JP2017516488A - Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の生産能を有する微生物、及びそれを利用したコハク酸またはｏ−スクシニルホモセリンの生産方法 - Google Patents

Abstract

Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の生産能を有する微生物、及びそれを利用したＯ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の生産方法が提供される。【選択図】図１

Description

本開示は、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の生産能を有する微生物、及びそれを利用したＯ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の生産方法に関する。

好気条件において、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の生産を増大させるためには、前駆体として、スクシニル−ＣｏＡが要求される。α−ケトグルタル酸脱水素酵素は、ＴＣＡ回路において、α−ケトグルタル酸のコハク酸への脱水素化を触媒する。該酵素をコーディングする遺伝子ｓｕｃＡＢは、染色体上において、コハク酸脱水素酵素（succinate dehydrogen）をコーディングするｓｄｈＣＤＡＢ及びスクシニル−ＣｏＡシンターゼをコーディングするｓｕｃＣＤと共に、クラスタ（cluster）として発現される構造を有し、クラスタ内部の２個のプローモーターによって発現されると知られている。該クラスタの遺伝子は、ｓｄｈＣプローモーターによって主に発現され、ｓｄｈＣＤＡＢ、ｓｕｃＡＢ、ｓｕｃＣＤの順序に発現される。ＴＣＡ回路の観点から見れば、コハク酸脱水素酵素をコーディングする遺伝子であるｓｄｈＣＤＡＢの発現が良好になされる構造であり、従って、コハク酸脱水素酵素の発現が強力であるため、ｓｕｃＡＢの発現によって、スクシニル−ＣｏＡを生産しても、スクシニル−ＣｏＡが迅速に分解されやすい構造である。クラスタ中間であるｓｄｈＣＤＡＢとｓｕｃＡＢとの間に、ｓｕｃＡプローモーターがあり、ｓｕｃＡプローモーターは、ｓｕｃＡＢの遺伝子の発現を駆動させるが、該クラスタにおける主要プローモーターは、ｓｄｈＣＤＡＢを駆動させるｓｄｈＣであり、ｓｕｃＡプローモーターは、ｓｄｈＣプローモーターに比べ、比較的弱いと知られている（S J Park, G Chao and R P Gunsalus, J. Bacteriol. 1997; Cunningham, L. & Guest, J. R. (1998) Microbiology 144, 2113-2123）。かような理由で、好気条件でのコハク酸生産菌株において、ｓｄｈＡＢの欠損によって、コハク酸生産が増加したという報告がある（A. Yu. Skorofkhodova, et al., Applied Biochemistry and Microbiology, December 2013, Vol. 49, Issue 7, pp. 629-637）。

それにより、本発明者は、コハク酸または０−スクシニルホモセリンの生産性を上昇させるための研究を行い、α−ケトグルタル酸脱水素酵素の活性を強化させることによって、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の生産性が向上した微生物を開発し、本開示を完成した。

本開示は、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を生産する微生物を提供することを目的とする。

本開示はまた、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を生産する微生物を培養する段階を含む、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を製造する方法を提供することを目的とする。

前記課題を解決するために、本開示は、α−ケトグルタル酸脱水素酵素の活性が、その内在された活性に比べて強化された、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の生産能を有する微生物を提供する。

前記課題を解決するために、本開示はまた、α−ケトグルタル酸脱水素酵素の活性が、その内在された活性に比べて強化された、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を生産する微生物を培養する段階、及び得られた微生物の培養液から、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を回収する段階を含む、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を生産する方法を提供する。

本開示のＯ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の生産菌株は、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を効率的に生産することができ、追加的な酵素的または化学的な転換を介して、多様な活用分野に利用される。

組み換えベクターｐＣＬ＿ＰｓｕｃＡ−ｓｕｃＡＢの概略図である。 組み換えベクターｐＣＬ＿Ｐｒｍｆ−ｓｕｃＡＢの概略図である。 組み換えベクターｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ−ｓｕｃＡＢの概略図である。 組み換えベクターｐＣＬ＿Ｐｃｙｓｋ−ｍｅｔＡ１１＿ＰｓｕｃＡ−ｓｕｃＡＢの概略図である。

一様態において、本開示は、コハク酸及びＯ−スクシニルホモセリンを生産する微生物を提供する。

本開示の一具現例において、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を生産する微生物は、α−ケトグルタル酸脱水素酵素の活性が、その内在された活性に比べて強化された、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の生産能を有する微生物でもある。

本明細書で使用された用語「Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を生産する微生物」は、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を生物体内で生産し、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を蓄積または分泌することができる、原核微生物または真核微生物を意味する。例えば、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を生産する微生物は、エシェリキア（Escherichia）属、アーウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacteria）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、レプトスピラ（Leptospira）属、サルモネラ（Salmonellar）属、ブレビバクテリア（Brevibacteria）属、ヒフォモナス（Hyphomonas）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属、ノカルディア（Nocardia）属、あるいはかび（fungi）または酵母（yeast）に属する微生物でもある。具体的には、エシェリキア属の微生物であり、さらに具体的には、大腸菌（Ｅ．coli）である。

コハク酸及びＯ−スクシニルホモセリンの生産を増加させるためには、スクシニル−ＣｏＡが要求され、スクシニルＣｏＡは、ＴＣＡ回路において、α−ケトグルタル酸の脱水素化に由来する。

α−ケトグルタル酸脱水素酵素は、ＴＣＡ回路において、α−ケトグルタル酸の脱水素化によって、コハク酸を生成する段階を触媒する酵素であり、α−ケトグルタル酸脱水素酵素とジヒドロリポ酸−スクシニル基伝達酵素を含むα−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体に構成し、ｓｕｃＡＢ（ｓｕｃＡ ＧｅｎＢａｎｋ Accession Ｎｏ．ＢＡＡ３５３９２．１、ｓｕｃＢ ＧｅｎＢａｎｋ Accession Ｎｏ．ＢＡＡ３５３９３．１）遺伝子によってコーディングされる。α−ケトグルタル酸脱水素酵素とジヒドロリポ酸−スクシニル基伝達酵素は、それぞれ配列番号２２及び２４のアミノ酸配列、またはそれらと、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有する配列を有することができ、ｓｕｃＡ及びｓｕｃＢによってコーディングされる。ｓｕｃＡ及びｓｕｃＢは、それぞれ配列番号２３及び２５、またはそれらと、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有する配列を有することができる。ｓｕｃＡＢは、ｓｄｈＣＤＡＢ及びｓｕｃＣＤと、クラスタでもって発現される構造を有し、ｓｄｈＣＤＡＢの強いプローモーターによって、コハク酸脱水素酵素をコーディングするｓｄｈＣＤＡＢが最も高いレベルに発現されるので、コハク酸及びスクシニルＣｏＡが早く分解される（Louise Cunningham et al., Microbiology (1998), 144, p.211-2123）。従って、該酵素の活性を強化させ、コハク酸の生成を増加させれば、コハク酸及びスクシニルＣｏＡの生産を増加させることができる。

