4℃保存。
(2)取DH5α感受态放冰上缓慢解冻，然后将PCR得到的产物加入感受态中进行化转，用引物glpF-F/glpF-R、dhaD-F/dhaD-R和dhaK-F/dhaK-R对转化子进行验证，将所有转化子收集后进行质粒提取，获得含有RBS随机突变序列的质粒文库。
(3)将质粒文库电转化C.glutamicum ATCC 13032菌株。电转化条件为：在100μL感受态细胞中加1.5μL质粒，轻轻吹打，之后把感受态转移到0.1cm Bio-Rad电转杯中，在冰上放30min，使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为1.8KV-6ms，电击后迅速加入1mL LBHIS液体培养基至电转杯中，吹打几次后将液体转移到1.5mL EP管中，46℃，水浴热激6min，置于30℃，200rpm培养1.5h，7000rpm离心2min后，均匀涂于含Kan抗性的LBHIS固体平板上，30℃，放置培养36h。
(4)在96孔板中加入600μL CGXII培养基((NH4)2SO4 20g/L，尿素5g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，MOPS 0.1mol/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，甘油10g/L，FeSO4·7H2O10g/L，MnSO4·H2O 10g/L，ZnSO4 1g/L，CuSO4·5H2O 0.2g/L，NiCl2·6H2O 0.02g/L，CaCl210g/L，生物素0.2g/L，pH7.0)，挑取单菌落于96孔板中，共设置6个对照，以含有原始甘油利用途径的质粒的菌株作为对照，将96孔板密封后置于摇床中，并在30℃，800rpm下培养40h，然后测定OD600，并从中挑取相对具有高OD600的菌株，将其划线于含Kan抗性的LBHIS平板中。对选出的几个生长较好的菌株进行摇瓶测试，从中选出生长最好的菌株，进行后续实验。
实施例2不同RBS强度过表达巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶基因gad菌株的构建
(1)首先从DH5α/pET21b-Bmgad菌株中提取pET21b-Bmgad质粒，DH5α/pXMJ19菌株中提取pXMJ19质粒，然后分别利用引物对gad-F/gad-R和pXMJ19-F/pXMJ19-R扩增出gad基因片段和pXMJ19载体片段，采用Golden Gate组装技术获得质粒pXMJ19-gad。用引物gad-H-F/RBS-gad-R扩增出gad-H基因片段，用引物gad-L-F/RBS-gad-R扩增出gad-L基因片段。利用GoldenGate组装技术将上述片段分别连接到载体pXMJ19上，获得质粒pXMJ19-gad、pXMJ19-gadH、pXMJ19-gadL。使用引物序列分别为：
gad-F：5’-gaaggagatatacatatgccacagtggcacccacaccgcg-3’
gad-R：5’-gcctttttgcgtttctacaaactcttttgtttatttttc-3’
pXMJ19-F：5’-gtttctacaaactcttttgtttatttttctaaatacattc-3’
pXMJ19-R：5’-gtgccactgtggcatatgtatatctccttcttaaagaagc-3’
gad-H-F：5’-gaattaattaagcttaaaggaggttgtcatgccacagtggcacccacac-3’
gad-L-F：5’-gaattaattaagcttaaaggtcgacttcatgccacagtggcacccacac-3’
RBS-gad-R：5’-cggtacccggggatccctagtggtggaagccgttatcgtac-3’
(2)将上述质粒pXMJ19-gad、pXMJ19-gadH、pXMJ19-gadL分别电转至谷氨酸棒杆菌含有甘油利用途径的菌株细胞中。
(3)将上述获得的谷氨酸棒杆菌工程菌株，接种至含有3mL LBHIS液体培养基中过夜培养，然后取1mL菌液转接至含有20mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养12-14h。转接至含有40mL发酵培养基的500mL三角瓶中，调整起始OD600为1.0。发酵条件为30℃，200rpm。种子培养基为：葡萄糖25g/L，发酵专用玉米粉30g/L，尿素8g/L，K2HPO4·3H2O 1.31g/L，MgSO4·7H2O 0.41g/L，pH 7.0。发酵培养基为：甘油60g/L，发酵专用玉米浆粉3g/L，尿素8g/L，FeSO4·7H2O 0.29g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MnSO4·H2O 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.82g/L，CaCO3 10g/L作为发酵培养基的缓冲剂，pH 7.0。最终以60g/L的葡萄糖为底物，经过36h发酵后，含有质粒pXMJ19-gad的工程菌株L-谷氨酸产量为1.27g/L，γ-氨基丁酸是2.0g/L，含有质粒pXMJ19-gadH的工程菌株γ-氨基丁酸含量达到3.4g/L，含有质粒pXMJ19-gadL的工程菌株γ-氨基丁酸含量达到0.96g/L。
实施例3谷氨酸棒杆菌丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶基因pknG缺失菌株的构建
(1)以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，分别使用引物pknG-up-F、pknG-up-R和pknG-dn-F、pknG-dn-R，扩增获得pknG-up片段和pknG-dn片段。通过融合PCR技术，把上同源臂和下同源臂进行连接。将融合后的片段用HindIII、XbaI酶进行处理，连接到温度敏感型敲除载体pCRD206上，获得敲除质粒pCRD206-pknG。使用引物序列分别为：
