ES2654809T3

ES2654809T3 - Microorganismos de Corynebacterium que pueden utilizar xilosa y procedimiento de producción de L-lisina utilizando los mismos

Info

Publication number: ES2654809T3
Application number: ES13736186.1T
Authority: ES
Inventors: So Yeon Rah; Lan HUH; Chang Gyeom Kim; Kwang Ho Lee; Jun Ok Moon; Kyung Han Lee; Jin Seok Sung; Hyung Joon Kim
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2012-01-10
Filing date: 2013-01-10
Publication date: 2018-02-15
Anticipated expiration: 2033-01-10
Also published as: KR20150046778A; US9200300B2; WO2013105802A2; US20160040200A1; JP2015503359A; MY164858A; JP5945336B2; CN108467848A; PL2803722T3; DK2803722T3; CN104245921A; WO2013105802A3; KR101592140B1; KR20130082124A; RU2014130234A; BR112014017088A2; EP2803722A4; RU2584593C2; EP2803722B1; US9399784B2

Abstract

Un microorganismo de Corynebacterium sp. modificado capaz de producir L-lisina utilizando xilosa, en el que el microorganismo comprende la xilosa isomerasa (XylA) y xilulocinasa (XylB) derivadas de Erwinia carotovora, en el que la XylA comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene un 95 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y en el que XylB comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácido que tiene un 90 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

DESCRIPCION

Microorganismos de Corynebacterium que pueden utilizar xilosa y procedimiento de producción de L-lisina utilizando los mismos

Antecedentes

1. Campo

La presente divulgación se refiere a un microorganismo de Corynebacterium sp. modificado para que utilice xilosa y un procedimiento para producir L-lisina utilizando el mismo.

2. Descripción de la técnica relacionada

Los microorganismos industriales utilizan azúcares tales como glucosa, fructosa y sacarosa como fuente de carbono. Los productos agrícolas se utilizan habitualmente como materia prima para obtener estas fuentes de carbono, pero son caras y son más valiosos como alimento. Recientemente, en vez de utilizar productos agrícolas como materia prima tradicional, han atraído la atención biomasa celulósica incluyendo residuos agrícolas o residuos madereros, residuos industriales, etc. como un material de azúcar en bruto para la fermentación, debido a que tiene la ventaja de bajo coste y suministro abundante.

Entre ellos, la xilosa es el segundo carbohidrato lignocelulósico más abundante en la naturaleza y es una biomasa celulósica representativa. Se han producido materiales útiles a partir de la xilosa utilizando microorganismos industriales. Por ejemplo, se conoce un procedimiento de producción de L-aminoácidos, cultivando una cepa de Escherichia sp. en un medio que contiene una mezcla de pentosas incluyendo glucosa y xilosa, en el que la cepa está modificada en cuanto a un aumento de expresión del agrupamiento genético xylABFGHR que codifica una enzima (xilosidasa) que hidroliza el xilósido, que es un derivado glicosídico de la xilosa, y después se recupera el L- aminoácido del medio (Patente Japonesa N° 4665567).

Por otra parte, se conoce una bacteria Corineforme, el Corynebacterium glutamicum, como una cepa Gram-positiva que se utiliza en la producción de distintos L-aminoácidos. Como se ha descrito anteriormente, debido a que la xilosa es el segundo carbohidrato lignocelulósico más abundante en la naturaleza, se espera que los L-aminoácidos tales como la L-lisina puede producirse más económicamente con Corynebacterium glutamicum utilizando xilosa. Sin embargo, el Corynebacterium glutamicum no tiene genes importantes que estén implicados en la ruta metabólica de la xilosa, que es una pentosa, y por lo tanto existe el problema de que no se puede producir un L-aminoácido a partir de Corynebacterium glutamicum utilizando xilosa. Para resolver este problema, existe un informa en el que se modifica el Corynebacterium glutamicum para que sea capaz de utilizar la xilosa introduciendo xilosa isomerasa (XylA) y xilulocinasa (XylB) derivadas de Escherichia coli (Kawaguchi y col., AEM 72:3418-3428, 2006).

El documento WO2009/12073 desvela cepas de Zymomonas modificadas por la introducción de un gen de xilosa isomerasa que contiene un promotor mutante del gen de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Z. mobilis. El promotor dirige un aumento de expresión de xilosa isomerasa, y cuando la cepa se modifica además para la expresión de xilulocinasa, transaldolasa y transcetolasa, se obtenía una mejora en la utilización de la xilosa.

Los presentes autores han hecho extensos esfuerzos para producir un L-aminoácido de manera más económica, y como resultados, descubrieron que cuando los genes que codifican XylA y XylB derivados de Erwinia carotovora se introducían en Corynebacterium glutamicum, la variante era capaz de utilizar la xilosa para producir L-lisina y también demuestran una capacidad de utilizar la xilosa mejorada que la conocida previamente para el microorganismo Corineforme en que se había introducido una XylA y XylB derivadas de Escherichia coli, completando de esta manera la presente divulgación.

Sumario

Un objetivo de la presente divulgación es la provisión de un microorganismo de Corynebacterium sp. modificado que es capaz de producir L-lisina utilizando xilosa.

Otro objetivo de la presente divulgación es la provisión de un procedimiento para producir L-lisina utilizando el microorganismo de Corynebacterium sp. modificado.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra un mapa de escisión de un vector de expresión pECCG122-pcj7-xylAB(Er) de la presente divulgación;

La FIG. 2 muestra un gráfico que presenta las características de cultivo de una cepa parental y un transformante al que se ha introducido el vector de expresión de acuerdo con una fuente de carbono contenida en un medio; y La FIG. 3 muestra un gráfico que presenta las características de cultivo de una cepa parental y un transformante en el que se ha insertado pcj7-xylAB(Er) en el cromosoma de acuerdo con una fuente de carbono contenido en un medio.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un microorganismo de Corynebacterium sp. capaz de producir L- lisina utilizando xilosa, que se caracteriza porque se han introducido en el mismo las actividades de xilosa isomerasa y xilulocinasa derivadas de Erwinia carotovora.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “xilosa isomerasa (XyIA)” significa una enzima que cataliza una reacción de isomerización de xilosa a xilulosa, que está implicada en la ruta metabólica de la xilosa, y con respecto al objetivo de la presente divulgación, puede ser una enzima derivada de Erwinia carotovora.

La XyIA es una xilosa isomerasa derivada de Erwinia carotovora y puede incluir una secuencia capaz de proporcionar la capacidad de utilizar la xilosa introduciendo su actividad junto con la actividad de la xilulocinasa derivad de Erwinia carotovora en el microorganismo de Corynebacterium sp. que no tiene actividad xilosa isomerasa, sin limitación. Además, es evidente que cualquier secuencia que tenga una actividad equivalente a la de la secuencia anterior, aunque no se derive de Erwinia carotovora, está incluida en la presente divulgación.