本明細書で使用された用語「内在された」活性は、微生物または細胞に本来存在する天然状態または変異前の活性を意味する。

本開示の一具現例において、前記微生物は、追加してホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼの活性が、その内在された活性に比べて強化されたものであるエシェリキア属微生物である。

ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼは、スクシニル−ＣｏＡ及びホモセリンから０−スクシニルホモセリンを生成する反応を触媒する酵素であり、メチオニン生合成経路の第１段階に関与する。前記酵素は、配列番号２６のアミノ酸配列、またはそれらと、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有する配列を有することができ、ｍｅｔＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Accession Ｎｏ．ＢＡＥ７８０１５．１）によってコーディングされる。ｍｅｔＡ遺伝子は、配列番号２７、またはそれと、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有する配列を有することができる。メチオニンによるフィードバック調節によって、その発現が抑制される。従って、メチオニンによるフィードバック調節を除去し、高いレベルに発現されるようにするための変異体が、メチオニン生産能上昇のために利用されている。前記メチオニンによるフィードバック調節が解除されたホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼは、配列番号３２のアミノ酸配列、またはそれらと、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有する配列を有することができ、その遺伝子は、配列番号３３（ｍｅｔＡ１１：大韓民国特許公開第２００９−０１０６３６５号）と、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有する配列によってコーディングされる。

本明細書において、配列と係わって使用された用語「相同性」は、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、百分率で表示される。本明細書において、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一であるか、あるいは類似した活性を有するその相同性配列が「％相同性」と表示され、点数（score）、同一性（identity）及び類似度（similarity）などの媒介変数（parameter）を計算するＢＬＡＳＴ ２．０を利用する、当業者に周知された方法で決定される。

本明細書で使用された用語、酵素活性の「強化」は、当該酵素をコーディングする遺伝子の過発現によって、内在的活性に比べ、酵素の活性が高くなるか、あるいはその遺伝子において、変異によってコーディングされた酵素の活性が、内在的活性より高くなるということを意味するものであり、当該酵素をコーディングする遺伝子のコピー数を増加させるか、前記遺伝子のプローモーターを、内在されたプローモーターより強いプローモーターに置換するか、あるいは前記酵素の活性が上昇するように、染色体上の前記遺伝子の塩基配列の全体または一部、あるいは発現調節配列の全体または一部を欠失、置換または挿入によって変異させるか、あるいはそれらの組み合わせによりもする。

本明細書で使用された用語「発現調節配列」は、遺伝子の発現を調節する塩基配列であり、個体内において、特定遺伝子の発現を増減させることができるセグメントを意味し、プローモーター、転写調節因子結合部位などを含むが、それらに限定されるものではない。

本開示の一具現例において、酵素活性を上昇させるために、当該酵素をコーディングする遺伝子のプローモーターを、内在的プローモーターより強い活性のプローモーターに交替するか、当該遺伝子のコピー数を増加させることができる。

本開示の一具現例において、前記プローモーターは、活性が強いプローモーターとして知られたＰｔａｃ、Ｐｔｒｃ、Ｐｐｒｏ、ＰＲ、ＰＬ、Ｐｒｍｆ、ＰｃｙｓＫなどを含むが、それらに限定されるものではない。

本開示の一具現例において、前記微生物は、追加してシスタチオンガンマシンターゼ及びホモセリンキナーゼのうち一つ以上の活性が、内在的活性に比べ、弱化されるか、あるいは除去されたものであるエシェリキア属微生物である。

シスタチオンガンマシンターゼは、Ｏ−スクシニルホモセリンをシスタチオンに転換させる活性を有する。シスタチオンガンマシンターゼは、配列番号２８のアミノ酸配列、またはそれらと、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有する配列を有することができ、ｍｅｔＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Accession Ｎｏ．ＢＡＥ７７３７１．１）によってコーディングされ、ｍｅｔＢ遺伝子は、配列番号２９、またはそれと、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有する配列を有することができる。該酵素の活性を弱化させるか、あるいは除去すれば、Ｏ−スクシニルホモセリンがシスタチオンに転換されないか、あるいはシスタチオンに転換される比率が低くなる。

ホモセリンキナーゼは、ホモセリンからのＯ−ホスホホモセリン合成を触媒し、配列番号３０のアミノ酸配列、またはそれらと、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有する配列を有することができ、ｔｈｒＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Accession Ｎｏ．ＢＡＢ９６５８０．１）によってコーディングされ、ｔｈｒＢ遺伝子は、配列番号３１、またはそれと、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有する配列を有することができる。該酵素の活性を弱化させるか、あるいは除去すれば、ホモセリンがＯ−ホスホホモセリンに転換されないか、あるいはＯ−ホスホホモセリンに転換される比率が低くなる。

本明細書で使用された用語、酵素活性の「弱化」または「除去」は、当該酵素をコーディングする遺伝子の発現が、内在的レベルより減少するか、あるいは全然存在しないということを意味するものであり、当該酵素をコーディングする遺伝子の塩基配列の全体または一部、あるいは発現調節配列の全体または一部が、欠失、置換または挿入によって変異されるか、あるいはそれらの組み合わせによりもする。

本開示の一具現例において、前記微生物は、大腸菌でもある。前記微生物は、α−ケトグルタル酸脱水素酵素の活性が、その内在的活性に比べて強化され、追加してホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼの活性が、その内在的活性に比べて強化されるか、あるいはシスタチオンガンマシンターゼ及びホモセリンキナーゼのうち一つ以上の活性が、内在的活性に比べ、弱化されるか除去された大腸菌でもある。

本開示の一具現例において、前記微生物は、大腸菌の染色体上のｍｅｔＡが、メチオニンによるフィードバック調節が除去された変異体であるｍｅｔＡ１１（配列番号３３：ＷＯ２００８−１２７２４０Ａ１）に交替され、本来のプローモーターより強いプローモーターの調節下にあるｓｕｃＡＢを含むベクターによって形質転換され、染色体上のｔｈｒＢ及びｍｅｔＢが欠損された大腸菌でもある。

