RU2757787C1

RU2757787C1 - Микроорганизмы для получения О-сукцинилгомосерина и способ получения О-сукцинилгомосерина с использованием указанных микроорганизмов

Info

Publication number: RU2757787C1
Application number: RU2018110317A
Authority: RU
Inventors: Су Джин ЧОЙ; Со Йоунг КИМ; Чанг Ил СО; Ёнг Ук СИН; Юнг Леол ЯНГ; Хье Вон УМ; Хе Мин ПАРК; Сун Ху ДЖОН; Бьюнг Хун ДЖУНГ
Original assignee: СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн
Priority date: 2013-10-23
Filing date: 2014-10-22
Publication date: 2021-10-21
Also published as: BR112016008952B1; KR101555750B1; WO2015060647A1; JP2016533731A; ES2908323T3; RU2651519C2; PL3061812T3; CN110468168A; EP3061812B1; KR20150046964A; BR112016008952A2; CN105705636A; HUE057421T2; RU2016116166A; EP3061812A4; US10316339B2; US20160304919A1; EP3061812A1; CN110468168B; MY190539A

Abstract

Изобретение относится к способу получения метионина. Способ предусматривает культивирование микроорганизма в среде, получение O-сукцинилгомосерина из микроорганизма или среды, превращение O-сукцинилгомосерина в метионин путем использования цистатионин-гамма-синтазы или O-сукцинилгомосеринсульфгидрилазы. При этом микроорганизм представляет собой микроорганизм Escherichia sp., продуцирующий О-сукцинилгомосерин, который экспрессирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосеринсукцинилтрансферазной активностью. Изобретение обеспечивает продукцию O-сукцинилгомосерина с высоким выходом, являющегося предшественником метионина, и, таким образом, может быть эффективно для получения метионина. 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится выделенному полипептиду, обладающему резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активностью, микроорганизму, экспрессирующему указанный полипептид, и способу получения O-сукцинилгомосерина с использованием указанного микроорганизма.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известно, что большинство микроорганизмов, представленных в природе, используют O-сукцинилгомосерин или O-ацетилгомосерин в качестве промежуточного продукта биосинтеза метионина. Обычно O-сукцинилгомосерин образует гомосерин-O-сукцинилтрансфераза (MetA), конъюгирующая сукцинильную группу сукцинил-КоA с гомосерином, и O-ацетилгомосерин образует гомосерин-O-ацетилтрансфераза (MetX), конъюгирующая ацетильную группу ацетил-КоA с гомосерином. То есть, применительно к получению O-сукцинилгомосерина наряду с другими промежуточными продуктами, metA является одним из наиболее важных генов при разработке микроорганизмов, продуцирующих O-сукцинилгомосерин. В то же время известно, что, в отличие от MetA, MetX не подвержен ингибированию по принципу обратной связи и обладает высокой ферментной стабильностью.

Накопление O-сукцинилгомосерина происходит при блокаде цистатионин-гамма-синтазы в метаболическом пути биосинтеза метионина, и, таким образом, штамму, продуцирующему O-сукцинилгомосерин, необходим L-метионин. Соответственно, в среду добавляют метионин, который ингибирует активность гомосерин-O-сукцинилтрансферазы, и, в конечном счете, O-сукцинилгомосерин не может быть получен в высокой концентрации.

Соответственно, во многих предшествующих патентах первостепенное внимание было уделено исследованиям по устранению ингибирования metA по принципу обратной связи контрольной системой обратной связи. Тем не менее, для гомосерин-O-сукцинилтрансферазы, кодируемой metA, свойственны проблемы низкой стабильности самого белка дикого типа, и введение мутаций для устранения ингибирования по принципу обратной связи усугубляет нестабильность. Соответственно, для разработки штамма, продуцирующего O-сукцинилгомосерин с высокой продуктивностью, необходимо устранение ингибирования гена metA по принципу обратной связи и сохранение стабильности фермента.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

Для решения феномена ингибирования metA по принципу обратной связи и проблемы нестабильности фермента, описанной выше, авторы настоящего изобретения предприняли попытку разработать гомосерин-O-сукцинилтрансферазу с сохраненной стабильностью фермента, не подверженную, в то же время, ингибированию метионином по принципу обратной связи, и провели на предмет этого скрининг новых ферментов, обладающих указанной активностью. В результате отбора генов-кандидатов, прошедших такой скрининг, и культивирования в колбах после их введения в Escherichia sp. авторы настоящего изобретения обнаружили, что происходило образование O-сукцинилгомосерина и что отобранные таким образом гены обладали гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активностью и резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи, завершив посредством этого настоящее изобретение.

Техническое решение

Задачей настоящего изобретения является обеспечение нового выделенного полипептида, обладающего резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активностью.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение полинуклеотида, кодирующего новый выделенный полипептид.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение микроорганизма для получения O-сукцинилгомосерина, экспрессирующего новый выделенный полипептид.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения O-сукцинилгомосерина с использованием указанного выше микроорганизма.

Полезные эффекты изобретения

Микроорганизм для получения O-сукцинилгомосерина, содержащий новый выделенный полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активностью, который может обладать резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и продуцировать O-сукцинилгомосерин с высоким выходом и, таким образом, может быть эффективно использован для получения L-метионина, используемого им в качестве предшественника, с высоким выходом.

