ES2599911T3 - Microorganismo que produce precursor de L-metionina y el procedimiento de producir precursor de L-metionina utilizando el microorganismo - Google Patents

Abstract

Un microorganismo derivado de Escherichia sp. para la producción de O-succinilhomoserina, en el que dicho microorganismo: (i) comprende una homoserina O-succiniltransferasa resistente a inhibición por retroalimentación de metionina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 14, 16, 18, 20 o 22; (ii) tiene una aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa que tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID No: 29; y (iii) tiene una actividad cistationina gamma sintasa que esta inactivada.

Description

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(ejemplo, ácido α-amino-β-hidroxivalérico, AHV), análogos de lisina (ejemplo, S-(2-aminoetil)-L-cisteína, AEC) y análogos de isoleucina (ejemplo, ácido α-aminobutílico). La TF4076 no es capaz de sintetizar metionina in vivo ya que es la cepa que tiene un requerimiento para metionina. Para utilizar esta cepa como una cepa que produce el precursor de metionina por libre de un requerimiento de metionina, los autores de la presente invención prepararon la cepa de E. coli CJM002 que produce L-treonina libre del requerimiento para metionina por mutación artificial utilizando NTG. La E. coli CJM002 se nombró como Escherichia coli MF001 y se depositó en el KCCM (Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos, Eulim Buld, Hongje-1-Dong, Seodaemun-Ku, Seúl, 361-221, Corea) el 9 de abril de 2004 (número de acceso: KCCM-10568). Los genes metB, thrB, metJ y metA de la E. coli CJM002 se suprimieron, luego se introdujo el gen metA resistente a la retroalimentación. La cepa que produce el precursor de Lmetionina resultado construida usando E. coli CJM002 se llamó CJM-A11. La cepa CJM-A11 se transformó con el vector de expresión de thrA y se llamó CJM-A11 (pthrA(M)-CL). La Escherichia coli CJM-A11, cepa que produce Osuccinilhomoserina, preparada por el procedimiento anterior se depositó el 23 de enero de 2008, con el n.º de acceso KCCM 10922P.

También se da a conocer que se utilizó FTR2533, que es la cepa que produce L-treonina dada a conocer en el documento PCT/KR2005/00344. FTR2533 se derivó de Escherichia coli TFR7624 que se derivó de Escherichia coli de número de acceso: KCCM10236. Y Escherichia coli de n.º de acceso KCCM 10236 que se derivó de Escherichia coli TF4076. Escherichia coli de n.º de acceso KCCM 10236 es, capaz de expresar niveles más altos de los genes ppc que catalizan la formación de oxaloacetato de PEP y las enzimas necesarias para la biosíntesis de treonina a partir de aspartato por ejemplo thrA: aspartocinasa 1-homoserina deshidrogenasa, thrB: homoserina cinasa, thrC: treonina sintasa, permitiendo de este modo un aumento de la producción de L-treonina. Y Escherichia coli FTR7624 (KCCM10538) tiene un gen tyrR inactivado que vuelve a la expresión del gen tyrB necesaria para la biosíntesis de Ltreonina. Y Escherichia coli FTR2533 (KCCM10541) es la cepa que produce L-treonina que tiene un gen gaIR inactivado, la cepa mutante de E. coli que produce L-treonina.

Se eliminaron los genes metB, thrB, metJ y metA de la E. coli FTR2533, después se introdujo el gen metA resistente a la retroalimentación. La cepa que produce el precursor de L-metionina resultado construida usando E. coli FTR2533 se llamó CJM-A11. La cepa CJM2-A11 se transformó con el vector de expresión thrA y se llamó CJM2-A11 (pthrA(M)-CL).

La Escherichia coli CJM2-A11 (pthrA(M)-CL) se depositó el 12 de febrero de 2008, con el n.º de acceso KCCM 10924P.

Se da a conocer adicionalmente un procedimiento para producir un precursor de L-metionina, comprendiendo el procedimiento: a) fermentación de los microorganismos anteriores; b) enriquecimiento del precursor de L-metionina en el medio o en los microorganismos; y c) aislamiento del precursor de L-metionina.

