ES2908323T3 - Microorganismo para la producción de o-succinilhomoserina y un método para la producción de o-succinilhomoserina mediante el uso del mismo - Google Patents

Microorganismo para la producción de o-succinilhomoserina y un método para la producción de o-succinilhomoserina mediante el uso del mismo Download PDF

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Abstract

Un método para producir O-succinilhomoserina mediante el uso de un polipéptido aislado que tiene resistencia a la inhibición por retroalimentación por metionina y una actividad de homoserina succiniltransferasa para usar en la producción de O-succinilhomoserina, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

Description

DESCRIPCIÓN
Microorganismo para la producción de O-succinilhomoserina y un método para la producción de O-succinilhomoserina mediante el uso del mismo
Campo Técnico
La presente invención se refiere a un método para producir O-succinilhomoserina mediante el uso de un polipéptido aislado que tiene una resistencia a la inhibición por retroalimentación por metionina y una actividad de homoserina O-succiniltransferasa, un microorganismo que expresa el polipéptido, y un método para producir O-succinilhomoserina mediante el uso del mismo.
Antecedentes de la técnica
Se conoce que la mayoría de los microorganismos presentes en la naturaleza utilizan O-succinilhomoserina u O-acetilhomoserina como intermediarios para la biosíntesis de metionina. Generalmente, O-succinilhomoserina se produce por homoserina O-succiniltransferasa (MetA) que conjuga el grupo succinil de succinil-CoA a homoserina, y O-acetilhomoserina se produce por homoserina O-acetiltransferasa (MetX) que conjuga el grupo acetilo de acetil-CoA a homoserina. Es decir, al producir O-succinilhomoserina entre los intermedios, metA es uno de los genes más importantes en el desarrollo de microorganismos productores de la misma. Mientras tanto, a diferencia de MetA, se conoce que MetX no se inhibe por retroalimentación y tiene una alta estabilidad enzimática.
La O-succinilhomoserina se acumula cuando se bloquea la cistationina gamma sintasa en la vía de biosíntesis de la metionina y, por lo tanto, la cepa productora de O-succinilhomoserina requiere L-metionina. Por consiguiente, se añade metionina a un medio, y la metionina añadida al medio inhibe la actividad de la homoserina O-succiniltransferasa y, finalmente, no se puede obtener O-succinilhomoserina a una concentración alta.
Por consiguiente, muchas patentes anteriores han centrado sus estudios en la liberación de la inhibición por retroalimentación de metA desde un sistema de control por retroalimentación. Por ejemplo, el documento EP 2128264 A1 describe una cepa de Escherichia coli que puede producir O-succinilhomoserina. La actividad de homoserina O-succiniltransferasa se introduce en la cepa y se potencia su actividad. La homoserina O-succiniltransferasa es resistente a la retroalimentación con metionina y presenta mutaciones en los aminoácidos en las posiciones: 24, 29, 79, 114, 140, 163, 222, 275, 290, 291, 295, 297, 304 y 305 (correspondientes a SEQ.ID.Nos 14, 16, 18, 20 y 22, respectivamente). Sin embargo, la homoserina O-succiniltransferasa codificada por metA tiene problemas porque tiene baja estabilidad por su propia proteína de tipo salvaje y porque la introducción de una mutación para la liberación de la inhibición por retroalimentación empeora la inestabilidad. Por consiguiente, para el desarrollo de una cepa productora de O-succinilhomoserina con alta productividad, es necesario eliminar la inhibición por retroalimentación del gen metA y asegurar la estabilidad de la enzima.
Descripción
Problema técnico
Para resolver el fenómeno de la inhibición por retroalimentación de metA y el problema de inestabilidad enzimática descrito anteriormente, los presentes inventores se esforzaron por desarrollar una homoserina O-succiniltransferasa, la cual asegura la estabilidad de la enzima sin ser inhibida por la retroalimentación por metionina, y en este sentido, se detectaron nuevas enzimas que tienen la actividad. Como resultado de seleccionar los genes candidatos detectados de este modo y cultivar en un matraz después de introducirlos en Escherichia sp., los presentes inventores han descubierto la producción de O-succinilhomoserina, y que los genes así seleccionados tienen una actividad de homoserina O-succiniltransferasa y una resistencia a la inhibición por retroalimentación por metionina, para de esta manera completar la presente invención.