Por ejemplo, se puede incluir una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos que contiene una secuencia conservada de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una sustitución, eliminación, inserción, adición o inversión de un aminoácido o varios aminoácidos (que puede variar dependiendo de las posiciones y tipos de restos de aminoácidos en la estructura tridimensional de la proteína, específicamente 2 a 20, específicamente 2 a 10, más específicamente 2 a 5 aminoácidos)( en una o más posiciones. Se puede incluir a condición de que sea capaz de mantener o aumentar la actividad de XyIA, una secuencia de aminoácidos que tenga un 95 % o más, mucho más específicamente un 97 % o más de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y la sustitución, eliminación, inserción, adición o inversión del aminoácido también incluye una secuencia mutada de origen natural en el microorganismo que tenga actividad XyIA o una secuencia modificada artificialmente.

Como se utiliza en el presente documento, el término “homología” se refiere a la identidad entre dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de nucleótidos diferentes, y se puede determinar por un procedimiento bien conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, BLAST 2.0, que calcula los parámetros tales como la valoración, identidad y similitud, pero no se limita particularmente al mismo.

Como se utiliza en el presente documento, el término “xilulocinasa” significa una enzima que cataliza la reacción de producción de xilulosa a xilulosa 5-fosfato, que está implicada en la ruta metabólica de la xilosa, y con respecto al objetivo de la presente divulgación, puede ser una enzima derivada de Erwinia carotovora.

La XyIB es la xilulocinasa derivada de Erwinia carotovora y puede incluir una secuencia capaz de proporcionar la capacidad de utilizar la xilosa por la introducción de su actividad junto con la actividad de la xilosa isomerasa derivada de Erwinia carotovora en el microorganismo de Corynebacterium sp. que no tiene actividad xilulocinasa, sin limitación. Además, es evidente que cualquier secuencia que tenga una actividad equivalente a la secuencia anterior, aunque no se derive de Erwinia carotovora, está incluida en el ámbito de la presente divulgación.

Por ejemplo, se puede incluir una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que contienen una secuencia conservada de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 y una sustitución, eliminación, inserción, adición o inversión de un aminoácido o varios aminoácidos ( que pueden variar dependiendo de las posiciones y tipos de restos de aminoácidos en la estructura tridimensional de la proteína, específicamente de 2 a 20, específicamente de 2 a 10, más específicamente de 2 a 5 aminoácidos) en una o más posiciones. Se puede incluir a condición de que sea capaz de mantener o aumentar la actividad de XyIB, una secuencia de aminoácidos que tenga un 95 % o más, mucho más específicamente un 97 % o más de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y la sustitución, eliminación, inserción, adición o inversión del aminoácido también incluye una secuencia mutada de origen natural en el microorganismo que tenga actividad XyIB o una secuencia modificada artificialmente.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “gen que codifica la xilosa isomerasa (XyIA) (de aquí en adelante (xyIA)" significa un polinucleótido que codifica la XyIA descrita anteriormente.

El gen puede incluir una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, una secuencia de nucleótidos que se pueda hibridar con una sonda derivada de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 en “condiciones rigurosas”, o una secuencia de nucleótidos en los que uno o varios nucleótidos esta/están sustituidos, eliminados, insertados, o añadidos en una o más posiciones de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3. A condición de que sea capaz de mantener o aumentar la actividad de XyIA, el gen puede incluir una secuencia de nucleótidos que tenga un 80 % o más, específicamente un 90 % o más, más específicamente un 95 % o más, mucho más específicamente un 97 % o más de homología con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, una secuencia de nucleótidos sustituida con codones favorecidos por las células huésped, una secuencia de nucleótidos en la que se ha extendido o eliminado el extremo N o el extremo C, o una secuencia de nucleótidos en la que el codón de inicio se ha modificado para modificar el nivel de expresión, y de esta manera el gen no está particularmente limitado a los mismos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “gen que codifica la xilulocinasa (XylB) (de aquí en adelante (xyIB)" significa un polinucleótido que codifica la XyIB descrita anteriormente.

El gen puede incluir una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4, una secuencia de nucleótidos que se pueda hibridar con una sonda derivada de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 en “condiciones rigurosas”, o una secuencia de nucleótidos en los que uno o varios nucleótidos esta/están sustituidos, eliminados, insertados, o añadidos en una o más posiciones de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4. A condición de que sea capaz de mantener o aumentar la actividad de XyIB, el gen puede incluir una secuencia de nucleótidos que tenga un 80 % o más, específicamente un 90 % o más, más específicamente un 95 % o más, mucho más específicamente un 97 % o más de homología con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4, una secuencia de nucleótidos sustituida con codones favorecidos por las células huésped, una secuencia de nucleótidos en la que se ha extendido o eliminado el extremo N o el extremo C, o una secuencia de nucleótidos en la que el codón de inicio se ha modificado para modificar el nivel de expresión, y de esta manera el gen no está particularmente limitado a los mismos.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “condiciones rigurosas” significa las condiciones que permiten una hibridación específica entre polinucleótidos, por ejemplo, la hibridación en un tampón de hibridación a 65 HC (3,53 SSC (0,15 M de NaCl/0,15 M de citrato sódico, pH 7,0), un 0,02% de Ficoll, un 0,02% de polivinilpirrolidona, un 0,02 % de seroalbúmina bovina, un 0,5 % de SdS, 2 mM de EDTA, 2,5 mM de NaH2PO4, pH 7), y se desvela una descripción detallada en la técnica relacionada (Molecular Cloning (A Laboratory Manual, J. Sambrook y col., Editores, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) o Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel y col., Editores, John Wiley & Sons, Inc., New York).

Como se ha descrito anteriormente la introducción de las actividades de XyIA y XyIB en un microorganismo de Corynebacterium sp. se puede llevar a cabo por distintos procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, hay un procedimiento de inserción de un polinucleótido que incluye las secuencia de nucleótidos que codifican XyIA y XyIB en un cromosoma, un procedimiento de introducción de un sistema de vector que incluye el polinucleótido en el microorganismo, un procedimiento de introducción de un potente promotor corriente arriba de las secuencias de nucleótido que codifican XyIA y XyIB, un procedimiento de introducción de xylA y xyIB con un promotor modificado, o un procedimiento de introducción de secuencias de nucleótidos modificadas que codifican XyIA y XyIB, o similares. Más específicamente, si se introducen secuencias de nucleótidos que codifican XyIA y XyIB, se puede utilizar el promotor pcj7 derivado de Corynebacterium ammoniagenes (Patente Coreana N° 10-0620092) como promotor para controlar la expresión de las mismas. En una realización de la presente divulgación, la adquisición de la capacidad de utilizar la xilosa se confirmó como la actividad del gen ajeno ausente en la cepa parental observada por la introducción de un vector de expresión o la inserción cromosómica.

Como se utiliza en el presente documento, el término “vector” se refiere a un producto de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que codifica la proteína diana, que está unida operativamente a una secuencia reguladora adecuada para expresar la proteína diana en una célula huésped. La secuencia reguladora incluye un promotor capaz de iniciar la transcripción, una secuencia operadora arbitraria para regular la transcripción, una secuencia que codifica un sitio de unión del ARNm al ribosoma, y secuencias para regular la terminación de la transcripción y la traducción. Una vez transformado en el huésped adecuado, el vector se puede replicar o funcionar independientemente del genoma huésped, o se puede integrar en el propio genoma.