pknG-up-F：5’-agtgaagcttattttcggtgaccccaataagg-3’
pknG-up-R：5’-caaatagccccaagtcaaaacagcgttttctgtcccttcttcctc-3’
pknG-dn-F：5’-ctgttttgacttggggctatttg-3’
pknG-dn-R：5’-tctgtctagagaaaatgcccagtttgtccgt-3’
(3)pknG基因敲除步骤：将质粒pCRD206-pknG电转入C.glutamicum ATCC 13032感受态细胞中。挑取转化子接到3mL有抗性的LBHIS液体培养基的试管中，25℃200rpm，24h后在含有Kan抗性的LBHIS固体平板上划线，37℃，恒温培养箱中培养12h，再接到3mL有抗性的LBHIS液体培养基中，37℃，200rpm培养12h，取100μL转接于有10％蔗糖的A培养基中(酵母提取物2g/L，酸水解酪素7g/L，(NH4)2SO4 7g/L，尿素2g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，葡萄糖40g/L，FeSO4·7H2O 6g/L，MnSO4·H2O 4.2g/L，生物素200g/L，VB1 200g/L，pH7.0)。之后划线到含10％蔗糖的A培养基中，30℃培养12h。挑取单菌落分别在含有Kan抗性的LBHIS固体平板和不含Kan抗性的LBHIS固体平板上对点划线，选在仅在无抗性的平板上生长的菌落进行验证。
PCR体系：5×phusion buffer 10μL，dNTPs混合液4μL，DMSO 1.5μL，PhusionHigh-Fidelity DNA聚合酶0.5μL，引物1 2.5μL，引物2 2.5μL，DNA模板1μL，28μL ddH2O。
PCR条件：第一阶段94℃处理5min；第二阶段设置35个循环，94℃30s，55℃30s，72℃1min；第三阶段72℃延伸7min，4℃降温保存。
酶切体系：HindIII 5μL，XbaI 5μL，10×buffer 10μL，pCRD206质粒或融合片段30μL，加50μL ddH2O，37℃酶切2h。
连接体系：10×buffer 2μL，T4 DNA连接酶1μL，pCRD206 4μL，融合片段13μL，混匀并置于22℃金属浴中过夜反应。
实施例4不同RBS强度过表达谷氨酸棒杆菌磷酸烯醇式丙酮酸脱羧酶基因ppc菌株的构建(1)以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，使用引物ppc-H-F和ppc-R扩增出ppcH基因片段，ppc-M-F和ppc-R，扩增出ppcM基因片段，ppc-L-F和ppc-R，扩增出ppcL基因片段。使用引物pXMJ19-gadH-F、pXMJ19-gadH-R，扩增pXMJ19-gadH载体片段。采用GoldenGate组装技术，分别获得质粒pXMJ19-gadH-ppcH、pXMJ19-gadH-ppcM、pXMJ19-gadH-ppcL。使用引物序列分别为：
ppc-H-F：5’-gtacgataacggcttccaccactagaaaggagttgcttatgactgattttttacg-3’
ppc-M-F：5’-gtacgataacggcttccaccactagaaaggcatgttctatgactgattttttacg-3’
ppc-L-F：5’-gtacgataacggcttccaccactagaaagggcctgtagatgactgattttttacg-3’
ppc-R：5’-ggtacccggggatccctagccggagttgcgcagcgcagtg-3’
pXMJ19-gadH-F：5’-ctgcgcaactccggctagggatccccgggtaccgagctcg-3’
pXMJ19-gadH-R：5’-ctttctagtggtggaagccgttatcgtacttggtatccttg-3’
(2)将pXMJ19-gadH-ppcH、pXMJ19-gadH-ppcM、pXMJ19-gadH-ppcL质粒分别电转至谷氨酸棒杆菌含有甘油利用途径同时丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶基因pknG缺失的菌株细胞中。
(3)将上述获得的谷氨酸棒杆菌工程菌株，接种至含有3mL LBHIS液体培养基中过夜培养，然后取1mL菌液转接至含有20mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养12-14h。转接至含有40mL发酵培养基的500mL三角瓶中，调整起始OD600为1.0。发酵条件为30℃，200rpm。种子培养基为：葡萄糖25g/L，发酵专用玉米粉30g/L，尿素8g/L，K2HPO4·3H2O 1.31g/L，MgSO4·7H2O 0.41g/L，pH 7.0。发酵培养基为：甘油60g/L，发酵专用玉米浆粉3g/L，尿素8g/L，FeSO4·7H2O 0.29g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MnSO4·H2O 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.82g/L，CaCO3 10g/L作为发酵培养基的缓冲剂，pH 7.0。最终以60g/L的葡萄糖为底物，经过36h发酵后，含有质粒pXMJ19-gadH-ppcH的工程菌株γ-氨基丁酸是2.02g/L，含有质粒pXMJ19-gadH-ppcM的工程菌株γ-氨基丁酸含量达到4.36g/L，含有质粒pXMJ19-gadH-ppcL的工程菌株γ-氨基丁酸含量达到5.17g/L。
实施例5谷氨酸棒杆菌γ-氨基丁酸氨基转移酶基因gabT、琥珀酸-半醛脱氢酶基因gabD和γ-氨基丁酸反转运蛋白基因gabP敲除菌株的构建
(1)以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，使用引物gabTDP-up-F、gabTDP-up-R和gabTDP-dn-F、gabTDP-dn-R，扩增获得gabTDP-up片段和gabTDP-dn片段。通过融合PCR技术，把上同源臂和下同源臂进行连接。将融合后的片段用speI酶进行处理，连接到载体pCRD206上，获得质粒pCRD206-gabTDP。使用引物序列分别为：
