ES2808145T3

ES2808145T3 - Microorganismo del género Corynebacterium de producción de lisina y procedimiento de producción de lisina usando el mismo

Info

Publication number: ES2808145T3
Application number: ES15792954T
Authority: ES
Inventors: Seung Bin Lee; Hyung Joon Kim; Lan Hur; Jun Ok Moon
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2014-05-14
Filing date: 2015-04-24
Publication date: 2021-02-25
Anticipated expiration: 2035-04-24
Also published as: CN107109356A; EP3144383A1; RU2016144211A; MY171575A; HUE050504T2; JP6526058B2; EP3144383A4; EP3144383B1; RU2016144211A3; DK3144383T3; JP2017515483A; US20170145452A1; WO2015174655A1; BR112016026484B1; PL3144383T3; BR112016026484A2; JP2019115341A; US20200347420A1; KR101539370B1; RU2668830C2

Abstract

Un microorganismo del género Corynebacterium productor de L-lisina, en el que la vía de biosíntesis de L-lisina está potenciada y la oxalacetato-descarboxilasa que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NÚM.: 1 está inactivada, en el que el microorganismo tiene una productividad de L-lisina potenciada en comparación con un microorganismo no modificado, y en el que el microorganismo comprende el gen aspB, el gen lysC, el gen asd, el gen dapA, el gen dapB y el gen lysA.

Description

DESCRIPCIÓN

Microorganismo del género Corynebacterium de producción de lisina y procedimiento de producción de lisina usando el mismo

Campo técnico

La presente solicitud se refiere a un microorganismo del género Corynebacterium productor de L-lisina y a un procedimiento de producción de L-lisina usando el mismo.

Técnica anterior

La L-lisina es biosintetizada a partir de un precursor oxalacetato por una vía biosintética de lisina, y el oxalacetato es degradado a piruvato y dióxido de carbono por oxalacetato-decarboxilasa (odx).

Anteriormente, Simon Klaffl and Bernhard J. Eikmanns simplemente demostraron que un gen cg1458 codifica la oxalacetato-decarboxilasa confirmando que la sobreexpresión del gen intrínseco cg1458 en Corynebacterium glutamicum aumenta la actividad de la oxalacetato-decarboxilasa y también disminuye la producción de L-lisina, y la actividad de la oxalacetato-decarboxilasa se ve atenuada por la inactivación del gen, pero no demostraron cambios en la producción de L-lisina por la inactivación del cg1458 (Klaffl S, Eikmanns BJ, et al., J. Bacteriol., May 2010, 192(10), p.2604-12). Sin embargo, los inventores de la presente predijeron que cuando es inhibida la actividad de oxalacetato-decarboxilasa intrínseco en una cepa de Corynebacterium productora de L-lisina, el suministro de oxalacetato para la vía biosintética de L-lisina aumenta sin que sea consumido oxalacetato en otras vías, e inactivaron el gen de la oxalacetato-decarboxilasa en diferentes clases de cepas productoras de L-lisina. Como resultado, los inventores de la presente descubrieron que la inactivación del gen de oxalacetato-descarboxilasa da lugar a la mejora de la capacidad de producción de L-lisina de la cepa, completando así la presente solicitud.

Descripción detallada de la invención

Problema técnico

La invención es definida en las reivindicaciones adjuntas. Por consiguiente, un objeto de la presente solicitud es proporcionar un microorganismo del género Corynebacterium productor de L-lisina.

Otro objeto de la presente solicitud es proporcionar un procedimiento de producción de L-lisina usando el microorganismo del género Corynebacterium.

Solución técnica

Para lograr los objetos mencionados con anterioridad, un aspecto de la presente solicitud proporciona un microorganismo del género Corynebacterium productor de L-lisina, en el que una actividad de oxalocetato-descarboxilasa es inactivada. Además, otro aspecto de la presente solicitud proporciona un procedimiento de producción de L-lisina mediante el cultivo del microorganismo del género Corynebacterium.

Efectos ventajosos de la invención

La presente solicitud proporciona un microorganismo recombinante del género Corynebacterium con producción potenciada de L-lisina por la inactivación de un gen de oxalacetato-decarboxilasa en una cepa de Corynebacterium productora de L-lisina. El microorganismo recombinante del género Corynebacterium es capaz de producir L-lisina con un alto rendimiento, por lo que tiene aplicaciones de utilidad industrial.

Descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra un vector pDZ-Aodx para eliminar un gen odx en el cromosoma de Corynebacterium.

Modo de la invención

En adelante en la presente memoria, la presente solicitud es descrita en detalle.

Un aspecto de la presente solicitud proporciona un microorganismo del género Corynebacterium con producción potenciada de L-lisina por la inactivación de la actividad de oxalacetato-descarboxilasa, en el que oxalacetatodescarboxilasa tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NÚM.: 1, en el que el microorganismo tiene una productividad de L-lisina potenciada en comparación con un microorganismo no modificado, y en el que el microorganismo comprende el gen aspB, el gen lysC, el gen asd, el gen dapA, el gen dapB y el gen lysA.

Oxalacetato-descarboxilasa (odx) es una enzima que cataliza la degradación del oxalacetato en piruvato y dióxido de carbono, y puede ser usada una enzima derivada de cualquier microorganismo, a condición de que la enzima tenga la actividad mencionada. Específicamente, puede ser usada una enzima derivada de un microorganismo Corniforme y, más específicamente, una enzima derivada de Corynebacterium glutamicum, pero sin limitación a esta.

La oxalacetato-descarboxilasa de la presente solicitud tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NÚM.: 1, y puede ser codificada por el gen odx que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NÚM.: 2. También puede ser incluida en la presente solicitud cualquier variante de la secuencia de nucleótidos anterior que codifica la misma secuencia de aminoácidos, que resulta de la degeneración del código genético.

El término "homología", como se usa en la presente memoria, se refiere a un grado de coincidencia con una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos determinada, y la homología puede ser expresada como un porcentaje. Una homología de secuencia que tiene una actividad idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos o a la secuencia de nucleótidos dada es expresa como "% de homología". La homología de secuencia puede ser determinada, por ejemplo, mediante el algoritmo BLAST [véase Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] o FASTA de Pearson [véase Methods Enzymol., 183 , 63 (1990)]. En base a este algoritmo, ha sido desarrollado un programa denominado BLASTN o BLASTX [véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov]. La homología de secuencia también puede ser identificada por comparación de las secuencias en un experimento de hibridación Southern bajo condiciones rigurosas como las definidas, y la definición de condiciones de hibridación adecuadas están dentro de la habilidad de la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, infra ), y pueden ser determinadas por un procedimiento bien conocido por los expertos en la técnica.

El término "inactivación", como se usa en la presente memoria, significa que la actividad es atenuada en forma adicional o eliminada, en comparación con la actividad de una proteína producida en estado natural o en estado no modificado de un microorganismo original, y la inactivación puede ser realizada mediante cualquier procedimiento de inactivación conocido en la técnica. En la presente solicitud, la inactivación de oxalacetato-decarboxilasa significa que el gen odx intrínseco es expresado a un nivel bajo o no es expresado, en comparación con el de una cepa madre o una cepa no modificada, o la actividad es eliminada o disminuida, aunque el gen sea expresado.

Específicamente, la actividad intrínseca de oxalacetato-descarboxilasa puede ser inactivada por la introducción de un vector recombinante que incluya una parte del gen que codifica oxalacetato-descarboxilasa en un microorganismo para eliminar o mutar el gen intrínseco de oxalacetato-descarboxilasa, la expresión de la proteína puede ser atenuada mediante la modificación de una secuencia de nucleótidos de una región promotora o una región 5'-UTR del gen, o la actividad de la proteína puede ser atenuada introduciendo una mutación en una región ORF del gen correspondiente. Además, la inserción del gen en el cromosoma puede ser realizada por cualquier procedimiento conocido en la técnica.

El término "actividad intrínseca", como se usa en la presente memoria, se refiere a la actividad de proteína de un microorganismo original en estado natural o no modificado.

Más específicamente, la inactivación puede ser causada por una alteración genética específica del sitio, pero no está limitada a esto.