Solución técnica
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para producir O-succinilhomoserina mediante el uso de un polipéptido aislado que tiene una resistencia a la inhibición por retroalimentación por metionina y una actividad de homoserina O-succiniltransferasa.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para la producción de O-succinilhomoserina que usa un polinucleótido que codifica el polipéptido aislado.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un microorganismo para producir O-succinilhomoserina, que exprese el polipéptido aislado.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para producir O-succinilhomoserina mediante el uso del microorganismo anterior.
Efectos ventajosos de la invención
El microorganismo para producir O-succinilhomoserina, incluido el polipéptido aislado, que tiene resistencia a la inhibición por retroalimentación por metionina y una actividad de homoserina O-succiniltransferasa, tiene una resistencia a la inhibición por retroalimentación por metionina y produce O-succinilhomoserina con alto rendimiento y, por lo tanto, puede usarse eficazmente para la producción de E-metionina, que usa la misma como precursor, con alto rendimiento.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
Para lograr los objetivos anteriores, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para producir O-succinilhomoserina mediante el uso de un polipéptido aislado que tiene una resistencia a la inhibición por retroalimentación por metionina y una actividad de homoserina O-succiniltransferasa.
Como se usa en la presente descripción, el término "actividad de homoserina O-succiniltransferasa" se refiere a la actividad de convertir homoserina en O-succinilhomoserina.
Como se usa en la presente descripción, el término "inhibición por retroalimentación" se refiere a la inhibición de la actividad de la homoserina O-succiniltransferasa por la metionina.
El polipéptido usado en el método de la presente invención se caracteriza porque tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que tiene actividad de homoserina O-succiniltransferasa y una resistencia a la inhibición por retroalimentación por metionina. Puede usarse cualquier polipéptido que comparta una homología de secuencia del 80 % o más con el polipéptido anterior, específicamente del 90 % o más, más específicamente del 95 % o más, e incluso más específicamente del 97 % o más, en la medida en que el polipéptido tenga la actividad de homoserina O-succiniltransferasa y la resistencia a la inhibición por retroalimentación por metionina sugeridas en la presente invención. El % de homología se puede determinar mediante el uso de BLAST 2.0, que es un algoritmo de referencia, o FASTA de Pearson [Methods Enzymol., 183, 63(1990), infra]. En base al algoritmo BLAST, se han desarrollado programas llamados BLASTN y BLASTX [www.ncbi.nlm.nih.gov, infra].
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir O-succinilhomoserina mediante el uso de un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido anterior. Específicamente, el polipéptido se codifica por la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 2 o s Eq ID NO: 3. Debido a la redundancia de los codones, se pueden usar aquellos polinucleótidos que tienen una homología de secuencia de al menos el 80 % con la secuencia anterior, específicamente del 90 % o más, más específicamente del 95 % o más, e incluso más específicamente del 97 % o más.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un vector que incluye el polinucleótido de forma operativa. Como se usa en la presente descripción, el término "vector" se refiere a una construcción de ADN que incluye la secuencia de nucleótidos del polinucleótido que codifica una proteína de interés, donde la proteína de interés se une operativamente a una secuencia reguladora adecuada para que la proteína de interés pueda expresarse en un huésped apropiado. La secuencia reguladora puede incluir un promotor capaz de iniciar la transcripción, cualquier secuencia operadora para la regulación de la transcripción, una secuencia que codifica un dominio de unión al ribosoma de ARNm apropiado y una secuencia que regula la terminación de la transcripción y traducción. El vector, después de transformarse dentro de un huésped apropiado, puede replicarse o funcionar independientemente del genoma del huésped, o puede integrarse en el propio genoma del huésped.
El vector usado en la presente invención puede no estar particularmente limitado siempre que el vector sea replicable en el huésped, y puede usarse cualquier vector conocido en la técnica.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un microorganismo productor de O-succinilhomoserina que expresa un polipéptido, que tiene una resistencia a la inhibición por retroalimentación por metionina y una actividad de homoserina O-succiniltransferasa.