本開示の一様態において、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を生産する方法として、α−ケトグルタル酸脱水素酵素の活性が、その内在された活性に比べて強化された、エシェリキア属微生物を培養する段階、及び得られた微生物の培養液から、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を回収する段階を含む方法が提供される。

本開示の一具体例によるＯ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を生産する方法において、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の生産菌株の培養は、当業界に公知である適する培地及び培養条件によってなされる。かような培養過程は、当業者であるならば、選択される菌株によって、容易に調整して使用することができる。培養方法の例として、回分式、連続式及び流加式の培養が含まれるが、それらに限定されるものではない。かような多様な培養方法は、例えば、文献（"Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176）に記載されている。

培養に使用される培地は、特定菌株の要求条件を適切に満足させなければならない。多様な微生物培養培地は、例えば、文献（"Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981）に記載されている。それら培地は、多様な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。炭素源は、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、果糖、麦芽糖、澱粉及び纎維素のような炭水化物；大豆油、ひまわりオイル、ひまし油（castor oil）及びココナッツオイル（coconut oil）のような脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸（stearic acid）及びリノール酸（linoleic acid）のような脂肪酸；グリセロール及びエタノールのようなアルコール；並びに酢酸のような有機酸を含む。それら炭素源は、単独、または組み合わせされて使用される。窒素源としては、ペプトン（peptone）、酵母抽出液（yeast extract）、肉汁（gravy）、麦芽抽出液（malt extract）、とうもろこし浸出液（ＣＳＬ：corn steep liquor）及び豆粉（bean flour）のような有機窒素源；並びに尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニウムカーボネート及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源を含む。それら窒素源は、単独、または組み合わせされて使用される。前記培地には、リン酸源として、追加してリン酸二水素カリウム（potassium dihydrogen phosphate）、リン酸水素二カリウム（dipotassium hydrogen phosphate）、及び相応するナトリウム含有塩（sodium-containing salts）を含んでもよい。また、培地は、硫酸マグネシウム（magnesium sulfate）または硫酸鉄（iron sulfate）のような金属を含んでもよい。また、アミノ酸、ビタミン及び適する前駆体などが添加される。

また、培養液の好気性条件を維持するために、培養液内に、酸素、または酸素を含んだガス（例えば、空気）が培養液に注入される。培養物の温度は、一般的に、２０〜４５℃、望ましくは、２５〜４０℃である。培養期間は、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の生産が所望レベルに逹するまで続けられ、望ましい培養時間は、１０〜１６０時間である。

以下、本開示について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本開示について例示的に説明するためのものであり、本開示の範囲は、それら実施例に限られるものではない。

参考例：Ｏ−スクシニルホモセリン生産菌株及びコハク酸生産菌株の作製
１）ｍｅｔＢ遺伝子の欠損
Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の蓄積を増加させるために、Ｌ−メチオニンの前駆体分解に関与する、シスタチオンガンマシンターゼをコーディングするｍｅｔＢ遺伝子を欠損させた菌株を製造した。

野生型Ｅ．coli（Ｋ１２）Ｗ３１１０菌株において、シスタチオンガンマシンターゼをコーディングするｍｅｔＢ遺伝子を欠損させた。シスタチオンガンマシンターゼは、細胞において、多様なメチオニン前駆体と結合し、それによって、多様な副産物を生成することができると知られている。従って、シスタチオンシンターゼの過発現は、付随反応の増加によって、細胞内反応効率性を低減させる。ｍｅｔＢ遺伝子欠損のために、ＦＲＴ−one−step−ＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）欠損方法を遂行した（PNAS (2000), Vol. l97, p6640-6645）。ｍｅｔＢ遺伝子欠損のために、配列番号１２及び１３のプリマーを利用して、ｐＫＤ３ベクター（PNAS (2000), Vol. l97, p6640-6645）をテンプレートにしたＰＣＲ反応を行い、欠損カセット（deletion cassette）を作製した。

配列番号１２：
5’-TTACTCTGGTGCCTGACATTTCACCGACAAAGCCCAGGGAACTTCATCACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
配列番号１３：
5’-CGCTGCGCCAGCTCCATACGCGGCACCAGCGTTCGCAACCCACGTAGCAGCATATGAATATCCTCCTTAG-3’

ＰＣＲ条件は、変性９５℃３０秒、アニーリング５５℃３０秒、伸張７２℃１分からなるサイクルを３０回反復遂行した。得られたＰＣＲ産物を、１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．１ｋｂサイズのバンドを溶離して精製した。回収されたＤＮＡ切片を、ｐＫＤ４６ベクター（PNAS (2000) Vol. 97, pp. 6640-6645）をあらかじめ形質転換させたＥ．coli（Ｋ１２）Ｗ３１１０菌株に、電気穿孔（electroporation）した。電気穿孔のために、ｐＫＤ４６に形質転換されたＷ３１１０菌株を、２００μｇ／Ｌアンピシリン（ampicilin）と５ｍＭアラビノース（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ）とが含まれたＬＢ培地を利用して、３０℃でＯＤ_６００＝０．５まで培養させた後、１０％グリセロールで３回洗浄して使用した。電気穿孔は、２，５００Ｖで行った。回収された菌株を、３０μｇ／Ｌクロラムフェニコール（chloramphenichol）を含んだＬＢ平板培地に塗抹し、３７℃で、１日ないし２日培養した後、耐性を示す菌株を選別した。

選別された菌株は、菌株をテンプレートにして、配列番号１４及び１５のプライマーを利用して、前述の条件でＰＣＲを行った後、１．０％アガロースゲル上で、遺伝子の大きさが１．５ｋｂと観察されることを確認し、ｍｅｔＢ遺伝子の欠損を確認した。

配列番号１４：5’-TATTCGCCGCTCCATTCAGC-3’
配列番号１５：5’-TACCCCTTGTTTGCAGCCCG-3’

ｍｅｔＢ遺伝子の欠損が確認された菌株を、ｐＣＰ２０ベクター（PNAS (2000) vol.97, p6640-6645）で形質転換させ、１００μｇ／Ｌアンピシリン（ampicilin）を含んだＬＢ培地で培養し、さらに同一条件のＰＣＲを介して、１．０％アガロースゲル上で小さくなった最終ｍｅｔＢ遺伝子欠損菌株を選別し、クロラムフェニコールマーカーが除去されていることを確認した。得られたメチオニン要求性菌株をＣＣ０３−０１３２と命名した。

