ES2761590T3

ES2761590T3 - Microorganismo de Corynebacterium sp. que tiene una productividad mejorada de L-arginina y procedimiento de producción de L-arginina mediante el uso del mismo

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Publication number: ES2761590T3
Application number: ES14788335T
Authority: ES
Inventors: Hyun Ae Bae; Min Gyeong Kang; Han Hyoung Lee; Hye Won Kim; Sung Gun Lee
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2013-04-23
Filing date: 2014-04-23
Publication date: 2020-05-20
Anticipated expiration: 2034-04-23
Also published as: TWI519645B; KR101500073B1; CN105143439A; CN105143439B; BR112015026761A2; EP2990475B1; PL2990475T3; WO2014175663A1; TW201506159A; EP2990475A4; JP2016516435A; JP2017169595A; JP6218929B2; US20160145661A1; HUE046457T2; KR20140126495A; US10266858B2; EP2990475A1; JP6463806B2

Abstract

Un microorganismo del género Corynebacterium con capacidad mejorada para producir L-arginina, que tiene una actividad mejorada de la aspartato amoníaco-liasa y la aspartato aminotransferasa en comparación con la actividad endógena de un microorganismo del género Corynebacterium con una capacidad para producir L-arginina, en el que dicha actividad mejorada se obtiene mediante un procedimiento seleccionado de: (a) un procedimiento para aumentar el número de copias de una secuencia de nucleótidos que codifica la aspartato amoníaco-liasa y la aspartato aminotransferasa en dicho microorganismo que comprende introducir un gen que codifica la aspartato amoníaco-liasa y la aspartato aminotransferasa en un vector y transformar el microorganismo con el vector; y (b) un procedimiento para reemplazar los promotores de los genes de la aspartato amoníaco-liasa y la aspartato aminotransferasa con promotores fuertes en dicho microorganismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Microorganismo de Corynebacterium sp. que tiene una productividad mejorada de L-arginina y procedimiento de producción de L-arginina mediante el uso del mismo

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un microorganismo recombinante del género Corynebacterium con una capacidad mejorada para producir L-arginina, y un procedimiento para producir L-arginina mediante el uso del mismo.

Descripción del estado de la técnica

La L-arginina está contenida en el ajo o la semilla de las plantas como forma libre. La L-arginina se usa ampliamente en medicamentos, alimentos y similares y también se usa como un suplemento dietético fortificado con aminoácidos.

Los microorganismos del género Corynebacterium biosintetizan L-arginina a través de una vía cíclica. La L-arginina se sintetiza a partir del L-glutamato a través de N-acetilglutamato, N-acetilglutamil fosfato, N-acetilglutamato semialdehído, N-acetilornitina, ornitina, citrulina y argininosuccinato.

Además, se conoce que Corynebacterium glutamicum está regulado por la inhibición por retroalimentación debido a la arginina intracelular (Vehary Sakanyan, y otros, Microbiology, 142:9-108, 1996), lo que sugiere que la producción de L-arginina con alto rendimiento es limitada.

Ikeda y otros informaron que la citrulina se acumula en un medio de fermentación durante la fermentación de arginina (Appl Environ Microbiol. Marzo de 2009; 75(6):1635-41. Epub 9 de enero de 2009).

En el proceso de biosíntesis, la citrulina se une al aspartato para generar argininosuccinato, que después libera fumarato para generar arginina. En este proceso, la aspartato amoníaco-liasa (AspA) es una enzima que sintetiza aspartato a partir de fumarato y amoníaco (Figura 1), y la aspartato aminotransferasa (AspB) es una enzima que cataliza la síntesis de varios L-aminoácidos mediante la transferencia del grupo amino de varios L-aminoácidos tales como el aspartato, glutamato y aminobutirato hacia los cetoácidos tales como el ácido a-cetoglutárico y el ácido acetoisovalérico.

Menkel y otros informaron que cuando se introdujo la aspA de E. coli en microorganismos del género Corynebacterium, los microorganismos de Corynebacterium aumentaron la disponibilidad de aspartato y después aumentaron la producción de lisina (APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Mar. 1989, p. 684-688).

En consecuencia, se divulga en la presente memoria que un microorganismo del género Corynebacterium tiene una capacidad mejorada para producir L-arginina al aumentar el influjo de aspartato que se une a la citrulina a través de la mejora de la expresión de la aspartato amoníaco-liasa y la aspartato aminotransferasa.

Sumario de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar un microorganismo del género Corynebacterium con una capacidad mejorada para producir L-arginina.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para producir L-arginina mediante el uso del microorganismo anterior del género Corynebacterium.

Para lograr los objetos anteriores, la presente invención proporciona un microorganismo del género Corynebacterium con la capacidad mejorada para producir L-arginina, que tiene una actividad mejorada de la aspartato amoníaco-liasa y la aspartato aminotransferasa en comparación con la actividad endógena de un microorganismo del género Corynebacterium con una capacidad para producir L-arginina, en el que dicha actividad mejorada se obtiene mediante un procedimiento seleccionado de:

(a) un procedimiento para aumentar el número de copias de una secuencia de nucleótidos que codifica la aspartato amoníaco-liasa y la aspartato aminotransferasa en dicho microorganismo que comprende introducir un gen que codifica la aspartato amoníaco-liasa y la aspartato aminotransferasa en un vector y transformar el microorganismo con el vector; y

(b) un procedimiento para reemplazar los promotores de los genes de la aspartato amoníaco-liasa y la aspartato aminotransferasa con promotores fuertes en dicho microorganismo.

La presente invención también proporciona un procedimiento para producir L-arginina que comprende las etapas de: cultivar un microorganismo del género Corynebacterium con capacidad mejorada para producir L-arginina, el cual tiene una actividad mejorada de la aspartato amoníaco-liasa en comparación con la actividad endógena de un microorganismo del género Corynebacterium con una capacidad para producir L-arginina, en el que dicha actividad mejorada se obtiene mediante un procedimiento seleccionado de:

(a) un procedimiento para aumentar el número de copias de una secuencia de nucleótidos que codifica la aspartato amoníaco-liasa en dicho microorganismo que comprende introducir un gen que codifica la aspartato amoníaco-liasa en un vector y transformar el microorganismo con el vector; y

(b) un procedimiento para reemplazar el promotor del gen de la aspartato amoníaco-liasa con un promotor fuerte en dicho microorganismo,

en un medio de cultivo; y

recuperar la L-arginina del medio de cultivo.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra una vía para sintetizar arginina a partir de citrulina y una vía para sintetizar aspartato a partir de fumarato.

Descripción detallada de la invención

De aquí en adelante, la presente invención se describirá en detalle.

La presente invención proporciona un microorganismo del género Corynebacterium con una capacidad mejorada para producir L-arginina, el cual tiene una actividad mejorada de la aspartato amoníaco-liasa y la aspartato aminotransferasa en comparación con la actividad endógena de un microorganismo del género Corynebacterium con una capacidad para producir L-arginina, en el que dicha actividad mejorada se obtiene mediante un procedimiento seleccionado de:

Como se usa en la presente memoria, el término "una capacidad para producir L-arginina (productividad de L-arginina)" se refiere a la capacidad de acumular L-arginina en un medio para el cultivo del microorganismo del género Corynebacterium durante el cultivo. Tal capacidad para producir L-arginina puede ser propiedad de un tipo silvestre, o la propiedad impartida o mejorada por una mutación artificial, de los microorganismos del género Corynebacterium.

Por ejemplo, para impartir la capacidad para producir L-arginina, un microorganismo del género Corynebacterium puede reproducirse como una variante que tiene resistencia al hidroxamato de arginina; una variante que tiene auxotrofía para ácido succínico o que tiene resistencia a un análogo de base de ácido nucleico; una variante deficiente en la capacidad de metabolizar arginina y que tiene resistencia a un antagonista de arginina y canavanina y auxotrofía para lisina; variante que tiene resistencia a arginina, hidroxamato de arginina, homoarginina, D-arginina y canavanina, o resistencia a hidroxamato de arginina y 6-azauracilo; o una variante que tiene resistencia a canavanina.

