CN117165504A - 一种发酵法高效生产γ-氨基丁酸的工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化合物生物技术及发酵工程技术领域，尤其是一种生产γ‑氨基丁酸的基因工程菌及其构建方法与应用。所述工程菌是以谷氨酸棒杆菌作为底盘菌株，通过在底盘菌中增强谷氨酸脱羧酶、磷酸解酮酶、谷氨酸合酶、和丙酮酸羧化酶的表达，同时降低琥珀酸‑半醛脱氢酶、谷氨酸激酶、乳酸脱氢酶的表达获得。本发明构建的生产γ‑氨基丁酸的基因工程菌，能够以葡萄糖等为底物，从头合成价值更高的γ‑氨基丁酸，发酵40h产量可高达59.4g/L，目前处于国内领先水平。与现有γ‑氨基丁酸生产菌相比，该基因工程菌具有遗传稳定性好、遗传背景清晰、可持续改造等优点，无需添加谷氨酸为底物，节约了生产成本，适合规模化工业生产的需要。
Description
技术领域：
本发明涉及化合物生物技术及发酵工程技术领域，尤其是一种生产γ-氨基丁酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术：
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)是一种非蛋白质氨基酸，广泛存在于微生物、动物和植物中，许多生理特性与抗焦虑、低血压镇静剂、利尿剂和止痛剂等相关，还具有介导神经传递和降压的活性，因此被广泛应用于医药、食品、饲料等领域。
生物合成反式-4-γ-氨基丁酸的主要途径由谷氨酸脱羧酶(GAD)催化L-谷氨酸得到，其具有安全、环保、可持续等优点。现如今，随着人们对γ-氨基丁酸功能研究的逐渐深入，其市场需求还在不断扩大。
谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性菌，并且是一种食品级(GRAS)微生物，以谷氨酸棒杆菌为底盘细胞进行工业生产γ-氨基丁酸更具有安全性，生产的产品可以广泛应用于食品行业。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种生产γ-氨基丁酸的基因工程菌。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述生产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述生产γ-氨基丁酸的基因工程菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种高产γ-氨基丁酸的基因工程菌株，为GABA-7，是由下述基因改造策略获得的：以谷氨酸棒杆菌作为底盘菌株，通过在底盘菌中增强谷氨酸脱羧酶、磷酸解酮酶、谷氨酸合酶、和丙酮酸羧化酶的表达，同时降低琥珀酸-半醛脱氢酶、谷氨酸激酶、乳酸脱氢酶的表达获得；
进一步地，所述谷氨酸脱羧酶的编码基因gadB1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
进一步地，所述磷酸解酮酶编码基因xfp，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
进一步地，所述谷氨酸合酶的编码基因cgl0184，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
进一步地，所述丙酮酸羧化酶的编码基因cgl0689，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
进一步地，所述除琥珀酸-半醛脱氢酶的编码基因cgl0051，核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；
进一步地，所述谷氨酸激酶的关键基因cgl2356，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
进一步地，所述乳酸脱氢酶的编码基因cgl2911，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
优选地，所述底盘菌株为谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC13032；
更进一步地，增强谷氨酸脱羧酶表达的方式为：整合两拷贝的谷氨酸脱羧酶编码基因gadB1；
更进一步地，增强磷酸解酮酶表达的方式为：整合一拷贝磷酸磷酸解酮酶编码基因xfp，减少碳流失；
更进一步地，增强谷氨酸合酶表达的方式为：整合一拷贝的谷氨酸合酶编码基因cgl0184，增强前体物质谷氨酸的生物合成；
更进一步地，增强丙酮酸羧化酶表达的方式为：将丙酮酸羧化酶编码基因cgl0689的原始启动子替换为Ptuf启动子，增强流入TCA循环中的碳流量；所述Ptuf启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
更进一步地，降低琥珀酸-半醛脱氢酶表达的方式为：敲除琥珀酸-半醛脱氢酶基因cgl0051，阻断GABA的分解途径；
更进一步地，降低谷氨酸激酶表达的方式为：敲除谷氨酸激酶关键基因cgl2356，减少谷氨酸分解代谢；
