JP6386552B2 - Ｏ−スクシニルホモセリンの生産のため微生物及びこれを用いたｏ−スクシニルホモセリンの生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、メチオニンによるフィードバック阻害に対する耐性及びホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ活性を有する分離されたポリペプチド、前記ポリペプチドを発現するＯ−スクシニルホモセリン生産微生物及びこれを用いてＯ−スクシニルホモセリンを生産する方法に関する。

自然界に存在する大部分の微生物は、メチオニンを生合成するためにＯ−スクシニルホモセリン（O-succinyl homoserine）またはＯ−アセチルホモセリン（O-acetyl homoserine）を中間体として用いることが知られている。一般的に、Ｏ−スクシニルホモセリンは、ホモセリン（Homoserine）に対して、スクシニルＣｏＡ（Succinyl-coA）のスクシニルグループ（Succinyl group）を結合させるＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ（homoserine O-succinyltransferase、MetA）により生産され、Ｏ−アセチルホモセリンは、ホモセリン（Homoserine）に対して、アセチルＣｏＡ（acetyl-coA）のアセチルグループ （Succinyl group）を結合させるホモセリンＯ−アセチルトランスフェラ−ゼ（homoserine O-acetyltransferase、MetX）により生産される。即ち、中間体のうち、Ｏ−スクシニルホモセリンの生産において、ｍｅｔＡは生産菌株の開発に非常に重要な遺伝子の一つである。一方、ＭｅｔＸは、ＭｅｔＡとは異なり、フィードバック阻害を受けず、酵素の安定性も高いことが知られている。

Ｏ−スクシニルホモセリンは、メチオニン生合成経路のシスタチオニンγ−シンターゼ（cystathionine gamma synthase）がブロックされて蓄積されるが、これに対し、Ｏ−スクシニルホモセリン生産菌株は、Ｌ−メチオニン要求性を示す。これにより、培地にメチオニンを添加することになるが、一方、このように添加されたメチオニンによりホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼがフィードバック阻害（feedback inhibition）を受けて活性が抑制され、最終的には高濃度のＯ−スクシニルホモセリンを得ることができなくなる。

したがって、従来の多くの特許は、フィードバック調節システムにおけるｍｅｔＡのフィードバック阻害を解除する研究に集中した。しかし、ｍｅｔＡによりコードされるホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼは、野生型タンパク質自体としも安定性が低く、フィードバック解除のために変異を導入すると、不安定性がより増大するという問題を抱えている。高い生産能を有するＯ−スクシニルホモセリン生産菌株の開発のためには、ｍｅｔＡ遺伝子のフィードバック阻害が除去され、酵素の安定性を確保する必要がある。

韓国特許登録番号第１０−０９６６３２４号公報 韓国特許登録番号第１０−０９０５３８１号公報

Karlin及びAltschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993) Methods Enzymol., 183, 63(1990) 「Biochemical Engineering」by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176 「Manual of Methods for General Bacteriology」by the American Society for Bacteriology, Washington DC, 米国, 1981年 PNAS(2000) vol 97 P6640-6644

前述したｍｅｔＡのフィードバック阻害現象と不安定性の問題を解決するために、本発明者らは、メチオニンによるフィードバック阻害を受けず、酵素の安定性が確保されたホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼを見出すために鋭意努力した結果、そのような活性を有する新規な酵素を探索した。このように探索した候補遺伝子を選別し、これをエシェリキア属微生物に導入してフラスコ培養した結果、Ｏ−スクシニルホモセリンが生成されることを確認した。このように選別された遺伝子は、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ活性を有し、メチオニンに対するフィードバック阻害に耐性を有することを確認し、本発明を完成した。

本発明は、メチオニンによるフィードバック阻害に対する耐性及びホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ活性を有する分離された新規なポリペプチドを提供することを目的とする。