Como se usa en la presente descripción, el término "un microorganismo productor de O-succinilhomoserina" puede referirse a un microorganismo que puede producir O-succinilhomoserina y almacenarla intracelular y extracelularmente.
El microorganismo para producir O-succinilhomoserina incluye cepas de microorganismos procarióticos y eucarióticos, por ejemplo, las cepas de microorganismos que pertenecen al género Escherichia, el género Erwinia, el género Serratia, el género Providencia, el género Corynebacterium y el género Brevibacterium, pero sin limitarse a ellos. Específicamente, el microorganismo puede ser un microorganismo perteneciente al género Escherichia, por ejemplo,
Escherichia coli.
El microorganismo productor de O-succinilhomoserina puede prepararse mediante el uso de cepas de microorganismos que producen E-lisina, E-treonina o E-isoleucina, y específicamente, mediante el uso de una cepa productora de E-treonina. Dado que la cepa productora de E-treonina es una cepa capaz de sintetizar E-treonina y homoserina como precursores de O-succinilhomoserina, se puede sintetizar una gran cantidad de precursores de metionina, es decir, O-succinilhomoserina, mediante el uso de la cepa.
En la presente invención, la expresión del polipéptido se puede lograr mediante la transformación con un vector recombinante que incluye un gen que codifica el polipéptido de manera operativa o mediante la inserción de un polinucleótido que codifica el polipéptido en el cromosoma, pero los métodos no se limitan a ello.
Como se usa en la presente descripción, el término "transformación" se refiere a un proceso de introducción de un vector que incluye un polinucleótido que codifica una proteína diana en una célula huésped, lo que permite, de esta manera, la expresión del polinucleótido codificado por la proteína en la célula huésped. Para el polinucleótido transformado, no importa si se inserta en el cromosoma de una célula huésped y se localiza allí o si se ubica fuera del cromosoma, siempre que pueda expresarse en la célula huésped. El polinucleótido puede insertarse en cualquier forma siempre que pueda introducirse en una célula huésped y expresarse en ella. Por ejemplo, el polinucleótido puede introducirse en una célula huésped en forma de un casete de expresión, que es una construcción polinucleotídica que incluye todos los elementos esenciales necesarios para la autoexpresión. El casete de expresión puede incluir convencionalmente un promotor conectado operativamente al marco abierto de lectura ("ORF", en adelante) del gen, una señal de terminación de la transcripción, un dominio de unión al ribosoma y una señal de terminación de la traducción.
El promotor usado en la presente invención puede no estar particularmente limitado siempre que pueda iniciar la transcripción del polinucleótido que codifica la proteína diana en una célula huésped con alta frecuencia, y puede usarse cualquier promotor conocido en la técnica. Específicamente, puede usarse el promotor T7, el promotor trc, el promotor tac y el promotor cysK (patente coreana núm. 10-0966324), aunque sin limitarse a ellos.
En una modalidad ejemplar de la presente invención, el gen metB que codifica la cistationina gamma sintasa en el microorganismo puede eliminarse o debilitarse adicionalmente.
En una modalidad ejemplar de la presente invención, el gen thrB que codifica la homoserina quinasa y el gen metA que codifica la homoserina O-succiniltransferasa en el microorganismo pueden eliminarse o debilitarse adicionalmente.
En la presente invención, las secuencias de los genes se pueden obtener de bases de datos como el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI).
Como se usa en la presente descripción, el término "eliminación" se refiere a un tipo de eliminación, dentro del cromosoma, de una parte o la totalidad de una región de la secuencia de nucleótidos de un gen diana de la secuencia de nucleótidos correspondiente al codón de iniciación a la del codón de terminación, o una parte o la totalidad de la región de la secuencia de nucleótidos de una región reguladora de la misma.
Como se usa en la presente descripción, el término "debilitamiento" se refiere a la eliminación o reducción de la actividad intracelular de al menos una enzima codificada por el ADN correspondiente en una cepa de microorganismo. Por ejemplo, se puede debilitar la expresión de una proteína mediante la modificación de la región promotora o la secuencia de nucleótidos de 5'-UTR de un gen, o se puede debilitar la actividad de una proteína mediante la introducción de una mutación en la región ORF del gen correspondiente.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir O-succinilhomoserina que incluye cultivar el microorganismo anterior en un medio para producir O-succinilhomoserina y obtener la O-succinilhomoserina a partir del microorganismo o del medio.