Además, la capacidad para producir L-arginina puede impartirse al modificar un microorganismo del género. Corynebacterium a fin de aumentar el nivel de expresión de los genes que codifican las enzimas para biosintetizar L-arginina. Los ejemplos de enzimas para biosintetizar L-arginina pueden incluir N-acetilglutamil fosfato reductasa (ArgC), ornitina acetil transferasa (ArgJ), N-acetilglutamato quinasa (ArgB), acetilornitina transaminasa (ArgD), ornitina carbamoil transferasa (ArgF), ácido argininosuccínico sintetasa (ArgG), ácido argininosuccínico liasa (ArgH), y carbomil fosfato sintetasa. Estas enzimas se colocan en el operón Arg (argCJBDFRGH) y están reguladas por un represor de arginina codificado por argR (J Bacteriol. Diciembre de 2002; 184(23):6602-14.). Por lo tanto, puede impartirse una capacidad para producir L-arginina al atenuar el represor de arginina (Documento US2002-0045223) o al sobreexpresar al menos uno de los genes relacionados con la biosíntesis.

En la presente invención, el microorganismo del género Corynebacterium con una capacidad para producir L-arginina no está específicamente limitado siempre que este pueda producir L-arginina. Específicamente, este puede ser Corynebacterium glutamicum que tiene la capacidad para producir L-arginina. Más específicamente, puede ser Corynebacterium glutamicum KCCM10741 (Patente Coreana núm. de Registro 10-0791659) o Corynebacterium glutamicum ATCC21831), pero no se limita a estos.

En un aspecto, la presente invención proporciona un microorganismo del género Corynebacterium con una capacidad mejorada para producir L-arginina, el cual tiene una actividad mejorada de la aspartato amoníaco-liasa y la aspartato aminotransferasa en comparación con la actividad endógena de un microorganismo del género Corynebacterium con una capacidad para producir L-arginina, en el que dicha actividad mejorada se obtiene mediante un procedimiento seleccionado de:

Como se usa en la presente memoria, el término "aspartato amoníaco-liasa (AspA)" se refiere a una enzima que funciona para sintetizar aspartato a partir de fumarato y amoníaco, y la síntesis de aspartato puede aumentarse al mejorar la expresión de la aspartato amoníaco-liasa, y de este modo puede aumentarse la productividad de la L-arginina por el aumento de aspartato.

En la presente invención, la aspartato amoníaco-liasa puede ser una enzima derivada de cualquier microorganismo, siempre que tenga la actividad de aspartato amoníaco-liasa. Específicamente, la aspartato amoníaco-liasa puede ser una enzima derivada de un microorganismo del género Escherichia o del género Corynebacterium. Más específicamente, puede ser una enzima derivada de E. coli o Corynebacterium glutamicum. Específicamente, la aspartato amoníaco-liasa puede tener una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 21 o 22. La aspartato amoníaco-liasa derivada de Corynebacterium que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 21 está codificada por aspA (NCgl1446) que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 23, y la aspartato amoníaco-liasa derivada de Escherichia que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la ^sE^qID NO: 22 está codificada por aspA (NCBI GENE ⁱD: 12933698) que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 24.

Una proteína que tiene una homología de al menos 80 %, específicamente al menos 90 %, más específicamente al menos 95 %, e incluso más específicamente al menos 97 % de los aminoácidos puede usarse en el microorganismo o en el procedimiento de la presente invención, siempre que tenga la actividad de aspartato amoníaco-liasa descrita anteriormente.

Como se usa en la presente memoria, el término "homología" se refiere a la identidad entre dos secuencias de aminoácidos y puede determinarse mediante el procedimiento bien conocido por los expertos en la técnica, mediante el uso del algoritmo BLAST (véase Karlin y Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)) o FASTA (véase Pearson, Methods Enzymol., 183, 63 (1990)) para calcular el parámetro tal como puntuación, identidad y similitud. Basado en el algoritmo BLAST, se ha desarrollado un programa llamado BLASTN o BLASTX (véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Como se usa en la presente memoria, el término "aspartato aminotransferasa" puede derivarse de un microorganismo del género Corynebacterium, tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 25 y está codificada por aspB (NCgl0237) que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 26, pero no se limita a esta.

Una proteína que tiene una homología de al menos 80 %, específicamente al menos 90 %, más específicamente al menos 95 %, e incluso más específicamente al menos 97 % con la secuencia de aminoácidos de la aspartato aminotransferasa descrita anteriormente, puede usarse en el microorganismo o en el procedimiento de la presente invención, siempre que tenga la actividad de aspartato aminotransferasa descrita anteriormente. La homología con la secuencia de aminoácidos puede determinarse mediante, por ejemplo, el algoritmo BLAST (véase Karlin y Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)) o FASTA (véase Pearson, Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Basado en este algoritmo, se ha desarrollado un programa llamado BLASTN o BLASTX (véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

El microorganismo de la invención del género Corynebacterium con una capacidad para producir L-arginina se caracteriza por ser modificado al mejorar (o aumentar) la actividad de la aspartato amoníaco-liasa y la aspartato aminotransferasa, en comparación con la actividad endógena de un microorganismo del género Corynebacterium con una capacidad para producir L-arginina, en el que dicha actividad mejorada se obtiene mediante un procedimiento seleccionado de:

Como se usa en la presente memoria, el término "actividad endógena" se refiere a la actividad de un microorganismo del género Corynebacterium con una capacidad para producir L-arginina que no experimentó ninguna manipulación o modificación genética para regular las actividades de las enzimas descritas anteriormente. Además, el término "mejorada" o "aumentada" significa que la productividad de L-arginina se mejoró en comparación con la actividad endógena de un microorganismo del género Corynebacterium con una capacidad para producir L-arginina.

La mejora (o aumento) de la actividad de las enzimas descritas en la presente memoria puede realizarse mediante el uso de diversos procedimientos de transformación bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de estos procedimientos incluyen un procedimiento para aumentar el número de copias de una secuencia de nucleótidos que codifica la aspartato amoníaco-liasa y la aspartato aminotransferasa mediante la introducción de un polinucleótido que codifica la aspartato amoníaco-liasa y la aspartato aminotransferasa en un sistema de vector, un procedimiento para reemplazar el promotor con un promotor fuerte, un procedimiento para introducir una mutación en el promotor, y un procedimiento basado en mutación genética.

En una realización específica de la presente invención, para mejorar la actividad de la aspartato amoníaco-liasa y la aspartato aminotransferasa en el microorganismo del género Corynebacterium con una capacidad para producir L-arginina, puede usarse un procedimiento en el cual un número de copias del gen que codifica la aspartato amoníacoliasa y la aspartato aminotransferasa se aumenta al introducir el gen que codifica la aspartato amoníaco-liasa y un gen que codifica la aspartato aminotransferasa en un vector y transformar el microorganismo del género Corynebacterium con el vector.

Como se usa en la presente memoria, el término "transformar" significa introducir un vector que contiene un polinucleótido que codifica una proteína diana en una célula huésped para que la proteína diana pueda expresarse en la célula huésped. El polinucleótido introducido puede localizarse dentro o fuera del cromosoma de la célula huésped, siempre que pueda expresarse en la célula huésped. El polinucleótido puede introducirse en cualquier forma, siempre que pueda expresarse en la célula huésped.

En una realización de la presente invención, el microorganismo transformado se preparó al introducir el vector recombinante que contenía los genes descritos anteriormente, y después al aislar la cepa productora de L-arginina que contenía 2 copias de cada uno de los genes anteriores en el cromosoma a través de un segundo cruce.