本発明は、また、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。

本発明は、また、前記分離された新規なポリペプチドを発現するＯ−スクシニルホモセリン生産微生物を提供することを目的とする。

本発明は、また、前記微生物を用いてＯ−スクシニルホモセリンを生産する方法を提供することを目的とする。
本発明は、以下を提供する。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列を有し、メチオニンによるフィードバック阻害に対する耐性（feedback resistant）及びホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ（Homoserine Succinyltransferase）活性を有する分離されたポリペプチド。
［２］上記［１］のポリペプチドをコードする配列番号２または３の塩基配列を有する分離されたポリヌクレオチド。
［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列を有し、メチオニンによるフィードバック耐性（feedback resistant）及びホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ（Homoserine Succinyltransferase）活性を有するポリペプチドを発現する、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物。
［４］上記エシェリキア属微生物が、大腸菌（Escherichia coli）である、上記［３］に記載のＯ−スクシニルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物。
［５］シスタチオニンγ−シンターゼ（cystathionine gamma synthase）をコードするｍｅｔＢ遺伝子がさらに欠損または弱化されている、上記［３］に記載のエシェリキア属微生物。
［６］ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）をコードするｔｈｒＢ遺伝子またはホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ（homoserine O-succinyltransferase）をコードするｍｅｔＡ遺伝子がさらに欠損または弱化されている、上記［３］に記載のエシェリキア属微生物。
［７］（ａ）上記［３］〜［６］のいずれか一項の微生物を培地で培養する工程；及び
（ｂ）上記微生物または培地からＯ−スクシニルホモセリンを得る工程を含む、Ｏ−スクシニルホモセリンの生産方法。

本発明の分離された新規なメチオニンに対するフィードバック阻害に耐性を有し、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ活性を有するポリペプチドを含むＯ−スクシニルホモセリン生産微生物は、メチオニンに対するフィードバック阻害に耐性を有し、高収率でＯ−スクシニルホモセリンを生産することができるため、これを前駆体とするＬ−メチオニンを高収率で生産するのに有用に用いられる。

前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、メチオニンによるフィードバック阻害に耐性を有し、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ活性を有する分離された新規なポリペプチドを提供する。

本発明における用語「ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ活性（activity of homoserine O-succinyltransferase）」とは、ホモセリン（Homoserine）をＯ−スクシニルホモセリン（O-succinyl homoserine）に変換する活性を意味する。

本発明における用語「フィードバック阻害（feedback inhibition）」とは、メチオニンがホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼの酵素活性を抑制することを意味する。

本発明においてポリペプチドは、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ活性を有する配列番号１のアミノ酸配列を有し、メチオニンフィードバック阻害に耐性を有することを特徴とする。本発明で提示したホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ活性及びメチオニンに対するフィードバック阻害に耐性を有する限り、前記ポリペプチドのアミノ酸配列に対して８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、特に具体的には９７％以上の相同性を有するポリペプチドも本発明に含まれる。前記アミノ酸配列に対する相同性は、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（非特許文献１）やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（非特許文献２）を用いて決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている[参照: www.ncbi.nlm.nih.gov]。

本発明のもう一つの態様は、前記ポリペプチドをコードする分離されたポリヌクレオチドを提供する。

前記ポリペプチドは、配列番号２または３のポリヌクレオチド配列によりコードされることができ、コドンの縮退性により、これと８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、特に具体的には９７％以上の相同性を有するポリヌクレオチドも本発明に含まれる。しかし、本発明がこれに限定されるものではない。

また、本発明の別の態様は、前記ポリヌクレオチドが作動可能になるように含まれているベクターを提供する。

本発明における用語「ベクター」とは、適当な宿主内で目的タンパク質を発現させるように、適切な調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列は、転写を開始することができるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終結を調節する配列を含む。ベクターは、適当な宿主内に形質転換された後、宿主のゲノムとは関係なく複製または機能することができ、ゲノムそのものに組み込むことができる。

本発明において用いられるベクターは、宿主の中で複製できるものであれば特に限定されず、当業界で知られている任意のベクターを利用することができる。

本発明のもう一つの態様は、メチオニンに対するフィードバック阻害に耐性を有する（feedback resistant）ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ（Homoserine O-succinyltransferase）活性を有するポリペプチドを発現し、Ｏ−スクシニルホモセリン（O-succinyl -homoserine）を生産する微生物を提供する。

本発明における用語「Ｏ−スクシニルホモセリン（O-succinyl L-homoserine）を生産する微生物」とは、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産し、細胞内外で蓄積することができる微生物であってもよい。

前記Ｏ−スクシニルホモセリンを生産する微生物は、原核及び真核微生物菌株を含む。例えば、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するエシェリキア（Escherichia）属、エルウイニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物菌株が含まれてもよいが、これに限定されない。具体的には、エシェリキア（Escherichia）属に属する微生物菌株、その例として大腸菌（Escherichia coli）が用いられてもよい。