El cultivo de la cepa de microorganismo para producir la O-succinilhomoserina preparada anteriormente se puede realizar de acuerdo con el medio y las condiciones de cultivo apropiados conocidos en la técnica. El proceso de cultivo se puede ajustar fácilmente para que lo utilice un experto en la técnica de acuerdo con la cepa que se seleccione. Específicamente, el cultivo puede ser un cultivo por lotes, un cultivo continuo, y un cultivo incrementado, pero no se limita a estos. Estos diversos procesos de cultivo se describen, por ejemplo, en una referencia (''Biochemical Engineering" por James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138 - 176).
Los medios usados para el cultivo deben cumplir adecuadamente los requisitos para cepas particulares. Los ejemplos de los medios para diversos microorganismos se describen, por ejemplo, en una referencia ("Manual of Methods for General Bacteriology" de la Sociedad Americana de Bacteriología, Washington D.C., EE. UU., 1981). Los medios pueden incluir diversas fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y oligoelementos. Los ejemplos de la fuente de carbono que debe contener el medio pueden incluir carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón y celulosa; grasas tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino y aceite de coco; ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico; alcoholes tales como glicerol y etanol; y ácidos orgánicos tales como ácido acético. Estas fuentes de carbono pueden usarse solas o en combinación. Los ejemplos de la fuente de nitrógeno que debe contener el medio pueden incluir fuentes de nitrógeno orgánico tales como peptona, extracto de levadura, salsa de carne, extracto de malta, licor de maceración de maíz (CSL) y harina de frijoles; y fuentes de nitrógeno inorgánico tales como urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Estas fuentes de nitrógeno pueden usarse solas o en combinación. Como fuente de fósforo, los medios pueden incluir dihidrógeno fosfato de potasio, hidrógeno fosfato de dipotasio y las correspondientes sales que contienen sodio. Adicionalmente, los medios de cultivo pueden incluir metales tales como sulfato de magnesio y sulfato de hierro. Además, pueden incluirse aminoácidos, vitaminas y precursores apropiados, etc. Estos medios de cultivo o precursores pueden añadirse al cultivo en forma de cultivo en lotes o cultivo continuo.
Adicionalmente, el pH del cultivo se puede ajustar mediante la adición de un compuesto tal como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoníaco, ácido fosfórico, y ácido sulfúrico durante el cultivo de una manera apropiada. Adicionalmente, la formación de burbujas se puede prevenir durante el cultivo mediante el uso de un agente antiespumante tal como el éster de poliglicol de ácido graso. Adicionalmente, se puede añadir al cultivo un gas de oxígeno o un gas que contenga un gas de oxígeno (por ejemplo, aire) para mantener las condiciones aeróbicas en el cultivo. La temperatura del cultivo puede estar en un rango de 20 °C a 45 °C, y específicamente de 25 °C a 40 °C. El cultivo puede continuarse hasta que se obtenga la cantidad deseada de producto O-succinilhomoserina, y específicamente de 10 horas a 160 horas.
La O-succinilhomoserina producida por el método de la presente invención se puede convertir en metionina mediante la cistationina gamma sintasa o la O-succinilhomoserina sulfhidrilasa. Adicionalmente, el ácido succínico puede obtenerse como un subproducto, además de L-metionina, mediante la reacción de la O-succinil-L-homoserina producida por el método de la presente invención con CH3SH.
En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un método para la producción de O-succinilhomoserina que usa un polipéptido que tiene resistencia a la inhibición por retroalimentación por metionina y una actividad de homoserina O-succiniltransferasa, en el que el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Se confirmó que el polipéptido de la presente invención tiene resistencia a la inhibición por retroalimentación por metionina y es capaz de producir O-succinilhomoserina con alto rendimiento y, por lo tanto, el polipéptido puede usarse para producir O-succinilhomoserina.