El cultivo de la cepa que produce el precursor de L-metionina preparada anteriormente puede realizarse por un medio y condiciones adecuados conocidos por aquellos expertos en la técnica. Se entiende bien por los expertos en la técnica que el procedimiento de cultivo se puede utilizar ajustando fácilmente, de acuerdo con la cepa seleccionada. Por ejemplo, el procedimiento de cultivo incluye, pero no está limitado a cultivo por lotes, cultivo continuo y cultivo semicontinuo. Una diversidad de procedimientos de cultivo se describen en la siguiente referencia: "Biochemical Engineering", de James M. Lee, Ediciones Prentice-Hall International, páginas 138-176.

El medio tiene que cumplir las condiciones de cultivo para una cepa específica. Una diversidad de medios de cultivo de microorganismos se describen en la siguiente referencia: "Manual of Methods for General Bacteriology" por la Sociedad Americana de Bacteriología, Washington DC, EE.UU., 1981. Esos medios incluyen diversas fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y elementos traza. La fuente de carbono se ejemplifica por hidrato de carbono tal como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón, celulosa; grasas tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino y aceite de coco, ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como glicerol y etanol y ácidos orgánicos tales como ácido acético. Uno de estos compuestos o una mezcla de los mismos se pueden utilizar como una fuente de carbono. La fuente de nitrógeno está ejemplificada por fuentes de nitrógeno orgánico tales como peptona, extracto de levadura, jugo de carne, extracto de malta, licor de maceración del maíz (LMM) y harina de habas y fuentes de nitrógeno inorgánico tales como urea, sulfato amónico, cloruro amónico, fosfato amónico, carbonato amónico y nitrato amónico. Uno de estos compuestos o una mezcla de los mismos se pueden utilizar como una fuente de nitrógeno. El medio en el presente documento puede incluir adicionalmente dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato dipotásico y las correspondientes sales que contienen sodio como fuente de fosfato. El medio también puede incluir una sal metálica tal como sulfato de magnesio o sulfato de hierro. Además, los aminoácidos, las vitaminas y los precursores adecuados pueden añadirse también. Los medios o los precursores se pueden añadir al cultivo por lotes o de tipo continuo.

El pH del cultivo se puede ajustar durante el cultivo añadiendo de la manera adecuada un compuesto tal como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoniaco, ácido fosfórico y ácido sulfúrico. La generación de burbujas de aire se puede inhibir durante el cultivo usando un agente antiespumante tal como éster poliglicólico de ácido graso. Para mantener la condición aeróbica del cultivo, se puede inyectar en el cultivo oxígeno o un gas que contenga oxígeno (por ejemplo, aire). La temperatura del cultivo es convencionalmente 20 -45 °C, preferentemente 25 -40 °C. El período de cultivo puede continuarse hasta que la producción de precursor de L-metionina alcanza un nivel

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de banda de 1,2 kpb. El fragmento de ADN recuperado se sometió a electroporación en la cepa W3-BT transformada con vector pKD46. La cepa recuperada se extendió sobre medio de placa LB que contiene cloranfenicol, seguido de cultivo a 37 °C durante la noche. Luego, se seleccionó una cepa que presenta resistencia.

Se realizó una PCR usando la cepa seleccionada como una plantilla con cebadores de SEQ. ID. NO: 7 y NO: 8 en las mismas condiciones que la anterior. La deleción de metJ se identificó confirmando el gen de 1,6 kb de tamaño en el gel de agarosa al 1,0 %. Luego la cepa se transformó con el vector pCP20 y se cultivó en medio LB. Se construyó la cepa con metJ anulado final en la que el tamaño del gen metJ se redujo a 600 kb en gel de agarosa al 1,0 % por PCR en las mismas condiciones y el marcador de cloranfenicol de cepa se confirmó que se eliminó. La cepa construida se llamó W3-BTJ.

<1-4> Deleción del gen metA

Para introducir un gen metA resistente a retroalimentación en el cromosoma, se eliminó el gen metA cromosómico auténtico en la cepa W3-BTJ. Para eliminar el gen metA, se realizó una deleción por PCR de una sola etapa de FRT.