Como se usa en la presente memoria, el término "vector" se refiere a un constructo de ADN que contiene la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que codifica la proteína diana que está operativamente unida a una secuencia reguladora adecuada para poder expresar la proteína diana en un huésped adecuado. La secuencia reguladora incluye un promotor para iniciar la transcripción, cualquier secuencia operadora para regular tal transcripción, una secuencia que codifica los sitios adecuados de unión al ribosoma del ARNm, y secuencias que regulan la terminación de la transcripción y la traducción. Después de transformarse en un huésped adecuado, el vector puede replicarse o realizar su función independientemente del genoma del huésped, o puede integrarse en el genoma mismo.

El vector que se usa en la presente invención no está específicamente limitado, siempre que pueda replicarse en un huésped. El vector puede ser cualquier vector conocido en la técnica. Los ejemplos de vectores que se usan comúnmente pueden incluir plásmidos naturales o recombinantes, cósmidos, virus y bacteriófagos.

La cepa de Corynebacterium glutamicum (KCCM11351P) transformada mediante el procedimiento descrito en la presente memoria se produce obteniendo mediante PCR aspA que codifica la aspartato amoníaco-liasa a partir del cromosoma de la cepa ATCC21831 de Corynebacterium glutamicum productora de L-arginina, insertando el aspA obtenido en un vector, y después introduciendo el vector en la cepa KCCM10741P de Corynebacterium glutamicum productora de L-arginina y después es un microorganismo transformado que tiene una mayor expresión de aspA. Se descubrió que la cepa KCCM11351P puede producir L-arginina con alto rendimiento por la sobreexpresión de aspA. En otro aspecto más, la presente invención también proporciona un procedimiento para producir L-arginina, que comprende las etapas de:

cultivar un microorganismo del género Corynebacterium con capacidad mejorada para producir L-arginina, el cual tiene una actividad mejorada de la aspartato amoníaco-liasa en comparación con la actividad endógena de un microorganismo del género Corynebacterium con una capacidad para producir L-arginina, en el que dicha actividad mejorada se obtiene mediante un procedimiento seleccionado de:

en un medio de cultivo; y

recuperar la L-arginina del medio de cultivo.

En el procedimiento de la invención para producir L-arginina, el proceso de cultivo del microorganismo transformado que sobreexpresa L-arginina puede realizarse en medios adecuados y condiciones de cultivo conocidas en la técnica. Este proceso de cultivo puede ser ajustado fácilmente por cualquier persona experta en la técnica dependiendo de una cepa seleccionada. Los ejemplos del proceso de cultivo incluyen, pero no se limitan a, cultivo por lotes, cultivo continuo y cultivo alimentado por lotes. Tales procesos de cultivo se divulgan, por ejemplo, en "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp138-176, 1991).

El medio que puede usarse en el procedimiento de la presente invención contiene azúcar cruda o glucosa como fuente principal de carbono. Además, la melaza que contiene una gran cantidad de azúcar cruda también puede usarse como fuente de carbono. Además, pueden usarse cantidades adecuadas de diversas fuentes de carbono, y puede usarse específicamente glucosa purificada. Los ejemplos de una fuente de nitrógeno que puede usarse en el procedimiento de la presente invención incluyen fuentes de nitrógeno orgánico tales como peptona, extracto de levadura, caldo de carne, extracto de malta, licor de maíz y harina de soja; y fuentes de nitrógeno inorgánico tales como urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Específicamente, puede usarse peptona. Estas fuentes de nitrógeno pueden usarse solas o en combinación. El medio puede contener, como fuente de fósforo, dihidrógeno fosfato de potasio, hidrógeno difosfato de dipotasio y las correspondientes sales que contienen sodio. Además, el medio puede contener una sal metálica tal como sulfato de magnesio o sulfato de hierro. Además, el medio puede contener aminoácidos, vitaminas y precursores apropiados. Estos medios o precursores pueden añadirse de manera continua o por lotes en el cultivo. Sin embargo, los ejemplos de una composición de un medio de cultivo no se limitan a estos.

Un compuesto tal como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoníaco, ácido fosfórico y ácido sulfúrico puede añadirse a un medio de cultivo durante el cultivo de manera adecuada para ajustar el pH del medio de cultivo. Además, puede añadirse un agente antiespumante tal como éster poliglicólico de ácido graso durante el cultivo para inhibir el burbujeo. Además, para mantener una condición aeróbica del medio de cultivo, puede inyectarse oxígeno o gas que contenga oxígeno (por ejemplo, aire) al medio de cultivo. La temperatura del medio de cultivo puede estar generalmente entre 20 °C y 45 °C, y específicamente entre 25 °C y 40 °C. El cultivo puede realizarse hasta que se produzca la cantidad deseada de L-arginina. Específicamente, el tiempo de cultivo puede ser de 10-160 horas.

La separación de L-arginina del medio de cultivo se puede realizar mediante un procedimiento convencional conocido en la técnica. El procedimiento puede incluir centrifugación, filtración, cromatografía de intercambio iónico, y cristalización. Por ejemplo, la L-arginina puede separarse al centrifugar el medio de cultivo a baja velocidad para eliminar la biomasa, y después separar el sobrenadante restante mediante cromatografía de intercambio iónico.

De aquí en adelante, la presente invención se describirá en mayor detalle con referencia a los ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Examen del efecto de aspA en la producción de L-arginina

Para examinar si aspA es un gen significativo en la producción de L-arginina, se construyó un vector con aspA delecionado y se transformó en la cepa KCCM10741P de Corynebacterium glutamicum productora de L-arginina (Número de Registro de Patente Coreana 0791659), y después se evaluó la productividad de L-arginina de la cepa transformada.

(1) Construcción del vector con aspA deficiente

Para eliminar el gen aspA que codifica la aspartato amoníaco-liasa (Ncgl1446) del cromosoma, el cromosoma de la cepa ATCC21831 de Corynebacterium glutamicum adquirida de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, por sus siglas en inglés) se extrajo mediante el uso de un sistema Genomic-tip (QIAGEN), y se realizó una PCR cruzada mediante el uso del cromosoma como un molde.

Específicamente, un fragmento de aproximadamente 798 pb que tenía un sitio de la enzima de restricción Xmal en la región 5' se amplificó mediante PCR con la polimerasa Pfu mediante el uso de cebadores de las SEQ ID NO: 1 y 2 durante 30 ciclos, cada uno de los cuales consistió en desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto, hibridación a 58 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 60 segundos. Después, un fragmento de aproximadamente 829 pb que tenía un sitio de la enzima de restricción XbaI en la región 3' se amplificó mediante PCR mediante el uso de cebadores de las SEQ ID NO: 3 y 4 de la misma manera que la descrita anteriormente. Los fragmentos de ADN resultantes se aislaron mediante el uso del kit GeneAllR Expin™ GEL SV (Seúl, Corea) y después se usaron como molde para la PCR cruzada.

Para obtener un fragmento de ADN que contiene aspA delecionado, se realizó una PCR cruzada mediante el uso de los dos fragmentos de ADN preparados anteriormente como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 1 y 4. Específicamente, se amplificó un fragmento de aproximadamente 1.583 pb mediante el procedimiento de PCR descrito anteriormente. El fragmento amplificado se trató con las enzimas de restricción XmaI y XbaI, y después se ligó con un vector pD tratado con las mismas enzimas, construyendo de este modo el vector pDKO1446.

(2) Preparación de la cepa recombinante

El vector pDKO1446 construido como se describió anteriormente se transformó en la cepa KCCM10741P de Corynebacterium glutamicum productora de L-arginina y se sometió a un segundo cruce, obteniendo de este modo una cepa productora de L-arginina que contenía un aspA delecionado en el cromosoma. La cepa obtenida se denominó "KCCM10741AaspA".