２）ｔｈｒＢ遺伝子の欠損
ホモセリンからのＯ−スクシニルホモセリン生成量を増加させるために、ホモセリンキナーゼをコーディングする遺伝子であるｔｈｒＢ遺伝子を欠損させた。特に、スレオニン生産菌株を利用する場合、ホモセリンの利用活性が非常に大きいために、該遺伝子の欠損が必ず必要である。前記１）で作製されたＣＣ０３−０１３２菌株において、ｔｈｒＢ遺伝子欠損のために、ＦＲＴ−one−step−ＰＣＲ欠損方法を遂行した（PNAS (2000) Vol. 97, p6640-6645）。ｔｈｒＢ遺伝子欠損のために、配列番号１６及び１７のプライマーを利用して、ｐＫＤ３ベクター（PNAS (2000) Vol. 97, p6640-6645）をテンプレートとしてＰＣＲ反応を行い、欠損カセット（deletion cassette）を作製した。

配列番号１６：
5’-CATGGTTAAAGTTTATGCCCCGGCTTCCAGTGCCAATATGAGCGTCGGGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
配列番号１７：
5’-GGAGATACCGCTCGCTACCGCGCCGATTTCCGCGACCGCCTGCCGCGCCTCATATGAATATCCTCCTTAG-3’

ＰＣＲ条件は、変性９５℃３０秒、アニーリング５５℃３０秒、伸張７２℃１分からなるサイクルを３０回反復遂行した。得られたＰＣＲ生成物を、１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．１ｋｂサイズのバンドを溶離して精製した。回収されたＤＮＡ切片を、ｐＫＤ４６ベクター（PNAS (2000) Vol. 97, p6640-6645）であらかじめ形質転換させたＣＣ０３−０１３２菌株に、電気穿孔によって注入した。電気穿孔のために、ｐＫＤ４６に形質転換されたＣＣ０３−０１３２菌株は、２００μｇ／Ｌアンピシリン（ampicilin）と５ｍＭアラビノースとが含まれたＬＢ培地を利用して、３０℃ ＯＤ_６００＝０．５まで培養させた後、１０％グリセロールで３回洗浄して使用した。電気穿孔は、２，５００Ｖで行った。回収された菌株を、３０μｇ／Ｌクロラムフェニコールを含んだＬＢ平板培地に塗抹し、３７℃で１日ないし２日培養した後、耐性を示す菌株を選別した。

選別された菌株は、菌株をテンプレートにして、配列番号１８及び１９のプライマーを利用して、前記条件でＰＣＲを行った後、１．０％アガロースゲル上で遺伝子の大きさが１．５ｋｂと観察されることを確認することにより、ｔｈｒＢ遺伝子の欠損を確認した。

配列番号１８：5’-ACTCGACGATCTCTTTGCC-3’
配列番号１９：5’-ACGCCGAGAGGATCTTCGCAG-3’

確認された菌株は、ｐＣＰ２０ベクター（PNAS (2000) vol. 97, pp. 6640-6645）で形質転換させ、１００μｇ／Ｌアンピシリン（ampicilin）を含んだＬＢ培地で培養し、また同一条件のＰＣＲを介して、１．０％アガロースゲル上で小さくなった最終ｔｈｒＢ遺伝子欠損菌株を作製し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。作製された菌株をＣＣ０３−０１３３と命名した。

３）ｍｅｔＡ１１挿入用ｐＳＧベクター作製
ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼは、培地に添加される微量のメチオニンによってフィードバック調節を受け、ほとんどの活性が抑制される特性を示すので、Ｌ−メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンの生産増加のために、メチオニンによるフィードバック調節が除去された変異型で交替した。大腸菌のホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコーディングする染色体上にある野生型ｍｅｔＡ遺伝子（配列番号２７）を、メチオニンによるフィードバック調節が除去された変異型をコーディングするｍｅｔＡ１１（配列番号３３）で交替するために、挿入用ベクターであるｐＳＧ−ｍｅｔＡ１１を作製した。ＷＯ２００８／１２７２４０ Ａ１に開示された内容によって、ｍｅｔＡ１１遺伝子の塩基配列情報を確保し、それに基づいて、ｍｅｔＡ１１遺伝子のＡＴＧ位置から、ＯＲＦを含み、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩ認知部位を含んでいるプライマー（配列番号２０及び２１）を合成した。ＷＯ２００８／１２７２４０ Ａ１に開示されたＴＦ４０７６ＢＪＦ ｍｅｔＡ＃１１菌株をテンプレートにして、下記配列番号を有したプライマーを利用してＰＣＲを行った。

配列番号２０：5’-ggccgaattcatgccgattcgtgtgccgga-3’
配列番号２１：5’-ggccgagttcttaatccagcgttggattca-3’

ＰＣＲは、ｐｆｕ−ＸＤＮＡポリメラーゼ（ソルジェント：ＳＰＸ１６−Ｒ２５０）を使用して行い、ＰＣＲ条件、は変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；及び伸張７２℃、２分からなるサイクルを３０回反復した。その結果、双方に、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩの認識部位を含むｍｅｔＡ１１ ＯＲＦが増幅されたＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲを介して得られたｍｅｔＡ１１遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩで処理し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩで処理されたｐＳＧ７６−Ｃベクター（J Bacteriol. 1997 Jul; 179 (13): 4426-8）に、結紮（ligation）を介して、前記遺伝子をクローニングし、最終的にｍｅｔＡ１１遺伝子がクローニングされたｐＳＧ−ｍｅｔＡ１１組み換えベクターを作製した。

４）ｍｅｔＡ１１挿入菌株の作製
参考例３）で作製したｍｅｔＡ１１染色体挿入ベクターであるｐＳＧ−ｍｅｔＡ１１を、参考例２）で得られた菌株に形質転換し、ＬＢ＿Ｃｍ（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０μｇ／Ｌ）培地で培養した後、クロラムフェニコール耐性を有するコロニーを選別した。選別された形質転換体は、ｐＳＧ−ｍｅｔＡ１１ベクターが、染色体内のｍｅｔＡ部分に一次挿入された菌株である。ｍｅｔＡ１１遺伝子が挿入された菌株に、ｐＳＧベクター内に存在するＩ−ＳｃｅＩ部分を切断する制限酵素であるＩ−ＳｃｅＩを発現するベクターであるｐＡＳｃｅＰ（JOURNAL OF BACTERIOLOGY, July 1997, 4426-4428）を形質転換させ、ＬＢ−Ａｍｐ（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、クロラムフェニコール１００μｇ／Ｌ）において生長する菌株を選別した。かように選別された菌株は、野生型ｍｅｔＡがｍｅｔＡ１１に交替され、挿入されたｐＳＧ７６−Ｃベクターが除去された菌株である。該菌株を大腸菌ＣＣ０３−００３８と命名した。