El término "vector recombinante", como se usa en la presente memoria, se refiere a una construcción de ADN que incluye una secuencia de polinucleótidos de un polinucleótido que codifica una proteína diana, que está vinculada operativamente a una secuencia reguladora adecuada para que la proteína diana pueda ser expresada en un huésped adecuado. La secuencia reguladora puede incluir un promotor capaz de iniciar la transcripción, cualquier secuencia operadora para regular la transcripción, una secuencia que codifique un sitio adecuado de unión al ribosoma del ARNm y una secuencia que regule la terminación de la transcripción y la traducción. El vector, tras ser transformado en una célula huésped adecuada, puede replicarse o funcionar independientemente del genoma huésped, o puede ser integrado en el propio genoma. El vector usado en la presente solicitud no está particularmente limitado, a condición de que el vector sea replicable en el huésped, y pueda ser usado cualquier vector conocido en la técnica.

El término "transformación", como se usa en la presente memoria, significa que un gen es introducido en una célula huésped, permitiendo así la expresión del gen en la célula huésped. El gen transformado puede estar localizado dentro o fuera del cromosoma de la célula huésped, a condición de que pueda ser expresado en la célula huésped. El gen puede ser introducido en cualquier forma, a condición de que pueda ser introducido en la célula huésped y expresado en esta.

Como una célula madre en la que es introducido el vector recombinante, puede ser usado cualquier microorganismo del género Corynebacterium, a condición de que el microorganismo sea capaz de producir L-lisina. Específicamente, puede ser usada Corynebacterium glutamicum.

En una realización específica de la presente solicitud, es construido un vector recombinante por la inserción de una parte del gen odx en un vector pDZ (Patente de Corea Núm. 0924065) que no es replicable en Corynebacterium glutamicum, y es permitida la transformación del vector recombinante en un microorganismo y la recombinación homóloga del vector recombinante en el cromosoma para la preparación del microorganismo del género Corynebacterium con una producción potenciada de L-lisina, en el que oxalacetato-carboxilasa es inactivada, pero la presente solicitud no se limita a esto.

Todas las cepas de Corynebacterium glutamicum preparadas en una realización de la presente solicitud mostraron una producción potenciada de L-lisina, en comparación con la cepa madre, lo que indica que son capaces de producir L-lisina con un alto rendimiento por inactivación del gen odx.

Otro aspecto de la presente solicitud proporciona un procedimiento de producción de L-lisina mediante el cultivo del microorganismo del género Corynebacterium. Más detalladamente, es proporcionado un procedimiento de producción de L-lisina, incluyendo el procedimiento la producción de L-lisina en un cultivo o células del microorganismo mediante el cultivo del microorganismo de la presente solicitud; y la recuperación de L-lisina a partir del cultivo o células del microorganismo, en el que el microorganismo es del género Corynebacterium en el que la vía de biosíntesis de L-lisina está potenciada y oxalocetato-descarboxilasa que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NÚM.:1 es inactivada, y en el que el microorganismo es un microorganismo definido en las reivindicaciones.

En el procedimiento de la presente solicitud, el cultivo del microorganismo del género Corynebacterium puede ser realizado usando cualquier condición y procedimiento de cultivo conocido en la técnica, pero no está limitado al siguiente ejemplo.

Un medio que puede ser usado para el cultivo del microorganismo del género Corynebacterium puede ser ejemplificado por los medios desvelados en Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).

Las fuentes de carbono a ser usadas en el medio pueden incluir sacáridos y carbohidratos tal como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, el almidón y celulosa, aceites y lípidos tal como aceite de soja, aceite de semilla de girasol, aceite de ricino y aceite de coco, ácidos grasos tal como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tal como glicerol y etanol, y ácidos orgánicos tal como ácido acético. Estos materiales pueden ser usados por separado o en una mezcla.

Las fuentes de nitrógeno a ser usadas pueden incluir peptona, extracto de levadura, caldo de carne, extracto de malta, licor de maíz, harina de soja y urea, o los compuestos inorgánicos, por ejemplo, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Estas fuentes de nitrógeno también pueden ser usadas por separado o en una mezcla.

