ES2918459T3 - Microorganismo del género Escherichia que produce L-triptófano y método para producir L-triptófano mediante el uso del mismo - Google Patents
Microorganismo del género Escherichia que produce L-triptófano y método para producir L-triptófano mediante el uso del mismo Download PDFInfo
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Abstract
La presente aplicación se relaciona con un microorganismo del género Escherichia que produce L-triptófano y, más específicamente, con un microorganismo del género Escherichia con una actividad mejorada de la producción de L-triptófano debilitando o inactivando la actividad de 6-fosfogluconato deshidratasa y 2- endógena y 2- Keto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa. Además, la presente aplicación se relaciona con un método para producir L-triptófano utilizando el microorganismo del género Escherichia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Microorganismo del género Escherichia que produce L-triptófano y método para producir L-triptófano mediante el uso del mismo
Campo Técnico
La presente solicitud se refiere a un microorganismo del género Escherichia que produce L-triptófano y un método para producir L-triptófano mediante el uso de este microorganismo.
Antecedentes de la Técnica
El L-triptófano, que es un aminoácido esencial, se ha usado ampliamente como un aditivo para piensos, etc., y además como materia prima para productos farmacéuticos, tales como soluciones de infusión e ingredientes de alimentos saludables. El L-triptófano se puede producir por un método de síntesis química, un método de reacción enzimática, un método de fermentación, etc., pero en la actualidad se usa principalmente el método de fermentación directa mediante el uso de un microorganismo.
Con respecto a la dirección del desarrollo de una cepa productora de L-triptófano, el desarrollo progresó inicialmente mediante la selección de mutaciones (patente coreana núm. 1987-0001813), o por métodos para superar la inhibición por retroalimentación del triptófano por parte de las enzimas en las rutas de biosíntesis junto con la ingeniería genética, o por el aumento de la síntesis de enzimas en procesos metabólicos, tales como el aumento de la expresión de las enzimas de biosíntesis de triptófano.
Mientras tanto, previamente se describe un método para mejorar los L-aminoácidos mediante el uso de la ruta de Entner-Doudoroff (patente de Estados Unidos núm. 7432085). La patente de Estados Unidos núm. 7432085 se refiere a un método para mejorar la producción de un L-aminoácido que se produce por una ruta de biosíntesis que utiliza ácido pirúvico como un intermediario, al aumentar las actividades de las enzimas involucradas en la ruta de Entner-Doudoroff, y específicamente, una característica clave de la patente es aumentar la actividad de 6-fosfogluconato deshidratasa o 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa.
Sin embargo, los presentes inventores han confirmado por primera vez que, en el caso del L-triptófano, a diferencia de otros L-aminoácidos, cuando las actividades de 6-fosfogluconato deshidratasa y 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa en la ruta de Entner-Doudoroff se inactivan, la capacidad de producir L-triptófano se puede mejorar significativamente, de esta manera se completa la presente invención con respecto al microorganismo del género Escherichia con una capacidad mejorada de producir L-triptófano y un método para producir L-triptófano mediante el uso del microorganismo.
Descripción
Problema Técnico
Un objetivo de la presente solicitud es proporcionar un microorganismo que produce L-triptófano.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para producir eficazmente L-triptófano mediante el uso del microorganismo que produce L-triptófano.
Solución Técnica
Para lograr los objetivos anteriores, en un aspecto, la presente solicitud proporciona un microorganismo del género Escherichia que produce L-triptófano mediante la inactivación de las actividades endógenas de la 6-fosfogluconato deshidratasa (edd) y la 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa (eda).
La invención proporciona un microorganismo del género Escherichia que produce L-triptófano, en donde se inactivan las actividades endógenas de la 6-fosfogluconato deshidratasa (Edd) y la 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa (Eda). La invención proporciona además un método para preparar L-triptófano, que comprende: cultivar el microorganismo del género Escherichia de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un medio; y recuperar L-triptófano del medio de cultivo o del microorganismo que se cultiva.
Como se usa en la presente descripción, el término "L-triptófano", se refiere a un L-aminoácido aromático, que es un a-aminoácido y un aminoácido esencial que no se sintetiza in vivo que tiene una fórmula química de C11H12N2O2. Como se usa en la presente descripción, el término "ruta de Entner-Doudoroff' se refiere a una ruta metabólica del carbono presente en un microorganismo del género Escherichia, que es una ruta que cataliza la conversión de fuentes de carbono que se introducen en la ruta metabólica del carbono en gliceraldehído-3-fosfato y piruvato a
través de una reacción enzimática en serie de dos etapas por la 6-fosfogluconato deshidratasa y la 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa.