(3) Examen de la productividad de L-arginina de la cepa recombinante

Para examinar el efecto de una deleción de aspA en la productividad de L-arginina, el recombinante producido anteriormente Corynebacterium glutamicum KCCMl0741AaspA que es una cepa productora de L-arginina se cultivó de la siguiente manera.

Como un grupo control, se usó la célula huésped, KCCM10741P de Corynebacterium glutamicum. Específicamente, se inoculó un asa de la cepa en un matraz con deflectores de 250 ml que contenía 25 ml del siguiente medio de producción, y se cultivó a 30 °C durante 48 horas a 200 rpm. Después de la finalización del cultivo, la producción de L-arginina se midió mediante HPLC, y los resultados se muestran en la Tabla 1 a continuación.

Medio de producción

6 % de glucosa, 3 % de sulfato de amonio, 0,1 % de dihidrógeno fosfato de potasio, 0,2 % de sulfato de magnesio heptahidratado, 1,5 % de licor de maíz (CSL, por sus siglas en inglés), 1 % de NaCl, 0,5 % de extracto de levadura, 100 mg/L de biotina, pH 7,2.

Tabla 1: Comparación de la productividad de L-arginina

Como puede observarse en la Tabla 1 anterior, la cepa que contenía aspA delecionado tenía una capacidad reducida para producir L-arginina, y aspA fue un gen significativo en la producción de L-arginina.

Ejemplo 2: Construcción de vector para introducir aspA derivado de Corynebacterium

Para construir un vector que contenga dos copias de aspA (Ncgl1446 que codifica la aspartato amoníaco-liasa derivada de Corynebacterium, la PCR se realizó mediante el uso del cromosoma de la cepa ATCC21831 de Corynebacterium glutamicum como molde y cada uno de un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 5 y 6 y un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 7 y 8, obteniendo de este modo fragmentos de ADN, cada uno que contiene aspA.

Específicamente, un fragmento de aproximadamente 1.893 pb que tiene un sitio de la enzima de restricción XmaI en la región 5' y un un sitio de la enzima de restricción BamHI en la región 3' se amplificó mediante PCR con la polimerasa Pfu mediante el uso de los cebadores de las SEQ ID NO: 5 y 6. La PCR se realizó durante 30 ciclos, cada uno de los cuales consistió en desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto, hibridación a 58 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 2 minutos. Mientras tanto, un fragmento de aproximadamente 1.885 pb que tenía un sitio de la enzima de restricción BamHI en la región 5' y un sitio de la enzima de restricción XbaI en la región 3' se amplificó mediante el uso de los cebadores de las SEQ ID NO: 7 y 8 de la misma manera que la descrita anteriormente.

Los fragmentos de ADN obtenidos se separaron mediante el uso del kit GeneAllR Expin™ GEL SV (Seúl, Corea). Después, el primer fragmento de los dos fragmentos anteriores se trató con XmaI y BamHI, y el segundo fragmento se trató con BamHI y XbaI. Además, un vector pD se trató con XmaI y XbaI. Los dos fragmentos de ADN y el vector pD, tratados con las enzimas de restricción, se ligaron y, de este modo se construyó un vector pD1446-2X.

Ejemplo 3: Preparación de cepas recombinantes que tengan una mayor expresión de aspA

El vector pD1446-2X construido en el Ejemplo 2 se transformó en cada una de las cepas productoras de L-arginina, KCCM10741P y ATCC21831 de Corynebacterium glutamicum, y después estas se sometieron a un segundo cruce, obteniendo de este modo cepas productoras de L-arginina que contenían 2 copias de aspA en el cromosoma. Las cepas obtenidas se denominaron "KCCM10741P::aspA_2X" y "ATCC21831::aspA_2X", respectivamente.

Ejemplo 4: Construcción del vector para introducir aspB derivado de Corynebacterium

Para construir un vector que contenga 2 copias de aspB (Ncgl0237) que codifican la aspartato aminotransferasa, la PCR se realizó mediante el uso del cromosoma de ATCC21831 de Corynebacterium glutamicum como molde y cada uno de un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 9 y 10 y un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 11 y 12, obteniendo de este modo fragmentos de ADN, cada uno de los cuales contenía aspB.

Específicamente, un fragmento de aproximadamente 1.692 pb que tiene un sitio de la enzima de restricción Xmal en la región 5' y un sitio de la enzima de restricción NdeI en la región 3' se amplificó mediante PCR con la polimerasa Pfu mediante el uso de los cebadores de las SEQ ID NO: 9 y 10. La PCR se realizó durante 30 ciclos, cada uno de los cuales consistió en desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto, hibridación a 58 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 2 minutos. Mientras tanto, un segundo fragmento de aproximadamente 1.643 pb que tenía un sitio de la enzima de restricción NdeI en la región 5' y un sitio de la enzima de restricción SpeI en la región 3' se amplificó mediante el mismo procedimiento de PCR descrito anteriormente.

Los fragmentos de ADN obtenidos se aislaron mediante el uso del kit GeneAllR Expin™ GEL SV (Seúl, Corea). Después, el primer fragmento de los dos fragmentos anteriores se trató con XmaI y NdeI, y el segundo fragmento se trató con NdeI y SpeI. Además, un vector pD se trató con XmaI y XbaI. El vector pD y los dos fragmentos de ADN, que se trataron con las enzimas de restricción, se sometieron a ligazón de 3 piezas, construyendo de este modo un vector pD0237-2X.

Ejemplo 5: Preparación de cepas que tengan una mayor expresión de aspB

El vector pD0237-2X construido en el Ejemplo 4 se transformó en cada una de las cepas productoras de L-arginina, KCCM10741P y ATCC21831 de Corynebacterium glutamicum, y después estas se sometieron a un segundo cruce, obteniendo de este modo cepas productoras de L-arginina que contenían 2 copias de aspB en el cromosoma. Las cepas obtenidas se denominaron "KCCM10741P::aspB_2X" y "ATCC21831::aspB_2X", respectivamente.

Ejemplo 6: Preparación de cepas que tienen una mayor expresión de aspA y aspB

El vector pD0237-2X construido en el Ejemplo 4 se transformó en cada una de las cepas recombinantes (KCCM10741P::aspA_2X y ATCC21831::aspA_2X) preparadas en el Ejemplo 3, y después estas se sometieron a un segundo cruce, obteniendo de este modo cepas productoras de L-arginina que contenían 2 copias de aspA y aspB en el cromosoma. Las cepas obtenidas se denominaron "KCCM10741P::aspA_2X::aspB_2X" y "ATCC21831:: aspA_2X:: aspB_2X".

Ejemplo 7: Evaluación de la productividad de L-arginina

Para examinar el efecto de un aumento en aspA, aspB o ambos aspA y aspB en la productividad de L-arginina, cada una de las cepas productoras de L-arginina, Corynebacterium glutamicum KCCM10741P::aspA_2X, ATCC21831::aspA_2X, KCCM10741P::aspB_2X, ATCC21831::aspB_2X, KCCM10741P::aspA_2X::aspB_2X y ATCC21831::aspA_2X::aspB_2X, preparadas en los Ejemplos 3, 5 y 6, se cultivaron de la siguiente manera.

Como grupo control, se usaron las células huésped de cada una de KCCM10741P y ATCC21831 de Corynebacterium glutamicum. Específicamente, se inoculó un asa de cada una de las cepas en un matraz con deflectores de 250 ml que contenía 25 ml del medio de producción descrito en el Ejemplo 1, y las cepas inoculadas se cultivaron a 30 °C durante 48 horas a 200 rpm. Después de la finalización del cultivo, se midió la producción de L-arginina, y los resultados de la mediciones se muestran en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2: Comparación de la productividad de arginina entre cepas

Como puede observarse en la Tabla 2 anterior, la producción de L-arginina se aumentó en los dos tipos de cepas de Corynebacterium glutamicum cuando se introdujeron 2 copias de aspA en las cepas. Particularmente, la productividad de L-arginina de KCCM10741P::aspA_2X se aumentó notablemente en un 30 % en comparación con la del grupo control. KCCM10741P::aspA_2X se depositó en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (KCCM, por sus siglas en inglés), una autoridad depositaria internacional ubicada en 361-221, Hongje 1-dong Seodaemun-gu, Seúl, Corea, el 21 de enero de 2013 bajo el número de acceso KCCM11351P.