Наилучший вариант осуществления изобретения

Для решения указанных выше задач в одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен новый выделенный полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активностью.

Использованный здесь термин «гомосерин-O-сукцинилтрансферазная активность» относится к активности по превращению гомосерина в O-сукцинилгомосерин.

Использованный здесь термин «ингибирование по принципу обратной связи» относится к ингибированию активности гомосерин-O-сукцинилтрансферазы метионином.

Полипептид по настоящему изобретению характеризуется тем, что он имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, обладающую гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активностью и резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи. Любой полипептид, последовательность которого на 80% или более гомологична указанному выше полипептиду, конкретно на 90% или более, конкретнее на 95% или более и еще конкретнее на 97% или более, также включен в объем настоящего изобретения, с учетом того, что полипептид обладает гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активностью и резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи, предложенными в настоящем изобретении. Процент гомологии может быть определен с использованием BLAST 2.0, являющегося эталонным алгоритмом, или FASTA по Pearson [Methods Enzymol., 183, 63(1990), ниже]. На основе алгоритма BLAST разработаны программы, называемые BLASTN и BLASTX [www.ncbi.nlm.nih.gov, ниже].

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий указанный выше полипептид. Конкретно, полипептид может быть кодирован полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. Ввиду вырожденности кодонов объем настоящего изобретения также включает, без ограничения, полинуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 80%, конкретно на 90% или более, конкретнее на 95% или более и еще конкретнее на 97% или более гомологична указанной выше последовательности.

В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен вектор, содержащий функциональный полинуклеотид.

Использованный здесь термин «вектор» относится к ДНК-конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего интересующий белок, где интересующий белок функционально связан с подходящей регуляторной последовательностью, таким образом, что интересующий белок может быть экспрессирован в подходящем хозяине. Регуляторная последовательность может содержать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую операторную последовательность для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий домен связывания рибосом на мРНК, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции. После трансформации подходящего хозяина вектор может быть реплицирован, или может функционировать независимо от генома хозяина, или может быть интегрирован в сам геном хозяина.

Относительно вектора, используемого в настоящем изобретении, может не быть существенных ограничений, при условии, что вектор может быть реплицирован в хозяине, и может быть использован любой вектор, известный в данной области.

В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, продуцирующий O-сукцинилгомосерин, экспрессирующий полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активностью.

Использованный здесь термин «микроорганизм, продуцирующий O-сукцинилгомосерин», может относиться к микроорганизму, способному продуцировать O-сукцинилгомосерин и хранить его внутриклеточно и внеклеточно.

Микроорганизм для получения O-сукцинилгомосерина включает штаммы прокариотических и эукариотических микроорганизмов, например, без ограничения, штаммы микроорганизмов, принадлежащие к роду Escherichia, роду Erwinia, роду Serratia, роду Providencia, роду Corynebacterium и роду Brevibacterium. Конкретно, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, принадлежащий к роду Escherichia, например, Escherichia coli.

Микроорганизм, продуцирующий O-сукцинилгомосерин, может быть получен с использованием штаммов микроорганизмов, продуцирующих L-лизин, L-треонин или L-изолейцин, и, конкретно, с использованием штамма, продуцирующего L-треонин. Поскольку штамм, продуцирующий L-треонин, представляет собой штамм, способный синтезировать L-треонин и гомосерин в качестве предшественника O-сукцинилгомосерина, с использованием этого штамма может быть синтезировано большое количество предшественников метионина, то есть O-сукцинилгомосерина.

В настоящем изобретении экспрессия полипептида может быть достигнута трансформацией рекомбинантным вектором, содержащим функциональный ген, кодирующий полипептид, или введением полинуклеотида, кодирующего полипептид, в хромосому, однако методы не ограничены указанными выше.

Использованный здесь термин «трансформация» относится к процессу введения вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяина, что позволяет экспрессировать полинуклеотид, кодируемый белком, в клетке-хозяине. Неважно, введен ли полинуклеотид, используемый для трансформации, в хромосому клетки-хозяина, будучи расположен в ней, или расположен вне хромосомы, при условии что он может быть экспрессирован в клетке-хозяине. Полинуклеотид может быть введен в любой форме, с учетом того, что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессирован в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, представляющей собой полинуклеотидную конструкцию, содержащую все основные элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии. Обычно экспрессионная кассета может содержать промотор, функционально связанный с открытой рамкой считывания (далее - «ORF») гена, сигнал терминации транскрипции, домен связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции.

Относительно промотора, используемого в настоящем изобретении, может не быть существенных ограничений, при условии, что он способен инициировать транскрипцию полинуклеотида, кодирующего целевой белок, в клетке-хозяине с высокой частотой, и может быть использован любой промотор, известный в данной области. Конкретно, но без ограничения, могут быть использованы промотор T7, промотор trc, промотор tac и промотор cysK (патент Кореи № 10-0966324).

В типичном воплощении настоящего изобретения ген metB, кодирующий цистатионин-гамма-синтазу, у микроорганизма может быть дополнительно удален или ослаблен.

В типичном воплощении настоящего изобретения ген thrB, кодирующий гомосеринкиназу, и ген metA, кодирующий гомосерин-O-сукцинилтрансферазу, у микроорганизма могут быть дополнительно удалены или ослаблены.