前記Ｏ−スクシニルホモセリンを生産する微生物は、Ｌ−リジン、Ｌ−トレオニンまたはＬ−イソロイシン生産菌株を用いて製造することができる。具体的には、Ｌ−トレオニン生産菌株を用いて製造することができる。Ｌ−トレオニン生産菌株は、Ｌ−トレオニン及びＯ−スクシニルホモセリンの前駆体であるホモセリンの合成が既に円滑に行われる菌株であるため、これを活用して大量のメチオニン前駆体、即ち、Ｏ−スクシニルホモセリンを合成することができる。

本発明において、前記ポリペプチドの発現は、前記ポリペプチドをコードする遺伝子が作動可能に含まれている組み換えベクターに形質転換されるか、または前記ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドが染色体に挿入されることにより達成されることができるが、これは特に制限されない。

本発明における用語「形質転換」とは、目的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクターを、宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドが暗号化するタンパク質を発現することができることを意味する。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現さえできれば、宿主細胞の染色体に挿入されて位置するか、または染色体外に位置することができる。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現することができるものであれば、如何なる形で導入されても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての尿素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセット（expression cassette）の形で宿主細胞に導入することができる。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子のオープンリーディングフレーム（open reading frame、以下「ＯＲＦ」と略称する）に作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、及び翻訳終結シグナルを含む。

本発明において用いられるプロモーターは、宿主細胞内で目的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドの転写を高い頻度で開始するものであれば、特に限定されず、当業界で知られている任意のプロモーターを利用することができる。具体的には、Ｔ７プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｃｙｓＫプロモーター（特許文献１）を用いることができ、これに限定されるものではない。

本発明の具体的な実施態様において、前記微生物は、シスタチオニンγ−シンターゼ（cystathionine gamma synthase）をコードするｍｅｔＢ遺伝子をさらに欠損または弱化させることができる。

また、本発明の具体的な実施態様において、前記微生物は、ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）をコードするｔｈｒＢ遺伝子及びホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ（homoserine O-succinyltransferase）をコードするｍｅｔＡ遺伝子をさらに欠損または弱化させることができる。

本発明において、前記遺伝子の配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のようなデータベースから得られる。

本発明における用語「欠損（deletion）」とは、目的遺伝子の開始コドンに該当する塩基配列から終止コドンまでの塩基配列領域、あるいはその調節部位の塩基配列のうち一部あるいは全部を、染色体の内部から除去した形を意味する。

本願における用語「弱化（weakening）」とは、微生物菌株で相応するＤＮＡによりコードされる１つ以上の酵素に対する細胞内活性を除去または減少させることを意味するが、例えば、遺伝子のプロモーター（promoter）部位及び５'−ＵＴＲ部位の塩基配列を変形させることにより、タンパク質の発現を弱化させたり、該遺伝子のＯＲＦ部位に突然変異を導入することにより、タンパク質の活性を弱化させることができる。

本発明のもう一つの態様は、前記微生物を培地で培養してＯ−スクシニルホモセリンを生産する段階及び前記微生物または培地からＯ−スクシニルホモセリンを得る段階を含む、Ｏ−スクシニルホモセリンの生産方法を提供する。

前記製造されたＯ−スクシニルホモセリン生産菌株の培養過程は、当業界で知られている適当な培地と培養条件に応じて行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば、選択された菌株に応じて容易に調整して使用することができる。前記培養方法の例には、回分式、連続式及び流加式培養が含まれるが、ここに限定されるものではない。このような多様な培養方法は、例えば、非特許文献３に開示されている。

培養に使用される培地は、特定な菌株の要求条件を適切に満足させなければならない。多様な微生物の培地は、例えば、非特許文献４に開示されている。前記培地は、多様な炭素源、窒素源、及び微量元素成分を含む。使用することのできる炭素源の例には、グルコース、スクロース、乳糖、果糖（fructose）、マルトース、澱粉、セルロースのような炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油のような脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール及びエタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの炭素源は、単独または組み合わせて使用することができる。使用することのできる窒素源の例には、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液（ＣＳＬ）及び大豆ミールのような有機窒素源及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源が含まれる。これらの窒素源は、単独または組み合わせて使用することができる。前記培地にはリン源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、及び相応するナトリウム−含有塩が含まれる。また、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含むことができる。この他、アミノ酸、ビタミン、及び適切な前駆体などが含まれる。これらの培地または前駆体は、培養物に回分式または連続式で添加することができる。