Para construir casete de eliminación de metA, se realizó una PCR con cebadores de SEQ. ID. NO: 9 y NO: 10 de la siguiente manera; 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos, extensión a 72 °C durante 1 minuto.

El producto de PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,0%, seguido de purificación de ADN obtenido de banda de 1,2 kpb. El fragmento de ADN recuperado se sometió a electroporación en la cepa de E. coli W3-BTJ transformada con vector pKD46. La cepa recuperada se extendió sobre medio de placa LB que contiene cloranfenicol, seguido de cultivo a 37 °C durante la noche. Luego, se seleccionó una cepa que presenta resistencia.

Se realizó PCR usando la cepa seleccionada como una plantilla con cebadores de SEQ. ID. NO: 9 y NO: 10 en las mismas condiciones que la anterior. La deleción de gen metA se identificó confirmando el gen de tamaño 1,1 kb en gel de agarosa al 1,0 %. Luego la cepa se transformó con el vector pCP20 y se cultivó en medio LB. Se construyó la cepa con metA anulado final en la que el tamaño de gen metA se redujo a 100 kb en gel de agarosa al 1,0 % por PCR en las mismas condiciones. Se confirmó que el marcador de cloranfenicol se eliminó. La cepa construida se llamó W3-BTJA.

<1-5> Introducción de gen metA resistente a retroalimentación

Para aumentar la producción de O-succinilhomoserina que es precursor de L-metionina, se realizó una sobreexpresión de gen metA resistente a retroalimentación que codifica homoserina O-succiniltransferasa. El documento PCT/US2007/009146 da a conocer el procedimiento para preparar gen metA resistente a retroalimentación y la actividad de aquel.

La secuencia del gen metA 10 resistente a retroalimentación se representa en la SEQ. ID. NO: 13 y la secuencia de aminoácidos codificada por el gen está representado en la SEQ. ID. NO: 14. La secuencia del gen metA 11 gen está representada en la SEQ. ID. NO: 15 y la secuencia de aminoácidos codificada por el gen está representado en la SEQ. ID. NO: 16. La secuencia del gen metA 32 gen está representada en la SEQ. ID. NO: 17 y la secuencia de aminoácidos codificada por el gen está representada en la SEQ. ID. NO: 18. La secuencia del gen metA 37 gen está representada en la SEQ. ID. NO: 19 y la secuencia de aminoácidos codificada por el gen está representado en la SEQ. ID. NO: 20. La secuencia del gen metA 41 gen está representada en la SEQ. ID. NO: 21 y la secuencia de aminoácidos codificada por el gen está representado en la SEQ. ID. NO: 22 (documento PCT/US2007/009146).

PCR se realizó usando los genes anteriores como una plantilla con los cebadores de las SEQ. ID. NO: 11 y NO: 12 de la siguiente manera; 25 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos, extensión a 72 °C durante 2 minutos.

El producto de PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,0%, seguido de purificación de ADN obtenido de banda de 1,2 kpb. Después del aislamiento del fragmento de ADN, se escindió el vector pCL 1920 con la enzima de restricción SmaI y se ligó al fragmento de ADN aislado. La E. coli se transformó con el vector y las células portadoras de plásmidos se seleccionaron sobre agar LB que contenía 50 μg/l de espectinomicina. El vector construido se mostró en la Fig. 3.

El vector se sometió a electroporación en la cepa W3-BTJA y la capacidad de producción de la cepa se comprobó usando cultivo en matraz Erlenmeyer como se describe en el Ejemplo 2-1. La producción de O-succinilhomoserina de cepa modificada se mide, en base al 100 % de la producción de O-succinilhomoserina de la cepa de tipo silvestre. Como resultado, la producción de O-succinilhomoserina de todas las cepas modificadas se incrementó significativamente con respecto a la de cepas de tipo silvestre, en particular, metA 11, metA 10 y metA 32 muestran la producción más eficaz.

Tabla 1. Resistencia a retroalimentación de metA mutante en presencia de metionina 100 mM.

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