В настоящем изобретении последовательности генов могут быть получены из баз данных, таких как Национальный центр биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information, NCBI).

Использованный здесь термин «делеция» относится к типу удаления из хромосомы части или всей области нуклеотидной последовательности целевого гена, начиная с нуклеотидной последовательности, соответствующей инициирующему кодону, до нуклеотидной последовательности, соответствующей терминирующему кодону, или части или всей области нуклеотидной последовательности его регуляторной области.

Использованный здесь термин «ослабление» относится к устранению или снижению внутриклеточной активности по меньшей мере одного фермента, кодируемого соответствующей ДНК, у штамма микроорганизма. Например, экспрессия белка может быть ослаблена модификацией промоторной области нуклеотидной последовательности 5'-UTR (5'-нетранслируемой области) гена, или активность белка может быть ослаблена введением мутации в область ORF соответствующего гена.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ получения O-сукцинилгомосерина, включающий культивирование микроорганизма в среде для получения O-сукцинилгомосерина и получение O-сукцинилгомосерина из микроорганизма или среды.

Культивирование штамма микроорганизма для получения O-сукцинилгомосерина, полученного выше, может быть проведено в соответствии с подходящей средой и условиями культивирования, известными в данной области. Способ культивирования может быть легко адаптирован специалистом в данной области для применения в соответствии с выбранным штаммом. Конкретно, культура может представлять собой, без ограничения, периодическую культуру, непрерывную культуру и адаптированную культуру (fetch culture). Эти различные способы культивирования раскрыты, например, в приведенной ссылке (“Biochemical Engineering” by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138 - 176).

Среды, используемые для культивирования, должны подходящим образом соответствовать требованиям для определенных штаммов. Примеры сред для различных микроорганизмов раскрыты, например, в приведенной ссылке (“Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981). Среды могут содержать различные источники углерода, источники азота и микроэлементы. Примеры источников углерода для включения в среды могут включать углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол; и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти источники углерода могут быть использованы по отдельности или в комбинации. Примеры источников азота для включения в среды могут включать органические источники азота, такие как пептон, дрожжевой экстракт, мясной бульон, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт (CSL) и бобовую муку; и неорганические источники азота, такие как мочевина, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Эти источники азота могут быть использованы по отдельности или в комбинации. В качестве источника фосфора среды могут содержать дигидрофосфат калия, гидроортофосфат калия и соответствующие натрий-содержащие соли. В дополнение, культуральные среды могут содержать металлы, такие как сульфат магния и сульфат железа. Кроме того, могут быть включены аминокислоты, витамины, подходящие предшественники и так далее. Эти культуральные среды или предшественники могут быть добавлены в культуру в форме периодической культуры или непрерывной культуры.

В дополнение, во время культивирования pH культуры можно подходящим образом корректировать добавлением такого соединения, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. Кроме того, образование пузырьков во время культивирования можно предотвращать с использованием пеногасителя, такого как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты. В дополнение, в культуру может быть добавлен газообразный кислород или газ, содержащий газообразный кислород (например, воздух), для поддержания в культуре аэробных условий. Температура культуры может входить в диапазон от 20°C до 45°C и, конкретно, от 25°C до 40°C. Культивирование можно продолжать до получения желаемого количества продукта O-сукцинилгомосерина и, конкретно, от 10 часов до 160 часов.

O-сукцинилгомосерин, полученный способом по настоящему изобретению, может быть превращен в метионин цистатионин-гамма-синтазой или O-сукцинилгомосеринсульфгидрилазой. Кроме того, возможно получение янтарной кислоты в качестве побочного продукта, в дополнение к L-метионину, посредством взаимодействия O-сукцинил-L-гомосерина, полученного способом по настоящему изобретению, с CH₃SH.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению полипептида, обладающего резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активностью, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Было подтверждено, что новый выделенный полипептид по настоящему изобретению обладает резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и способен продуцировать O-сукцинилгомосерин с высоким выходом, и, таким образом, указанный полипептид может быть использован для получения O-сукцинилгомосерина.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие Примеры. Тем не менее, эти Примеры приведены лишь в иллюстративных целях, и изобретение не следует ограничивать этими Примерами.

Пример 1: Отбор полипептидов, обладающих новой O -сукцинилтрансферазной активностью

В качестве способа устранения контроля гена metA по принципу обратной связи и сохранения его стабильности был разработан metX, имеющий происхождение от Chromobacterium violaceum, на основании того факта, что ген metX (гомосерин-O-ацетилтрансфераза) не подвержен ингибированию L-метионином по принципу обратной связи, несмотря на то, что ген metX имеет структуру, близкую к структуре гена metA.

В этом отношении, для разработки новой гомосерин-O-ацетилтрансферазы авторы настоящего изобретения провели анализ гомологии аминокислотных последовательностей уже разработанных metX, имеющих происхождение от Chromobacterium violaceum, и в итоге отобрали полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, не подверженный ингибированию метионином по принципу обратной связи. Авторы настоящего изобретения недавно подтвердили, что отобранный полипептид, несмотря на то, что он представляет собой metX, имеющий происхождение от Sideroxydans lithotrophicus ES-1, обладает новой активностью, о которой никогда не сообщалось ранее.