Como se usa en la presente descripción, el término "6-fosfogluconato deshidratasa (Edd; EC 4.2.1.12)" se refiere a una enzima involucrada en la ruta de Entner-Doudoroff, que cataliza la reacción de conversión de 6-fosfo-D-gluconato en 2-dihidro-3-desoxi-6-fosfo-D-gluconato. Específicamente, la enzima puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, pero cualquier secuencia que tenga la actividad de la enzima se puede incluir sin limitación. Adicionalmente, en una modalidad ilustrativa, el gen que codifica la 6-fosfogluconato deshidratasa se puede representar por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, pero cualquier secuencia que codifique la enzima se puede incluir sin limitación.
Como se usa en la presente descripción, el término "2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa (Eda; EC 4.1.2.14)" se refiere a una enzima involucrada en la ruta de Entner-Doudoroff, que cataliza la reacción de conversión de 2-dihidro-3-desoxi-6-fosfo-D-gluconato en gliceraldehído-3-fosfato y piruvato. Específicamente, la enzima puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, pero cualquier secuencia que tenga la actividad de la enzima se puede incluir sin limitación. Adicionalmente, en una modalidad ilustrativa, el gen que codifica la 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa se puede representar por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4, pero cualquier secuencia que codifique la enzima se puede incluir sin limitación.
Cada una de las enzimas que se describieron anteriormente se pueden incluir sin limitación, además de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 1 a 3, cualquier secuencia de aminoácidos que tenga una homología del 70 % o mayor, específicamente 80 % o mayor, más específicamente 90 % o mayor, incluso más específicamente 95 % o mayor, aún incluso más específicamente 98 % o mayor, y aún más específicamente 99 % o mayor, con cada una de las secuencias de aminoácidos enumeradas anteriormente, siempre que la enzima exhiba un efecto sustancialmente igual o correspondiente a cada una de las enzimas. Adicionalmente, es obvio que cualquier enzima modificada que tenga la homología que se describió anteriormente y tenga el efecto correspondiente a cada enzima puede pertenecer al alcance de la presente solicitud, aunque la enzima puede tener una secuencia de aminoácidos con una eliminación parcial, modificación, sustitución o adición.
Adicionalmente, los genes que codifican cada una de las enzimas pueden incluir además sin limitación, además de las secuencias de nucleótidos representadas por la SEQ ID NO 2 o 4, cualquier secuencia génica que codifique las enzimas, que tenga una homología del 80 % o mayor, específicamente 90 % o mayor, más específicamente 95 % o mayor, incluso más específicamente 98 % o mayor, y aún incluso más específicamente 99 % o mayor, con cada una de las secuencias de nucleótidos enumeradas anteriormente, siempre que la secuencia codifique una enzima que tenga un efecto sustancialmente igual o correspondiente a cada una de las enzimas. Adicionalmente, es obvio que cualquier secuencia de nucleótidos que tenga las homologías anteriores puede pertenecer al alcance de la presente solicitud, aunque la secuencia puede tener una eliminación parcial, modificación, sustitución o adición en esta. Como se usa en la presente descripción, el término "homología" se refiere a un porcentaje de identidad entre dos fracciones de polinucleótidos o de polipéptidos. La correspondencia de secuencia de una fracción con respecto a la otra se puede determinar mediante una práctica conocida en la técnica. Por ejemplo, la homología se puede determinar directamente mediante la alineación de la información de la secuencia (por ejemplo, parámetros tales como la puntuación, la identidad y la similitud) de dos moléculas polinucleotídicas o dos moléculas polipeptídicas mediante el uso de un programa informático (por ejemplo, BLAST 2.0) que esté fácilmente disponible y que sea capaz de alinear la información de la secuencia. Adicionalmente, la homología se puede determinar mediante la hibridación de los polinucleótidos bajo la condición de formar una cadena doble estable en las regiones homólogas y luego digerir la cadena hibridada con una nucleasa específica de cadena simple para determinar el tamaño de los fragmentos digeridos.
Como se usa en la presente descripción, el término "actividad endógena" se refiere a un estado activo de una enzima en un microrganismo en un estado natural o antes de la modificación.