El vector que se utiliza en la presente divulgación no está limitado específicamente y puede ser cualquier vector conocido en la técnica a condición de que pueda replicarse en el huésped. Ejemplos del vector que se utiliza normalmente pueden ser un plásmido, cósmido, virus y bacteriófago naturales o recombinantes. Por ejemplo, se pueden utilizar como el vector fago o el vector cósmido, pWE15, M13, XMBL3, XMBL4, XIXII, XASHII, XAPiI, M10, M11, Charon4A, Charon21A o similares. Como vector plasmídico ser pueden utilizar, tipo pBR, tipo pUC, tipo pBluescriptlI, tipo pGEM, tipo pTZ, tipo pCL, tipo pET o similares.

El vector útil en la presente divulgación no está limitado particularmente, y se puede utilizar el vector de expresión conocido. Específicamente un vector pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMwi18, pCCIBAC o similares.

Además, el vector que se utiliza en la presente divulgación puede ser un vector capaz de transformar células huésped, para insertar el polinucleótido que codifica la proteína diana en el cromosoma de la célula huésped. Ejemplos específicos del vector incluye, pero no se limita a, el vector lanzadera pECCG112 que puede auto- replicarse en ambas direcciones en E. coli /o bacterias de tipo Corineformes. (Patente coreana N° 10-0057684).

Como se utiliza en el presente documento, el término “transformación” significa una serie de operaciones para la introducción de un vector que incluye un polinucleótido que codifica la proteína diana en una célula huésped de manera que exprese la proteína codificada por el polinucleótido en la célula huésped. El polinucleótido que se va a introducir en la célula huésped puede tener cualquier formar, a condición de que se introduzca en la célula huésped y se exprese en ella. Por ejemplo, el polinucleótido se puede introducir en una célula huésped en forma de casete de expresión que es una estructura que incluye todos los elementos (un promotor unido operativamente al polinucleótido, una señal de terminación, un sitio de unión al ribosoma, una señal de terminación de la señal, etc.) necesarios para la auto-expresión. El casete de expresión puede estar en forma de un vector de expresión auto-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

replicable. Además, el propio polinucleótido se pude introducir en una célula huésped para unirse operativamente a una secuencia necesaria para la expresión en la célula huésped.

La célula huésped puede ser uno cualquiera de microorganismos procariotas, a condición de que sea capaz de producir L-lisina. Ejemplos de la célula huésped puede incluir microorganismos de Providencia sp., Corynebacterium sp. y Brevibacterium sp., específicamente, un microorganismo de Corynebacterium sp., y más específicamente Corynebacterium glutamicum. En una realización de la presente divulgación, cuando microorganismos de Corynebacterium sp. como KCCM11016P, KCCM10770P, KfCc10750, y CJ3P no tienen la capacidad de utilizar la xilosa se les introduce XyIA y XyIB derivadas de Erwinia carotovora, se les provee de la capacidad de utilizar la xilosa, y como resultado, pueden producir L-aminoácidos como la L-lisina utilizando la xilosas como fuente de carbono (Tablas 1 a 6).

Un microorganismo de Corynebacterium sp. que tiene la capacidad de producir L-lisina puede ser una variante resistente a un análogo de la L-lisina. El análogo de L-lisina inhibe el crecimiento de microorganismos Corineformes, pero esta inhibición se desensibiliza total o parcialmente cuando coexiste L-lisina en un medio. Ejemplos de análogos de L-lisina incluyen, pero no se limita oxa-L-lisina, hidroxamato de L-lisina, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), Y-metil L-lisina, a-clorocaprolactamo o similares. La variante que tiene resistencia a estos análogos de L- lisina se puede obtener por tratamiento de mutagénesis artificial convencional del microorganismo de Corineforme. Además, cuando se lleva a cabo la manipulación genética para inducir un microorganismo productor de L-lisina, se puede conseguir mejorando la expresión de uno o más genes que codifican enzimas implicadas en el sistema biosintético de L-lisina. Ejemplos de estos genes pueden incluir el gen de la dihidrodipicolinato sintasa (dapA), gen de aspatocinasa (lysC), gen de la dihidrodipicolinato reductasa (dapB), gen de diaminopimelato descarboxilasa (lysA), gen de la diaminopimelato deshidrogenasa (ddh), gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc), gen de la aspartato semialdehído deshidrogenasa (asd) y gen de aspartasa (aspa), pero no se limita a los mismos.

Como se utiliza en el presente documento, el término “L-lisina” es uno de los a-aminoácidos básicos, es un aminoácido esencial que no se sintetiza en el cuerpo, es uno de los L-aminoácidos, y tiene la fórmula química de NH2(CH2)4CH(NH2)COOH. La L-lisina se sintetiza a partir del oxaloacetato mediante la ruta biosintética de L-lisina, y una reductasa dependiente de NADPH cataliza un proceso intermedio para la biosíntesis de L-lisina. Durante el proceso biosintético de 1 molécula de L-lisina se consumen directamente 3 moléculas de NADPH por las correspondientes enzimas, y se utiliza indirectamente una molécula de NADPH.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “un microorganismo de Corynebacterium sp. capaz de producir L-lisina” significa un microorganismo de Corynebacterium sp. modificado para producir L-lisina a partir de xilosa, que se prepara introduciendo genes que codifican las enzimas implicadas en el metabolismo de xilosa y no se encuentran en el microorganismo de Corynebacterium sp. El microorganismo de Corynebacterium sp. puede ser pero no se limita particularmente a, Corynebacterium glutamicum, y las enzimas implicadas en el metabolismo de xilosa pueden ser, pero no se limitan particularmente a, XyIA y XyIB.

A este respecto, la línea celular puede ser de microorganismos de Corynebacterium sp., en que la expresión de uno o más de los genes que codifican las enzimas implicadas en el sistema biosintético de L-lisina están mejorados, y los genes que codifican las enzimas implicadas en el sistema biosintético de L-lisina puede ser, pero no se limita al gen de la dihidrodipicolinato sintasa (dapA), gen de aspatocinasa (lysC), gen de la dihidrodipicolinato reductasa (dapB), gen de diaminopimelato descarboxilasa (LysA), gen de la diaminopimelato deshidrogenasa (ddh), gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc), gen de la aspartato semialdehído deshidrogenasa (asd) y gen de aspartasa (aspa) o similares.

Además, la célula huésped puede ser una cepa mutante resistente a un análogo de L-lisina. La cepa mutante puede obtenerse por mutación del microorganismo de Corynebacterium sp. El análogo de L-lisina inhibe el crecimiento del microorganismo Corineforme, pero esta inhibición está desensibilizada total o parcialmente cuando coexiste la L- lisina en un medio. Ejemplos de análogos de L-lisina pueden ser, pero no se limitan particularmente a, preferentemente oxa-L-lisina, hidroxamato de L-lisina, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), Y-metil L-lisina, a- clorocaprolactamo o similares.

Entre tanto, en la presente divulgación, se pueden controlar adicionalmente las actividades de enzimas conocidas implicadas en la biosíntesis de L-lisina con el fin de mejorar la producción de L-lisina. Específicamente, en la presente invención, los genes asd, dapB, y ddh, que codifican cada uno las enzimas aspartato semialdehído deshidrogenasa, dihidrodipicolinato reductasa y diaminopimelato deshidrogenasa, se sobre-expresan para controlar adicionalmente las actividades de las enzimas, mejorando de esta manera la producción de L-lisina.