Пример 2: Конструирование плазмид

2-1. Синтез гена metX , имеющего происхождение из Sideroxydans lithotrophicus ES-1

Ген metX, имеющий происхождение из Sideroxydans lithotrophicus ES-1 (sli) (SEQ ID NO: 3), синтезировали на основе последовательности гена metX (SEQ ID NO: 2) из базы данных NCBI (эталонная последовательность: YP_003522665.1) с оптимизацией кодонов, чтобы ген можно было экспрессировать в E. coli.

2-2. Конструирование плазмиды, экспрессирующей ген metX , имеющий происхождение из Sideroxydans lithotrophicus ES-1

Ген metX амплифицировали посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция) с использованием праймеров SEQ ID NO: 4 и 5 на основе синтезированной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3. Праймер SEQ ID NO: 5 имеет сайт рестрикции HindIII.

SEQ ID NO: 4) 5'-ATCTTGAGTATTTCGGTTGGTATTG-3'

SEQ ID NO: 5) 5'-CCCAAGCTTTTAAGCAGCTGATTCCCAAGC-3'

ПЦР проводили на протяжении 30 циклов, состоявших из денатурации при 95°C в течение 30 с, отжига при 55°C в течение 30 с и удлинения при 72°C в течение 1 мин. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1,0%-м агарозном геле и полосу 1,14 т.п.о. элюировали, очищали и обрабатывали HindIII. Вектор pCL1920, содержащий промотор cysK, обрабатывали EcoRV и HindIII и полученные рестрикционные фрагменты клонировали. Плазмида, экспрессирующая ген metX, полученная в результате клонирования, была названа «pCL-PcysK-metX (sli)».

Пример 3: Конструирование экспериментальных штаммов

3-1. Делеция гена metB

Проводили делецию гена metB, кодирующего цистатионин-гамма-синтазу, у штамма E. coli (K12) W3110 дикого типа. Для делеции гена metB применяли метод делеции «FRT-one-step-PCR» (PNAS (2000) vol 97: P 6640 - 6645). Для делеции гена metB конструировали делеционную кассету посредством ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 6 и 7 и вектора pKD3 (PNAS (2000) vol 97: P 6640 - 6645) в качестве матрицы.

SEQ ID NO: 6)

5'-TTACTCTGGTGCCTGACATTTCACCGACAAAGCCCAGGGAACTTCATCACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'

SEQ ID NO: 7)

5'-CGCTGCGCCAGCTCCATACGCGGCACCAGCGTTCGCAACCCACGTAGCAGCATATGAATATCCTCCTTAG-3'

ПЦР проводили на протяжении 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°C в течение 30 с, отжига при 55°C в течение 30 с и удлинения при 72°C в течение 1 мин. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1,0%-м агарозном геле и полосу 1,1 т.п.о. элюировали и очищали. Полученный фрагмент ДНК электропорировали в штамм E. coli (K12) W3110, уже трансформированный вектором pKD46 (PNAS (2000) vol 97 P 6640 - 6645). Для электропорации штамм W3110, трансформированный pKD46, культивировали в среде LB, содержащей 200 мкг/л ампициллина и 5 мМ L-арабинозы, при 30°C до достижения OD₆₀₀ 0,5 и для использования промывали 3 раза 10%-м глицерином. Электропорацию проводили при 2500 В. Полученный штамм высевали на чашки со средой LB, содержащей 30 мкг/л хлорамфеникола, культивировали при 37°C в течение 1-2 суток и отбирали штамм, резистентный к хлорамфениколу. Отобранный штамм подвергали ПЦР в тех же условиях, что описаны выше, с использованием праймеров SEQ ID NO: 8 и 9 и делецию гена metB подтверждали, наблюдая присутствие 1,5 т.п.о. полосы гена в 1,0%-м агарозном геле.

SEQ ID NO: 8) 5'-TATTCGCCGCTCCATTCAGC-3'

SEQ ID NO: 9) 5'-TACCCCTTGTTTGCAGCCCG-3'

Подтвержденный таким образом штамм трансформировали вектором pCP20 (PNAS (2000) vol 97 P 6640 - 6645) и культивировали в среде LB, содержащей 100 мкг/л ампициллина. Конечный штамм с делецией гена metB, имеющего уменьшенный размер, подтвержденный в 1,0%-м агарозном геле, конструировали, проводя ПЦР в тех же условиях, и подтверждали удаление хлорамфениколового маркера из штамма. Сконструированный таким образом штамм, которому необходим метионин, был назван «CC03-0131».

3-2. Делеция гена thrB

Была предпринята попытка увеличить количество O-сукцинилгомосерина, синтезируемого из гомосерина, делецией гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу. В частности, для использования штамма, продуцирующего треонин, необходима делеция гена thrB, поскольку активность утилизации гомосерина очень высока. Делецию гена thrB в штамме CC03-0131, конструированном выше, проводили методом делеции «FRT-one-step-PCR». Делеционную кассету thrB конструировали посредством ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 10 и 11 и вектора pKD3 в качестве матрицы.