また、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を培養物に適切な方法で添加して培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素−含有気体（例えば、空気）を注入する。培養物の温度は、通常２０℃〜４５℃、具体的には、２５℃〜４０℃である。培養期間は、所望のＯ−スクシニルホモセリンの生成量が得られるまで継続することができ、具体的には１０〜１６０時間である。

本発明の方法で生産したＯ−スクシニルホモセリンは、シスタチオニンγ−シンターゼ（cystathionine gamma synthase）またはＯ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ（O-succinylhomoserine sulfhydrylase）によりメチオニンに転換することができる。また、本発明の方法で製造したＯ−スクシニル−Ｌ−ホモセリンとＣＨ_３ＳＨとの反応を通じてＬ−メチオニン以外にも、コハク酸を別途の生産工程なしに副産物として得ることができる。

本発明のもう一つの態様は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、メチオニンによるフィードバック耐性（feedback resistant）及びホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ（Homoserine Succinyltransferase）活性を有するポリペプチドのＯ−スクシニルホモセリン生産用途に関する。本発明において、分離された新規な前記ポリペプチドがメチオニンに対するフィードバック阻害に耐性を有し、高収率でＯ−スクシニルホモセリンを生産することができることを究明したところ、前記ポリペプチドは、Ｏ−スクシニルホモセリン生産用途として用いられる。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。

実施例１：新規なＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ活性を有するポリペプチドの選別
ｍｅｔＡ遺伝子のフィードバック調節の解除及び安定性を確保するための方法の一環として、ｍｅｔＸ遺伝子（Homoserine O-acetyltransferase）がｍｅｔＡ遺伝子と類似の構造を有しながらもＬ−メチオニン（L-methonine）に対するフィードバック阻害を受けないことに着目し、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）由来のｍｅｔＸが開発されたことがある。

これに対し、新規なホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼの開発のために、既に開発されたクロモバクテリウム・ビオラセウム由来のｍｅｔＸのアミノ酸配列の相同性分析により、最終的に配列番号１のアミノ酸配列を有するメチオニンフィードバック阻害耐性に解除されたポリペプチドを選別し、選別されたポリペプチドは、シデロキシダンス・リトトロピクスＥＳ−１（Sideroxydans lithotrophicus ES-1）に由来のｍｅｔＸであるが、既存に報告されたことのない新規な活性を、本発明者らが新たに確認した。

実施例２：プラスミドの作製
２−１．シデロキシダンス・リトトロピクスＥＳ−１由来のｍｅｔＸ遺伝子の合成
選別したシデロキシダンス・リトトロピクスＥＳ−１（ｓｌｉ）由来のｍｅｔＸ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースの参照配列（reference sequence）ＹＰ＿００３５２２６６５．１のｍｅｔＸ遺伝子配列（配列番号２）をベースに、大腸菌（Escherichia coli）で発現できるようにコドン最適化（codon optimization）の過程を経て合成した（配列番号３）。

２−２．シデロキシダンス・リトトロピクスＥＳ−１由来のｍｅｔＸ遺伝子を発現するプラスミドの作製
合成した配列番号３の塩基配列をベースに、配列番号４、５のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｍｅｔＸ遺伝子を増幅した。配列番号５のプライマーは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有している。

配列番号4) 5'- ATC TTGAGTATTTCGGTTGGTATTG-3’
配列番号5) 5'-CCC AAGCTT ttaagcagctgattcccaagc-3’

ＰＣＲ条件は、変性（denaturation）９５℃で３０秒間、アニーリング（annealing）５５℃で３０秒間、伸長（extension）７２℃で１分間を３０回繰り返して行った。このＰＣＲ結果物は、１．０％のアガロースゲルで電気泳動した後、１．１４ｋｂの大きさのバンドを溶離して精製した後、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を処理し、ｃｙｓＫプロモーターが含まれているｐＣＬ１９２０ベクターは、ＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で処理した後、両断片をクローニングした。クローニングの結果として得たｍｅｔＸ遺伝子発現プラスミドをｐＣＬ−ＰｃｙｓＫ−ｍｅｔＸ（ｓｌｉ）と命名した。