Las fuentes de fósforo a ser usadas pueden ser hidrógeno fosfato dipotásico, dihidrógeno fosfato potásico, o sales que contienen sodio correspondientes, y el medio de cultivo puede incluir sales metálicas tal como sulfato de magnesio o sulfato de hierro requerido para el crecimiento. Además de estos materiales, pueden ser usados materiales de crecimiento esenciales tal como aminoácidos y vitaminas. Además, pueden ser añadidos precursores adecuados al medio de cultivo. Estos materiales pueden ser añadidos al cultivo durante el cultivo por un procedimiento adecuado en un lote o en modo continuo.

Durante el cultivo del microorganismo, el pH del cultivo puede ser ajustado con un compuesto básico tal como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amoníaco, o un compuesto ácido tal como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. La generación de espuma puede ser restringida usando un agente antiespumante tal como éster de poliglicol de ácidos grasos. Para mantener las condiciones aeróbicas, puede ser introducido en el cultivo oxígeno o un gas que contenga oxígeno (por ejemplo, aire). La temperatura del cultivo puede estar generalmente entre 20°C y 45°C, y específicamente, entre 25°C y 40°C. El cultivo puede continuar hasta que sea producida una cantidad deseada de L-lisina. Específicamente, el tiempo de cultivo puede ser de 10 a 160 horas.

En el procedimiento de la presente solicitud, el cultivo puede ser realizado de manera continua o por lotes, tal como un proceso por lotes, un proceso de alimentación por lotes y un proceso de alimentación por lotes repetido. El procedimiento de cultivo es bien conocido en la técnica, y puede ser usado cualquier procedimiento.

En adelante en la presente memoria, la presente solicitud será descrita con más detalle con referencia a los ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos tienen sólo fines ilustrativos, y el alcance de la presente solicitud no pretende ser limitado por estos ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: construcción de un vector recombinante para inactivación del gen odx derivado de Corynebacterium

Con el fin de inactivar un gen odx (SEQ ID NÚM.: 2) que codifica oxalacetato-decarboxilasa de Corynebacterium glutamicum que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NÚM.: 1 por la alteración de un gen específico del sitio, fue construido un vector plásmido por el siguiente procedimiento. En primer lugar, en base a NIH Genbank (USA), fue obtenida una secuencia nucleotídica del gen odx, y en base a esta secuencia fueron sintetizados cebadores para la preparación de fragmentos inactivados del gen odx.

Fue realizada PCR [Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories] usando el cromosoma de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 de tipo silvestre como plantilla e iniciadores de la SEQ ID NÚM.: 3 y SEQ ID NÚM.: 4, SEQ ID NÚM.: 5 y SEQ ID NÚM.: 6. Después de la desnaturalización a 95°C durante 5 minutos, fueron repetidos 30 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, recocido a 55°C durante 30 segundos, y polimerización a 72°C durante 30 segundos, y luego fue realizada la polimerización a 72°C durante 7 minutos. Como un resultado, fueron obtenidas la SEQ ID NÚM.: 7 de 536 pb y la SEQ ID Nú M.: 8 de 534 pb incluyendo el extremo 5' y el extremo 3' del gen odx, respectivamente.

SEQ ID NÚM.: 3: 5'-TCTAGAACGATGAAATCGCCGCGGGT-3'

SEQ ID NÚM.: 4: 5'-GGGTTGCCCAGCTTGCCGATCACGGGGGTGAGGTTAGCT-3'

SEQ ID NÚM.: 5: 5'-AGCTAACCTCCCCCGTGATCGGCAAGCTGGGCAACCC-3'

SEQ ID NÚM.: 6: 5'-TCTAGAGGTTGCTGCGGATTCTGATT-3'

Fue realizado PCR usando la SEQ ID NÚM.: 7 y la SEQ ID NÚM.: 8 amplificados como una plantilla y la SEQ ID NÚM.: 3 y la SEQ ID NÚM.: 6. Después de la desnaturalización a 95°C durante 5 minutos, fueron repetidos 30 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, recocido a 55°C durante 30 segundos y polimerización a 72°C durante 60 segundos, y luego fue realizada la polimerización a 72°C durante 7 minutos. Como un resultado, fue amplificada la SEQ ID NÚM.: 9 (en adelante en la presente memoria, referida Aodx) de 1030 pb, en la que el extremo 5' y el extremo 3' del gen odx estaban unidos entre sí.