SEQ ID NO: 10)

5'-CATGGTTAAAGTTTATGCCCCGGCTTCCAGTGCCAATATGAGCGTCGGGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'

SEQ ID NO: 11)

5'-GGAGATACCGCTCGCTACCGCGCCGATTTCCGCGACCGCCTGCCGCGCCTCATATGAATATCCTCCTTAG-3'

ПЦР проводили на протяжении 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°C в течение 30 с, отжига при 55°C в течение 30 с и удлинения при 72°C в течение 1 мин. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1,0%-м агарозном геле и полосу 1,1 т.п.о. элюировали и очищали. Полученный фрагмент ДНК электропорировали в штамм CC03-0131, уже трансформированный вектором pKD46. Для электропорации штамм CC03-0131, трансформированный pKD46, культивировали в среде LB, содержащей 200 мкг/л ампициллина и 5 мМ арабинозы, при 30°C до достижения OD₆₀₀ 0,5 и для использования промывали 3 раза 10%-м глицерином. Электропорацию проводили при 2500 В. Полученный штамм высевали на чашки со средой LB, содержащей 30 мкг/л хлорамфеникола, культивировали при 37°C в течение 1-2 суток и отбирали штамм, резистентный к хлорамфениколу.

Отобранный штамм подвергали ПЦР в тех же условиях, что описаны выше, с использованием праймеров SEQ ID NO: 12 и 13 и делецию гена thrB подтверждали, наблюдая присутствие 1,5 т.п.о. полосы гена в 1,0%-м агарозном геле.

SEQ ID NO: 12) 5'-ACTCGACGATCTCTTTGCC-3'

SEQ ID NO: 13) 5'-ACGCCGAGAGGATCTTCGCAG-3'

Подтвержденный таким образом штамм трансформировали вектором pCP20 и культивировали в среде LB, содержащей 100 мкг/л ампициллина. Конечный штамм с делецией гена thrB, имеющего уменьшенный размер, подтвержденный в 1,0%-м агарозном геле, конструировали, проводя ПЦР в тех же условиях, и подтверждали удаление хлорамфениколового маркера из штамма. Конструированный таким образом штамм был назван «CC03-0131-2».

3-3. Делеция гена metA

Для описания субстратной специфичности и активности гена metX, имеющего происхождение из Sideroxydans lithotrophicus ES-1, у штамма E. coli проводили делецию исходного гена metA на хромосоме на основе штамма CC03-0131-2, представляющего собой штамм E. coli (K12) W3110 с делециями генов metB и thrB. Делецию гена metA проводили методом делеции «FRT-one-step-PCR». Делеционную кассету metA конструировали посредством ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 14 и 15 и вектора pKD3 в качестве матрицы.

SEQ ID NO: 14)

5'-TCAGCTGTTGCGCATCGATTCCCGTGAATCGCGCAACACGCCCGCAGAGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'

SEQ ID NO: 15)

5'-CCGTCACAAAGGCAATGCGCTTATCTTTACTGGCAAACAGATATGCATCCCATATGAATATCCTCCTTAG-3'

ПЦР проводили на протяжении 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°C в течение 30 с, отжига при 55°C в течение 30 с и удлинения при 72°C в течение 1 мин. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1,0%-м агарозном геле и полосу 1,1 т.п.о. элюировали и очищали. Полученный фрагмент ДНК электропорировали в штамм CC03-0131-2, уже трансформированный вектором pKD46. Для электропорации штамм CC03-0131-2, трансформированный pKD46, культивировали в среде LB, содержащей 200 мкг/л ампициллина и 5 мМ арабинозы, при 30°C до достижения OD₆₀₀ 0,5 и для использования промывали 3 раза 10%-м глицерином. Электропорацию проводили при 2500 В. Полученный штамм высевали на чашки со средой LB, содержащей 30 мкг/л хлорамфеникола, культивировали при 37°C в течение 1-2 суток и отбирали штамм, резистентный к хлорамфениколу.

Отобранный штамм подвергали ПЦР в тех же условиях, что описаны выше, с использованием праймеров SEQ ID NO: 16 и 17 и делецию гена metA подтверждали, наблюдая присутствие 1,5 т.п.о. полосы гена в 1,0%-м агарозном геле.

SEQ ID NO: 16) 5'-CTCATTAACGTTGGTTGTCA-3'

SEQ ID NO: 17) 5'-TATCTTGCTGCTGCTGAATG-3'

Подтвержденный таким образом штамм трансформировали вектором pCP20 и культивировали в среде LB, содержащей 100 мкг/л ампициллина. Конечный штамм с делецией гена metA, имеющего уменьшенный размер, подтвержденный в 1,0%-м агарозном геле, конструировали, проводя ПЦР в тех же условиях, и подтверждали удаление хлорамфениколового маркера из штамма. Конструированный таким образом штамм был назван «CC03-0132».

3-4. Конструирование штамма с введенной плазмидой, экспрессирующей ген metX , имеющий происхождение из Sideroxydans lithotrophicus ES-1

Для описания субстратной специфичности и активности гена metX, имеющего происхождение из Sideroxydans lithotrophicus ES-1, в штамм CC03-0132, представляющий собой штамм E. coli (K12) W3110 с делециями генов metB, thrB и metA, вводили плазмиду pCL-PcysK-metX (sli), конструированную в Примере 2.