De acuerdo con una realización de la presente divulgación, los presentes autores seleccionaron el ECA0097(xylA) (SEQ ID NO: 1) y el ECA0096(xylB) (SEQ ID NO: 2) derivados de Erwinia carotovora (SCRI1043) como genes adecuados que codifican XyIA y XyIB para introducirlos en el microorganismo de Corynebacterium sp. (Ejemplo 1), y clonaron los genes seleccionados que codifican XyIA y XyIB de manera que se construye un vector de expresión pECCG122-pcj7-xylA-xylB (de aquí en adelante, pECCG122-pcj7-xylAB(Er)) que expresa xyIA y xyIB (de aquí en adelante, xylAB(Er)) al mismo tiempo. El vector de expresión se introdujo en el Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (este microorganismo se desvela como KFCC10881, y se re-depositó en una Autoridad depositaria

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

bajo el tratado de Budapest con el N° de acceso KCCM11016P, Patentes Coreanas N° 10-0159812 y 10-0397322) para preparar un transformante que sobre-exprese xylAB(Er). Se confirmó que el transformante preparado crecía utilizando xilosa como fuente de carbono (FlG. 2), y que producía L-lisina utilizando tanto glucosa como xilosa, o utilizando glucosa y xilosa al mismo tiempo (Tabla 1). Además, con el fin de expresar xylAB(Er) en el cromosoma, se construyó un vector recombinante para la inserción cromosómica, pDZTn-pcj7-xylAB(Er), y se transformaron en KCCM11016P, y mediante un segundo cruzamiento, un transformante KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er) que tiene el xylAB(Er) unido operativamente al promotor pcj7 en el transposón en el cromosoma. También se confirmó que el transformante crece utilizando xilosa como una fuente de carbono (FIG. 3), y produce L-lisina utilizando glucosa o xilosa, o utilizando glucosa y xilosa al mismo tiempo (Tabla 1). Además, con el fin de expresar xylAB (de aquí en adelante, xylAB(Ec)) y la introducción del xylAB(Er) derivado de Erwinia carotovora de la presente divulgación, se preparó una cepa (KCCM11016P-pcj7-xylAB(Ec)) introduciendo xylAB(Ec) en KCCM11016P, y su característica de capacidad de utilizar xilosa y de producción de L-lisina se compararon con la de KGCM11016P-pcj7-xylAB(Er). Como resultado, se descubrió que la tasa de consumo de xilosa de KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er) aumentó sorprendentemente en comparación con el de KCCM11016P-pcj7-xylAB(Ec)), indicando una mejora de la producción fermentadora de L-lisina (Tabla 3). Además con el fin de confirmar si distintos microorganismos de Corynebacterium sp. muestran los mismos resultados, se introdujo el pDZTn-pcj7-xylAB(Er) en una cepa productora de L-lisina KCCM10770P para preparar un transformante KCCM10770P-pcj7-xylAB(Er), y se confirmó que el transformante era capaz de producir L-lisina utilizando glucosa o xilosa y utilizando glucosa y xilosa al mismo tiempo (Tabla 4). También se introdujo pDZTn-pcj7-xylAB(Er) en otra cepa productora de L-lisina KFCC10750 (este microorganismo fue desvelado como KFCC10750 y se re-depositó en una Autoridad Depositaria Internacional bajo el Tratado de Budapest con el N° de acceso KCGM11347P, Patente Coreana N° 10-0073610) para preparar un transformante KFCC10750-pcj7-xylAB(Er). También se confirmó que este transformante es capaz de producir L- lisina utilizando glucosa o xilosa, o utilizando glucosa y xilosa al mismo tiempo (Tabla 5). Además, también se introdujo el pDZTn-pcj7-xylAB(Er) en la otra cepa productora de L-lisina CJ3P para preparar un transformante CJ3P- pcj7-xylAB(Er). También se confirmó que este transformate era capaz de producir L-lisina utilizando glucosa o xilosa, o utilizando glucosa y xilosa al mismo tiempo.

En consecuencia, los presentes autores diseñaron el transformante como “CA01-2195”, que crece utilizando xilosa en un medio y también produce L-lisina utilizando xilosa y glucosa en el medio, y que se depositó bajo el Tratado de Budapest en el Centro de Cultivo Coreano de Microorganismos (KCCM, localizado en Hongjae 1-Dong, Seodaemun- Gu, Seúl, Corea) el 29 de diciembre de 2011 con el N° de acceso KCCM11242P. Es decir, este depósito se reconoce por una Autoridad Depositaria Internacional bajo el Tratado de Budapest.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para producir L-lisina, que incluye las etapas de (i) cultivar el microorganismo de Corynebacterium sp. modificado que es capaz de producir L-lisina utilizando xilosa en un medio de cultivo que contiene xilosa como fuente de carbono, de manera que se obtiene un caldo de cultivo; y (ii) recuperar la L-lisina del caldo de cultivo.

Como se utiliza en el presente documento, el término “cultivar” significa que un microorganismo se cultiva en condiciones ambientales controladas artificialmente. En la presente divulgación, el procedimiento para cultivar el microorganismo de Corynebacterium sp. se puede llevar a cabo utilizan un procedimiento ampliamente conocido en la técnica. Específicamente, los ejemplos de procedimiento de cultivo incluyen el procedimiento discontinuo, semi- continuo o el proceso semi-continuo repetido de una manera continua, pero no se limita a los mismos.

El medio utilizado para el cultivo tiene que cumplir los requerimientos de un microorganismo específico de una manera apropiada mientras se controla la temperatura, pH, etc. en condiciones aeróbicas en un medio típico que contiene una fuente de carbono, fuente de nitrógeno, aminoácidos, vitaminas, etc. apropiadas. El medio de cultivo para la cepa de Corynebacterium se desvela (por ejemplo, Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981). Las fuentes de carbono posibles pueden incluir azúcares y carbohidratos tales como la sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón, y celulosa, además de una mezcla de glucosa y xilosa como fuente de carbono principal, aceites y grasas tales como al aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino, y grasa de coco, ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido esteárico, y ácido linoleico, alcoholes tales como glicerol y etanol, y ácidos orgánicos tales como el ácido acético. Estas sustancias se pueden utilizar individualmente o como mezclas. Las fuentes de nitrógeno posibles pueden incluir fuentes de nitrógeno inorgánico tales como amonio, sulfato amónico, cloruro amónico, acetato amónico, fosfato amónico, carbonato amónico, y nitrato amónico; aminoácidos tales como ácido glutámico, metionina, y glutamina; y fuentes de nitrógeno orgánico tal como peptona, NZ-amina, extracto de carne, extracto de levadura, extracto de malta, agua de macerado de maíz, hidrolizados de caseína, pescado o productos de descomposición del mismo, y aglutinado de soja desgrasada o productos de descomposición del mismo. Estas fuentes de nitrógeno se pueden utilizar individualmente o en combinación. El medio puede incluir fosfato dihidrógeno potásico, fosfato hidrógeno dipotásico o las sales que contienen sodio correspondientes como fuentes de fósforo. Las fuentes de fósforo posibles pueden incluir fosfato dihidrógeno potásico, fosfato hidrógeno dipotásico o las sales que contienen sodio correspondientes. Además, se pueden utilizar compuestos inorgánicos tales como cloruro sódico, cloruro cálcico, cloruro de hierro, sulfato magnésico, sulfato de hierro, sulfato de manganeso y carbonato cálcico. Además de las sustancias anteriores, se pueden incluir sustancias esenciales para el crecimiento, tales como aminoácidos y vitaminas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

También se pueden añadir precursores apropiados al medio de cultivo. Las sustancias mencionadas anteriormente se pueden añadir adecuadamente al medio de cultivo en modo discontinuo, semi-continuo o continuo durante el cultivo, pero no se limita particularmente a estos. El pH del cultivo se puede ajustar añadiendo adecuadamente compuestos básicos tales como el hidróxido sódico, hidróxido potásico, y amoniaco, o compuestos ácidos tales como el ácido fosfórico y ácido sulfúrico.