Como se usa en la presente descripción, el término "debilitamiento de la actividad de una enzima en comparación con su actividad endógena" se refiere a un concepto que incluye un caso donde hay una disminución en la actividad de una enzima en un microorganismo en comparación con la que originalmente poseía en su estado natural o antes de la modificación, un caso donde el nivel de expresión total de la proteína es inferior al de la cepa de tipo salvaje o al de la cepa antes de la modificación del microorganismo se debe a la inhibición de la expresión o inhibición de la traducción del gen que codifica el mismo, o una combinación de estos.
Como se usa en la presente descripción, el término "inactivación" se refiere a un caso donde el gen que codifica una enzima en un microorganismo no se expresa en absoluto y un caso donde el gen se expresa pero no exhibe actividad en comparación con la cepa de tipo salvaje o la cepa antes de la modificación del microorganismo.
El debilitamiento o inactivación de una actividad enzimática se puede lograr mediante varios métodos que se conocen bien en la técnica. Los ejemplos de los métodos pueden incluir un método para sustituir el gen que codifica la enzima en el cromosoma con un gen mutado de modo que la actividad enzimática se pueda reducir, lo que incluye
el caso cuando se elimina la actividad enzimática; un método para introducir una modificación en la secuencia de control de la expresión del gen que codifica la enzima en el cromosoma; un método para sustituir la secuencia de control de la expresión del gen que codifica la enzima con una secuencia que tiene una actividad débil o nula; un método para eliminar una parte o la totalidad de un gen que codifica la enzima en el cromosoma; un método para introducir un oligonucleótido antisentido (por ejemplo, ARN antisentido), que inhibe la traducción del ARNm a una enzima por una unión complementaria al transcrito del gen en el cromosoma; un método para hacer imposible la unión del ribosoma mediante la formación de una estructura secundaria mediante la adición artificial de una secuencia de Shine-Dalgarno (SD) y su secuencia complementaria en el extremo frontal de la secuencia SD del gen que codifica la enzima; un método de ingeniería genética de transcripción inversa (RTE), que añade un promotor de manera que se transcriba inversamente en el extremo 3' del marco de lectura abierto (ORF) de la secuencia correspondiente, etc., e incluye además una combinación de estos, pero no se limitan a ellos.
Específicamente, el método para eliminar parte o la totalidad de un gen que codifica una enzima se puede realizar mediante la sustitución del polinucleótido que codifica una proteína diana endógena dentro del cromosoma con un polinucleótido o un gen marcador que tiene una eliminación parcial en la secuencia de ácido nucleico, mediante el uso de un vector para la inserción cromosómica en la bacteria. En una modalidad ilustrativa del método para eliminar parte o la totalidad de un gen, el gen se puede eliminar por recombinación homóloga.
Como se usa en la presente descripción, el término “parte”, aunque puede variar en dependencia de los tipos de polinucleótidos, se puede referir específicamente a de 1 nucleótido a 300 nucleótidos, más específicamente de 1 nucleótido a 100 nucleótidos, e incluso más específicamente de 1 nucleótido a 50 nucleótidos, pero no se limitan particularmente a ello.
Como se usa en la presente descripción, el término "recombinación homóloga" se refiere a la recombinación genética que se produce a través del entrecruzamiento en los loci de la cadena genética que tienen una homología mutua.
Específicamente, la secuencia de control de la expresión se puede modificar por la inducción de una modificación de la secuencia de control de la expresión a través de la eliminación, inserción, sustitución conservativa o no conservativa, o una combinación de estas en la secuencia de ácido nucleico de la secuencia de control de la expresión; o mediante la sustitución con un promotor más débil, etc. La secuencia de control de la expresión puede incluir un promotor, una secuencia operadora, una secuencia que codifica una región de unión a ribosomas y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción.
Además, la secuencia génica en el cromosoma puede modificarse mediante la inducción de una modificación en la secuencia por eliminación, inserción, sustitución conservativa o no conservativa, o una combinación de estas en la secuencia génica para debilitar aún más la actividad enzimática; o mediante la sustitución con una secuencia génica que se mejoró para tener una actividad más débil o una secuencia génica que se mejoró para no tener actividad. En una modalidad ilustrativa de la presente solicitud, se confirmó que la inactivación de la actividad se puede realizar mediante al menos un método de mutación seleccionado del grupo que consiste en una mutación por inserción que se realiza mediante la inserción de al menos un par de bases en el gen que codifica la 6-fosfogluconato deshidratasa y en el gen que codifica la 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa; una mutación por eliminación que se realiza al tener una eliminación en al menos un par de bases dentro del gen; y una mutación de transición o transversión de un par de bases que se realiza mediante la introducción de un codón sin sentido o un codón diferente en el gen. En la presente solicitud, el microorganismo del género Escherichia puede ser específicamente Escherichia coli, pero no se limita a ello.