更进一步地，降低乳酸脱氢酶的表达方式为：敲除乳酸脱氢酶基因cgl2911，阻断丙酮酸分解途径。
上述基因工程菌在发酵生产γ-氨基丁酸中的应用；
进一步地，采用上述基因工程菌发酵生产γ-氨基丁酸的方法如下：
(1)斜面活化：将生产菌株从-80℃的20％甘油保菌管接入斜面活化培养，培养条件为32℃、12h；
(2)一级种子摇瓶：32℃，pH 7.0，220rpm，摇床培养10h；
(3)发酵罐二级种子：一级种子液接入发酵罐内进行二级种子培养，32℃，pH 7.0，溶氧40％，培养至OD600达到40；
(4)发酵罐发酵培养：接种量20％，32℃，溶氧40％，培养30-50h；
进一步地，种子培养基为：葡萄糖25g/L，玉米浆干粉15g/L，豆粕水解液15ml/L，K2HPO4·3H2O 1.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，其余为水。
进一步地，发酵培养基的组成为：葡萄糖60g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，MnSO4·H2O 20mg/L，FeSO4 20mg/L，VB1 0.5mg/L，VH 0.1mg/L，酵母粉7g/L，蛋氨酸0.5g/L，玉米浆干粉20g/L，豆粕水解液30mL/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0；
进一步地，发酵培养基中添加0-40mg/L的PLP(磷酸吡哆醛)；
5L发酵罐，发酵40h，产量可高达59.4g/L。
有益效果：
本发明构建的生产γ-氨基丁酸的基因工程菌，为高产γ-氨基丁酸的基因工程菌GABA-7。该基因工程菌以葡萄糖等为底物，从头合成价值更高的γ-氨基丁酸，发酵40h产量可高达59.4g/L，目前处于国内领先水平。与现有γ-氨基丁酸生产菌相比，该基因工程菌具有遗传稳定性好、遗传背景清晰、可持续改造等优点，无需添加谷氨酸为底物，节约了生产成本，适合规模化工业生产的需要。
附图说明：
图1γ-氨基丁酸相关代谢图解。
图2GABA-6菌落PCR验证图。
图3GABA-7菌落PCR验证图。
图4菌株GABA-1～GABA-7生产性能对比柱状图。
图5PLP添加量对GABA-7发酵影响柱状图。
图6菌株GABA-7发酵过程曲线图。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。
实施方案中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指体积百分比；溶液的百分比“％(m/v)”指100ml溶液中含有溶质的克数。
本发明构建γ-氨基丁酸的基因工程菌采用的底盘菌株为谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC13032；
本发明及实施例菌株构建过程中用到的引物见表1，实施例中所述菌株和质粒见表2，目的片段PCR扩增体系见表3，重叠PCR体系见表4。
表1构建菌株所用引物序列
表2.菌株和质粒
表3目的片段PCR扩增体系
表4重叠PCR扩增体系
表3、4体系的PCR反应条件(Prime STAR HS酶)：预变性(95℃)5min；变性(98℃)10s，退火((Tm-3/5)℃)15s，72℃延伸(酶活力1min延伸约1kb)进行30轮循环；72℃继续延伸10min；维持(4℃)。
以下通过具体实施例对本发明作进一步地解释说明。
实施例1菌株GABA-1的构建
以谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC13032为底盘菌，在基因组Ncgl1995位点和Ncgl2850位点整合两拷贝gadB1，构建GABA-1菌株。
(1)获取突变基因gadB1
以大肠杆菌w3110基因组为模板，设计引物gadB-62U-S、gadB-62U-A和gadB-62D-S、gadB-62D-A，通过PCR扩增获得上下游同源臂gadB-62-up和gadB-62-dw，再以其为模板通过HS酶重叠PCR获得gadB-62*，再设计引物gadB-309U-s、gadB-309U-a和gadB-309D-s、gadB-309D-a，通过HS酶PCR扩增获得上下游同源臂gadB-309-up和gadB-309-dw，再利用gadB-62U-S和gadB-309D-a引物通过HS酶PCR扩增获得突变片段gadB1(上下游引物两端包含20bp左右的HindⅢ和XbaⅠ酶切位点两端同源序列)。
用XbaⅠ和HindⅢ将pXT01质粒双酶切(pXT01质粒本身携带tuf启动子)，与片段gadB1进行重组，化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。BHI培养基摇管培养，并提出质粒pXT01-gadB1。
(2)pK18mobsacB-Ncgl1995::PtufgadB1载体构建