Ejemplo 8: Construcción de vector para introducir aspA derivado del género E. coli

Para introducir aspA (NCBI-GeneID: 12933698), se usó un gen que codifica la aspartato amoníaco-liasa derivada del género E. coli, en el cromosoma de Corynebacterium glutamicum con una capacidad para producir L-arginina, un sitio Ncgl1221 conocido como un exportador de glutamato (yggB: Appl Environ Microbiol. julio de 2007; 73(14):4491-8). Para construir un vector que tenga un aspA de E. coli introducido en sitio Ncgl1221, se construyó un vector pDKO1221 que contenía una alteración génica específica de sitio de Ncgl1221.

Para obtener un fragmento de ADN que contenga una alteración génica específica de sitio de Ncgl1221, se extrajo el cromosoma de ATCC21831 de Corynebacterium glutamicum, y se realizó una PCR cruzada mediante el uso del cromosoma como un molde. Específicamente, un fragmento de aproximadamente 789 pb que tiene un sitio de la enzima de restricción EcoRI en la región 5' se amplificó mediante PCR con la polimerasa Pfu mediante el uso de cebadores de las SEQ ID NO: 13 y 14. La PCR se realizó durante 30 ciclos, cada uno de los cuales consistió en desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto, hibridación a 58 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 60 segundos. Mientras tanto, un fragmento de aproximadamente 835 pb que tenía un sitio de la enzima de restricción PstI en la región 3' se amplificó mediante PCR mediante el uso de los cebadores de las SEQ ID NO: 15 y 16 de la misma manera que la descrita anteriormente. Los fragmentos de ADN obtenidos se aislaron mediante el uso del kit GeneAllR Expin™ GEL SV (Seúl, Corea) y después se usaron como moldes para la PCR cruzada.

Para obtener un fragmento de ADN que contenga una alteración génica específica de sitio de Ncgl1221, se realizó una PCR cruzada mediante el uso de los dos fragmentos de ADN obtenidos anteriormente como moldes y los cebadores de las SEQ ID NO: 13 y 16. Específicamente, se amplificó un fragmento de aproximadamente 1.602 pb mediante el procedimiento de PCR descrito anteriormente. El fragmento amplificado se trató con las enzimas de restricción EcoRI y PstI, y después se ligó con un vector pD tratado con las mismas enzimas de restricción, construyendo de este modo un vector pDKO1221.

Mediante el uso del vector pDKO1221 construido, se construyó un vector que tenía un aspA de E. coli introducido en este. Para obtener un promotor cj7 (patente coreana número 10-0620092) que opere en Corynebacterium glutamicum, un fragmento de aproximadamente 524 pb que tenía un sitio de la enzima de restricción BamHI en la región 5' se amplificó mediante PCR con la polimerasa Pfu mediante el uso de p117 pcj7-gfp como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 17 y 18. La PCR se realizó durante 30 ciclos, cada uno de los cuales consistió en desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto, hibridación a 58 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 30 segundos. El aspA derivado de E.coli se extrajo del cromosoma de W3110 de E. coli mediante el uso de un sistema Genomic-tip (QIAGEN) y se amplificó un fragmento de aproximadamente 1.607 pb que tenía un sitio de la enzima de restricción XbaI en la región 3' mediante el uso del cromosoma como un molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 19 y 20. Los fragmentos de ADN obtenidos se aislaron mediante el uso del kit GeneAllR Expin™ GEL SV (Seúl, Corea) y después se usaron como moldes para la PCR cruzada.

Para obtener un fragmento de ADN de aspA derivado de E.coli, se realizó la PCR cruzada mediante el uso de los dos fragmentos de ADN obtenidos anteriormente como moldes y los cebadores de las SEQ ID NO: 17 y 20. Específicamente, se amplificó un fragmento de aproximadamente 2.095 pb mediante el procedimiento de PCR descrito anteriormente. El fragmento amplificado se trató con las enzimas de restricción BamHI y XbaI, y después se ligó con un vector pDKO1221 tratado con las mismas enzimas de restricción, construyendo de este modo un vector pDKO1221-EC_aspA.

Ejemplo 9: Preparación de la cepa recombinante que tenga una mayor expresión de aspA de E. coli

El vector pDKO1221-EC_aspA construido como se describió anteriormente se transformó en cada una de las cepas KCCM10741P y ATCC21831 de Corynebacterium glutamicum productoras de L-arginina y estas se somtieron a un segundo cruce, obteniendo de este modo cepas productoras de L-arginina, cada una de las cuales contenía un gen aspA derivado de E. coli en el cromosoma. Las cepas obtenidas se denominaron "KCCM10741PANcgl1221-EC_aspA"y "ATCC21831ANcgl1221-EC_aspA", respectivamente. Además, el vector pDKO1221 construido como se describió anteriormente se transformó en cada una de las cepas KCCM10741P y ATCC21831 de Corynebacterium glutamicum productoras de L-arginina y estas se sometieron a un segundo cruce, obteniendo de este modo las cepas KCCM10741PANcgl1221 y ATCC21831ANcgl1221, cada una de las cuales contenía un NCgl1221 delecionado en el cromosoma.

Ejemplo 10: Evaluación de la productividad de L-arginina de cepas recombinantes que tienen una mayor expresión de aspA de E. coli

Para evaluar el efecto de la introducción de aspA de E. coli en la productividad de L-arginina, las cepas productoras de L-arginina KCCM10741PANcgl1221-EC_aspA y ATCC21831ANcgl1221-EC_aspA preparadas en el Ejemplo 9 se cultivaron de la siguiente manera.

Como grupo control, se cultivaron las células huésped de cada una de KCCM10741P, ATCC21831, KCCM10741PANcgl1221 y ATCC21831ANcgl1221 de Corynebacterium glutamicum. Específicamente, se inoculó un asa de cada cepa en un matraz con deflectores de 250 ml que contenía 25 ml del medio de producción descrito anteriormente y se cultivaron a 30 °C durante 48 horas a 200 rpm. Después de la finalización del cultivo, se midió la producción de L-arginina, y los resultados se muestran en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3: Comparación de la productividad de L-arginina

Como puede observarse en la Tabla 3 anterior, la producción de L-arginina se aumentó en los dos tipos de Corynebacterium glutamicum cuando se introdujo aspA de E. coli en las cepas.

Como se describió anteriormente, se divulga en la presente memoria un microorganismo recombinante del género Corynebacterium, que tiene una actividad mejorada de la aspartato amoníaco-liasa y/o actividad mejorada de la aspartato aminotransferasa, y por lo tanto tiene una capacidad mejorada para producir L-arginina. El microorganismo recombinante del género Corynebacterium puede producir L-arginina con alto rendimiento y, por lo tanto, es industrialmente útil.