５）スレオニン生産菌株基盤Ｏ−スクシニルホモセリン生産菌株の作製
野生型大腸菌Ｗ３１１０の代わりに、国際特許ＷＯ２００５／０７５６２５に開示されたスレオニン生産菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１Ｐを利用して、前記１）ないし４）に記載された方法と同一に菌株を作製し、コハク酸及びＯ−スクシニルホモセリンを生産することができる菌株を作製し、それをＣＪＭ２−Ａ１１と命名した。

実施例１．ｓｕｃＡＢ強化のためのプラスミド作製
１−１．ｓｕｃＡプローモーターを有したｓｕｃＡＢ発現強化プラスミド作製
米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）のデータベースから、ｓｕｃＡＢによってコーディングされるα−ケトグルタル酸脱水素酵素の塩基配列情報（ｓｕｃＡ ＧｅｎＢａｎｋ Accession Ｎｏ．ＢＡＡ３５３９２．１：配列番号２３、ｓｕｃＢ ＧｅｎＢａｎｋ Accession Ｎｏ．ＢＡＡ３５３９３．１：配列番号２５）を確保し、それに基づいて、ｓｕｃＡプローモーターが含まれたｓｕｃＡＢ遺伝子を確保するために、ｓｕｃＡＢのＯＲＦ開始コドンであるＡＴＧを基準に−１８８位置から含み、それぞれ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及び制限酵素ＸｂａＩによって認識される配列番号１及び２のプライマーを合成した。

配列番号１：5’-GGCCAAGCTTGCATCAGGCGTAACAAAGAA-3’
配列番号２：5’-GGCCTCTAGATGTCCATCCTTCAGTAATCG-3’

α−ケトグルタル酸脱水素酵素をコーディングする遺伝子であるｓｕｃＡＢをクローニングするために、野生型大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートにし、前記配列番号１及び２のプライマーを利用して、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。重合酵素連鎖反応［Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories］は、ｐｆｕ−ＸＤＮＡポリメラーゼ（ソルジェント：ＳＰＸ１６−Ｒ２５０）を使用して行い、ＰＣＲ条件は、変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；及び重合反応７２℃、５分からなるサイクルを３０回反復した。その結果、ｓｕｃＡプローモーター、ｓｕｃＡＢ遺伝子、並びに制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及び制限酵素ＸｂａＩの認識部位を含む約４．５ｋｂのＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素及びＸｂａＩ制限酵素で処理した。その後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及び制限酵素ＸｂａＩで処理されたｐＣＬ１９２０（Lerner, C.G. and Inouye, M., Nucl. Acids Res. (1990) 18: 4631）ベクターに、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Roche：１０４８１２２０００１）を利用して、前記ＰＣＲ産物を結紮させ、組み換えベクターｐＣＬＰｓｕｃＡ−ｓｕｃＡＢを作製した。図１は、組み換えベクターｐＣＬＰｓｕｃＡ−ｓｕｃＡＢの概略図である。

１−２．プローモーターｒｍｆまたはｔｒｃを有するｓｕｃＡＢ発現強化プラスミドの作製
米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）のデータベースから、ｓｕｃＡＢ遺伝子（α−ケトグルタル酸脱水素酵素をコーディングする遺伝子）の塩基配列情報（ｓｕｃＡ ＧｅｎＢａｎｋ Accession Ｎｏ．ＢＡＡ３５３９２．１：配列番号２３、ｓｕｃＢ ＧｅｎＢａｎｋ Accession Ｎｏ．ＢＡＡ３５３９３．１：配列番号２５）を確保し、それに基づいてｓｕｃＡＢ遺伝子を得るために、制限要素ＥｃｏＲＶ及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位を有する配列番号３及び４のプライマーを合成した。

配列番号３：5’-ATCATGCAGAACAGCGCTTTGAA-3’
配列番号４：5’-GGCCAAGCTTTGTCCATCCTTCAGTAATCG-3’

ｓｕｃＡＢをクローニングするために、野生型大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートにし、前記配列番号３及び４のプライマーを利用して、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。重合酵素連鎖反応［Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories］は、ｐｆｕ−ＸＤＮＡポリメラーゼ（ソルジェント：ＳＰＸ１６−Ｒ２５０）を使用して行い、ＰＣＲ条件は、変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；及び重合反応７２℃、５分からなるサイクルを３０回反復した。その結果、ｓｕｃＡＢ遺伝子と、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位とを含む約４．３ｋｂのＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理した。ｓｕｃＡＢ遺伝子の原型（native）プローモーターであるｓｕｃＡプローモーターを置換するために、それぞれプローモーターｒｍｆとプロモーターｔｒｃとを含むベクターであるｐＣＬ＿Ｐｒｍｆ−ｇｆｐ（配列番号５）とｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ−ｇｆｐ（配列番号６）とを、制限酵素ＥｃｏＲＶと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Roche：１０４８１２２０００１）を利用して、前記ＰＣＲ産物を結紮させ、組み換えベクターｐＣＬ＿Ｐｒｍｆ−ｓｕｃＡＢ，ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ−ｓｕｃＡＢを作製した。ベクターｐＣＬ＿Ｐｒｍｆ−ｇｆｐ及びベクターｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ−ｇｆｐは、プローモーターｒｍｆとプロモーターｔｒｃとの強度を測定するために、緑色蛍光タンパク質であるｇｆｐ遺伝子を導入したベクターであり、ｓｕｃＡＢを、前記ベクター中のプローモーターに結紮させ、それぞれｒｍｆプロモーターとｔｒｃプローモーターとの調節下に発現されるｓｕｃＡＢを含むベクターを作製した。図２及び図３は、それぞれ組み換えベクターｐＣＬ＿Ｐｒｍｆ−ｓｕｃＡＢ及びｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ−ｓｕｃＡＢの概略図である。

実施例２．ｓｕｃＡＢとｍｅｔＡ１１との同時発現強化のためのプラスミド作製
Ｏ−スクシニルホモセリンの合成のために、ｓｕｃＡＢ及びｍｅｔＡ１１を同時に発現するベクターを作製するために、国際出願公開ＷＯ２００８／１２７２４０Ａ１に開示されたＴＦ４０７６ＢＪＦ ｍｅｔＡ＃１１菌株のＯ−スクシニルトランスフェラーゼ変異体をコーディングするアミノ酸配列に基づいて、ｍｅｔＡ１１遺伝子の塩基配列情報を確保し、それに基づいて、ｍｅｔＡ１１遺伝子のＡＴＧ部分からＴＡＡ部分までＯＲＦを増幅させるために利用され、両末端に制限酵素ＥｃｏＲＶ，ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を有する配列番号７及び８のプライマーを合成した。