以谷氨酸棒杆菌TCCC 13032基因组为模板，以Ncgl1995基因上游同源臂扩增引物N1995-up-s和N1995-up-a，下游同源臂扩增引物N1995-dw-s和N1995-dw-a作为扩增引物，扩增出上下游同源臂片段，以质粒pXT01-gadB1为模板，N1995tuf-s和N1995gadB1-a作为扩增引物，扩增出带有tuf启动子(SEQ ID NO.8)的gadB1基因(SEQ ID NO.1)片段并回收。
用扩增出的Ncgl1995基因上下游同源臂和带有tuf启动子的gadB1基因片段作为模板，以N1995tuf-s和N1995gadB1-a作为引物，进行重叠PCR，获得重叠片段Ncgl1995::PtufgadB1。
用XbaⅠ和HindⅢ将pK18mobsacB质粒双酶切，与重叠片段Ncgl1995::PtufgadB1进行重组，化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。BHI培养基摇管培养，并提出质粒pK18mobsacB-Ncgl1995::PtufgadB1。
(3)在Ncgl1995位点整合一拷贝gadB1菌株构建
将构建好的质粒pK18mobsacB-Ncgl1995::PtufgadB1电击转化到ATCC 13032的感受态细胞中，涂布于0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24h。进行筛选获得阳性转化子，即为发生单交换的单菌落。
将发生单交换的单菌落接入摇管，32℃培养。分别在2h、4h、6h接50μL发酵液涂布于含有15％蔗糖的BHI平板，32℃，培养24h。将单菌落对点于含有15％蔗糖的BHI平板和0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，挑取在15％蔗糖的BHI平板生长且在0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板不生长的单菌落，菌落PCR验证后的阳性转化子即为目的菌株。
同上述操作一致，在基因组Ncgl2850位点整合第二个gadB1基因(替换对应引物即可，引物见表1)，即获得目的菌株GABA-1。同时将挑选出的菌株用体积分数为20％的甘油保藏。
实施例2菌株GABA-2的构建
在GABA-1基因组Ncgl1960位点整合一拷贝xfp基因的菌株GABA-2的构建。
(1)以青春双歧杆菌ATCC 15703为模板，通过上游引物Ptuf-Xfp-U、下游引物为Ptuf-Xfp-D进行PCR扩增获得xfp目的基因(上下游引物两端包含20bp左右的HindⅢ和XbaⅠ酶切位点两端同源序列)。
用XbaⅠ和HindⅢ将pXT01质粒双酶切，与xfp片段进行重组，化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。BHI培养基摇管培养，并提出质粒pXT01-xfp。
pK18mobsacB-Ncgl1960::Ptufxfp载体构建：
以谷氨酸棒杆菌TCCC 13032基因组为模板，以Ncgl1960基因上游同源臂扩增引物N1960-up-s和N1960-up-a，下游同源臂扩增引物N1960-dw-s和N1960-dw-a作为扩增引物，扩增出上下游同源臂，以质粒pXT01-xfp为模板，以N1960tuf-s和N1960xfp-a作为扩增引物，扩增出带有tuf启动子(SEQ ID NO.8)的xfp基因(SEQ ID NO.2)片段并回收。
用扩增出的Ncgl1960基因上下游同源臂和带有tuf启动子的xfp基因片段作为模板，以N1960tuf-s和N1960xfp-a作为引物，进行重叠PCR，获得重叠片段Ncgl1960::Ptufxfp。
用XbaⅠ和HindⅢ将pK18mobsacB质粒双酶切，与重叠片段Ncgl1960::Ptufxfp进行重组，化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。BHI培养基摇管培养，并提出质粒pK18mobsacB-Ncgl1960::Ptufxfp。
(2)在Ncgl1960位点整合一拷贝xfp菌株构建
将构建好的质粒pK18mobsacB-Ncgl1960::Ptufxfp电击转化到GABA-1的感受态细胞中，涂布于0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24h。进行筛选获得阳性转化子，即为发生单交换的单菌落。
将发生单交换的单菌落接入摇管，32℃培养。分别在2h、4h、6h接50μL发酵液涂布于含有15％蔗糖的BHI平板，32℃，培养24h。将单菌落对点于含有15％蔗糖的BHI平板和0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，挑取在15％蔗糖的BHI平板生长且在0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板不生长的单菌落，菌落PCR验证后的阳性转化子即为目的菌株GABA-2，同时将挑选出的菌株用体积分数为20％的甘油保藏。
实施例3菌株GABA-3的构建
在GABA-2基因组Ncgl2001位点整合一拷贝谷氨酸合酶cgl0184基因的菌株GABA-3的构建。