実施例３：実験菌株の作製
３−１．ｍｅｔＢ遺伝子欠損
野生型Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｋ１２）Ｗ３１１０菌株からシスタチオニンγ−シンターゼをコードするｍｅｔＢ遺伝子を欠損させた。ｍｅｔＢ遺伝子欠損のためにＦＲＴ−ｏｎｅ−ｓｔｅｐ−ＰＣＲ ｄｅｌｅｔｉｏｎ方法を行った（非特許文献５）。ｍｅｔＢ遺伝子欠損のために、配列番号６、７のプライマーを用いてｐＫＤ３ベクター（非特許文献５）を鋳型としてＰＣＲ反応により欠損カセット（deletion cassette）を作製した。

配列番号6) 5’-TTACTCTGGTGCCTGACATTTCACCGACAAAGCCCAGGGAACTTCATCACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
配列番号7) 5'-CGCTGCGCCAGCTCCATACGCGGCACCAGCGTTCGCAACCCACGTAGCAGCATATGAATATCCTCCTTAG-3’

ＰＣＲ条件は、変性９５℃で３０秒間、アニーリング５５℃で３０秒間、伸長７２℃で１分間を３０回繰り返して行った。このＰＣＲ結果物は、１．０％のアガロースゲルで電気泳動した後、１．１ｋｂの大きさのバンドを溶離して精製した。回収したＤＮＡ切片はｐＫＤ４６ベクター（非特許文献５）を予め形質転換したＥ． ｃｏｌｉ（Ｋ１２）Ｗ３１１０菌株にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション（electroporation）のために、ｐＫＤ４６に形質転換したＷ３１１０菌株は、２００μｇ／Ｌのアンピシリン（ampicillin）と５ ｍＭのアラビノース（L-arabinose）が含まれたＬＢ培地を用いて３０℃、ＯＤ_６００＝０．５まで培養した後、１０％のグリセロールで３回洗浄して使用した。エレクトロポレーションは２５００Ｖで加えた。回収した菌株を３０μｇ／Ｌのクロラムフェニコール（chloramphenicol）を含むＬＢ平板培地に塗抹し、３７℃で１〜２日間培養した後、耐性を示す菌株を選別した。

選別された菌株は、菌株を鋳型として配列番号８、９のプライマーを用いて、前記条件でＰＣＲした後、１．０％のアガロースゲル上で遺伝子の大きさが１．５ｋｂで観察されたことを確認したことにより、ｍｅｔＢ遺伝子の欠損を確認した。

配列番号8) 5'-TATTCGCCGCTCCATTCAGC-3’
配列番号9) 5'-TACCCCTTGTTTGCAGCCCG-3’

確認した菌株は、ｐＣＰ２０ベクター（非特許文献５）で形質転換させ、１００μｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、再び同様の条件のＰＣＲにより１．０％のアガロースゲル上で小さくなった最終的なｍｅｔＢ遺伝子欠損菌株を作製し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。作製したメチオニン要求性菌株をＣＣ０３−０１３１と命名した。

３−２．ｔｈｒＢ遺伝子欠損
ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子であるｔｈｒＢ遺伝子を欠損させることにより、ホモセリンからＯ−スクシニルホモセリンの合成量を増加させようとした。特に、トレオニン生産菌株を利用する場合、ホモセリンの利用活性が非常に大きいため、この遺伝子の欠損が必ず必要である。前記作製したＣＣ０３−０１３１菌株でｔｈｒＢ遺伝子欠損のためにＦＲＴ−ｏｎｅ−ｓｔｅｐ−ＰＣＲ ｄｅｌｅｔｉｏｎ方法を行った。ｔｈｒＢ遺伝子欠損のためには、配列番号１０、１１のプライマーを用い、ｐＫＤ３ベクターを鋳型としてＰＣＲ反応により欠損カセットを作製した。

配列番号10) 5’-CATGGTTAAAGTTTATGCCCCGGCTTCCAGTGCCAATATGAGCGTCGGGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
配列番号11) 5’-GGAGATACCGCTCGCTACCGCGCCGATTTCCGCGACCGCCTGCCGCGCCTCATATGAATATCCTCCTTAG-3’