Específicamente, la cepa original del microorganismo del género Escherichia que produce L-triptófano mediante la inactivación de las actividades de edd y eda puede no estar particularmente limitada siempre que el microorganismo pertenezca al género Escherichia. Por ejemplo, el microorganismo que produce L-triptófano puede ser un microorganismo en el que, para aumentar la ruta de biosíntesis, las actividades del gen en la ruta competitiva, el regulador en la ruta direccional del operón triptófano y el gen para introducir y descomponer el triptófano se debilitaron o inactivaron, y/o se sobreexpresó la actividad del operón triptófano. Los métodos para debilitar o inactivar la actividad son los mismos que se explicaron anteriormente, y los métodos que se conocen en la técnica se incluyen sin limitación. Adicionalmente, los métodos para sobreexpresar la actividad del operón triptófano que se conocen en la técnica se incluyen sin limitación. Por ejemplo, los métodos pueden incluir un método de introducción adicional de un polinucleótido, que incluye parte o la totalidad de la secuencia de nucleótidos del gen del operón o una región de control de la expresión que se introduce desde el exterior, en el cromosoma; un método para aumentar el número de copias mediante la introducción en un sistema vector; un método para aumentar la actividad del operón mediante la sustitución de la secuencia de control de la expresión que controla la expresión del gen con otra secuencia de control de la expresión, una modificación que tiene una mutación inducida en parte o la totalidad de la secuencia de nucleótidos de la región de control de la expresión y una introducción de una modificación del propio gen, etc., pero no se limitan a ellos. Específicamente, el microorganismo puede ser E. coli, en la que parte o la totalidad del gen pheA, el gen trpR, el gen mtr y el gen tnaAB se elimina y/o el operón triptófano se sobreexpresa.
En la presente solicitud, el gen edd, el gen eda, el gen pheA, el gen trpR, el gen mtr, el gen tnaAB y el operón triptófano, y las secuencias de proteínas que estos codifican se pueden obtener de una base de datos conocida, por ejemplo, GenBank de NCBI, pero no se limitan a ello. Adicionalmente, los detalles específicos con respecto al gen pheA, el gen trpR, el gen mtr y el gen tnaAB se pueden encontrar en la descripción de la patente coreana núm. 10 0792095.
A partir de las modalidades ilustrativas de la presente solicitud, se confirmó que, con respecto a la inactivación de las actividades de 6-fosfogluconato deshidratasa y 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa en diversas cepas originales, cualquier microorganismo del género Escherichia, independientemente de su cepa original, mejoró significativamente la producción de L-triptófano cuando las actividades de 6-fosfogluconato deshidratasa y 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa se inactivaron juntas.
La presente solicitud proporciona un método para preparar L-triptófano, que incluye el cultivo de un microorganismo del género Escherichia que produce L-triptófano mediante la inactivación de las actividades endógenas de la 6-fosfogluconato deshidratasa (edd) y la 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa (eda) de la presente solicitud; y recuperar L-triptófano del medio de cultivo o del microorganismo que se cultiva.
El medio y otras condiciones de cultivo que se usan para cultivar el microorganismo de la presente solicitud particularmente no se limitan, sino que se pueden usar cualquier medio convencional para el cultivo de microorganismos del género Escherichia. Específicamente, el microorganismo de la presente solicitud se puede cultivar en un medio convencional que contiene fuentes apropiadas de carbono, fuentes de nitrógeno, fuentes de fósforo, compuestos inorgánicos, aminoácidos y/o vitaminas, etc., en condiciones aeróbicas mientras se ajusta la temperatura, el pH, etc.