gabTDP-up-F：5’-cggactagtttaggatatttccggaagcatcagtgatgtcagc-3’
gabTDP-up-R：5’-cgtataccacgcgtccaccgccacaccgtgc-3’
gabTDP-dn-F：5’-gaatactcatcacctaggcgatcgtcggattaatgcctgcg-3’
gabTDP-dn-R：5’-cggactagtttacaacaatttgggcgtatctggaatcatgggc-3’
(2)gabTDP基因敲除步骤：将质粒pCRD206-gabTDP电转入谷氨酸棒杆菌丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶基因pknG缺失菌株细胞中。采用上述相同策略筛选获得敲除菌株。
实施例6过表达大肠杆菌γ-氨基丁酸转运蛋白基因gadC菌株的构建
(1)以大肠杆菌基因组为模板，使用引物gadC-F和gadC-R扩增出gadC基因片段，并使用引物pXMJ19-gadH-ppcL-F和pXMJ19-gadH-ppcL-R，扩增出pXMJ19-gadH-ppcL载体片段。随后，采用Golden Gate组装技术获得质粒pXMJ19-gadH-ppcL-gadC。使用引物序列分别为：
gadC-F：5’-gcaactccggctagaaaggagaacgtgatggctacatcagtacagacag-3’
gadC-R：5’-cggtacccggggatccttagtgtttcttgtcattcatcac-3’
pXMJ19-gadH-ppcL-F：5’-cctttctagccggagttgcgcagcgcagtggaaagaccg-3’
pXMJ19-gadH-ppcL-R：5’-caagaaacactaaggatccccgggtaccgagctcgaattc-3’
(2)将质粒pXMJ19-gadH-ppcL-gadC电转至谷氨酸棒杆菌含有甘油利用途径同时丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶基因pknG缺失，γ-氨基丁酸氨基转移酶基因gabT、琥珀酸-半醛脱氢酶基因gabD和γ-氨基丁酸反转运蛋白基因gabP缺失的菌株细胞中。
(3)将上述获得的谷氨酸棒杆菌工程菌株，接种至含有3mL LBHIS液体培养基中过夜培养，然后取1mL菌液转接至含有20mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养12-14h。转接至含有40mL发酵培养基的500mL三角瓶中，调整起始OD600为1.0。发酵条件为30℃，200rpm。种子培养基为：葡萄糖25g/L，发酵专用玉米粉30g/L，尿素8g/L，K2HPO4·3H2O 1.31g/L，MgSO4·7H2O 0.41g/L，pH 7.0。发酵培养基为：甘油60g/L，发酵专用玉米浆粉3g/L，尿素8g/L，FeSO4·7H2O 0.29g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MnSO4·H2O 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.82g/L，CaCO3 10g/L作为发酵培养基的缓冲剂，pH 7.0。最终以60g/L的葡萄糖为底物，经过36h发酵后，含有质粒pXMJ19-gadH-ppcL-gadC的谷氨酸棒杆菌工程菌株γ-氨基丁酸达到10.94g/L。

Claims (7)

1.本发明提供一株利用甘油生产γ-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法。包括以下步骤：
(1)本发明所选宿主菌株为食品安全级微生物谷氨酸棒杆菌；
(2)本发明首先通过对甘油转运蛋白基因glpF，甘油脱氢酶基因dhaD，二羟丙酮激酶基因dhaK进行核糖体结合位点(RBS)随机突变，获得能够高效利用甘油的菌株；
(3)在(2)获得的菌株的基础上，过表达巨大芽孢杆菌的谷氨酸脱羧酶基因gad，并选取不同表达强度RBS序列来表达gad基因，获得最有利于积累γ-氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶；
(4)在(3)获得的菌株的基础上，通过减少α-酮戊二酸的合成同时选取不同表达强度RBS表达序列来过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，提高前体L-谷氨酸的水平，获得最利于γ-氨基丁酸的重组菌株；
(5)在(4)获得的菌株的基础上，通过较少γ-氨基丁酸的降解，同时过表达γ-氨基丁酸转运蛋白，促进γ-氨基丁酸的合成。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于：本研究所述微生物为谷氨酸棒杆菌。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于：提高菌株甘油利用的方法包括对甘油转运蛋白基因glpF，甘油脱氢酶基因dhaD，二羟丙酮激酶基因dhaK进行核糖体结合位点(RBS)随机突变。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于：过表达巨大芽孢杆菌的谷氨酸脱羧酶基因gad，再通过比较不同强度RBS表达谷氨酸脱羧酶基因gad，比较γ-氨基丁酸产量的变化，包括高强度RBS表达和低强度RBS表达，其中高强度RBS表达谷氨酸脱羧酶基因gad最利于γ-氨基丁酸的合成。
5.权利要求1所述的方法，其特征在于：通过提高L-谷氨酸水平提高γ-氨基丁酸产量，包括敲除丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶基因pknG，不同强度RBS过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，促进前体物L-谷氨酸的积累。