Número de Acceso

Autoridad depositaria: Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos

Número de acceso: KCCM11351P

Fecha de deposición: 21 de enero de 2013

<110> CJ Cheiljedang Corporation

<120> MICROORGANISMO DEL GÉNERO CORYNEBACTERIUM CON PRODUCTIVIDAD MEJORADA DE L-

ARGININA Y PROCEDIMIENTO DE PRODUCCIÓN DE L-ARGININA MEDIANTE EL USO DEL MISMO

<130> PP13-0149

<160> 26

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para la deleción de aspA

<400> 1

cgagctcggt acccggggtg tcgcagatgc catcgccg 38 <210>2

<211> 44

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para la deleción de aspA

<400> 2

cgccaatgac tggctccatg accgcacgaa gggtgtgcac cccg 44 <210> 3

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para la deleción de aspA

<400> 3

cggggtgcac acccttcgtg cggtcatgga gccagtcatt ggcg 44 <210> 4

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para la deleción de aspA

<400> 4

tgcaggtcga ctctagagtt cttgcggtga ccgccacg 38 <210> 5

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para la copia de aspA 2

<400> 5

cgagctcggt acccgggttt taactacccc cg 32

<210> 6

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para la copia de aspA 2

<400> 6

gtcgactcta gaggatccgg ccatatagtc tgctcc 36 <210>7

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para la copia de aspA 2

<400> 7

ttttggatcc ttttaactac cccc 24

<210>8

<211> 32

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para la copia de aspA 2

<400> 8

gcaggtcgac tctagacggc catatagtct gc 32

<210>9

<211> 42

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para la copia de aspB 2

<400> 9

ccagtgaatt cgagctcggt acccgggagc tagaacggct gc 42

<210> 10

<211> 75

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para la copia de aspB 2

<400> 10

ctagctcata tgataaaacg aaaggcccag tctttcgact gagcctttcg ttttatgtat 60

tcactctagc tagcg 75 <210> 11

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para la copia de aspB 2

<400> 11

cgttttatca tatgagctag aacggctgca acacatgg 38

<210> 12

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para la copia de aspB 2

<400> 12

gcctgcaggt cgacactagt gtattcactc tagctagc 38

<210> 13

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para la deleción de yggb

<400> 13

cggaattcga ggaatagagc gggtcataca 30

<210> 14

<211> 39

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para la deleción de yggb

<400> 14

gtttctagag ccgggatcct tgataatacg catggccag 39 <210> 15

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para la deleción de yggb

<400> 15

caaggatccc ggctctagaa acgatggaat ctagcgtcga a 41 <210> 16

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para la deleción de yggb

<400> 16

aaaactgcag ctttctgttt gtgttgtatt ccc 33

<210> 17

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para yggB::Pcj7-aspA_EC

<400> 17

gcgtattatc aaggatcctt ccttcaggct aatctt 36

<210> 18

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para yggB::Pcj7-aspA_EC

<400> 18

acgaatgttg tttgacatat gtgtttcctt tcgttg 36

<210> 19

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para yggB::Pcj7-aspA_EC

<400> 19

caacgaaagg aaacacatat gtcaaacaac attcgt 36

<210> 20

<211> 36

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador para yggB::Pcj7-aspA_EC

<400> 20

cgacgctaga ttccatcgtt tctagaaact agcata 36

<210> 21

<211> 526

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 21

Met Ser Lys Thr Ser Asn Lys Ser Ser Ala Asp Ser Lys Asn Asp Thr

1 5 10 15

Lys Ala Glu Asp lie Val Asn Gly Glu Asn Gln lie Ala Thr Asn Glu

20 25 30

Ser Gln Ser Ser Asp Ser Ala Ala Val Ser Glu Arg Val Val Glu Pro

35 40 45

Lys Thr Thr Val Gln Lys Lys Phe Arg lie Glu Ser Asp Leu Leu Gly

50 55 60

Glu Leu Gln lie Pro Ser His Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg

65 70 75 80

Ala Val Asp Asn Phe Gln lie Ser Arg Thr Thr lie Asn His Val Pro 85 90 95

Asp Phe lie Arg Gly Met Val Gln Val Lys Lys Ala Ala Ala Leu Ala

100 105 110

Asn Arg Arg Leu His Thr Leu Pro Ala Gln Lys Ala Glu Ala lie Val

115 120 125

Trp Ala Cys Asp Gln lie Leu lie Glu Glu Arg Cys Met Asp Gln Phe

130 135 140

Pro lie Asp Val Phe Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Leu Asn Met Asn

145 150 155 160

Thr Asn Glu Val Val Ala Asn Leu Ala Leu Glu Phe Leu Gly His Glu 165 170 175

Lys Gly Glu Tyr His lie Leu His Pro Met Asp Asp Val Asn Met Ser

180 185 190 GLn Ser Thr Asn Asp Ser Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Leu Gly He Tyr

195 200 205

Ala Gly Leu Gln Thr Leu He Ala Glu lie Asp Glu Leu Gln Val Ala

210 215 220

Phe Arg His Lys Gly Asn Glu Phe Val Asp lie lie Lys Met Gly Arg

225 230 235 240

Thr Gln Leu Gln Asp Ala Val Pro Met Ser Leu Gly Glu Glu Phe Arg 245 250 255

Ala Phe Ala His Asn Leu Ala Glu Glu Gln Thr Val Leu Arg Glu Ala

260 265 270

Ala Asn Arg Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala lie Gly Thr

275 280 285

Gly Val Asn Thr Pro Ala Gly Tyr Arg His Gln Val Val Ala Ala Leu

290 295 300

Ser Glu Val Thr Gly Leu Glu Leu Lys Ser Ala Arg Asp Leu lie Glu

305 310 315 320

Ala Thr Ser Asp Thr Gly Ala Tyr Val His Ala His Ser Ala ríe Lys 325 330 335

Arg Ala Ala Met Lys Leu Ser Lys lie Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu

340 345 350

Ser Ser Gly Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu lie Asn Leu Pro Pro Arg

355 360 365

GLn Ala Gly Ser Ser He Met Pro Ala Lys val Asn Pro val ríe Pro

370 375 380

Glu Val Val Asn Gln Val Cys Phe Lys Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr

385 390 395 400

Val Thr Met Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu 405 410 415

Pro Val lie Gly Glu Ser Leu Phe Gln Ser Leu Arg lie Leu Gly Asn

420 425 430

Ala Ala Lys Thr Leu Arg Glu Lys Cys Val Val Gly lie Thr Ala Asn

435 440 445

Ala Asp Val Cys Arg Ala Tyr Val Asp Asn Ser lie Gly lie ríe Thr

450 455 460

Tyr Leu Asn Pro Phe Leu Gly His Asp lie Gly Asp Gln lie Gly Lys

465 470 475 480

Glu Ala Ala Glu Thr Gly Arg Pro Val Arg Glu Leu lie Leu Glu Lys 485 490 495

Lys Leu Met Asp Glu Lys Thr Leu Glu Ala Val Leu Ser Lys Glu Asn

500 505 510

Leu Met His pro Met Phe Arg Gly Arg Leu Tyr Leu Glu Asn

515 520 525

<210> 22

<211> 478

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 22

Met Ser Asn Asn lie Arg lie Glu Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu 1 5 10 15

Val Pro Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg Ala lie Glu

20 25 30

Asn Phe Tyr lie Ser Asn Asn Lys lie Ser Asp lie Pro Glu Phe Val

35 40 45

Arg Gly Met Val Met Val Lys Lys Ala Ala Ala Met Ala Asn Lys Glu

50 55 60

Leu Gln Thr lie Pro Lys Ser Val Ala Asn Ala lie lie Ala Ala Cys 65 70 75 80 Asp Glu Val Leu Asn Asn Gly Lys Cys Met Asp Gln Phe Pro Val Asp 85 90 95

Val Tyr Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Val Asn Met Asn Thr Asn Glu

100 105 110

Val Leu Ala Asn lie Gly Leu Glu Leu Met Gly His Gln Lys Gly Glu

115 120 125

Tyr Gln Tyr Leu Asn Pro Asn Asp His Val Asn Lys Cys Gln Ser Thr

130 135 140

Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Gly Phe Arg lie Ala Val Tyr Ser Ser Leu 145 150 155 160 lie Lys Leu Val Asp Ala lie Asn Gln Leu Arg Glu Gly Phe Glu Arg 165 170 175