(1)谷氨酸棒杆菌TCCC 13032基因组为模板，通过上游引物Ptuf-cgl0184-U、下游引物为Ptuf-cgl0184-D进行PCR扩增获得cgl0184目的基因(上下游引物两端包含20bp左右的HindⅢ和XbaⅠ酶切位点两端同源序列)。
用XbaⅠ和HindⅢ将pXT01质粒双酶切，与cgl0184片段进行重组，化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。BHI培养基摇管培养，并提出质粒pXT01-cgl0184。
pK18mobsacB-Ncgl2001::Ptufcgl0184载体构建：
以谷氨酸棒杆菌TCCC 13032基因组为模板，以Ncgl2001基因上游同源臂扩增引物N2001-up-s和N2001-up-a，下游同源臂扩增引物N2001-dw-s和N2001-dw-a作为扩增引物，扩增出上下游同源臂，以质粒pXT01-cgl0184为模板，以N2001tuf-s和N2001cgl0184-a作为扩增引物，扩增出带有tuf启动子(SEQ ID NO.8)的cgl0184基因(SEQ ID NO.3)片段并回收。
用扩增出的Ncgl2001基因的上下游同源臂和带有tuf启动子的cgl0184基因片段作为模板，以N2001tuf-s和N2001cgl0184-a作为引物，进行重叠PCR，获得重叠片段Ncgl2001::Ptufcgl0184。
用XbaⅠ和HindⅢ将pK18mobsacB质粒双酶切，与重叠片段Ncgl2001::Ptufcgl0184进行重组，化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。BHI培养基摇管培养，并提出质粒pK18mobsacB-Ncgl2001::Ptufcgl0184。
(2)在Ncgl2001位点整合一拷贝cgl0184菌株构建
将构建好的质粒pK18mobsacB-Ncgl2001::Ptufcgl0184电击转化到GABA-2的感受态细胞中，涂布于0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24h。进行筛选获得阳性转化子，即为发生单交换的单菌落。
将发生单交换的单菌落接入摇管，32℃培养。分别在2h、4h、6h接50μL发酵液涂布于含有15％蔗糖的BHI平板，32℃，培养24h。将单菌落对点于含有15％蔗糖的BHI平板和0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，挑取在15％蔗糖的BHI平板生长且在0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板不生长的单菌落，菌落PCR验证后的阳性转化子即为目的菌株GABA-3，同时将挑选出的菌株用体积分数为20％的甘油保藏。
实施例4菌株GABA-4的构建
将GABA-3中丙酮酸羧化酶基因原始启动子替换为Ptuf启动子，构建GABA-4菌株。
(1)以谷氨酸棒杆菌TCCC 13032基因组为模板，以U-Ptuf-ppc-U和U-Ptuf-ppc-D为上下游引物，进行PCR扩增，得到上同源臂；以Ptuf-ppc-U和Ptuf-ppc-D为上下游引物，进行PCR扩增，得到目的基因Ptuf；以D-Ptuf-ppc-U和D-Ptuf-ppc-D为上下游引物，进行PCR扩增，得到下同源臂。
用扩增出的上下游同源臂和目的基因Ptuf为模板，以U-Ptuf-ppc-U和D-Ptuf-ppc-D为上下游引物进行PCP扩增，得到重叠片段Ptuf-ppc。
用XbaⅠ和HindⅢ将pK18mobsacB质粒双酶切，与重叠片段Ptuf-ppc重组，得到重组质粒pK18mobsacB-Ptuf，将获得的重组质粒化转到大肠杆菌DH5α中，涂布于0.05mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。BHI培养基摇管培养，并提出质粒pK18mobsacB-Ptuf。
(2)丙酮酸羧化酶基因替换Ptuf启动子
将构建好的质粒pK18mobsacB-Ptuf电击转化到GABA-3感受态细胞中，涂布于0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24h。挑选单菌落进行PCR，经过筛选获得阳性转化子，为发生单交换的单菌落。
将发生单交换的单菌落接入BHI摇管，32℃培养。分别在2h、4h、6h接50μL发酵液涂布于含有15％蔗糖的BHI平板，32℃，培养24h。将单菌落对点于含有15％蔗糖的BHI平板和0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，挑取在15％蔗糖的BHI平板生长且在0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板不生长的单菌落，经过筛选获得阳性转化子，发生双交换即替换成功的单菌落GABA-4。
实施例5菌株GABA-5的构建