Un vector pDZ (Patente de Corea Núm. 0924065) no replicable en Corynebacterium glutamicum y el fragmento de ADN amplificado Aodx fueron tratados con una enzima de restricción XbaI, respectivamente, y luego, ligados entre sí usando ADN ligasa. Fue realizada clonación para obtener un plásmido. Este plásmido fue designado pDZ-Aodx (FIG. 1).

Ejemplo 2: inactivación de odx en Corynebacterium productora de L-lisina y análisis de la producción de L-lisina pDZ-Aodx preparado en el Ejemplo 1 fue transformado en cepas productoras de L-lisina, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P y KCCM11347P por un procedimiento de pulso eléctrico (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545), respectivamente, y las cepas transformadas fueron obtenidas en un medio de selección que contenía 25 mg/L de kanamicina. Las cepas que tenían el gen odx inactivado fueron obtenidas mediante el fragmento de ADN Aodx insertado en el genoma por recombinación secundaria (cross-over), y las cepas fueron designadas KCCM11016P/Aodx y KCCM11347P/Aodx, respectivamente.

Con el fin de examinar si la inactivación del gen odx realmente influye en el aumento de la producción de lisina, las cepas inactivadas por odx, KCCM11016P/Aodx y KCCM11347P/Aodx fueron cultivadas por el siguiente procedimiento y su producción fue examinada.

Cada una de las cepas fue inoculada en un matraz de 250 ml con deflectores en las esquinas que contenía 25 ml del siguiente medio de cultivo, seguido de un cultivo a 37°C durante 20 horas bajo agitación a 200 rpm. Fue inoculado 1 ml del cultivo de semillas en un matraz de 250 ml con deflectores en las esquinas que contenía 24 ml del siguiente medio de producción, seguido de un cultivo a 30°C durante 72 horas con agitación a 200 rpm.

* Composición del medio de siembra (pH 7,0):

20 g de glucosa, 10 g de peptona, 10 g de extracto de levadura, 5 g de urea, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4-7H2O, 100 |jg de biotina, 1000 |jg de HCl de tiamina (en 1 litro de agua de proceso).

* Composición del medio de producción (pH 7,0):

80 g de glucosa, 20 g de melaza o melaza pretratada (como azúcar reductor), 5 g de licor de maíz, 40 g de (NH4)2SO4, 4 g de urea, 1 g de KH2PO4, 2,5 g de NaCl, 1 g de MgSO4-7H2O, 10 mg de FeSO4-7H2O, 10 mg de MnSO4-5H2O, 100 jg de biotina, 200 jg de tiamina HCl, 40 g de CaCO3, si es necesario, 0,4 g de L-leucina, si es necesario, 0,1 g de L-treonina, si es necesario, 0,1 g de L-metionina (en 1 litro de agua de proceso).

Una vez completo el cultivo, la producción de L-lisina fue medida por HPLC. Como un resultado, el contenido de L-lisina en el cultivo de cada cepa era como en la siguiente Tabla 1.

Tabla 1

Como es mostrado en la Tabla 1, las cepas inactivadas por odx, KCCM11016P/Aodx y KCCM11347P/Aodx demostraron un aumento de aproximadamente 4,2% en la producción de L-lisina, en comparación con sus cepas madre, KCCM11016P y KCCM11347P, respectivamente.

Entre estas, la cepa KCCM11016P/Aodx fue designada como CA01-2276, y depositada en la autoridad internacional de depósito, el Korean Culture Center of Microorganisms, que es la Subsidiary Culture Collection of the Korean Federation of Culture Collections ubicada en 361-221, Hongje-1-Dong, Seodaemungu-Gu, Seoul, Korea, el 22 de noviembre de 2013 bajo el número de adhesión KCCM11478P.

Ejemplo 3: inactivación de odx en Corynebacterium con vía biosintética de L-lisina, productora de L-lisina, y análisis de la producción de lisina

pDZ-Aodx preparado en el Ejemplo 1 fue transformado en una cepa de Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Patente de Corea Núm. 10-0924065) productora de L-lisina potenciada por vía biosintética, de la misma manera que en el Ejemplo 2 para preparar una cepa transformada, que fue designada KCCM10770P/Aodx.