Se puede utilizar un agente anti-espumante tal como ésteres poliglicólicos de ácidos grasos para suprimir el desarrollo de espuma. Con el fin de mantener las condiciones aeróbicas, se puede introducir oxígeno o gas que contiene oxígeno (por ejemplo, aire) en el caldo de cultivo. La temperatura del caldo de cultivo normalmente es de 27 HC a 37 HC, específicamente de 30 HC a 35 HC. El cultivo se puede continuar hasta que la producción de L- lisina alcance el nivel deseado. Este objetivo puede conseguirse normalmente en 10 a 100 horas. La L-lisina se puede liberar en el medio de cultivo o incluirse en las células.

Además, la etapa de la recuperación de L-lisina del caldo de cultivo se puede llevar a cabo por un procedimiento conocido en la técnica. Específicamente, el procedimiento conocido para recuperar L-lisina es, pero no se limita particularmente a, específicamente, centrifugación, filtración, extracción, pulverización, secado, evaporación, precipitación, cristalización, electroforesis, solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación en sulfato amónico), cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrófoba, y exclusión por tamaño) o similares.

De aquí en adelante, las constituciones y efectos de la presente divulgación se describirán con más detalle en referencia a los Ejemplos. Sin embargo, estos Ejemplos son solamente con fines ilustrativos, y el ámbito de la divulgación no tiene la intención de limitarse por estos Ejemplos.

Ejemplo 1: Selección del gen ajeno

Se seleccionaron como genes ajenos los de Erwinia carotovora (ECA0097(xylA) derivada de SCRI1043) (aminoácidos SEQ ID NO: 1, nucleótidos SEQ ID NO: 3) y ECA0096(xylB) (aminoácidos: SEQ ID NO: 2, nucleótidos: SEQ ID NO: 4) para preparar un microorganismo de Corynebacterium sp. provisto de capacidad de utilizar xilosa.

Ejemplo 2: Construcción de un vector que exprese xylAB derivado de Erwinia carotovora

Los genes codificantes de XyIA y XyIB derivados de Erwinia carotovora seleccionados en el Ejemplo 1 se localizan muy cera entre ellos. La información (N° de acceso BX950851 acerca de xylA y xylB(Er) y la secuencia de nucleótidos circundante se obtuvo en US NIH GenBank, y basándose en la secuencia de nucleótidos obtenida, se sintetizaron los cebadores para la amplificación de xylAB(Er).

SEQ ID NO: 5: 5'-ACACATATGCAAGCCTATTTTGAACAGATC-3'

SEQ ID NO: 6: 5'-AGAACTAGTGCCTTTT GGTGGTGTTTAAGT-3'

Con el fin de obtener el fragmento xylAB(Er), se llevó a cabo una PCR utilizando el ADN cromosómico de la cepa SCRI1043 de Erwinia carotovora como matriz y un par de cebadores (SEQ ID NO: 5 y 6). Se utilizó la aDn polimerasa PfuUltra™ de alta fidelidad (Stratagene) como la polimerasa, y se llevó a cabo la PCR con una desnaturalización a 94 HC durante 5 minutos, seguido por repetición del ciclo 30 veces que incluye desnaturalización a 94 HC durante 30 segundos, hibridación a 56 HC durante 30 segundos y polimerización a 72 HC durante 3 minutos, y después la polimerización a 72 HC durante 7 minutos. Como resultado, se obtuvo un fragmento genético (SEQ ID NO: 18) de 3122 pb que contenía el xylAB(Er) (SEQ ID NO: 17) de 2844 pb. Con el fin de obtener el promotor pcj7 derivado de Corynebacterium ammoniagenes (KR0620092), se llevó a cabo la PCR utilizando el ADN genómico de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KR0620092) como matriz y un par de cebadores (SEQ ID NO: 15 y 16). Se utilizó la ADN polimerasa PfuUltra™ de alta-fidelidad (Stratagene) como la polimerasa, y se llevó a cabo la PCR con desnaturalización a 94 HC durante 5 minutos, seguido por la repetición del ciclo 30 veces que incluye desnaturalización a 94 HC durante 30 segundos, hibridación a 56 HC durante 30 segundos y polimerización a 72 HC durante 1 minuto, y después polimerización a 72 HC durante 7 minutos. Como resultado, se obtuvo un polinucleótido de 318 pb (SEQ iD NO: 14).

SEQ ID NO: 15: 5'-AATCTAGAAACATCCCAGCGCTA-3'

SEQ ID NO: 16: 5'-AAACTAGTC'ATATGTGTTTCCTTTCGTTG-3'

El pcj7 se clonó en el vector lanzadera E. coli-Corynebacterium pECCG122 utilizando enzimas de restricción, Xbal y Spel, y después se clonó el fragmento xylAB(Er) se clonó utilizando Ndel y Spel, obteniendo de esta manera el vector pECCG122-pcj7-xylAB(Er) (FIG.1). La FIG. 1 es un mapa de escisión del vector de expresión pECCG122- pcj7-xylAB(Er) de la presente divulgación.

Ejemplo 3: Desarrollo de la cepa productora de L-lisina a la que se ha introducido xylAB derivado de Erwinia carotovora y examen de la capacidad para utilizar xilosa

Cada vector de expresión pECCG122-pcj7-xylAB(Er) que se obtiene en el Ejemplo 2 se introdujo en Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (Patentes Coreanas N° 10-0159812 y 10-0397322) para preparar un transformante que exprese xylAB(Er), el Corynebacterium glutamicum CA01-2195.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Con el fin de comparar la capacidad de utilizar xilosa entre KCCM11016P y CA01-2195, se cultivaron las cepas en medio de siembra que contenía glucosa o xilosa como fuente de carbono y se compararon sus características de crecimiento. También se cultivaron en un medio de producción que contenía glucosa o xilosa como fuente de carbono y se compararon sus características de producción de L-lisina.

Primero, con el fin de comparar las características de crecimiento, se inocularon las cepas en 25 ml de medio de siembra [fuente de carbono (glucosa o xilosa) 10 g/l, peptona 10 g/l, extracto de levadura 10 g/l, urea 5 g/l, KH2PO4 8 g/l, MgSO47H2O 0,5 g/l, biotina 100 mg/l, tiamina-HCl 1 mg/l, pH 7,0], respectivamente. SE midió la absorbancia (DO600) del caldo de cultivo mientras se cultivaban las cepas a 30 DC durante 32 horas, y se compararon entre ellas (FIG. 2). La FIG. 2 es un gráfico que muestra las características de crecimiento de KCCM11016P y CA01-2195. de acuerdo con la fuente de carbono contenida en el medio, en la que (♦) indica la KCCM11016P cultivada en el medio que contenía glucosa, (■) indica la KCCM11016P cultivada en el medio que contenía xilosa, (▲) indica la CA01-2195 cultivada en el medio que contenía glucosa, y (X) indica la CA01-2195 cultivada en el medio que contenía xilosa.