Los ejemplos de las fuentes de carbono a usar en la presente solicitud pueden incluir carbohidratos tales como glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, manitol, sorbitol, etc.; alcoholes tales como alcoholes de azúcar, glicerol, piruvato, lactato, citrato, etc.; y aminoácidos tales como ácido orgánico, ácido glutámico, metionina, lisina, etc. Adicionalmente, nutrientes orgánicos naturales tales como hidrolizado de almidón, melaza, melaza de caña, salvado de arroz, almidón de yuca, melaza de caña de azúcar, licor de maceración de maíz, etc., y específicamente, carbohidratos tales como glucosa y melaza pretratada estéril (es decir, melaza convertida en un azúcar reductor), etc. Además, se pueden usar sin limitación diversas otras fuentes de carbono en una cantidad adecuada. Estas fuentes de carbono se pueden usar solas o en una combinación de dos o más.
Los ejemplos de las fuentes de nitrógeno a usar en la presente solicitud pueden incluir compuestos inorgánicos, tales como amoniaco, sulfato de amonio, cloruro de amonio, acetato de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio, nitrato de amonio, etc.; aminoácidos, tales como ácido glutámico, metionina, glutamina, etc.; y fuentes de nitrógeno orgánico tales como peptona, NZ-amina, extracto de carne, extracto de levadura, extracto de malta, licor de maceración de maíz, hidrolizado de caseína, pescado o productos de descomposición de este, y torta de soja desgrasada o productos de descomposición de esta, etc. Estas fuentes de nitrógeno se pueden usar solas o en combinación de dos o más.
Los ejemplos de las fuentes de fósforo a usar en la presente solicitud pueden incluir fosfato monobásico de potasio, fosfato dipotásico dibásico, las correspondientes sales que contienen sodio, etc., pero no se limitan a ello. Los ejemplos de compuestos inorgánicos pueden incluir cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de hierro, sulfato de magnesio, sulfato de manganeso, carbonato de calcio, etc., y adicionalmente se pueden incluir aminoácidos, vitaminas y/o precursores adecuados para un medio de cultivo. Estos medios o precursores se pueden añadir a un cultivo mediante un cultivo discontinuo o un cultivo continuo.
En la presente solicitud, el pH de un cultivo se puede ajustar durante el cultivo por la adición de forma adecuada al cultivo de un compuesto tal como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoniaco, ácido fosfórico y ácido sulfúrico. Durante el periodo de cultivo, se puede añadir un agente antiespumante, tal como éster de poliglicol de ácido graso, para evitar la generación de espuma. Adicionalmente, se puede inyectar en el cultivo oxígeno o un gas que contenga oxígeno para mantener un estado aeróbico del cultivo; o se puede inyectar gas nitrógeno, hidrógeno o dióxido de carbono sin la inyección de un gas para mantener un estado anaeróbico o microaeróbico del cultivo. La temperatura del cultivo generalmente puede estar en un intervalo de 27 °C a 40 °C, y específicamente, de 30 °C a 37 °C, pero no se limita a ello. El cultivo se puede continuar hasta que se obtenga la cantidad de materiales útiles deseados, y específicamente de 10 horas a 100 horas, pero no se limita a ello.
El L-triptófano se puede recuperar mediante un método adecuado que se conoce en la técnica, por ejemplo, cultivo discontinuo, cultivo continuo o cultivo discontinuo alimentado, etc., de acuerdo con el método de cultivo de la presente solicitud.
La recuperación además puede incluir una etapa de purificación.
Los L-aminoácidos se pueden liberar en el medio de cultivo que se cultiva o se pueden contener en los microorganismos.
Efectos Ventajosos de la Invención
La presente solicitud proporciona un microorganismo del género Escherichia que produce L-triptófano mediante la inactivación de la actividad endógena de la 6-fosfogluconato deshidratasa y la 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa y, de este modo, la presente solicitud proporciona un efecto que el L-triptófano se puede producir con mayor rendimiento y con mayor eficiencia y rentabilidad mediante el uso del microorganismo.
Modos para llevar a cabo la invención
A continuación, la presente solicitud se describirá en detalle con ejemplos acompañantes. Sin embargo, los ejemplos que se describen en la presente descripción son solo para fines ilustrativos y no se deben interpretar como limitantes del alcance de la presente solicitud.