ＰＣＲ条件は、変性９５℃で３０秒間、アニーリング５５℃で３０秒間、伸長７２℃で１分間を３０回繰り返して行った。このＰＣＲ結果物は、１．０％のアガロースゲルで電気泳動した後、１．１ ｋｂの大きさのバンドを溶離して精製した。回収したＤＮＡ切片はｐＫＤ４６ベクターを予め形質転換させたＣＣ０３−０１３１菌株にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションのためにｐＫＤ４６に形質転換したＣＣ０３−０１３１菌株は、２００μｇ／Ｌのアンピシリンと５ ｍＭのアラビノースを含むＬＢ培地を用い、３０℃、ＯＤ_６００＝０．５まで培養した後、１０％のグリセロールで３回洗浄して使用した。エレクトロポレーションは２５００Ｖで加えた。回収した菌株を３０μｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ平板培地に塗抹して３７℃で１〜２日間培養した後、耐性を示す菌株を選別した。

選別された菌株は、菌株を鋳型として配列番号１２、１３のプライマーを用いて前記条件でＰＣＲした後、１．０％のアガロースゲル上で遺伝子の大きさが１．５ ｋｂで観察されることを確認することにより、ｔｈｒＢ遺伝子の欠損を確認した。

配列番号12) 5'-ACTCGACGATCTCTTTGCC-3’
配列番号13) 5'-ACGCCGAGAGGATCTTCGCAG-3’

確認した菌株は、ｐＣＰ２０ベクターで形質転換させ、１００μｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、再び同様の条件のＰＣＲにより１．０％のアガロースゲル上で小さくなった最終的なｔｈｒＢ遺伝子欠損菌株を作製し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。作製された菌株をＣＣ０３−０１３１−２と命名した。

３−３．ｍｅｔＡ遺伝子欠損
Ｅ． ｃｏｌｉ菌株でシデロキシダンス・リトトロピクスＥＳ−１由来のｍｅｔＸ遺伝子の基質特異性及び活性を確認するために、Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｋ１２）Ｗ３１１０菌株にｍｅｔＢとｔｈｒＢ遺伝子を欠損させたＣＣ０３−０１３１−２菌株をベースに、染色体上の本来のｍｅｔＡ遺伝子を欠損させた。ｍｅｔＡ遺伝子欠損のためにＦＲＴ−ｏｎｅ−ｓｔｅｐ−ＰＣＲ ｄｅｌｅｔｉｏｎ方法を行った。ｍｅｔＡ遺伝子欠損のために、配列番号１４、１５のプライマーを用い、ｐＫＤ３ベクターを鋳型としてＰＣＲ反応により欠損カセットを作製した。

配列番号14) 5’-TCAGCTGTTGCGCATCGATTCCCGTGAATCGCGCAACACGCCCGCAGAGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
配列番号15) 5’-CCGTCACAAAGGCAATGCGCTTATCTTTACTGGCAAACAGATATGCATCCCATATGAATATCCTCCTTAG-3’

ＰＣＲ条件は、変性９５℃で３０秒間、アニーリング５５℃で３０秒間、伸長７２℃で１分間を３０回繰り返して行った。このＰＣＲ結果物は、１．０％のアガロースゲルで電気泳動した後、１．１ｋｂの大きさのバンドを溶離して精製した。回収したＤＮＡ切片は、ｐＫＤ４６ベクターを予め形質転換させたＣＣ０３−０１３１−２菌株にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション（electroporation）のためにｐＫＤ４６に形質転換されたＣＣ０３−０１３１−２菌株は、２００μｇ／Ｌのアンピシリンと５ｍＭのアラビノースを含むＬＢ培地を用いて３０℃、ＯＤ_６００＝０．５まで培養した後、１０％のグリセロールで３回洗浄して使用した。エレクトロポレーションは２５００Ｖで加えた。回収した菌株は３０μｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ平板培地に塗抹して３７℃で１〜２日間培養した後、耐性を示す菌株を選別した。

選別された菌株は、菌株を鋳型として配列番号１６、１７のプライマーを用い、前記条件でＰＣＲした後、１．０％のアガロースゲル上で遺伝子の大きさが１．５ｋｂで観察されたことを確認したことにより、ｍｅｔＡ遺伝子の欠損を確認した。

配列番号16) 5'-CTCATTAACGTTGGTTGTCA-3’
配列番号17) 5'-TATCTTGCTGCTGCTGAATG-3’