Como se muestra en la FIG. 2, no había diferencia en las características de crecimiento entre KCCM11016P y CA01-2195 en el medio de siembra que contenía glucosa como fuente de carbono. Sin embargo en el medio que contenía xilosa como fuente de carbono, la CA01-2195 crecía a cierto nivel mientras que la KCCM11016P apenas crecía. Por lo tanto se puede ver que la CA01-2195 es capaz de crecer utilizando la xilosa contenida en el medio como única fuente de carbono.

A continuación, para comparar las características de producción de L-lisina entre KCCM11016P y CA01-2195, se inoculó 1 ml de caldo de cultivo en 24 ml de medio de producción [fuente de carbono, (NH4)2SO4 40 g/l, proteína de soja 2,5 g/l, solidos de macerado de maíz 5 g/l, urea 3 g/l, KH2PO4 1 g/l, MgSO47H2O 0,5 g/l, biotina 100 mg/l, tiamina-HCl 1 mg/l, CaCO3 30 g/l, pH 7,0], y se cultivaron a 35 DC y 200 rpm durante 72 horas. En este momento, se determinaron para utilizarse como fuentes de carbono 100 g/l de glucosa, 50 g/l de glucosa + 50 g/l de xilosa, y 70 g/l de glucosa + 30 g/l de xilosa. A continuación, se midieron la concentración de L-lisina, la concentración residual de xilosa y la concentración de glucosa residual en cada caldo de cultivo y se compararon.

[Tabla 1]

Cepa: Glucosa 100 g/l Glucosa 50 g/l + Xilosa 50 g/l Glucosa 70 g/l + Xilosa 30 g/l

: L-lisina R.X R.G L-lisina R.X R.G L-lisina R.X R.G

KCCM11016P: 42 - 0 21 50 0 29 30 0

CA01-2195: 42 - 0 40 0 0 41 0 0

R.X: xilosa residual (concentración de xilosa residual después de terminar la reacción) (unidades: g/l) R.G: glucosa residual (concentración de glucosa residual después de terminar la reacción)

Como se muestra en la Tabla 1, cuando se utilizaba el medio que no contenía xilosa (glucosa 100 g/l), la concentración de L-lisina producida en la cepa parental era equivalente a la de CA01-2195. Sin embargo, cuando se utilizaba el medio que contenía xilosa (glucosa 50 g/l + xilosa 50 g/l, y glucosa 70 g/l + xilosa 30 g/l), la CA01-2195 producía L-lisina consumiendo tanto glucosa como xilosa, mientras que la cepa parental producía L-lisina no consumiendo xilosa sino solo glucosa.

Este resultado indica que el microorganismo de Corynebacterium sp. que no tiene capacidad de utilizar la xilosa es capaz de consumir xilosa introduciendo el xylAB derivado de Erwinia carotovora.

Ejemplo 4: Construcción de un vector recombinante para la inserción cromosómica de xylAB derivado de Erwinia carotovora (pDZTn-pcj7-xylAB(Er)) y el vector recombinante para la inserción cromosómica de xylAB derivado de E. coli (pDZTn-pcj7-xylAB(Ec))

Para expresar el xylAB(Er) en el cromosoma, se construyó un vector recombinante pDZTn-pcj7-xylAB(Er) para la inserción cromosómica. Para obtener el fragmento pcj7-xylAB(Er), se llevó a cabo una PCR utilizando el pECCG122- pcj7-xylAB(Er) obtenido en el Ejemplo como matriz y un par de cebadores (SEQ ID NO: 7 y 8). Se utilizó la ADN polimerasa PfuUltra™ de alta-fidelidad (Stratagene) como polimerasa, y se llevó a cabo la PCR con desnaturalización a 94 DC durante 5 minutos, seguido por la repetición del ciclo 30 veces que incluía desnaturalización a 94 DC durante 30 segundos, hibridación a 56 DC durante 30 segundos y polimerización a 72 DC durante 3 minutos, y después polimerización a 72 DC durante 7 minutos. Como resultado, se obtuvo un fragmento genético de 3440 pb (SEQ ID NO: 9). En consecuencia el pcj7-xylAB(Er) de 3440 pb se clonó en el vector pDZTn (Patente Coreana N° 10-1126041) tratado con la enzima de restricción SpeI utilizando un kit In-Fusión BD, obteniendo de esta manera un vector recombinante pDZTn-pcj7-xylAB(Er).

SEQ ID NO: 7: 5'-GAGTTCCTCGAGACTAGTAGAAACATCCCAGCGCTA-3'

SEQ ID NO: 8: 5'-GATGTCGGGCCCACTAGGCCTTTTTGGTGGTGTTTA-3'

5

10

15

20

25

30

35

40

A continuación, para expresar el xylAB derivado de E. coli en el cromosoma, se construyó un vector recombinante pDZTn-pcj7-xylAB(Ec) para la inserción cromosómica. Para obtener el promotor pcj7, se llevó a cabo una PCR utilizando el fragmento pcj7 obtenido en el Ejemplo 2 como matriz y un par de cebadores (SEQ ID NO: 7 y 10). Se utilizó la ADN polimerasa PfuUltra™ de alta-fidelidad (Stratagene) como polimerasa, y se llevó a cabo la PCR con desnaturalización a 94 HC durante 5 minutos, seguido por la repetición del ciclo 30 veces que incluía desnaturalización a 94 HC durante 30 segundos, hibridación a 56 HC durante 30 segundos y polimerización a 72 HC durante 1 minuto, y después polimerización a 72 HC durante 7 minutos. Como resultado, se obtuvo un fragmento genético de 318 pb. Para obtener el fragmento xylAB(Ec), se llevó a cabo una PCR utilizando el ADN cromosómico de E. coli K12 como matriz y un par de cebadores (SEQ ID NO: 11 y 12). Se utilizó la ADN polimerasa PfuUltra™ de alta-fidelidad (Stratagene) como polimerasa, y se llevó a cabo la PCR con desnaturalización a 94 HC durante 5 minutos, seguido por la repetición del ciclo 30 veces que incluía desnaturalización a 94 HC durante 30 segundos, hibridación a 56 HC durante 30 segundos y polimerización a 72 HC durante 3 minutos, y después polimerización a 72 HC durante 7 minutos. Como resultado, se obtuvo el fragmento xylAB(Ec) de 3145 pb (SEQ ID NO: 13). En consecuencia se clonaron los productos de PCR de la región pcj7 de 318 pb y el xylAB(Ec) de 3145 pb en el vector pDZTn tratado con la enzima de restricción SpeI utilizando un kit In-Fusión BD, obteniendo de esta manera un vector recombinante pDZTn-pcj7-xylAB(Ec) final.