配列番号７：5’-GAGTGCGATATCatgccgattcgtgtgccggac-3’
配列番号８：5’-GCACTCAAGCTTttaatccagcgttggatacatg-3’

前記ＴＦ４０７６ＢＪＦ ｍｅｔＡ＃１１菌株をテンプレートにし、配列番号７及び８のプライマーを利用して、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。該重合酵素連鎖反応は、ｐｆｕ−ＸＤＮＡポリメラーゼ（ソルジェント：ＳＰＸ１６−Ｒ２５０）を使用して行い、ＰＣＲ条件は、変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；及び重合反応７２℃、１分からなるサイクルを３０回反復した。それによって得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＥｃｏＲＶ及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理した。ベクターであるｐＣＬ＿Ｐｃｙｓｋ−ｇｆｐ（配列番号９）を、制限酵素ＥｃｏＲＶと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとで処理し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Roche：１０４８１２２０００１）を利用して、前記ＰＣＲ産物を結紮させ、組み換えベクターｐＣＬ＿Ｐｃｙｓｋ−ｍｅｔＡ１１を作製した。前記作製されたベクターにｓｕｃＡＢを含めるために、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を有する配列番号１０及び１１のプライマーを合成した。

配列番号１０：5’-GGCCAAGCTTGCATCAGGCGTAACAAAGAA-3’
配列番号１１：5’-GGCCAAGCTTTGTCCATCCTTCAGTAATCG-3’

ｍｅｔＡ１１とｓｕｃＡＢとを同時に発現させるために、ｐＣＬ＿Ｐｃｙｓｋ−ｍｅｔＡ１１＿ＰｓｕｃＡ−ｓｕｃＡＢベクターを作製した。このために、野生型大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートにし、前記配列番号１０及び１１のプライマーを利用して重合酵素連鎖反応を行った。重合酵素連鎖反応［Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories］は、ｐｆｕ−ＸＤＮＡポリメラーゼ（ソルジェント：ＳＰＸ１６−Ｒ２５０）を使用して行い、ＰＣＲ条件は、変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；及び重合反応７２℃、５分からなるサイクルを３０回反復した。その結果、双方に、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を含むＰｓｕｃＡ−ｓｕｃＡＢを有した約４．５ｋｂのＰＣＲ産物を得た。前記得られたＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で処理した。その後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理されたｐＣＬ＿Ｐｃｙｓｋ−ｍｅｔＡ１１ベクターに、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Roche：１０４８１２２０００１）を利用して、前記ＰＣＲ産物を結紮させ、組み換えベクターｐＣＬ＿Ｐｃｙｓｋ−ｍｅｔＡ１１＿ＰｓｕｃＡ−ｓｕｃＡＢを作製した。図４は、組み換えベクターｐＣＬ＿Ｐｃｙｓｋ−ｍｅｔＡ１１＿ＰｓｕｃＡ−ｓｕｃＡＢの概略図である。

実施例３．コハク酸生産のための発酵
参考例で作製されたＯ−スクシニルホモセリン生産菌株に、ｓｕｃＡＢだけ単独で活性強化したとき、コハク酸生産量を確認するために、フラスコ培養を実施した。参考例４）のＣＣ０３−００３８、及び参考例５）のＣＪＭ２−Ａ１１菌株に、実施例１で作製されたｐＣＬ＿ＰｓｕｃＡ−ｓｕｃＡＢ、ｐＣＬ＿Ｐｒｍｆ−ｓｕｃＡＢ、ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ−ｓｕｃＡＢのプラスミドを形質転換した後、抗生物質スペクチノマイシンが含有された平板ＬＢ培地に塗抹し、ｓｕｃＡＢが導入された菌株を準備し、対照群で、それぞれＣＣ０３−００３８菌株及びＣＪＭ２−Ａ１１菌株に、ｐＣＬ１９２０ベクターが導入された菌株を準備した。また、国際出願公開ＷＯ１０／１０１３６０に記載されたサルモネラ由来のｐＵＲ４００プラスミドのｓｃｒＯ配列を有するｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｃｒＯベクター（配列番号３４）を、前記各菌株に導入し、原糖を炭素源として利用することができる菌株も、下記表２の組成を有する培地で培養し、コハク酸生産量を評価した。

菌株を培地に接種し、３３℃で一日中培養した後、単一コロニーを、スペクチノマイシンが含まれた２ｍｌＬＢ培地に接種した後、３３℃で２時間培養し、さらに２５ｍｌフラスコ培地を含んだ２５０ｍｌ三角フラスコに、ＯＤ_６００＝０．５で接種し、３３℃ ２００ｒｐｍで３３時間培養し、ＨＰＬＣ分析を介して、コハク酸生産量を比較した。下記表３は、その結果を表示している。

その結果、ｓｕｃＡＢを発現強化するほど、コハク酸生産能が上昇するということを確認することができた。かような結果は、ｓｕｃＡＢの発現強化が、グルタミン酸の量を減少させながら、スクシニル−ＣｏＡを生産する流れ（flux）を増大させてコハク酸生産が増加し、ブドウ糖を炭素源として利用するとき、最大３０％まで増加するということを確認することができた。それは、好気条件で、コハク酸生合成が強化された菌株であればあるほど、さらに増加すると判断される。また、原糖を利用して確認した結果、ブドウ糖と同一に、コハク酸の生産能が上昇するということを確認することができた。下記表４は、その結果を表示している。

表１．ブドウ糖フラスコ培地の組成

表２．原糖フラスコ培地組成

表３．ブドウ糖を利用したフラスコ培養を介したコハク酸の生産

表４．原糖を利用したフラスコ培養を介したコハク酸の生産

実施例４．Ｏ−スクシニルホモセリン生産のための発酵
ＣＣ０３−００３８菌株及びＣＪＭ２−Ａ１１菌株に、ｓｕｃＡＢとｍｅｔＡとを同時に発現強化させるために、実施例２で作製したｐＣＬ＿Ｐｃｙｓｋ−ｍｅｔＡ１１＿ＰｓｕｃＡ−ｓｕｃＡＢプラスミドを形質転換させ、Ｏ−スクシニルホモセリン生産量を確認するために、三角フラスコで培養を実施した。フラスコ培地組成は、前記表１の通りである。参考例４）で発現強化されたｍｅｔＡ１１は、本来のプローモーター調節下にあるので、発現を強化させるために、ｍｅｔＡ１１を、ｃｙｓＫプローモーターによって発現されるベクターにクローニングし、発現をさらに強化させ、それにｓｕｃＡＢの発現を同時に進めた。