构建pK18mobsacB-Δcgl0051载体，并对GABA-4进行琥珀酸-半醛脱氢酶基因cgl0051敲除操作：
1、pK18mobsacB-Δcgl0051载体构建
(1)以谷氨酸棒杆菌TCCC 13032基因组为模板，以cgl0051基因上游同源臂扩增引物cgl0051-up-s和cgl0051-up-a，下游同源臂扩增引物cgl0051-dw-s和cgl0051-dw-a作为扩增引物(其中cgl0051-up-s和cgl0051-dw-a的5’端分别加入限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ的线性载体同源序列，cgl0051-up-a和cgl0051-dw-s有25bp的重叠区域)，扩增出上下同源臂片段进行回收。
(2)用扩增出的上下游同源臂作为模板，以cgl0051-up-s和cgl0051-dw-a作为引物，进行重叠PCR，获得cgl0051中间部分缺失的重叠片段Δcgl0051。
(3)用XbaⅠ和HindⅢ将pK18mobsacB质粒双酶切，与重叠片段Δcgl0051进行重组，化转至谷氨酸棒杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。BHI培养基摇管培养，并提出质粒pK18mobsacB-Δcgl0051。
2、谷氨酸棒杆菌基因敲除操作
(1)将构建好的质粒pK18mobsacB-Δcgl0051电击转化到GABA-4感受态细胞中，涂布于0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24h。挑选单菌落进行PCR，经过筛选获得阳性转化子，为发生单交换的单菌落。
(2)将发生单交换的单菌落接入BHI摇管，32℃培养。分别在2h、4h、6h接50μL发酵液涂布于含有15％蔗糖的BHI平板，32℃，培养24h。将单菌落对点于含有15％蔗糖的BHI平板和0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，挑取在15％蔗糖的BHI平板生长且在0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板不生长的单菌落，对长好的单菌落进行PCR验证，将PCR扩增完成后的菌株进行琼脂糖凝胶电泳，所用引物为cgl0051-up-s和cgl0051-dw-a，若条带大小为900左右，则证明该单菌落发生双交换即敲除成功的单菌落GABA-5。
实施例6菌株GABA-6的构建
对GABA-5菌株进行谷氨酸激酶基因的敲除，构建GABA-6菌株。
1、构建pK18mobsacB-Δcgl2356载体，并进行谷氨酸激酶基因cgl2356敲除操作：
pK18mobsacB-Δcgl2356载体构建：
(1)以谷氨酸棒杆菌TCCC 13032基因组为模板，以cgl2356基因上游同源臂扩增引物cgl2356-up-s和cgl2356-up-a，下游同源臂扩增引物cgl2356-dw-s和cgl2356-dw-a作为扩增引物(其中cgl2356-up-s和cgl2356-dw-a的5’端分别加入限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ的线性载体同源序列，cgl2356-up-a和cgl2356-dw-s有25bp的重叠区域)，扩增出上下同源臂片段进行回收。
(2)用扩增出的上下游同源臂作为模板，以cgl2356-up-s和cgl2356-dw-a作为引物，进行重叠PCR，获得cgl2356中间部分缺失的重叠片段Δcgl2356(验证见图2泳道1)。
(3)用XbaⅠ和HindⅢ将pK18mobsacB质粒双酶切，与重叠片段Δcgl2356进行重组，化转至谷氨酸棒杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。BHI培养基摇管培养，并提出质粒pK18mobsacB-Δcgl2356。
2、谷氨酸棒杆菌基因敲除操作
(1)将构建好的质粒pK18mobsacB-Δcgl2356电击转化到GABA-5感受态细胞中，涂布于0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24h。挑选单菌落进行PCR，经过筛选获得阳性转化子，为发生单交换的单菌落。
(2)将发生单交换的单菌落接入BHI摇管，32℃培养。分别在2h、4h、6h接50μL发酵液涂布于含有15％蔗糖的BHI平板，32℃，培养24h。将单菌落对点于含有15％蔗糖的BHI平板和0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，挑取在15％蔗糖的BHI平板生长且在0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板不生长的单菌落，对长好的单菌落进行PCR验证，将PCR扩增完成后的菌株进行琼脂糖凝胶电泳，所用引物为cgl2356-up-s和cgl2356-dw-a，若条带大小为900左右，胶图见图2中泳道2，则证明该单菌落发生双交换即敲除成功的单菌落GABA-6。
实施例7菌株GABA-7的构建