SEQ ID NO: 10: 5'-TCAAAATAGGCTTGCATGAGTGTTTCCTTTCGTTG-3'

SEQ ID NO: 11: 5'-CAAC:GAAAGGAAACACATGC'AAGCCTATTTTGAC-3'

SEQ ID NO: 12: 5'-GATGTCGGGGGCACTAGTGGTGTCATTAACACGCCA-3'

Ejemplo 5: Desarrollo de la cepa productora de L-lisina en la que se ha insertado el xylAB derivado de Erwinia y examen de la capacidad de utilizar xilosa

El vector pDZTn-pcj7-xylAB(Er) preparado se transformó en KCCM11016P, y mediante un segundo cruzamiento, se obtuvo una cepa KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er) que tenía el xylAB(Er) con sustitución de una copia del promotor pcj7 en el transposón del cromosoma.

Para comparar la capacidad de utilización de xilosa entre KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er) y KCCM11016P, se cultivaron en un medio de siembra que contenía glucosa y xilosa como fuente de carbono, y se compararon sus características de crecimiento, y se cultivaron en un medio de producción que contenía glucosa o xilosa como fuente de carbono y se compararon sus características de producción de L-lisina, de la misma manera que en el Ejemplo 3.

La FIG. 3 es un gráfico que muestra las características de crecimiento del as cepas de acuerdo con la fuente de carbono contenida en el medio, en el que (♦) indica la KCCM11016P cultivada en el medio que contenía glucosa, (■) indica la KCCM11016P cultivada en el medio que contenía xilosa, (A) indica la KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er) cultivada en el medio que contenía glucosa, y (X) indica la KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er) cultivada en el medio que contenía xilosa.

No había diferencias en las características de crecimiento entre la KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er) y KCCM11016P en el medio de siembra que contenía glucosa como fuente de carbono. Sin embargo, en el medio de siembra que contenía xilosa como fuente de carbono, la KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er) creía hasta un cierto nivel mientras que la KCCM11016P apenas crecía. Por lo tanto, se puede ver que cuando se inserta el xylAB(Er) en el cromosoma, la cepa es capaz de crecer utilizando la xilosa contenida en el medio.

A continuación se examinaron las características de producción de L-lisina de KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er) y KCCM11016P y se compararon entre ellas (Tabla 2).

[Tabla 2]

: L-lisina R.X R.G L-lisina R.X R.G L-lisina R.X R.G

KCCM11016P: 43.0 - 0 22,6 50 0 29,2 30 0

42.5: - 0 21,9 0 0 29,6 0 0

KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er): 42.8 - 0 42,1 0 0 42,6 0 0

43.1: - 0 42,0 0 0 42,2 0 0

R.X: xilosa residual (concentración de xilosa residual después de terminar la reacción) (unidades: g/l) R.G: glucosa residual (concentración de glucosa residual después de terminar la reacción)

Como se muestra en la Tabla 2, cuando se utilizaba el medio que no contenía xilosa (glucosa 100 g/l), la concentración de L-lisina producida en KCCM11016P era equivalente a la de la KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er). Sin embargo, cuando se utilizaba el medio que contenía xilosa (glucosa 50 g/l + xilosa 50 g/l, y glucosa 70 g/l + xilosa 30

5

10

15

20

25

30

35

g/l), la cepa KCCM11016P producía L-lisina consumiendo solo glucosa, mientras que la KCCM11016P-pcj7- xylAB(Er) producía L-lisina consumiendo tanto glucosa como xilosa.

Ejemplo 6: Preparación de la cepa productora de L-lisina a la que se ha insertado el xylAB derivado de E. coli y comparación de su capacidad para utilizar la xilosa con la cepa KCCM11016P-pcj7-xylAB(Ec)

Para comparar los efectos de mejora de la capacidad de utilización de xilosa entre la introducción de xylAB derivado de E. coli y la introducción de xylAB derivado de Erwinia carotovora de la presente divulgación, se preparó una cepa por la introducción de xylAB(Ec) en KCCM11016P, y se compararon las características de capacidad de utilización de xilosa y la producción de L-lisina con las de la KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er) preparada.

Para preparar una cepa con el xylAB(Ec) introducido, el vector pDZTn-pcj7-xylAB(Ec) preparado en el Ejemplo 4 se transformó en la KCCM11016P, y mediante un segundo cruzamiento, se obtuvo una cepa KCCM11016P-pcj7- xylAB(Ec) que tenía un xylAB(Ec) unido operativamente al promotor pcj7 en el transposón del cromosoma.

De la misma manera que en el Ejemplo 3, para comparar la capacidad de utilización de xilosa entre KCCM11016P- pcj7-xylAB(Er) y KCCM11016P-pcj7-xylAB(Ec), se cultivaron en el medio de producción que contenía 50 g/l de glucosa + 50 g/l de xilosa como fuente de carbono, y se compararon las características de producción de L-lisina, y para examinar la capacidad de utilización de xilosa, se midió la concentración de xilosa residual en el caldo de cultivo a las 15 horas (Tabla 3).

[Tabla 3]

: R.X(g/l) Lisina

: 45 h 72 h 72 h

KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er): 8,0 0 42,8

7,2: 0 42,2

KCCM11016P-pcj7-xylAB(Ec): 11,2 0 42,7

12,1: 0 42,4

R.X: xilosa residual (concentración de xilosa residual después de terminar la reacción) (unidades: g/l)_________________________________________________________

Como se muestra en la Tabla 3, las dos cepas demostraban una productividad de L-lisina similar. La tasa de consumo de xilosa de KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er) era más rápida que la de KCCM11016P-pcj7-xylAB(Ec), indicando una mejora en la productividad de la fermentación. Es decir, este resultado indica que la introducción de xylAB(Er) derivado de Erwinia carotovora de la presente divulgación muestra un efecto más excelente de mejora de la productividad de fermentación de L-lisina que la introducción del previo xylAB(Ec) derivado de E. coli.

Ejemplo 7: Desarrollo de la cepa derivada de KCCM10770P en la que se ha insertado xylAB derivado de Erwinia carotovora y examen de la capacidad de utilización de xilosa.

Para examinar si la introducción de xylAB(Er) presenta el mismo efecto en otras cepas productoras de L-lisina distintas de KCCM11016P. se introdujo el pDZTn-pcj7-xylAB(Er) en una cepa KCCM 10770P productora de L-lisina (Patente Coreana N° 10-0924065) que se depositó en una Autoridad Depositaria Internacional bajo el Tratado de Budapest. Después de la introducción por un procedimiento de pulso eléctrico, se obtuvo una cepa que tenía el xylAB(Er) con la sustitución de una copia del promotor pcj7 dentro del transposón del cromosoma mediante un segundo cruzamiento, y la cepa se llamó Corynebacterium glutamicum KCCM10770P-pcj7-xylAB(Er).

Se midieron la capacidad de utilización de la xilosa y la productividad de L-lisina del Corynebacterium glutamicum KCCM 10770P y Corynebacterium glutamicum KCCMl0770P-pcj7-xylAB(Er) de la presente invención de la misma manera que en el Ejemplo 3 (Tabla 4).