Descripción detallada de la invención
De aquí en lo adelante, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos. Ejemplo 1: Selección de polipéptidos que tienen nueva actividad de O-succiniltransferasa
Como un método para liberar el control de retroalimentación del gen metA y asegurar la estabilidad del mismo, se ha desarrollado metX derivado de Chromobacterium violaceum en base a que el gen metX (homoserina O-acetiltransferasa) no se inhibe por retroalimentación por L-metonina aunque el gen metX tiene una estructura similar a la del gen metA.
En este sentido, para el desarrollo de una nueva homoserina O-acetiltransferasa, los presentes inventores han realizado un análisis de homología con respecto a las secuencias de aminoácidos del metX ya desarrollado derivado de Chromobacterium violaceum, y finalmente se seleccionó el polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, liberado de la inhibición por retroalimentación por metionina. Los presentes inventores han confirmado recientemente que el polipéptido seleccionado, aunque es un metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1, tiene una nueva actividad que nunca se había informado anteriormente.
Ejemplo 2: Construcción de plásmido
2-1. Síntesis del gen metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1
El gen metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1 (sli) (SEQ ID NO: 3) se sintetizó en base a la secuencia del gen metX (SEQ ID NO: 2) de la base de datos NCBI (secuencia de referencia: YP_003522665.1) a través del proceso de optimización de codones para que el gen pueda expresarse en E. coli.
2-2. Construcción de un plásmido que expresa el gen metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1
El gen metX se amplificó por PCR mediante el uso de los cebadores de SEQ ID NOS: 4 y 5 basados en la secuencia de nucleótidos sintetizada de SEQ ID NO: 3. El cebador de SEQ ID NO: 5 tiene el sitio de restricción HindIII.
SEQ ID NO: 4) 5'-ATC TT GAGT ATTTCGGTTGGT ATT G-3'
SEQ ID NO: 5) 5'-CCC AAGCTT ttaagcagctgattcccaagc-3'
La PCR se realizó durante 30 ciclos, que consistieron en desnaturalización a 95 °C durante 30 s, hibridación a 55 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 1 min. Los productos de la PCR se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa al 1,0 % y se eluyó, purificó y trató con HindIII una banda de 1,14 kb. El vector pCL1920 que incluye el promotor de cysK se trató con EcoRV y HindIII, y se clonaron los fragmentos de restricción resultantes. El plásmido que expresa el gen metX obtenido como resultado de la clonación se denominó "pCL-PcysK-metX (sli)".
Ejemplo 3: Construcción de cepas experimentales
3-1. Eliminación del gen metB
Se eliminó el gen metB que codifica la cistationina gamma sintasa en una cepa de E. coli (K12) W3110 de tipo salvaje. Para la eliminación del gen metB, se realizó el método de eliminación FRT-one-step-PCR (PNAS (2000) vol 97: P 6640-6645). Para la eliminación del gen metB, se construyó un casete de eliminación por PCR mediante el uso de los cebadores de SEQ ID NOS: 6 y 7, y el vector pKD3 (PNAS (2000) vol 97: P 6640 - 6645) como plantilla.
Figure imgf000006_0001
AGGGAACTTC AT C AC
GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3 ’
SEQ ID NO: 7)
5’-CGCTGCGCCAGCTCCATACGCGGCACCAGCGTTCGCAACCCACGTAGCAG
CATATGAATATCCTCCTTAG-3 ’
La PCR se realizó durante 30 ciclos, que consistieron en desnaturalización a 95 °C durante 30 s, hibridación a 55 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 1 min. Los productos de la PCR se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa al 1,0 % y se eluyó y purificó una banda de 1,1 kb. El fragmento de ADN recuperado se sometió a electroporación en la cepa de E. coli (K12) W3110, transformada antes con el vector pKD46 (PNAS (2000) vol. 97 P6640 - 6645). Para la electroporación, la cepa W3110, que se transformó con el pKD46, se cultivó a 30 °C en medio LB que contenía 200 gg/L de ampicilina y 5 mM de L-arabinosa hasta que la DO600 alcanzó 0,5, y se lavó 3 veces con glicerol al 10 % para su uso. La electroporación se realizó a 2500 V. La cepa recuperada se sembró en una placa de medio LB que contenía 30 gg/L de cloranfenicol, se cultivó a 37 °C durante 1 a 2 días y se seleccionó la cepa que mostraba resistencia al cloranfenicol. La cepa seleccionada se sometió a una PCR en las mismas condiciones descritas anteriormente mediante el uso de los cebadores de SEQ ID NOS: 8 y 9, y la eliminación del gen metB se confirmó al observar la presencia de una banda de 1,5 kb del gen en un gel de agarosa al 1,0 %.