Штамм CC03-0132 с введенной pCL-PcysK-metX (sli) был назван «CC03-0136» и депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM), расположенном по адресу 361 - 221, Hongje-1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea, являющемся дочерней структурой Корейской федерации коллекций культур (Korean Federation of Culture Collections, KFCC) и признанном международным органом по депонированию согласно Будапештскому соглашению 10 июня 2013 г., под регистрационным номером KCCM11424P.

Штамм был конструирован введением плазмиды pCL-PcysK-metA, конструированной таким же образом, как в Примере 2, за исключением того, что в качестве контрольной группы был использован metA дикого типа в штамме CC03-0132. Конструированный таким образом штамм был назван «CC03-0132/pCL-PcysK-metA».

Кроме того, конструировали штамм с использованием штамма CJM002, продуцирующего треонин, не нуждающегося в метионине (регистрационный номер: KCCM-10568), посредством искусственной мутации с использованием NTG на основе штамма TF4076 (регистрационный номер: KFCC-10718), продуцирующего L-треонин, представляющего собой штамм, которому необходим метионин, раскрытый в патенте Кореи № 10-0905381, таким же образом, как в Примерах 3-1 - 3-3, и конструированный таким образом штамм был назван «CJM-BTA».

Плазмиды pCL-PcysK-metX (sli) и pCL-PcysK-metA, как описано выше, вводили в штамм CJM-BTA, и конструированные таким образом штаммы были названы «CJM-BTA/pCL-PcysK-metX (sli)» и «CJM-BTA/pCL-PcysK-metA», соответственно.

Пример 4: Получение O - сукцинилгомосерина с использованием штамма

4-1. Эксперимент с культивированием в колбах

Для описания субстратной специфичности и активности гена metX, имеющего происхождение из Sideroxydans lithotrophicus ES-1, введенного в штамм, конструированный в Примере 3, проводили культивирование в колбах Эрленмейера. Состав культур в колбах показан в Таблице 1 ниже.

Таблица 1

Состав	Исходно	Концентрация (на литр)	Объем (мл)
Глюкоза		40 г	200
KH₂PO₄		2 г	100
Сульфат аммония		17 г	500
MgSO₄·7H₂O		1 г
Дрожжевой экстракт		4 г
Метионин		0,4 г
MnSO₄·7H₂O	10 мг/мл	0,01 г (1 мл маточного раствора)
ZnSO₄·7H₂O	1 мг/мл	0,01 г (10 мл маточного раствора)
FeSO₄·7H₂O	10 мг/мл	10 мг (1 мл маточного раствора)
Карбонат кальция		30 г	200

Штамм CC03-0132 и штамм CJM-BTA высевали на чашки со средой LB в качестве контрольных групп. Штамм CC03-0136 (трансформированный вектором экспрессии metX), штамм CC03-0132/pCL-PcysK-metA (трансформированный вектором экспрессии metX, полученный с использованием того же вектора) и два других штамма, CJM-BTA/pCL-PcysK-metX (sli) и CJM-BTA/pCL-PcysK-metA (трансформированные вектором экспрессии metX или вектором экспрессии metA на основе штамма CJM-BTA, соответственно), высевали на чашки со средой LB, содержащей спектиномицин, и культивировали при 33°C в течение ночи. Затем отдельные колонии засевали в 2 мл среды LB, содержащей спектиномицин, культивировали при 33°C в течение 2 часов, засевали снова в колбы Эрленмейера объемом 250 мл, содержащие 25 мл среды, до оптической плотности OD₆₀₀ 0,07, культивировали при 33°C и 200 об/мин в течение 48 часов и количество полученного O-сукцинилгомосерина сравнивали посредством HPLC-анализа (высокоэффективная жидкостная хроматография). Результаты показаны в Таблице 2 ниже.

Таблица 2

Штамм	OD	Потребление глюкозы (г/л)	Количество полученного O-сукцинилгомосерина (г/л)
CC03-0132	16	40	0,0
CC03-0132/pCL-PcysK-metA	20	40	0,5
CC03-0132/pCL-PcysK-metX (sli) : CC03-0136	20	40	1,3
CJM-BTA	5	40	0,0
CJM-BTA/pCL-PcysK-metA	6	40	1,0
CJM-BTA/pCL-PcysK-metX (sli)	6	40	3,5

В результате было подтверждено, что ген metX, имеющий происхождение из Sideroxydans lithotrophicus ES-1, как и ген metA E. coli, продуцирует O-сукцинилгомосерин, используя сукцинил-КоА в качестве субстрата, но не продуцирует O-ацетилгомосерин. При введении гена metX, имеющего происхождение из Sideroxydans lithotrophicus ES-1, не было ингибирования метионином, добавленным в среду, по принципу обратной связи, даже при использовании дикого типа самого по себе, без каких-либо модификаций.

Специалистам в данной области будет ясно, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без выхода за рамки его сущности или основных признаков. Описанные воплощения следует рассматривать во всех отношениях только как иллюстративные и не ограничивающие. Таким образом, объем настоящего изобретения определен приложенной формулой изобретения, но не предшествующим описанием. Все изменения в рамках значения и диапазона эквивалентности формулы изобретения следует рассматривать как включенные в объем настоящего изобретения.