A fin de examinar si la inactivación del gen odx influye realmente en el aumento de la producción de L-lisina, la cepa inactivada por odx, KCCM10770P/Aodx fue cultivada de la misma manera que en el Ejemplo 2, y su producción fue examinada. El contenido de L-lisina en el cultivo de cada cepa era como en la siguiente Tabla 2.

Tabla 2

Como es mostrado en la Tabla 2, la cepa activada por odx, KCCM10770P/Aodx mostró un aumento de 6,4% en la producción de L-lisina, en comparación con la cepa madre, KCCM10770P.

Ejemplo 4: inactivación de odx en Corynebacterium productora de L-lisina de origen silvestre y análisis de producción de lisina

pDZ-Aodx preparado en el Ejemplo 1 fue transformado en una cepa de Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40, pyc (P458S), hom (V59A), lysC (T311I)) productora de L-lisina de origen silvestre, de la misma manera que en el Ejemplo 2 para preparar una cepa transformada, que fue designada CJ3P/Aodx.

A fin de examinar si la inactivación del gen odx influye realmente en el aumento de la producción de lisina, la cepa inactivada por odx, CJ3P/Aodx fue cultivada de la misma manera que en el ejemplo 2, y su producción fue examinada. El contenido de L-lisina en el cultivo de cada cepa era como en la siguiente Tabla 3.

Tabla 3

Como es mostrado en la Tabla 3, cuando fue inactivado odx en la cepa madre CJ3P, que es la cepa productora de L-lisina de origen silvestre, también fue observado un aumento de aproximadamente 3,8% en la producción de lisina.

En consecuencia, los solicitantes de la presente demostraron en los Ejemplos 2 a 4 que el aumento de la producción de lisina era observada comúnmente en diferentes clases de microorganismos del género Corynebacterium mediante la inactivación del gen odx, lo que indica que la inactivación del gen odx es un rasgo eficaz en la producción de L-lisina.

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> Un microorganismo del género Corynebacterium con productividad potenciada de lisina y procedimiento de producción de lisina usando el mismo