SEQ ID NO: 8) 5'-TATTCGCCGCTCCATTCAGC-3'
SEQ ID NO: 9) 5'-TACCCCTTGTTTGCAGCCCG-3'
La cepa así confirmada se transformó con el vector pCP20 (PNAS (2000) vol 97 P 6640 - 6645) y se cultivó en medio LB que contenía 100 gg/L de ampicilina. La cepa final con una eliminación del gen metB de tamaño reducido, que se confirmó en un gel de agarosa al 1,0 %, se construyó mediante la realización de una PCR en las mismas condiciones y confirmó que el marcador de cloranfenicol se eliminó de la cepa. La cepa así construida, que requiere metionina, se denominó "CC03-0131".
3-2. Eliminación del gen thrB
Se intentó aumentar la síntesis de O-succinilhomoserina a partir de homoserina mediante la eliminación del gen thrB que codifica la homoserina quinasa. En particular, es esencial eliminar el gen thrB para usar una cepa productora de treonina, porque la actividad de utilización de la homoserina es muy alta. La eliminación del gen thrB en la cepa CC03-0131 construida anteriormente se realizó mediante el método de eliminación FRT-one-step-PCR. Se construyó un casete de eliminación de thrB por PCR mediante el uso de los cebadores de SEQ ID NOS: 10 y 11 y el vector pKD3 como una plantilla.
SEQ ID NO: 10)
5’-CATGGTTAAAGTTTATGCCCCGGCTTCCAGTGCCAATATGAGCGTCGGGT
GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3 ’
SEQ ID NO: 11)
5’-GGAGATACCGCTCGCTACCGCGCCGATTTCCGCGACCGCCTGCCGCGCCT
CATATGAATATCCTCCTTAG-3 ’
La PCR se realizó durante 30 ciclos, que consistieron en desnaturalización a 95 °C durante 30 s, hibridación a 55 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 1 min. Los productos de la PCR se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa al 1,0 % y se eluyó y purificó una banda de 1,1 kb. El fragmento de ADN recuperado se sometió a electroporación en la cepa CC03-0131, transformada antes con el vector pKD46. Para la electroporación, la cepa CC03-0131, que se transformó con el pKD46, se cultivó a 30 °C en un medio LB que contenía 200 qg/L de ampicilina y 5 mM de arabinosa hasta que la DO600 alcanzó 0,5, y se lavó 3 veces con glicerol al 10 % para su uso. La electroporación se realizó a 2500 V. La cepa recuperada se sembró en una placa de medio LB que contenía 30 qg/L de cloranfenicol, se cultivó a 37 °C durante 1 a 2 días y se seleccionó la cepa que mostraba resistencia al cloranfenicol.
La cepa seleccionada se sometió a una PCR en las mismas condiciones descritas anteriormente mediante el uso de los cebadores de SEQ ID NOS: 12 y 13, y se confirmó la eliminación del gen thrB al observar la presencia de una banda de 1,5 kb del gen en un gel de agarosa al 1,0 %.
SEQ ID NO: 12) 5'-ACT CGACGAT CT CTTTGCC-3'
SEQ ID NO: 13) 5'-ACGCCGAGAGGAT CTT CGCAG-3'
La cepa así confirmada se transformó con el vector pCP20 y se cultivó en medio LB que contenía 100 qg/L de ampicilina. La cepa final con una eliminación del gen thrB de tamaño reducido, que se confirmó en un gel de agarosa al 1,0 %, se construyó mediante la realización de una PCR en las mismas condiciones y confirmó que el marcador de cloranfenicol se eliminó de la cepa. La cepa así construida se denominó "CC03-0131-2".