[Tabla 4]

Cepa: R.G R.X L-lisina

KCCM10770P: 0 50 23,8

0: 50 24,4

KCCM10770P-pcj7-xylAB(Er): 0 0 47,6

0
0: 47,5

Como se muestra en la Tabla 4, cuando se introducía el xylAB(Er) en la cepa KCCM 10770P productora de L-lisina, consumía completamente la xilosa, a pesar de que la cepa parental no pueda utilizar la xilosa, y su productividad de

5

10

15

20

25

30

35

L-lisina también aumentaba.

Este resultado apoya que cuando el xylAB derivado de Erwinia carotovora se introduce en distintos microorganismos de Corynebacterium sp. así como en microorganismos de Corynebacterium sp. especificado por un cierto Número de Acceso, consumen completamente la xilosa como fuente de carbono, produciendo eficazmente de esta manera aminoácidos tales como la L-lisina.

Ejemplo 8: Desarrollo de la cepa derivada de KFCC10750 en la que se inserta el xylAB derivado de Erwinia carotovora y examen de la capacidad de utilización de xilosa

Para examinar si la introducción de xylAB(Er) presenta el mismo efecto en otras cepas productoras de L-lisina diferentes de KCCM11016P, se introdujo el pDZTn-pcj7-xylAB(Er) en una cepa KFCC10750 productora de L-lisina (Patente Coreana N° 10-0073610). Después de la introducción con un procedimiento de pulso eléctrico, se obtuvo una cepa que tenía el xylAB(Er) con una sustitución de una copia del promotor pcj7 dentro del transposón del cromosoma mediante un segundo cruzamiento, y la cepa se denominó Corynebacterium glutamicum KFCC10750- pcj7-xylAB(Er).

La capacidad de utilización de xilosa y productividad de L-lisina de Corynebacterium glutamicum KFCC10750 y Corynebacterium glutamicum KFCC10750-pcj7-xylAB(Er) de la presente divulgación se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 3 (Tabla 5).

[Tabla 5]

Cepa: R.G R.X L-lisina

KFCC10750: 0 50 19,7

0: 50 18,8

KFCC 10750-pcj7-xylAB(Er): 0 0 38,3

0
0: 38,6

Como se muestra en la Tabla 5, cuando se introdujo el xylAB(Er) en la cepa KFCC10750 productora e L-lisina, consumía completamente la xilosa, a diferencia de la cepa parental que no podía utilizar la xilosa, y su productividad de L-lisina también estaba aumentada.

Este resultado apoya que cuando un xylAB derivado de Erwinia carotovora se introduce en distintos microorganismos de Corynebacterium sp. así como microorganismos de Corynebacterium sp. especificados por un cierto Número de Acceso, consumían completamente la xilosa como fuente de carbono, produciendo eficazmente de esta manera aminoácidos tales como la L-lisina.

Ejemplo 9: Desarrollo de la cepa derivada de CJ3P en la que se ha insertado xylAB derivado de Erwinia carotovora y examen de la capacidad de utilización de xilosa

Para examinar si la introducción de xylAB(Er) presentaba el mismo efecto en otras cepas productoras de L-lisina distintas de KCCM11016P, se introdujo el pDZTn-pcj7-xylAB(Er) en una cepa CJ3P productora de lisina. La cepa CJ3P es una cepa de Corynebacterium glutamicum que tiene la capacidad para producir L-lisina por la introducción de las mutaciones P458S, V59A, y T311I en 3 tipos de genes pyc, hom, y lysC de la cepa de tipo silvestre, basándose en la técnica expuesta por Binder y col. (Genome Biology 2102, 13:R40). Después de la introducción por un procedimiento de pulso eléctrico, se obtuvo una cepa que tenía xylAB(Er) con la sustitución de una copia del promotor pcj7 en el transposón sobre el cromosoma mediante un segundo cruzamiento, y la cepa se llamó Corynebacterium glutamicum CJ3P-pcj7-xylAB(Er).

La capacidad de utilización de xilosa y productividad de L-lisina de Corynebacterium glutamicum CJ3P y Corynebacterium glutamicum CJ3P-pcj7-xylAB(Er). de la presente divulgación se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 3 (Tabla 6).

[Tabla 6]

Cepa: R.G R.X L-lisina

CJ3P: 0 50 4,0

: 0 50 4,5

5

10

15

20

25

30

35

40

(continuación)

Cepa: R.G R.X L-lisina

CJ3P-pcj7-xylAB(Er): 0 0 8,5

: 0 0 9,0

Como se muestra en la Tabla 6, cuando se introducía el xylAB(Er) en la cepa CJ3P productora de L-lisina, consumía completamente la xilosa, a diferencia de la cepa parental que no podía utilizar la xilosa, y su producción de L-lisina también aumentaba.

Este resultado apoya que cuando el xylAB de Erwinia carotovora se introduce en distintos microorganismos de Corynebacterium sp. así como los microorganismos de Corynebacterium sp. especificados por un cierto Número de Acceso, consumen completa mente la xilosa como fuente de carbono, produciendo eficazmente de esta manera aminoácidos tales como la L-lisina.

Por lo tanto, el microorganismo de Corynebacterium sp. que expresan xylAB(Er) es capaz de crecer utilizando xilosa en un medio, y también es capaz de producir L-lisina utilizando xilosa y glucosa en un medio.

Efecto de la divulgación

Cuando se utiliza el microorganismo de Corynebacterium sp. de la presente divulgación que es capaz de producir L- lisina utilizando xilosa, la L-lisina se puede producir utilizando xilosa como el segundo carbohidrato lignocelulósico más abundante en la naturaleza. Por lo tanto, el microorganismo se puede utilizar ampliamente para la producción eficaz y económica de L-lisina.

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> Corynebacterium sp. que tiene disponibilidad de xilosa y un procedimiento para preparar L-lisina empleando el mismo

<130> OPA12193/PCT

<150> KR 10-2012-0003133 <151>

<160> 18

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1 <211>439 <212> PRT

<213> Erwinia carotovora <220>

<221> PÉPTIDO <222> (1)..(439)

<223> XylA

<400> 1

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un microorganismo de Corynebacterium sp. modificado capaz de producir L-lisina utilizando xilosa, en el que el microorganismo comprende la xilosa isomerasa (XylA) y xilulocinasa (XylB) derivadas de Erwinia carotovora,

en el que la XylA comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 5 un 95 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y en el que XylB comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácido que tiene un 90 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
2. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que XylA es codificada por una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 3, y XylB es codificada por una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 4.

10 3. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el microorganismo en Corynebacterium

glutamicum.
4. Un procedimiento de producción del microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la introducción de las actividades de XylA y XylB se lleva a cabo insertando un polinucleótido que incluye las secuencias de nucleótidos que codifican XylA y XylB en un cromosoma, introduciendo un sistema de vector que incluye el

15 polinucleótido en el microorganismo, corriente arriba de las secuencias de nucleótido que codifican XylA y XylB, introduciendo XylA y XylB con un promotor modificado, o introduciendo las secuencias de nucleótido modificadas que codifican XylA y XylB.
5. Un procedimiento de producción de L-lisina, que comprende las etapas de:

(i) cultivar un microorganismo de Corynebacterium sp. modificado capaz de producir L-lisina utilizando xilosa de

20 acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en un medio de cultivo que contiene como una fuente

de carbono para obtener un caldo de cultivo; y

(ii) recuperar L-lisina del caldo de cultivo.

imagen1

imagen2