ＣＣ０３−００３８に、実施例２で作製されたｐＣＬ＿Ｐｃｙｓｋ−ｍｅｔＡ１１＿ＰｓｕｃＡ−ｓｕｃＡＢプラスミドを形質転換した後、抗生物質スペクチノマイシンが含有された平板ＬＢ培地に塗抹し、形質転換された菌株を準備し、対照群として、それぞれＣＣ０３−００３８菌株及びＣＪＭ２−Ａ１１菌株に、ｐＣＬ１９２０ベクターが導入された菌株を準備した。また、大韓民国特許出願公開第２００９−００１８１２８号に開示されたサルモネラ由来のｐＵＲ４００プラスミドのｓｃｒＯ配列を有するｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｃｒＯベクターを導入し、原糖を炭素源として利用することができる菌株を、表２に記載された組成を有する原糖フラスコ培地で培養し、Ｏ−スクシニルホモセリン生産量を評価した。評価する菌株を接種し、３３℃で一日中培養した後、単一コロニーを、スペクチノマイシンが含まれた２ｍｌＬＢ培地に接種した後、３３℃で２時間培養し、さらに２５ｍｌフラスコ培地を含んだ２５０ｍｌ三角フラスコに、ＯＤ_６００＝０．５で接種し、３３℃２００ｒｐｍで３３時間培養し、ＨＰＬＣ分析を介して、Ｏ−スクシニルホモセリン生産量を比較した。その結果が表５に表示されている。

その結果、ｐＣＬ＿Ｐｃｙｓｋ−ｍｅｔＡ１１＿ＰｓｕｃＡ−ｓｕｃＡＢを導入した菌株において、Ｏ−スクシニルホモセリン濃度が上昇するということを確認することができ、対照群対比で約４０％の収率が上昇するということを確認した。また、Ｏ−スクシニルホモセリンが増加するほど、グルタミン酸とホモセリンとの量が減少するということが分かり、ｓｕｃＡＢの発現強化が、スクシニル−ＣｏＡ供給に主要な役割りを果たし、スクシニル−ＣｏＡを基質として使用するｍｅｔＡ発現を同時に強化させたとき、Ｏ−スクシニルホモセリン濃度が急激に上昇した。

表５．ブドウ糖を利用したフラスコ培養を介したＯ−スクシニルホモセリンの生産

表６．原糖を利用したフラスコ培養を介したＯ−スクシニルホモセリンの生産

本開示の一具体例によるエシェリキア属微生物は、ｓｕｃＡＢを含むベクターによって形質転換され、ｓｕｃＡＢの発現を強化させた場合、スクシニル−ＣｏＡ及びコハク酸の生産能上昇を示すということが確認された。従って、ｓｕｃＡＢ発現の強化は、中心炭素代謝（central carbon metabolism）の観点から、同一ＴＣＡ回路を有する微生物、例えば、酵母、放線菌などにおいても、同一に適用されるであろう。

Ｏ−スクシニルホモセリン生産能が確認されたＣＣ０３−００３８／ｐＣＬ＿Ｐｃｙｓｋ−ｍｅｔＡ１１＿ＰｓｕｃＡ−ｓｕｃＡＢを、ＣＣ０３−０１５７と命名し、ブダペスト条約下で、２０１３年１１月２２日付けで、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１１４８８Ｐを受けた。

受託番号：ＫＣＣＭ１１４８８Ｐ

配列目録フリーテキスト
本明細書に記載された配列番号１ないし配列番号３４の配列は、添付された配列リストに表示される。

好気条件において、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の生産を増大させるためには、前駆体として、スクシニル−ＣｏＡが要求される。α−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体は、ＴＣＡ回路において、α−ケトグルタル酸のコハク酸への脱水素化を触媒する。該酵素をコーディングする遺伝子ｓｕｃＡＢは、染色体上において、コハク酸脱水素酵素（succinate dehydrogen）をコーディングするｓｄｈＣＤＡＢ及びスクシニル−ＣｏＡシンターゼをコーディングするｓｕｃＣＤと共に、クラスタ（cluster）として発現される構造を有し、クラスタ内部の２個のプローモーターによって発現されると知られている。該クラスタの遺伝子は、ｓｄｈＣプローモーターによって主に発現され、ｓｄｈＣＤＡＢ、ｓｕｃＡＢ、ｓｕｃＣＤの順序に発現される。ＴＣＡ回路の観点から見れば、コハク酸脱水素酵素をコーディングする遺伝子であるｓｄｈＣＤＡＢの発現が良好になされる構造であり、従って、コハク酸脱水素酵素の発現が強力であるため、ｓｕｃＡＢの発現によって、スクシニル−ＣｏＡを生産しても、スクシニル−ＣｏＡが迅速に分解されやすい構造である。クラスタ中間であるｓｄｈＣＤＡＢとｓｕｃＡＢとの間に、ｓｕｃＡプローモーターがあり、ｓｕｃＡプローモーターは、ｓｕｃＡＢの遺伝子の発現を駆動させるが、該クラスタにおける主要プローモーターは、ｓｄｈＣＤＡＢを駆動させるｓｄｈＣであり、ｓｕｃＡプローモーターは、ｓｄｈＣプローモーターに比べ、比較的弱いと知られている（S J Park, G Chao and R P Gunsalus, J. Bacteriol. 1997; Cunningham, L. & Guest, J. R. (1998) Microbiology 144, 2113-2123）。かような理由で、好気条件でのコハク酸生産菌株において、ｓｄｈＡＢの欠損によって、コハク酸生産が増加したという報告がある（A. Yu. Skorofkhodova, et al., Applied Biochemistry and Microbiology, December 2013, Vol. 49, Issue 7, pp. 629-637）。

それにより、本発明者は、コハク酸または０−スクシニルホモセリンの生産性を上昇させるための研究を行い、α−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体の活性を強化させることによって、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の生産性が向上した微生物を開発し、本開示を完成した。

前記課題を解決するために、本開示はまた、α−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体の活性が、その内在された活性に比べて強化された、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を生産する微生物を培養する段階、及び培養培地、あるいは培養された微生物から、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を回収する段階を含む、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を生産する方法を提供する。