3-3. Eliminación del gen metA
Para la caracterización de la especificidad de sustrato y la actividad del gen metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1 en una cepa de E. coli, se eliminó el gen metA original en el cromosoma en base a la cepa CC03-0131-2, que es una cepa de E. coli (K12) W3110 con eliminaciones de los genes metB y thrB. El gen metA se eliminó por el método de eliminación FRT-one-step-PCR. Se construyó un casete de eliminación de metA por PCR mediante el uso de los cebadores de SEQ ID NOS: 14 y 15 y el vector pKD3 como una plantilla.
SEQ ID NO: 14)
5’-TCAGCTGTTGCGCATCGATTCCCGTGAATCGCGCAACACGCCCGCAGAGC GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3 ’
SEQ ID NO: 15)
5’-CCGTCACAAAGGCAATGCGCTTATCTTTACTGGCAAACAGATATGCATCC CATATGAATATCCTCCTTAG-3 ’
La PCR se realizó durante 30 ciclos, que consistieron en desnaturalización a 95 °C durante 30 s, hibridación a 55 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 1 min. Los productos de la PCR se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa al 1,0 % y se eluyó y purificó una banda de 1,1 kb. El fragmento de ADN recuperado se sometió a electroporación en la cepa CC03-0131-2, transformada antes con el vector pKD46. Para la electroporación, la cepa CC03-0131-2, que se transformó con el vector pKD46, se cultivó a 30 °C en medio LB que contenía 200 qg/L de ampicilina y 5 mM de arabinosa hasta que la DO600 alcanzó 0,5, y se lavó 3 veces con glicerol al 10 % para su uso. La electroporación se realizó a 2500 V. La cepa recuperada se sembró en una placa de medio LB que contenía 30 qg/L de cloranfenicol, se cultivó a 37 °C durante 1 a 2 días y se seleccionó la cepa que mostraba resistencia al cloranfenicol.
La cepa seleccionada se sometió a una PCR en las mismas condiciones descritas anteriormente mediante el uso de los cebadores de SEQ ID NOS: 16 y 17, y se confirmó la eliminación del gen metA al observar la presencia de una banda de 1,5 kb del gen en un gel de agarosa al 1,0 %.
SEQ ID NO: 16) 5'-CTCATTAACGTTGGTTGTCA-3'
SEQ ID NO: 17) 5'-TATCTTGCTGCTGCTGAATG-3'
La cepa así confirmada se transformó con el vector pCP20 y se cultivó en medio LB que contenía 100 qg/L de ampicilina. La cepa final con una eliminación del gen metA de tamaño reducido, que se confirmó en un gel de agarosa al 1,0 %, se construyó mediante la realización de una PCR en las mismas condiciones y se confirmó que el marcador de cloranfenicol se eliminó de la cepa. La cepa así construida se denominó "CC03-0132".
3- 4. Construcción de una cepa introducida con un plásmido que expresa el gen metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1
Para la caracterización de la especificidad de sustrato y la actividad del gen metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1, se introdujo a la cepa CC03-0132, que es una cepa de E. coli (K12) W3110 con eliminaciones de los genes metB, thrB y metA, el plásmido pCL-PcysK-metX (sli) que se construyó en el Ejemplo 2.
La cepa CC03-0132 a la que se introdujo pCL-PcysK-metX (sli) se denominó "CC03-0736" y se depositó en el Centro Cultural de Microorganismos de Corea (KCCM) ubicado en 361-221, Hongje-1-dong, Seodaemun-gu, Seúl, Corea, que es una subsidiaria de la Federación Coreana de Colecciones de Cultivos (KFCC), reconocida como autoridad depositaria internacional en virtud del Tratado de Budapest, el 10 de junio de 2013 con el número de acceso KCCM11424P.
Se construyó una cepa con la introducción de un plásmido pCL-PcysK-metA, que se construyó de la misma manera que en el Ejemplo 2 excepto que se usó el gen metA de tipo salvaje en la cepa CC03-0132 como grupo de control. La cepa así construida se denominó "CC03-0132/pCL-PcysK-metA".
Adicionalmente, se construyó una cepa, mediante el uso de la cepa CJM002 productora de treonina, que se liberó del requerimiento de metionina (número de acceso: KCCM-10568), a través de una mutación artificial mediante el uso de NTG en base a la cepa TF4076 productora de L-treonina (número de acceso: KFCC-10718), que es una cepa que requiere metionina descrita en la patente coreana núm. 10-0905381, de la misma manera que en los Ejemplos 3-1 al 3-3, y la cepa así construida se denominó "CJM-BTA".