Lys Ala Val Glu Phe Gln Asp lie Leu Lys Met Gly Arg Thr Gln Leu

180 185 190

Gln Asp Ala Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Phe Arg Ala Phe Ser

195 200 205

lie Leu Leu Lys Glu Glu Val Lys Asn H e Gln Arg Thr Ala Glu Leu

210 215 220

Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala lie Gly Thr Gly Leu Asn 225 230 235 240 Thr Pro Lys Glu Tyr Ser Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu Ala Glu Val 245 250 255

Thr Gly Phe Pro Cys Val Pro Ala Glu Asp Leu lie Glu Ala Thr Ser

260 265 270

Asp Cys Gly Ala Tyr Val Met Val His Gly Ala Leu Lys Arg Leu Ala

275 280 285

Val Lys Met Ser Lys lie Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly

290 295 300

Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu lie Asn Leu Pro Glu Leu Gln Ala Gly

305 310 315 320

Ser Ser lie Met Pro Ala Lys Val Asn Pro Val Val Pro Glu Val Val 325 330 335

Asn Gln Val Cys Phe Lys Val lie Gly Asn Asp Thr Thr Val Thr Met

340 345 350

Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu Pro Val H e

355 360 365

Gly Gln Ala Met Phe Glu Ser Val His lie Leu Thr Asn Ala Cys Tyr

370 375 380

Asn Leu Leu Glu Lys Cys lie Asn Gly lie Thr Ala Asn Lys Glu Val

385 390 395 400

Cys Glu Gly Tyr Val Tyr Asn Ser lie Gly lie Val Thr Tyr Leu Asn 405 410 415

Pro Phe lie Gly His His Asn Gly Asp lie Val Gly Lys lie Cys Ala

420 425 430

Glu Thr Gly Lys Ser Val Arg Glu Val Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu

435 440 445

Thr Glu Ala Glu Leu Asp Asp lie Phe Ser Val Gln Asn Leu Met His

450 455 460

Pro Ala Tyr Lys Ala Lys Arg Tyr Thr Asp Glu Ser Glu Gln 465 470 475

<210> 23

<211> 1581

<212>ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 23

atgtctaaga cgagcaacaa gtcttcagca gactcaaaga atgacgcaaa agccgaagac 60 attgtgaacg gcgagaacca aatcgccacg aatgagtcgc agtcttcaga cagcgctgca 120 gtttcggaac gtgtcgtcga acoaaaaacc acggttcaga aaaagttccg aatcgaatcg 180 gatctgcttg gtgaacttca gatcccatcc cacgcatatt acggggtgca cacccttcgt 240 gcggtggaca acttccaaat ctcacgaacc accatcaacc acgtcccaga tttcattcgc 300 ggcatggtcc aggtgaaaaa ggccgcagct ttagcaaacc gccgactgca cacacttcca 360 gcacaaaaag cagaagcaat tgtctgggct tgtgatcaga tcctcattga ggaacgctgt 420 atggatcagt tccccatcga tgtgttccag ggtggcgcag gtacctcact gaacatgaac 480 acoaacgagg ttgttgccaa ccttgcactt gagttcttag gccatgaaaa gggcgagtac 540 cacatcctgc accccatgga tgatgtgaac atgtcccagt ccaccaacga ttcctaccca 600 actggtttcc gcctgggcat ttacgctgga ctgcagaccc tcatcgctga aattgatgag 660 cttcaggttg cgttccgcca caagggcaat gagtttgtcg acatcatcaa gatgggccgc 720 acccagttgc aggatgctgt tcccatgagc ttgggcgaag agttccgagc attcgcgcac 780 aacctcgcag aagagcagac cgtgctgcgt gaagctgcca accgtctcct cgaggtcaat 840 cttggtgcaa ccgcaatcgg tactggtgtg aacactccag aaggctaccg ccaacaggtt 900 gtcgctgctc tgtctgaggt caccggactg gaactaaagt ccgcacgtga tctcatcgag 960 gctacctatg aaaccggtga atatgttcat gcgcactcGg caatGaagcg tgcagccatg 1020 aaactgtcca agatctgtaa cgatctacgt ctgctgtctt ctggtcctcg tgctggcttg 1080 aacgaaatca acctgccacc acgccaggct ggttcctcca tcatgccagc caaggtcaac 1140 ccagtgatcc cagaagtggt caaccaggtc tgcttcaagg tcttcggtaa cgatctcacc 1200 gtcaccatgg ctgcggaagc tggccagttg cagctcaacg tcatggagcc agtcattggc 1260 gaatccctct tccagtcact gcgcatcctg ggcaatgcag ccaagacttt gcgtgagaag 1320 tgcgtcgtag gaatcaccgc caacgctgat gtttgccgtg cttacgttga taactccatc 1380 gggattatca cttacctgaa cccattcctg ggccacgaca ttggagatca gatcggtaag 1440 gaagcagccg aaactggtcg accagtgcgt gaactcatcc tggaaaagaa gctcatggat 1500 gaaaagacgc tcgaggcagt cctgtccaag gagaacctca tgcacccaat gttccgcgga 1560 aggctctact tggagaacta a 1581 <210> 24

<211> 1437

<212>ADN

<213> Escherichia coli

<400> 24

atgtcaaaca acattcgtat cgaagaagat ctgttgggta ccagggaagt tccagctgat 60 gcctactatg gtgttcacac tctgagagcg attgaaaact tctatatcag caacaacaaa 120 atcagtgata ttcctgaatt tgttcgcggt atggtaatgg ttaaaaaagc cgcagctatg 180 gcaaacaaag agctgcaaac cattcctaaa agtgtagcga atgccatcat tgccgcatgt 240 gatgaagtcc tgaacaacgg aaaatgcatg gatcagttcc cggtagacgt ctaccaggga 300 ggcgcaggta cttccgtaaa catgaacacc aacgaagtgc tggccaatat cggtctggaa 360 ctgatgggtc accaaaaagg tgaatatcag tacctgaacc cgaacgacca tgttaacaaa 420 tgtcagtcca ctaacgacgc ctacccgacc ggtttccgta tcgcagttta ctcttccctg 480 attaagctgg tagatgcgat taaccaactg cgtgaaggct ttgaacgtaa agctgtcgaa 540 ttccaggaca tcctgaaaat gggtcgtacc cagctgcagg acgcagtacc gatgaccctc 600 ggtcaggaat tccgcgcttt cagcatcctg ctgaaagaag aagtgaaaaa catccaacgt 660 accgntgaac tgctgctgga agttaacctt ggtgnaacag caatcggtac tggtctgaac 720 acgccgaaag agtactctcc gctggcagtg aaaaaactgg ctgaagttac tggcttccca 780 tgcgtaccgg ctgaagacct gatcgaagcg acctctgact gcggcgctta tgttatggtt 840 cacggcgcgc tgaaacgcct ggctgtgaag atgtccaaaa tctgtaacga cctgcgcttg 900 ctctcttcag gcccacgtgc cggcctgaac gagatcaacc tgccggaact gcaggcgggc 960 tcttccatca tgccagctaa agtaaacccg gttgttccgg aagtggttaa ccaggtatgc 1020 ttcaaagtca tcggtaacga caccactgtt accatggcag cagaagcagg tcagctgcag 1080 ttgaacgtta tggagccggt cattggccag gccatgttcg aatccgttca cattctgacc 1140 aacgcttgct acaacctgct ggaaaaatgc attaacggca tcactgctaa caaagaagtg 1200 tgcgaaggtt acgtttacaa ctctatcggt atcgttactt acctgaaccc gttcatcggt 1260 caccacaacg gtgacatcgt gggtaaaatc tgtgccgaaa ccggtaagag tgtacgtgaa 1320 gtcgttctgg aacgcggtct gttgactgaa gcggaacttg acgatatttt ctccgtacag 1380 aatctgatgc acccggctta caaagcaaaa cgctatactg atgaaagcga acagtaa 1437 <210> 25