6.权利要求1所述的方法，其特征在于：通过敲除γ-氨基丁酸氨基转移酶基因gabT，琥珀酸-半醛脱氢酶基因gabD，γ-氨基丁酸转运蛋白基因gabP，较少胞内γ-氨基丁酸的降解，同时过表达γ-氨基丁酸转运蛋白基因gadC，促进γ-氨基丁酸的外排。
7.权利要求1中所得到的谷氨酸棒杆菌工程菌株发酵生产γ-氨基丁酸，其特征在于：将单菌落接到3mL LBHIS液体培养基中过夜培养，然后取1mL菌液转接至含有20mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养12-14h。然后转接至含有40mL发酵培养基的500mL三角瓶中，起始OD600为1.0。发酵条件为30℃，200rpm。种子培养基为：葡萄糖25g/L，发酵专用玉米粉30g/L，尿素8g/L，K2HPO4·3H2O 1.31g/L，MgSO4·7H2O 0.41g/L，pH为7.0。发酵培养基为：甘油60g/L，发酵专用玉米浆粉3g/L，尿素8g/L，FeSO4·7H2O 0.29g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MnSO4·H2O 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.82g/L，CaCO3 10g/L作为发酵培养基的缓冲剂，pH为7.0。
CN201910318343.5A 2019-04-19 2019-04-19 利用甘油生产γ-氨基丁酸的重组菌及其构建方法 Pending CN110283763A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910318343.5A CN110283763A (zh) 2019-04-19 2019-04-19 利用甘油生产γ-氨基丁酸的重组菌及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910318343.5A CN110283763A (zh) 2019-04-19 2019-04-19 利用甘油生产γ-氨基丁酸的重组菌及其构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110283763A true CN110283763A (zh) 2019-09-27

Family

ID=68001696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910318343.5A Pending CN110283763A (zh) 2019-04-19 2019-04-19 利用甘油生产γ-氨基丁酸的重组菌及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110283763A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112251428A (zh) * 2020-12-21 2021-01-22 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在生产γ-氨基丁酸中的应用
CN112359037A (zh) * 2021-01-11 2021-02-12 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种高产γ-氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶GADZ11及其基因和应用
CN113444655A (zh) * 2020-03-26 2021-09-28 吉林中粮生化有限公司 谷氨酸棒状杆菌、高谷氨酸产量的温度敏感型菌株及其获得方法、应用以及谷氨酸发酵方法
CN114752544A (zh) * 2022-06-16 2022-07-15 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 一步法生产γ-氨基丁酸的方法及其菌株构建
CN117165504A (zh) * 2023-08-03 2023-12-05 天津世纪伟康生物科技有限公司 一种发酵法高效生产γ-氨基丁酸的工程菌及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103555779A (zh) * 2013-08-01 2014-02-05 江南大学 一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法
WO2015092599A1 (en) * 2013-12-17 2015-06-25 Basf Se Improved process for the production of gamma-aminobutyric acid (gaba)
CN107674855A (zh) * 2017-06-14 2018-02-09 漳州卫生职业学院 一种产γ‑氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103555779A (zh) * 2013-08-01 2014-02-05 江南大学 一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法
WO2015092599A1 (en) * 2013-12-17 2015-06-25 Basf Se Improved process for the production of gamma-aminobutyric acid (gaba)