Los plásmidos, pCL-PcysK-metX(sli) y pCL-PcysK-metA, como se describió anteriormente, se introdujeron en base a la cepa CJM-b Ta , y la cepa así construida se denominó "CJM-BTA/pCL-PcysK- metX (sli)" y "CJM-BTAlpCL-PcysK-metA", respectivamente.
Ejemplo 4: Producción de O-succinilhomoserina mediante el uso de una cepa
4- 1. Experimento de cultivo en un matraz
Para la caracterización de la especificidad de sustrato y la actividad del gen metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1, introducido en la cepa construida en el Ejemplo 3, se realizó un cultivo en un matraz Erlenmeyer. La composición del medio de cultivo del matraz se muestra en la Tabla 1 más abajo.
Tabla 1
Figure imgf000008_0001
La cepa CC03-0132 y la cepa CJM-BTA se inocularon en placas con medio LB como grupos de control. La cepa CC03-0136 (transformada con un vector de expresión de metX), la cepa CC03-0132/pCL-PcysK-metA (transformada con el vector de expresión de metX preparado mediante el uso del mismo vector) y otras dos cepas, CJM-BTA/pCL-PcysK-metX (sli) y CJM-BTAlpCL-PcysK-metA (transformadas con el vector de expresión de metX o el vector de expresión de metA en base a la cepa CJM-BTA, respectivamente) se inocularon en placas con medio LB que contenían espectinomicina, se cultivaron a 33 °C durante la toda la noche. Luego, se inocularon colonias individuales en 2 mL de medio LB que contenía espectinomicina, se cultivaron a 33 °C durante 2 horas, se inocularon nuevamente en un matraz Erlenmeyer de 250 mL que contenía 25 mL de medio y se cultivaron a 33 °C a una velocidad de 200 rpm durante 48 horas hasta alcanzar una absorbancia de 0,07 a DO600 y la cantidad de producción de O-succinilhomoserina se comparó mediante un análisis en una HPLC. Los resultados se muestran en la Tabla 2 más abajo.
Tabla 2
Figure imgf000009_0001
Como resultado, se confirmó que el gen metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1, al igual que el gen metA de E. coli, produce O-succinilhomoserina mediante el uso de succinil-CoA como sustrato pero no produjo O-acetilhomoserina. Cuando se introdujo el gen metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1, no apareció ninguna inhibición de retroalimentación por la metionina añadida al medio incluso con la propia cepa tipo salvaje sin introducción de ninguna modificación.
Las modalidades descritas deben considerarse en todos los sentidos solo como ilustrativas y no restrictivas. El alcance de la presente invención, por lo tanto, se indica en las reivindicaciones adjuntas en lugar de por la descripción anterior.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir O-succinilhomoserina mediante el uso de un polipéptido aislado que tiene resistencia a la inhibición por retroalimentación por metionina y una actividad de homoserina succiniltransferasa para usar en la producción de O-succinilhomoserina, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el polinucleótido aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 1 tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o 3.
3. Un microorganismo de Escherichia sp productor de O-succinilhomoserina que expresa un polipéptido que tiene resistencia a la inhibición por retroalimentación por metionina y una actividad de homoserina succiniltransferasa, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
4. El microorganismo de Escherichia sp productor de O-succinilhomoserina de la reivindicación 3, en donde el microorganismo de Escherichia sp es Escherichia coli.
5. El microorganismo de Escherichia sp de la reivindicación 3, en donde el gen metB que codifica la cistationina gamma sintasa se elimina adicionalmente o se debilita la activación de la cistationina gamma sintasa.
6. El microorganismo de Escherichia sp de la reivindicación 3, en donde el gen thrB que codifica la homoserina quinasa o el gen metA que codifica la homoserina O-succiniltransferasa se eliminan adicionalmente o se debilita la activación de la homoserina quinasa o la homoserina O-succiniltransferasa.
7. Un método para producir O-succinilhomoserina, que comprende:
(a) cultivar el microorganismo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 en un medio de cultivo; y
(b) obtener la O-succinilhomoserina del microorganismo o del medio.
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