<211> 426

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 25

Met Ser Ser Val Ser Leu Gln Asp Phe Asp Ala Glu Arg lie Gly Leu

1 5 10 15

Phe His Glu Asp lie Lys Arg Lys Phe Asp Glu Leu Lys Ser Lys Asn

20 25 30

Leu Lys Leu Asp Leu Thr Arg Gly Lys Pro Ser Ser Glu Gln Leu Asp

35 40 45

Phe Ala Asp Glu Leu Leu Ala Leu Pro Gly Lys Gly Asp Phe Lys Ala

50 55 60

Ala Asp Gly Thr Asp Val Arg Asn Tyr Gly Gly Leu Asp Gly lie Val

65 70 75 80

Asp lie Arg Gln lie Trp Ala Asp Leu Leu Gly Val Pro Val Glu Gln 85 90 95

Val Leu Ala Gly Asp Ala Ser Ser Leu Asn lie Met Phe Asp Val lie

100 105 110

Ser Trp Ser Tyr lie Phe Gly Asn Asn Asp Ser Val Gln Pro Trp Ser

115 120 125

Lys Glu Glu Thr Val Lys Trp lie Cys Pro Val Pro Gly Tyr Asp Arg

130 135 140

His Phe Ser lie Thr Glu Arg Phe Gly Phe Glu Met lie Ser Val Pro

145 150 155 160 Met Asn Glu Asp Gly Pro Asp Met Asp Ala val Glu Glu Leu Val Lys 165 170 175

Asn Pro Gln Val Lys Gly Met Trp Val Val Pro Val Phe Ser Asn Pro

180 185 190

Thr Gly Phe Thr Val Thr Glu Asp Val Ala Lys Arg Leu Ser Ala Met

195 200 205

Glu Thr Ala Ala Pro Asp Phe Arg Val Val Trp Asp Asn Ala Tyr Ala

210 215 220

val His Thr Leu Thr Asp Glu Phe Pro Glu val lie Asp lie Val Gly

225 230 235 240

Leu Gly Glu Ala Ala Gly Asn Pro Asn Arg Phe Trp Ala Phe Thr Ser 245 250 255

Thr Ser Lys H e Thr Leu Ala Gly Ala Gly Val Ser Phe Phe Leu Thr

260 265 270

Ser Ala Glu Asn Arg Lys Trp Tyr Thr Gly His Ala Gly lie Arg Gly

275 280 285

H e Gly Pro Asn Lys Val Asn Gln Leu Ala His Ala Arg Tyr Phe Gly

290 295 300

Asp Ala Glu Gly Val Arg Ala Val Met Arg Lys His Ala Ala Ser Leu

305 310 315 320

Ala Pro Lys Phe Asn Lys Val Leu Glu lie Leu Asp Ser Arg Leu Ala 325 330 335

Glu Tyr Gly Val Ala Gln Trp Thr Val Pro Ala Gly Gly Tyr Phe lie

340 345 350

Ser Leu Asp Val Val Pro Gly Thr Ala Ser Arg Val Ala Glu Leu Ala

355 360 365

Lys Glu Ala Gly lie Ala Leu Thr Gly Ala Gly Ser Ser Tyr Pro Leu

370 375 380

Arg Gln Asp Pro Glu Asn Lys Asn Leu Arg Leu Ala Pro Ser Leu Pro

385 390 395 400

Pro Val Glu Glu Leu Glu Val Ala Met Asp Gly Val Ala Thr Cys Val 405 410 415

Leu Leu Ala Ala Ala Glu His Tyr Ala Asn

420 425

<210> 26

<211> 1281

<212>ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 26

atgagttcag tttcgctgca ggattttgat gcagagcgaa ttggtttgtt ccacgaggac 60 attaagcgca agtttgatga gctcaagtca aaaaatctga agctggatct tactcgcggt 120 aagccttcgt cggagcagtt ggatttcgct gatgagttgt tggcgttgcc tggtaagggt 180 gatttcaagg ctgcggatgg tactgatgtc □gtaactatg gcgggctgga tggcatcgtt 240 gatattcgcc agatttgggc ggatttgctg ggtgttcctg tggagcaggt cttggcgggg 300 gatgcttcga gcttgaacat catgtttgat gtgatcagct ggtcgtacat tttcggtaac 360 aatgattcgg ttcagccttg gtcgaaggaa gaaaccgtta agtggatttg ccctgttccg 420 ggctatgatc gccatttctc catcacggag cgtttcggct ttgagatgat ttctgtgcca 480 atgaatgaag acggccctga tatggatgct gttgaggaat tggtgaagaa tccgcaggtt 540 aagggcatgt gggttgttcc ggtgttttct aacccgactg gtttcacggt gacagaagac 600 gtcgcaaagc gtctaagcgc aatggaaacc gcagctccgg acttccgcgt tgtgtgggat 660 aatgcctacg ccgttcatac gctgaccgat gaattccctg aggttatcga tatcgtcggg 720 cttggtgagg ccgctggcaa cccgaaccgt ttctgggcgt tcacttctac ttcgaagatc 780 actctcgcgg gtgcgggcgt gtcgttcttc ctcacctctg cggagaaccg caagtggtac 840 accggccatg cgggtatccg tggcattggc cctaacaagg tcaatcagtt ggctcatgcg 900 cgttactttg gcgatgctga gggagtgcgc gcggtgatgc gtaagcatgc tgcgtcgttg 960 gctccgaagt tcaacaaggt tctggagatt ctggattctc gccttgctga gtacggtgtc 1020 gcgcagtgga ctgtccctgc gggcggttac ttcatttccc ttgatgtggt tcctggtacg 1080 gcgtctcgcg tggctgagtt ggctaaggaa gccggcatcg cgttgacggg tgcgggttct 1140 tcttacccgc tgcgtcagga tccggagaac aaaaatctcc gtttggcacc gtcgctgcct 1200 ccagttgagg aacttgaggt tgccatggat ggcgtggcta cctgtgtgct gttggcagca 1260 gcggagcatt acgctaacta a 1281

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un microorganismo del género Corynebacterium con capacidad mejorada para producir L-arginina, que tiene una actividad mejorada de la aspartato amoníaco-liasa y la aspartato aminotransferasa en comparación con la actividad endógena de un microorganismo del género Corynebacterium con una capacidad para producir L-arginina, en el que dicha actividad mejorada se obtiene mediante un procedimiento seleccionado de:

2. El microorganismo de la reivindicación 1, en el que la aspartato amoníaco-liasa se deriva de un microorganismo del género Corynebacterium o un microorganismo del género Escherichia coli.

3. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la aspartato amoníaco-liasa tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 21 o 22.

4. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la aspartato aminotransferasa tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 25.

5. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el microorganismo del género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.

6. Un procedimiento de producción de L-arginina, que comprende las etapas de:

en un medio de cultivo; y

recuperar la L-arginina del medio de cultivo.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la aspartato amoníaco-liasa se deriva de un microorganismo del género Corynebacterium o un microorganismo del género Escherichia coli.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la aspartato amoníaco-liasa tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 21 o 22.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la actividad de la aspartato aminotransferasa se mejora en comparación con la actividad endógena de un microorganismo del género Corynebacterium con una capacidad para producir L-arginina, en el que dicha actividad mejorada se obtiene mediante un procedimiento seleccionado de:

(a) un procedimiento para aumentar el número de copias de una secuencia de nucleótidos que codifica la aspartato aminotransferasa en dicho microorganismo que comprende introducir un gen que codifica la aspartato aminotransferasa en un vector y transformar el microorganismo con el vector; y

(b) un procedimiento para reemplazar el promotor del gen de la aspartato aminotransferasa con un promotor fuerte en dicho microorganismo.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la aspartato aminotransferasa tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 25.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el microorganismo del género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.