CN107674855A (zh) * 2017-06-14 2018-02-09 漳州卫生职业学院 一种产γ‑氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KEI-ANNE G. BARITUGO等: "Recent advances in metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum as a potential platform microorganism for biorefinery", 《BIOFUELS BIOPRODUCTS & BIOREFINING-BIOFPR》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113444655A (zh) * 2020-03-26 2021-09-28 吉林中粮生化有限公司 谷氨酸棒状杆菌、高谷氨酸产量的温度敏感型菌株及其获得方法、应用以及谷氨酸发酵方法
CN113444655B (zh) * 2020-03-26 2023-05-16 吉林中粮生化有限公司 谷氨酸棒状杆菌、高谷氨酸产量的温度敏感型菌株及其获得方法、应用以及谷氨酸发酵方法
CN112251428A (zh) * 2020-12-21 2021-01-22 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在生产γ-氨基丁酸中的应用
CN112251428B (zh) * 2020-12-21 2021-03-02 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在生产γ-氨基丁酸中的应用
CN112359037A (zh) * 2021-01-11 2021-02-12 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种高产γ-氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶GADZ11及其基因和应用
CN114752544A (zh) * 2022-06-16 2022-07-15 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 一步法生产γ-氨基丁酸的方法及其菌株构建
CN114752544B (zh) * 2022-06-16 2022-09-06 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 一步法生产γ-氨基丁酸的方法及其菌株构建
CN117165504A (zh) * 2023-08-03 2023-12-05 天津世纪伟康生物科技有限公司 一种发酵法高效生产γ-氨基丁酸的工程菌及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110283763A (zh) 利用甘油生产γ-氨基丁酸的重组菌及其构建方法
CN110607268B (zh) 一株高产l-缬氨酸的基因工程菌及发酵生产l-缬氨酸方法
CN103243042B (zh) 具有增强的l-赖氨酸产率的棒状杆菌属微生物以及使用所述微生物生产l-赖氨酸的方法
CN102165056B (zh) 生产l-氨基酸的微生物和使用其生产l-氨基酸的方法
CN104245921B (zh) 可利用木糖的棒状杆菌微生物和利用其产生l-赖氨酸的方法
CN110468092A (zh) 一株高产l-缬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN109750069A (zh) 生产l-赖氨酸的重组菌、其构建方法以及l-赖氨酸的生产方法
CN110982772B (zh) 一种高产缬氨酸的棒杆菌及其构建方法与应用
CN105734002B (zh) 一种重组谷氨酸生产菌株及其制备方法与应用
CN110241061A (zh) 提高短乳杆菌γ-氨基丁酸合成能力的方法及其应用
US11408017B2 (en) Composition for producing tagatose and method of producing tagatose using the same
CN105255849B (zh) 一种酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体构建及其应用
WO2022174597A1 (zh) 一种用于l-肌氨酸生产的基因工程菌及构建方法与应用
CN104593308A (zh) 一种基因工程菌及其构建方法和在生产木糖醇中的应用
CN107646053A (zh) 具有l‑色氨酸生产力的埃希氏杆菌属某种的微生物和使用其制备l‑色氨酸的方法
CN106497961B (zh) 一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法
CN113073074B (zh) 一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用
CN105316273B (zh) 一株无苹果酸副产的l-天冬氨酸酶重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN105602881B (zh) 一种产谷氨酸的温敏型重组谷氨酸棒状杆菌及其应用
WO2017088094A1 (zh) 一种信号肽及其在利用魔芋粉合成l-谷氨酸及其高值化的应用
CN106574236A (zh) 遗传修饰的产生(r)‑乳酸的嗜热细菌
CN108441525A (zh) 一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法
CN108504617A (zh) 一种高产l-赖氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法
KR20120130579A (ko) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 제조방법
US20210324391A1 (en) Recombinant microorganism, preparation method therefor and application thereof in producing coenzyme q10

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190927