构建pK18mobsacB-Δcgl2911载体，并对GABA-6菌株进行cgl2911(乳酸脱氢酶基因)敲除操作：
1、pK18mobsacB-Δcgl2911载体构建
(1)以谷氨酸棒杆菌TCCC 13032基因组为模板，以cgl2911基因上游同源臂扩增引物cgl2911-up-s和cgl2911-up-a，下游同源臂扩增引物cgl2911-dw-s和cgl2911-dw-a作为扩增引物(其中cgl2911-up-s和cgl2911-dw-a的5’端分别加入限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ的线性载体同源序列，cgl2911-up-a和cgl2911-dw-s有25bp的重叠区域)，扩增出上下同源臂片段进行回收。
(2)用扩增出的上下游同源臂作为模板，以cgl2911-up-s和cgl2911-dw-a作为引物，进行重叠PCR，获得cgl2911中间部分缺失的重叠片段Δcgl2911(验证见图3泳道1)。
(3)用XbaⅠ和HindⅢ将pK18mobsacB质粒双酶切，与重叠片段Δcgl2911进行重组，化转至谷氨酸棒杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。BHI培养基摇管培养，并提出质粒pK18mobsacB-Δcgl2911。
2、谷氨酸棒杆菌基因敲除操作
(1)将构建好的质粒pK18mobsacB-Δcgl2911电击转化到GABA-6感受态细胞中，涂布于0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24h。经过筛选获得阳性转化子，为发生单交换的单菌落。
(2)将发生单交换的单菌落接入BHI摇管，32℃培养。分别在2h、4h、6h接50μL发酵液涂布于含有15％蔗糖的BHI平板，32℃，培养24h。将单菌落对点于含有15％蔗糖的BHI平板和0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，挑取在15％蔗糖的BHI平板生长且在0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板不生长的单菌落，对长好的单菌落进行PCR验证，将PCR扩增完成后的菌株进行琼脂糖凝胶电泳，所用引物为cgl2911-up-s和cgl2911-dw-a，若条带大小为1000左右，胶图见图3中泳道2，则证明该单菌落发生双交换即敲除成功的单菌落GABA-7。
实施例8采用实施例1-7构建的基因工程菌株进行摇瓶发酵生产γ-氨基丁酸
1.培养基
(1)种子培养基为：葡萄糖25g/L，玉米浆干粉15g/L，豆粕水解液15ml/L，K2HPO4·3H2O1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L。
(2)发酵培养基为：
葡萄糖60g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，SO4·H2O 20mg/L，FeSO4 20mg/L，VB1 0.5mg/L，VH 0.1mg/L，酵母粉7g/L，蛋氨酸0.5g/L，玉米浆干粉20g/L，豆粕水解液30mL/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0。
2.摇瓶培养方案
(1)菌种活化：将谷氨酸棒杆菌菌株GABA-1～GABA-7菌株分别从-80℃的20％甘油保菌管接入斜面活化培养，培养条件为32℃、12h；
(2)种子培养：摇瓶定容种子培养基100mL，32℃，pH 7.0，220rpm，摇床培养10h；
(3)发酵培养：
按10％接种量接种菌种活化后制备的种子液到装有30ml发酵培养基的三角瓶中，九层纱布封口，32℃，220r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0左右；初始添加1mL 60％葡萄糖溶液维持发酵进行(待体系中葡萄糖耗尽时继续添加)，发酵周期30h。
发酵γ-氨基丁酸生产结果见图4，摇瓶发酵30h，GABA-1～GABA-7菌株γ-氨基丁酸产量分别为3.59、4.95、6.64、7.34、8.56、9.74、10.68g/L。初始菌株(C.glutamicum)ATCC13032没有γ-氨基丁酸生成。
实施例9单因素实验优化PLP(磷酸吡哆醛)添加量
以GABA-7为生产菌株，具体发酵培养方式如实施例8所示，在发酵培养基中设置5个PLP(磷酸吡哆醛)梯度添加量，分别是0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L，其余均与实施例8相同。
本实施例公开了5组摇瓶发酵32h的数据，分别为添加辅因子PLP浓度为0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L时的OD600nm与γ-氨基丁酸产量值，结果如图5所示。
由结果可以看出，PLP辅因子添加量为40mg/L时菌体生物量与γ-氨基丁酸产量达到最高，分别为47.5与13.1g/L。