確認した菌株は、ｐＣＰ２０ベクターで形質転換させ、１００μｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、再び同様の条件のＰＣＲにより１．０％のアガロースゲル上で小さくなった最終的なｍｅｔＡ遺伝子欠損菌株を作製し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。作製された菌株をＣＣ０３−０１３２と命名した。

３−４．シデロキシダンス・リトトロピクスＥＳ−１由来のｍｅｔＸ遺伝子発現プラスミドが導入された菌株の作製
シデロキシダンス・リトトロピクスＥＳ−１由来のｍｅｔＸ遺伝子の基質特異性及び活性を確認するために、野生型菌株Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｋ１２）Ｗ３１１０をベースにｍｅｔＢ、ｔｈｒＢ及びｍｅｔＡ遺伝子を欠損させた菌株ＣＣ０３−０１３２菌株に、前記実施例２で作製したプラスミドｐＣＬ−ＰｃｙｓＫ−ｍｅｔＸ（ｓｌｉ）を導入した。

プラスミドｐＣＬ−ＰｃｙｓＫ−ｍｅｔＸ（ｓｌｉ）を導入したＣＣ０３−０１３２菌株をＣＣ０３−０１３６と命名し、２０１３年Ｏ６月１０日付で韓国ソウル特別市西大門区弘済１洞３６１−２２１番地に所在するブダペスト条約の下の国際寄託機関である韓国種菌協会付設韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ １１４２４Ｐとして寄託した。

対照群としてＣＣ０３−０１３２菌株に、野生型ｍｅｔＡを利用したこと以外は実施例２と同様の方法で作製したプラスミドｐＣＬ−ＰｃｙｓＫ−ｍｅｔＡを導入して菌株を作製した。前記作製された菌株をＣＣ０３−０１３２／ｐＣＬ−ＰｃｙｓＫ−ｍｅｔＡと命名した。

それだけでなく、特許文献２に開示された菌株として、メチオニン要求性菌株であるＬ−トレオニン（L-threonine）の生産菌株ＴＦ４０７６（受託番号：ＫＦＣＣ−１０７１８）をベースにＮＴＧを用いた人工的な突然変異法を利用して、メチオニン要求性が解除されたトレオニン生産菌株ＣＪＭ００２（受託番号：ＫＣＣＭ−１０５６８）を用いて、前記３−１〜３−３と同様の方法で菌株を作製し、作製された菌株をＣＪＭ−ＢＴＡと命名した。

ＣＪＭ−ＢＴＡ菌株をベースに、前記と同じプラスミドｐＣＬ−ＰｃｙｓＫ−ｍｅｔＸ（ｓｌｉ）、ｐＣＬ−ＰｃｙｓＫ−ｍｅｔＡを導入し、作製された菌株をそれぞれＣＪＭ−ＢＴＡ／ｐＣＬ−ＰｃｙｓＫ−ｍｅｔＸ（ｓｌｉ）及びＣＪＭ−ＢＴＡ／ｐＣＬ−ＰｃｙｓＫ−ｍｅｔＡと命名した。

実施例４：菌株を用いたＯ−スクシニルホモセリンの生産
４−１．フラスコ培養実験
前記実施例３で作製した菌株に導入されたシデロキシダンス・リトトロピクスＥＳ−１由来のｍｅｔＸ遺伝子の基質特異性及び活性を確認するために、三角フラスコ培養を行った。フラスコ培地組成を下記表１に示した。

平板ＬＢ培地に、対照群としてＣＣ０３−０１３２菌株及びＣＪＭ−ＢＴＡ菌株を接種し、抗生剤であるスペクチノマイシンが含有された平板ＬＢ培地に、ｍｅｔＸ発現ベクターを形質転換したＣＣ０３−０１３６菌株及び同じベクターを用いて作製したｍｅｔＡ発現ベクターを形質転換した菌株（ＣＣ０３−０１３２／ｐＣＬ−ＰｃｙｓＫ− ｍｅｔＡ）、そしてＣＪＭ−ＢＴＡ菌株をベースに、ｍｅｔＸまたはｍｅｔＡ発現ベクターをそれぞれ形質転換した両菌株（ＣＪＭ−ＢＴＡ／ｐＣＬ−ＰｃｙｓＫ−ｍｅｔＸ（ｓｌｉ）及びＣＪＭ−ＢＴＡ／ｐＣＬ−ＰｃｙｓＫ− ｍｅｔＡ）を接種して３３℃で一夜培養した後、単一のコロニーをスペクチノマイシンが含まれた２ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３３℃で２時間培養し、再び２５ｍｌのフラスコ培地を含む２５０ ｍｌの三角フラスコにＯＤ_６００＝０．０７で接種して３３℃の２００ｒｐｍで４８時間培養し、ＨＰＬＣ分析によりＯ−スクシニルホモセリンの生産量を比較した。その結果を下記表２に示した。