<130> PX048854PCT

<150> KR 14/057,966

<151> 2014-05-14

<160>9

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 268

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 1

Met Arg Phe Gly Arg lie Ala Thr Pro Asp Gly Met Cys Phe Cys Ser

1 5 10 15

lie Glu Gly Glu Gly Asp Asp Val Ala Asn Leu Thr Ala Arg Glu lie

20 25 30

Glu Gly Thr Pro Phe Thr Glu Pro Lys Phe Thr Gly Arg Glu Trp Pro

35 40 45

Leu Lys Asp Val Arg Leu Leu Ala Pro Met Leu Pro Ser Lys Val Val

50 55 60

Ala lie Gly Arg Asn Tyr Ala Asp His Val Ala Glu Val Phe Lys Lys

65 70 75 80

Ser Ala Glu Ser Leu Pro Pro Thr Leu Phe Leu Lys Pro Pro Thr Ala

85 90 95

Val Thr Gly Pro Glu Ser Pro lie Arg lie Pro Ser Phe Ala Thr Lys

100 105 110

Val Glu Phe Glu Gly Glu Leu Ala Val Val lie Gly Lys Pro Cys Lys

115 120 125

Asn Val Lys Ala Asp Asp Trp Lys Ser Val Val Leu Gly Phe Thr lie

130 135 140

lie Asn Asp Val Ser Ser Arg Asp Leu Gln Phe Ala Asp Gly Gln Trp

145 150 155 160

Ala Arg Ala Lys Gly lie Asp Thr Phe Gly Pro lie Gly Pro Trp lie

165 170 175

Glu Thr Asp lie Asn Ser lie Asp Leu Asp Asn Leu Pro lie Lys Ala

180 185 190

Arg Leu Thr His Asp Gly Glu Thr Gln Leu Lys Gln Asp Ser Asn Ser

195 200 205

Asn Gln Met lie Met Lys Met Gly Glu lie lie Glu Phe lie Thr Ala

210 215 220

Ser Met Thr Leu Leu Pro Gly Asp Val lie Ala Thr Gly Ser Pro Ala

225 230 235 240

Gly Thr Glu Ala Met Val Asp Gly Asp Tyr lie Glu lie Glu lie Pro

245 250 255

Gly lie Gly Lys Leu Gly Asn Pro Val Val Asp Ala

260 265

<210>2

<211> 807

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<400>2

atgcgttttg gacgaattgc caccccagat ggaatgtgtt tttgctcaat tgaaggcgaa 60

ggcgatgatg tagctaacct caccgcccgt gagatcgagg gtaccccctt cactgaacca 120

aagttcaccg gtcgcgaatg gccacttaaa gatgtacgcc tgctggcacc aatgctgcca 180

agcaaagtcg tcgcgattgg ccgtaactac gccgatcacg ttgctgaggt gtttaagaag 240

tccgcagaat cactgccacc aaccctgttc ctgaagccac caacagctgt caccggacca 300

gagtccccaa tccgaatccc ttcctttgcc accaaggtgg aattcgaagg tgagctcgca 360

gtagttatcg gcaagccctg caagaacgtc aaggctgatg actggaagtc tgtcgttttg 420

ggcttcacca tcatcaacga cgtctcctcc cgtgacctcc agttcgctga cggccagtgg 480

gcacgcgcta agggcattga caccttcggc cccatcggac catggattga aactgacatc 540

aactccatcg acttggacaa cctgcccatc aaggcacgcc tcacccacga cggcgaaacc 600

caattgaagc aggactccaa ctccaaccag atgatcatga agatgggcga aattatcgag 660

ttcatcaccg cctccatgac cctgctccca ggcgacgtta ttgcaaccgg ttctccagca 720

ggcaccgaag caatggttga cggcgactac atcgaaatcg aaattccagg catcggcaag 780

ctgggcaacc cagttgtgga cgcctaa 807 <210>3

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 3

tctagaacga tgaaatcgcc gcgggt 26

<210>4

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400>4

gggttgccca gcttgccgat cacgggcggt gaggttagct 40

<210>5

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 5

agctaacctc accgcccgtg atcggcaagc tgggcaaccc 40

<210> 6

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 6

tctagaggtt gctgcggatt ctgatt 26

<210>7

<211> 536

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> odx terminal 5'

<400> 7

tctagaacga tgaaatcgcc gcgggtatcg acatcaaaga ggcgcttggc caactactgc 60

aggcgctcca gggacgcgcc atgctggcgc atttttcacc catcgagcgc gattttattt 120

cggccgcatg cctcaagcat ttcggaacgc ttctcgacgt ccccctcgtg gatacttttg 180

ccatggaacg ccgccacatg gagaggatgt ccacctaccc acgtggcgaa gacctccggc 240

ttgcacgcat tcgacaacga tatggtcttc ccaattactc caatcaccag gcattaaccg 300

acgctttggc gtgcgccgag gtgtatttgg tgcagatcac gcaccttcgg gcgaacaccc 360

tcaaagatat ttgggaatag gggtcatcgt gcaggccccc acacccaacg cgtaacataa 420

cggtcatgcg ttttggacga attgccaccc cagatggaat gtgtttttgc tcaattgaag 480

gcgaaggcga tgatgtagct aacctcaccg cccgtgatcg gcaagctggg caaccc 536 <210>8

<211> 534

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> odx terminal 3'