--->

<110> СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн

<120> МИКРООРГАНИЗМЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ O-СУКЦИНИЛГОМОСЕРИНА И СПОСОБ

ПОЛУЧЕНИЯ O-СУКЦИНИЛГОМОСЕРИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННЫХ

МИКРООРГАНИЗМОВ

<130> OPA14138

<150> KR 10-2013-0126612

<151> 2013-10-23

<160> 17

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 377

<212> ПРТ

<213> Sideroxydans lithotrophicus

<400> 1

Met Ser Ile Ser Val Gly Ile Val Thr Ala Gln Arg Ala Val Phe Asp

1 5 10 15

Lys Pro Leu Ser Phe Arg Ser Gly Ala Val Leu Pro Arg Tyr Glu Leu

20 25 30

Val Tyr Glu Thr Tyr Gly Thr Leu Asn Ala Glu Arg Ser Asn Ala Ile

35 40 45

Leu Ile Cys His Ala Leu Ser Gly Asn His His Val Ala Gly Tyr Tyr

50 55 60

Ala Gly Asp Glu Lys Ser Leu Gly Trp Trp Asp Asn Met Val Gly Pro

65 70 75 80

Gly Lys Pro Ile Asp Thr Asn Lys Phe Phe Val Val Gly Leu Asn Asn

85 90 95

Leu Gly Gly Cys His Gly Ser Thr Gly Pro Ser Ser Ile Asp Pro Gln

100 105 110

Thr Gly Lys Pro Tyr Gly Ala Ser Phe Pro Val Val Thr Val Glu Asp

115 120 125

Trp Val Glu Ser Gln Ala Arg Leu Ala Asp His Leu Gly Val Tyr Arg

130 135 140

Phe Ala Ala Val Val Gly Gly Ser Leu Gly Gly Met Gln Ala Met Gln

145 150 155 160

Trp Ala Leu Ala Tyr Pro Asp Arg Val Arg His Val Leu Ala Ile Ala

165 170 175

Thr Ala Pro His Leu Thr Ala Gln Asn Ile Ala Phe Asn Asp Val Ala

180 185 190

Arg Asn Ala Ile Leu Thr Asp Pro Asp Phe His Asn Gly Asp Phe Tyr

195 200 205

Gln His Gly Val Val Pro Thr Arg Gly Leu Arg Leu Ala Arg Met Leu

210 215 220

Gly His Ile Thr Tyr Leu Ser Asp Asp Ala Met Ala Asp Lys Phe Gly

225 230 235 240

Arg Glu Leu Arg Thr Gly Lys Leu Asn Phe Ser Tyr Asp Ile Glu Phe

245 250 255

Gln Ile Glu Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Gly Asp Lys Phe Ala Ala Tyr