本開示の一具現例において、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を生産する微生物は、α−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体の活性が、その内在された活性に比べて強化された、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の生産能を有する微生物でもある。

α−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体は、ＴＣＡ回路において、α−ケトグルタル酸の脱水素化によって、コハク酸を生成する段階を触媒する酵素であり、α−ケトグルタル酸脱水素酵素とジヒドロリポ酸−スクシニル基伝達酵素を含むα−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体に構成し、ｓｕｃＡＢ（ｓｕｃＡ ＧｅｎＢａｎｋ Accession Ｎｏ．ＢＡＡ３５３９２．１、ｓｕｃＢ ＧｅｎＢａｎｋ Accession Ｎｏ．ＢＡＡ３５３９３．１）遺伝子によってコーディングされる。α−ケトグルタル酸脱水素酵素とジヒドロリポ酸−スクシニル基伝達酵素は、それぞれ配列番号２２及び２４のアミノ酸配列、またはそれらと、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有する配列を有することができ、ｓｕｃＡ及びｓｕｃＢによってコーディングされる。ｓｕｃＡ及びｓｕｃＢは、それぞれ配列番号２３及び２５、またはそれらと、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有する配列を有することができる。ｓｕｃＡＢは、ｓｄｈＣＤＡＢ及びｓｕｃＣＤと、クラスタでもって発現される構造を有し、ｓｄｈＣＤＡＢの強いプローモーターによって、コハク酸脱水素酵素をコーディングするｓｄｈＣＤＡＢが最も高いレベルに発現されるので、コハク酸及びスクシニルＣｏＡが早く分解される（Louise Cunningham et al., Microbiology (1998), 144, p.211-2123）。従って、該酵素の活性を強化させ、コハク酸の生成を増加させれば、コハク酸及びスクシニルＣｏＡの生産を増加させることができる。

本開示の一具現例において、前記微生物は、大腸菌でもある。前記微生物は、α−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体の活性が、その内在的活性に比べて強化され、追加してホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼの活性が、その内在的活性に比べて強化されるか、あるいはシスタチオンガンマシンターゼ及びホモセリンキナーゼのうち一つ以上の活性が、内在的活性に比べ、弱化されるか除去された大腸菌でもある。

本開示の一様態において、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を生産する方法として、α−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体の活性が、その内在された活性に比べて強化された、エシェリキア属微生物を培養する段階、及び培養培地、あるいは培養された微生物から、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を回収する段階を含む方法が提供される。

実施例１．ｓｕｃＡＢ強化のためのプラスミド作製
１−１．ｓｕｃＡプローモーターを有したｓｕｃＡＢ発現強化プラスミド作製
米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）のデータベースから、ｓｕｃＡＢによってコーディングされるα−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体の塩基配列情報（ｓｕｃＡ ＧｅｎＢａｎｋ Accession Ｎｏ．ＢＡＡ３５３９２．１：配列番号２３、ｓｕｃＢ ＧｅｎＢａｎｋ Accession Ｎｏ．ＢＡＡ３５３９３．１：配列番号２５）を確保し、それに基づいて、ｓｕｃＡプローモーターが含まれたｓｕｃＡＢ遺伝子を確保するために、ｓｕｃＡＢのＯＲＦ開始コドンであるＡＴＧを基準に−１８８位置から含み、それぞれ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及び制限酵素ＸｂａＩによって認識される配列番号１及び２のプライマーを合成した。

α−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体をコーディングする遺伝子であるｓｕｃＡＢをクローニングするために、野生型大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートにし、前記配列番号１及び２のプライマーを利用して、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。重合酵素連鎖反応［Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories］は、ｐｆｕ−ＸＤＮＡポリメラーゼ（ソルジェント：ＳＰＸ１６−Ｒ２５０）を使用して行い、ＰＣＲ条件は、変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；及び重合反応７２℃、５分からなるサイクルを３０回反復した。その結果、ｓｕｃＡプローモーター、ｓｕｃＡＢ遺伝子、並びに制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及び制限酵素ＸｂａＩの認識部位を含む約４．５ｋｂのＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素及びＸｂａＩ制限酵素で処理した。その後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及び制限酵素ＸｂａＩで処理されたｐＣＬ１９２０（Lerner, C.G. and Inouye, M., Nucl. Acids Res. (1990) 18: 4631）ベクターに、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Roche：１０４８１２２０００１）を利用して、前記ＰＣＲ産物を結紮させ、組み換えベクターｐＣＬＰｓｕｃＡ−ｓｕｃＡＢを作製した。図１は、組み換えベクターｐＣＬＰｓｕｃＡ−ｓｕｃＡＢの概略図である。

１−２．プローモーターｒｍｆまたはｔｒｃを有するｓｕｃＡＢ発現強化プラスミドの作製
米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）のデータベースから、ｓｕｃＡＢ遺伝子（α−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体をコーディングする遺伝子）の塩基配列情報（ｓｕｃＡ ＧｅｎＢａｎｋ Accession Ｎｏ．ＢＡＡ３５３９２．１：配列番号２３、ｓｕｃＢ ＧｅｎＢａｎｋ Accession Ｎｏ．ＢＡＡ３５３９３．１：配列番号２５）を確保し、それに基づいてｓｕｃＡＢ遺伝子を得るために、制限要素ＥｃｏＲＶ及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位を有する配列番号３及び４のプライマーを合成した。

Claims (7)

1. α−ケトグルタル酸脱水素酵素の活性が、その内在された活性に比べて強化された、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の生産能を有するエシェリキア（Escherichia）属微生物。
2. 前記α−ケトグルタル酸脱水素酵素は、配列番号２２及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のエシェリキア属微生物。
3. 前記微生物は、追加してホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼの活性が、その内在された活性に比べて強化されたことを特徴とする、請求項１に記載のエシェリキア属微生物。
4. 前記微生物は、追加してシスタチオンガンマシンターゼ及びホモセリンキナーゼのうち一つ以上の活性が、内在的活性に比べて弱化されるか、あるいは除去されたことを特徴とする、請求項１に記載のエシェリキア属微生物。
5. 前記微生物は、大腸菌であることを特徴とする、請求項１ないし４のうちいずれか１項に記載のエシェリキア属微生物。
6. α−ケトグルタル酸脱水素酵素の活性が、その内在された活性に比べて強化された、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を生産するエシェリキア属微生物を培養する段階と、
   得られた微生物の培養液から、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を回収する段階と、
   を含む、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を生産する方法。
7. 前記微生物は、大腸菌であることを特徴とする、請求項６に記載のＯ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸を生産する方法。