<400> 8

agctaacctc accgcccgtg atcggcaagc tgggcaaccc agttgtggac gcctaaaatg 60

gatcaccacc atcacgatca tggggagaag cgtccgtacg accaggtcac cccagaatcc 120

atggagaatc aatacaccac cacggaacaa gtctggagcg gcaaccccaa ccaagcactc 180

atcgcctact tgggtgaaga gccagctgaa ggcaccgcac tagacattgg ctgtggcgaa 240

ggcgctgacc tcgtgtggct gtcctccaag ggatacgtca ccaccggcat cgacttcgca 300

ccaactgcag tgaagcgcgc gaaacaaaac gccccatcag ccgaagtcct cttggtatca 360

ttcaccgaat tcgccatcga atccggtcgc caattcgacc tcgtcagctg ctcgtacggc 420

caaatcccag ccaacgacac ctccgtcgcg caactggaaa acctcgtcgc acccggcgga 480

accctcctgt tcacccacca cgactttgaa tcagaatccg cagcaacctc taga 534 <210>9

<211> 1030

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> odx

<400> 9

tctagaacga tgaaatcgcc gcgggtatcg acatcaaaga ggcgcttggc caactactgc 60 aggcgctcca gggacgcgcc atgctggcgc atttttcacc catcgagcgc gattttattt 120 cggccgcatg cctcaagcat ttcggaacgc ttctcgacgt ccccctcgtg gatacttttg 180 ccatggaacg ccgccacatg gagaggatgt ccacctaccc acgtggcgaa gacctccggc 240 ttgcacgcat tcgacaacga tatggtcttc ccaattactc caatcaccag gcattaaccg 300 acgctttggc gtgcgccgag gtgtatttgg tgcagatcac gcaccttcgg gcgaacaccc 360 tcaaagatat ttgggaatag gggtcatcgt gcaggccccc acacccaacg cgtaacataa 420 cggtcatgcg ttttggacga attgccaccc cagatggaat gtgtttttgc tcaattgaag 480 gcgaaggcga tgatgtagct aacctcaccg cccgtgatcg gcaagctggg caacccagtt 540 gtggacgcct aaaatggatc accaccatca cgatcatggg gagaagcgtc cgtacgacca 600 ggtcacccca gaatccatgg agaatcaata caccaccacg gaacaagtct ggagcggcaa 660 ccccaaccaa gcactcatcg cctacttggg tgaagagcca gctgaaggca ccgcactaga 720 cattggctgt ggcgaaggcg ctgacctcgt gtggctgtcc tccaagggat acgtcaccac 780 cggcatcgac ttcgcaccaa ctgcagtgaa gcgcgcgaaa caaaacgccc catcagccga 840 agtcctcttg gtatcattca ccgaattcgc catcgaatcc ggtcgccaat tcgacctcgt 900 cagctgctcg tacggccaaa tcccagccaa cgacacctcc gtcgcgcaac tggaaaacct 960 cgtcgcaccc ggcggaaccc tcctgttcac ccaccacgac tttgaatcag aatccgcagc 1020 aacctctaga 1030

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un microorganismo del género Corynebacterium productor de L-lisina, en el que la vía de biosíntesis de L-lisina está potenciada y la oxalacetato-descarboxilasa que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NÚM.: 1 está inactivada, en el que el microorganismo tiene una productividad de L-lisina potenciada en comparación con un microorganismo no modificado, y en el que el microorganismo comprende el gen aspB, el gen lysC, el gen asd, el gen dapA, el gen dapB y el gen lysA.

2. El microorganismo del género Corynebacterium de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el microorganismo del género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.

3. El microorganismo del género Corynebacterium de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el microorganismo comprende una mutación por eliminación o interrupción del gen que codifica la oxalacetato-carboxilasa.

4. Un procedimiento de producción de un microorganismo del género Corynebacterium con una productividad de L-lisina potenciada en comparación con un microorganismo no modificado, comprendiendo el procedimiento proporcionar un microorganismo del género Corynebacterium en el que la vía de biosíntesis de L-lisina está potenciada y oxalacetato-decarboxilasa que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NÚM.:1 es inactivada, en el que el microorganismo del género Corynebacterium en el que la vía de biosíntesis de L-lisina está potenciada comprende el gen aspB, el gen lysC, el gen asd, el gen dapA, el gen dapB y el gen lysA.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el microorganismo del género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en el que el procedimiento comprende inactivar la oxalacetatodescarboxilasa que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NÚM.:1, y la inactivación de la oxalacetato-descarboxilasa comprende una mutación por eliminación o interrupción del gen que codifica la oxalacetatodescarboxilasa.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en el que el microorganismo no modificado es un microorganismo de la cepa KCCM10770P.

8. Un microorganismo del género Corynebacterium obtenible por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 4-7.

9. Un procedimiento de producción de L-lisina, comprendiendo el procedimiento:

cultivar un microorganismo para obtener un cultivo o células del microorganismo; y

recuperar L-lisina del cultivo o de las células del microorganismo,

en el que el microorganismo es del género Corynebacterium en el que la vía de biosíntesis de L-lisina está potenciada y

la oxalacetato-decarboxilasa que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NÚM.:1 está inactivada,

en el que el microorganismo es el microorganismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 8.