实施例10菌株GABA-7在5L发酵罐发酵生产γ-氨基丁酸
高产菌株GABA-7经5L发酵罐发酵实验验证方法如下：
(1)发酵罐二级种子：一级种子液接入发酵罐内进行二级种子培养，32℃，pH 7.0，溶氧40％，培养至OD600达到40；
(2)发酵培养：等待种子菌体量OD600至40左右，按照20％接种量接入发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在32℃，溶氧在40％；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-1g/L(残糖仪测量)；发酵周期40h。
所述发酵培养基的组成为：葡萄糖60g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，MnSO4·H2O20mg/L，FeSO4 20mg/L，VB1 0.5mg/L，VH 0.1mg/L，酵母粉7g/L，蛋氨酸0.5g/L，玉米浆干粉20g/L，豆粕水解液30mL/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0
发酵γ-氨基丁酸生产结果见图6。上述基因工程菌GABA-7利用5L发酵罐发酵40h后γ-氨基丁酸的产量可达59.4g/L，糖酸转化率达到23.5％。此菌株具有良好的生产性能，为γ-氨基丁酸的产业化生产奠定了基础。
虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。
Claims (8)
1.一种基因工程菌株，其特征在于，是以谷氨酸棒杆菌作为底盘菌株，通过在底盘菌中增强谷氨酸脱羧酶、磷酸解酮酶、谷氨酸合酶、和丙酮酸羧化酶的表达，同时降低琥珀酸-半醛脱氢酶、谷氨酸激酶、乳酸脱氢酶的表达获得。
2.如权利要求1所述的一种基因工程菌株，其特征在于，所述底盘菌株为谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC13032。
3.如权利要求1所述的一种基因工程菌株，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶的编码基因gadB1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述磷酸解酮酶编码基因xfp，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述谷氨酸合酶的编码基因cgl0184，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述丙酮酸羧化酶的编码基因cgl0689，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述除琥珀酸-半醛脱氢酶的编码基因cgl0051，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述谷氨酸激酶的关键基因cgl2356，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述乳酸脱氢酶的编码基因cgl2911，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
4.如权利要求1所述的一种基因工程菌株，其特征在于，增强谷氨酸脱羧酶表达的方式为：整合两拷贝的谷氨酸脱羧酶编码基因gadB1；增强磷酸解酮酶表达的方式为：整合一拷贝磷酸磷酸解酮酶编码基因xfp；增强谷氨酸合酶表达的方式为：整合一拷贝的谷氨酸合酶编码基因cgl0184；增强丙酮酸羧化酶表达的方式为：将丙酮酸羧化酶编码基因cgl0689的原始启动子替换为Ptuf启动子；
降低琥珀酸-半醛脱氢酶、谷氨酸激酶、乳酸脱氢酶表达的方式为：敲除琥珀酸-半醛脱氢酶基因cgl0051，敲除谷氨酸激酶关键基因cgl2356，敲除乳酸脱氢酶基因cgl2911。
5.权利要求1-4任意一项所述基因工程菌株在生产γ-氨基丁酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，发酵罐生产γ-氨基丁酸的方法如下：种子液按20％接种量接入发酵培养基，32℃，溶氧40％，发酵培养30-50h。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，发酵培养基的组成为：葡萄糖60g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，MnSO4·H2O 20mg/L，FeSO4 20mg/L，VB1 0.5mg/L，VH 0.1mg/L，酵母粉7g/L，蛋氨酸0.5g/L，玉米浆干粉20g/L，豆粕水解液30mL/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，发酵培养基中添加0-40mg/L的磷酸吡哆醛。
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