260 265 270

Phe Asp Ala Asn Thr Tyr Leu Leu Met Thr Lys Ala Leu Asp Tyr Phe

275 280 285

Asp Pro Ala Arg Glu Leu Asp Gly Asp Leu Asn His Ala Phe Ala Ala

290 295 300

Ala Lys Ala Lys Phe Leu Val Val Ser Phe Thr Thr Asp Trp Arg Phe

305 310 315 320

Ser Pro Glu Arg Ser Arg Glu Ile Val His Ala Leu Leu His Asn Lys

325 330 335

Arg Asp Val Ser Tyr Ala Glu Ile Thr Ser Gln His Gly His Asp Ser

340 345 350

Phe Leu Met Gln Asp Glu Gln Tyr Phe Ala Val Met Arg Asn Tyr Leu

355 360 365

Asp Asn Val Ala Trp Glu Ser Ala Ala

370 375

<210> 2

<211> 1134

<212> ДНК

<213> Sideroxydans lithotrophicus

<400> 2

ttgagcatct cggttggcat cgttacagcg caacgcgcgg tttttgacaa acctctctcc 60

ttcaggagcg gagcagtatt gccgcgttat gaactggtat atgagaccta tggcacgctg 120

aacgcagagc gcagcaacgc catcctgatc tgtcacgcct tgtccggcaa tcaccatgtc 180

gctggctact acgccggcga tgaaaagagc ctcggctggt gggacaacat ggtgggaccc 240

ggcaaaccga tagacaccaa caaattcttt gtcgtcgggt tgaacaacct tggcggctgc 300

catggctcga ccggtccttc cagtatcgat ccgcagaccg gcaagccata tggtgcgagt 360

ttcccggtgg tcacggtgga agactgggtg gagtcgcagg cccgtctcgc cgaccatctc 420

ggcgtctacc ggttcgccgc agtggtcggc ggcagcctgg gtggcatgca ggccatgcaa 480

tgggcactgg cctatccgga tcgcgtgcga catgtgctgg ccatcgccac cgcaccgcat 540

cttacggcgc agaacatcgc attcaacgac gtggcgcgca atgcgatcct caccgacccg 600

gatttccata acggcgattt ctaccagcat ggcgtggtgc ctacacgcgg cctgcgcctg 660

gcgcgcatgc ttgggcacat cacctatctt tccgacgatg ccatggcgga caagttcggg 720

cgcgaattgc gcacgggtaa attaaatttc agctacgaca tcgaattcca gatcgaatcc 780

tacctgcgct accagggcga caagttcgcc gcgtatttcg acgcgaacac ttacctgctg 840

atgaccaagg cgctggatta tttcgacccg gcgcgcgaac tcgacggtga cctgaatcat 900

gccttcgcag ctgccaaggc caaattcctt gtcgtgtctt tcacgaccga ctggcgcttc 960

tcgccggagc gttcgcgcga gatcgtgcat gcgctgctgc acaacaagcg cgatgtgagt 1020

tacgcggaga tcacttcgca gcacggccac gattccttcc tgatgcagga cgagcagtat 1080

ttcgcggtca tgcgcaatta tctcgataac gtcgcctggg aaagtgcggc atga 1134

<210> 3

<211> 1134

<212> ДНК

<213> Sideroxydans lithotrophicus

<400> 3

ttgagtattt cggttggtat tgttacagcc caacgcgcgg tttttgacaa acccctctcc 60

tttaggtcag gagcagtatt gccacgttat gaattagtat atgaaaccta tggtacactg 120

aatgcagagc ggagcaatgc cattctgatt tgtcacgcat tgtccggtaa tcatcatgtc 180

gctggctact acgccgggga tgaaaaaagc ctaggctggt gggataacat ggtgggacct 240

ggcaaaccaa ttgatacgaa caaatttttt gtcgtcgggt taaataatct tggaggctgc 300

catggctcaa ccggtcctag cagtatcgat ccgcagactg gtaaaccata tggtgcgagt 360

tttcccgttg tcacggtgga agattgggta gaatctcagg cccgtctagc ggatcatctc 420

ggcgtttatc ggttcgctgc agtcgttggc ggatctttag gtggtatgca agccatgcag 480

tgggcactgg cttatccgga tcgcgtgcga catgttctgg ccatagctac cgcaccgcat 540

cttacggctc agaatattgc atttaacgac gttgcgcgca atgcaatcct taccgacccg 600

gattttcata acggagattt ttaccagcat ggagtggtgc ctacacgcgg cctgcgtctg 660

gcgcgaatgt tagggcacat aacctattta agcgatgatg ccatggcgga taaatttggt 720

cgtgaattgc gcacggggaa attaaatttc tcttatgata tcgaattcca gatcgaaagt 780

tacctgagat accaaggcga caaattcgct gcgtatttcg atgcgaacac ttacctgctg 840

atgaccaagg ccttggatta ttttgatccg gcgagagaac ttgacggtga tctgaatcat 900

gccttcgcag ctgccaaggc caaatttctt gtggtatctt tcactacaga ttggcggttt 960

tcgccggagc gttcacgcga aatagttcat gcgttactgc acaacaagcg cgatgtgagt 1020

tacgcagaga ttacttcaca gcacggccac gattcctttc tgatgcaaga cgaacagtat 1080

tttgcagtga tgagaaatta tttagataac gtagcttggg aatcagctgc ttaa 1134

<210> 4

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 4

atcttgagta tttcggttgg tattg 25

<210> 5

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 5

cccaagcttt taagcagctg attcccaagc 30

<210> 6

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 6

ttactctggt gcctgacatt tcaccgacaa agcccaggga acttcatcac gtgtaggctg 60

gagctgcttc 70

<210> 7

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 7

cgctgcgcca gctccatacg cggcaccagc gttcgcaacc cacgtagcag catatgaata 60

tcctccttag 70

<210> 8

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 8

tattcgccgc tccattcagc 20

<210> 9

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 9

taccccttgt ttgcagcccg 20

<210> 10

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 10

catggttaaa gtttatgccc cggcttccag tgccaatatg agcgtcgggt gtgtaggctg 60

gagctgcttc 70

<210> 11

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 11

ggagataccg ctcgctaccg cgccgatttc cgcgaccgcc tgccgcgcct catatgaata 60

tcctccttag 70

<210> 12

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 12

actcgacgat ctctttgcc 19

<210> 13

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 13

acgccgagag gatcttcgca g 21

<210> 14

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 14

tcagctgttg cgcatcgatt cccgtgaatc gcgcaacacg cccgcagagc gtgtaggctg 60

gagctgcttc 70

<210> 15

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 15

ccgtcacaaa ggcaatgcgc ttatctttac tggcaaacag atatgcatcc catatgaata 60

tcctccttag 70

<210> 16

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 16

ctcattaacg ttggttgtca 20

<210> 17

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 17

tatcttgctg ctgctgaatg 20

<---

Claims

1. Способ получения метионина, включающий:

а) культивирование микроорганизма в среде;

б) получение O-сукцинилгомосерина из микроорганизма или среды;

в) превращение О-сукцинилгомосерина в метионин с использованием цистатионин-гамма-синтазы или O-сукцинилгомосеринсульфгидрилазы,

где микроорганизм представляет собой микроорганизм Escherichia sp., продуцирующий O-сукцинилгомосерин, экспрессирующий полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосеринсукцинилтрансферазной активностью, где полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

2. Способ получения метионина по п. 1, где микроорганизм Escherichia sp. представляет собой Escherichia coli.

3. Способ получения метионина по п. 1, где ген metB, кодирующий цистатионин-гамма-синтазу микроорганизма Escherichia sp, дополнительно удален или ослаблен.

4. Способ получения метионина по п. 1, где ген thrB, кодирующий гомосеринкиназу, или ген metA, кодирующий гомосерин-O-сукцинилтрансферазу микроорганизма Escherichia sp, дополнительно удален или ослаблен.