その結果、シデロキシダンス・リトトロピクスＥＳ−１由来のｍｅｔＸ遺伝子はＥ． ｃｏｌｉのｍｅｔＡ遺伝子と同様に、スクシニルＣｏＡ（succinyl-CoA）を基質として用いてＯ−スクシニルホモセリンを生産し、Ｏ−アセチルホモセリンは生産していなかった。シデロキシダンス・リトトロピクスＥＳ−１由来のｍｅｔＸ遺伝子が導入された場合は、変異の導入なしに野生型そのものでも培地に添加されたメチオニンによるフィードバック阻害現象が示されないことが分かった。

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形で実施されうることを理解できるであろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (15)

1. 配列番号１で表されるアミノ酸配列を有し、メチオニンによるフィードバック阻害に対する耐性及びホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ（Homoserine Succinyltransferase）活性を有する、ポリペプチドを発現する、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物を含有する、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するための組成物。
2. 前記エシェリキア属微生物が、大腸菌（Escherichia coli）である、請求項１に記載の組成物。
3. 配列番号１で表されるアミノ酸配列を有し、メチオニンによるフィードバック阻害に対する耐性及びホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ（Homoserine Succinyltransferase）活性を有する、ポリペプチドを発現する、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物であって、シスタチオニンγ−シンターゼ（cystathionine gamma synthase）をコードするｍｅｔＢ遺伝子がさらに欠損または弱化されている、エシェリキア属微生物。
4. 配列番号１で表されるアミノ酸配列を有し、メチオニンによるフィードバック阻害に対する耐性及びホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ（Homoserine Succinyltransferase）活性を有する、ポリペプチドを発現する、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物であって、ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）をコードするｔｈｒＢ遺伝子またはホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ（homoserine O-succinyltransferase）をコードするｍｅｔＡ遺伝子がさらに欠損または弱化されている、エシェリキア属微生物。
5. （ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有し、メチオニンによるフィードバック阻害に対する耐性及びホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有する、ポリペプチドを発現する、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物を培地で培養する工程；及び
   （ｂ）前記微生物または培地からＯ−スクシニルホモセリンを得る工程を含む、Ｏ−スクシニルホモセリンの生産方法。
6. 前記エシェリキア属微生物が、大腸菌である、請求項５に記載の方法。
7. シスタチオニンγ−シンターゼをコードするｍｅｔＢ遺伝子がさらに欠失または弱化されている、請求項５または６に記載の方法。
8. ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）をコードするｔｈｒＢ遺伝子またはホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ（homoserine O-succinyltransferase）をコードするｍｅｔＡ遺伝子がさらに欠損または弱化されている、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するためのＯ−スクシニルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物の使用であって、前記微生物が、配列番号１のアミノ酸配列を有し、メチオニンによるフィードバック阻害に対する耐性及びホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼ活性を有するポリペプチドを発現する、使用。
10. 前記エシェリキア属微生物が、大腸菌である、請求項９に記載の使用。
11. シスタチオニンγ−シンターゼをコードする前記ｍｅｔＢ遺伝子がさらに欠失または弱化されている、請求項９または１０に記載の使用。
12. ホモセリンキナーゼをコードするｔｈｒＢ遺伝子またはホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラ−ゼをコードするｍｅｔＡ遺伝子がさらに欠損または弱化されている、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の使用。
13. Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するためのホモセリンスクシニルトランスフェラーゼとして単離されたポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を有する、使用。
14. Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するための請求項１３に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドの使用であって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列を有する、使用。
15. メチオニンを生産する方法であって、
    （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有し、メチオニンによるフィードバック阻害に対する耐性およびホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有する、ポリペプチドを発現する、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物を培地で培養する工程、
    （ｂ）前記微生物または前記培地からＯ−スクシニルホモセリンを得る工程、ならびに
    （ｃ）前記Ｏ−スクシニルホモセリンからメチオニンを生産する工程
    を含む、方法。