Ejemplo Comparativo 1: Preparación de una cepa original (ApheAAtrpRAmtrAtnaAB/pCL1920-Ptrc-trpO)
(1) Preparación de una cepa de tipo salvaje en la que se inactivan las proteínas que codifican los genes pheA, trpR, mtr y tnaAB
Para aumentar la ruta de biosíntesis del triptófano por la cepa original, el gen pheA, que es un gen en la ruta competitiva; el gen trpR, que es un regulador del operón triptófano y de la ruta direccional; el gen mtr, que es un gen para introducir triptófano; y los genes tnaA y tnaB, que son genes para introducir y descomponer triptófano, se inactivaron todos, y de esta manera se examina mejor la capacidad de producir triptófano del microorganismo de la presente solicitud. La corismato mutasa/prefenato hidratasa que codifica el gen pheA; el represor transcripcional trpR que codifica el gen trpR; el triptófano/indol: simportador de H+ por el gen mtr; y la triptofanasa y el triptófano: simportador de H+ que codifica los genes tnaA y tnaB en forma de un operón se inactivaron todos por recombinación homóloga de los genes en E. coli W3110 (ATCc® 39936™). Para este fin, se emplea el método de inactivación de una sola etapa mediante el uso de la recombinasa lambda Red que desarrollaron Datsenko KA y otros, y la inactivación se realizó en base al método que se describe en la patente coreana núm. 10-0792095. Las secuencias de los cebadores que se usan en el Ejemplo Comparativo 1 que se describe en la presente descripción, y el Ejemplo Comparativo 2 y los Ejemplos 1 y 3 que se describen a continuación se muestran en la Tabla 3 más abajo.
Específicamente, aproximadamente 1100 pares de fragmentos génicos se amplificaron por PCR mediante el uso del gen pKD3 como molde, junto con una parte del gen pheA que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 6 y los cebadores 1 y 2 que tienen una secuencia de nucleótidos parcial del gen de resistencia al cloranfenicol del gen pKD3. Luego, los fragmentos de ADN que se obtienen por PCR se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 %, se eluyeron y se usaron como molde para la segunda PCR. Para obtener los fragmentos de ADN 5' y 3' del gen pheA en E. coli, se amplificaron por PCR aproximadamente 250 pares de fragmentos génicos mediante el uso del cromosoma de E. coli W3110 como molde, junto con los cebadores 3 y 4 y los cebadores 5 y 6. Luego, los fragmentos de ADN que se obtienen por PCR se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 %, se eluyeron y se usaron como molde para la segunda PCR.
En lo anterior, las secuencias de nucleótidos de 18 pares entre el cebador 1 y el cebador 4 son complementarias y las secuencias de nucleótidos de 20 pares entre el cebador 2 y el cebador 5 son complementarias, y de este modo los fragmentos que se obtienen por el cebador 1 y el cebador 2, los que se obtienen por el cebador 3 y el cebador 4, y los que se obtienen por el cebador 5 y el cebador 6 se pueden unir como un solo fragmento. Los fragmentos de PCR que se obtienen de este modo se amplificaron 5 veces por PCR sin usar ningún cebador, se trataron con los cebadores 3 y 6 y se amplificaron de nuevo 25 veces por PCR. Como un resultado, se amplificaron fragmentos génicos con un tamaño de aproximadamente 1600 pares de bases.
Luego, E. coli W3110, que se transformó con pKD46, se preparó en células competentes de acuerdo con el método que desarrollaron Datsenko KA y otros, se introdujeron fragmentos génicos con un tamaño de aproximadamente 1600 pares de bases que se obtienen por PCR y se sembró en medio LB sólido que contiene cloranfenicol (30 mg/L). Después de confirmar por PCR que el gen pheA en la cepa que se obtiene de este modo era inactiva al tener un tamaño de 1600 pares de bases, se preparó la cepa E. coli W3110 ApheA.
De igual modo, las proteínas que codifica el gen trpR que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 8, el gen mtr que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 10, y los genes tnaA y tnaB que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 12 y 14 se inactivan mediante el uso de los cebadores de la Tabla 3, se construye de esta manera una cepa W3110 ApheAAtrpRAmtrAtnaAB.
(2) Preparación de vectores que se introducen con genes que exhiben la capacidad de producir triptófano
Para proporcionar la capacidad de producir triptófano a la cepa de tipo salvaje, W3110ApheAAtrpRAmtrAtnaAB, que se preparó anteriormente, se insertó al vector pCL1920 el promotor de Ptrc y el gen del operón triptófano y, de esta manera, se preparó pCL1920-Ptrc-trpO.
Específicamente, para insertar el promotor de Ptrc en el vector pCL1920, se recuperó el plásmido pCL1920, se trató con HindIII y PstI, y se preparó el promotor de Ptrc por PCR con la repetición de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 58 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 30 segundos mediante el uso de pTrcHis B (Invitrogen, EE. UU.) como molde junto con los cebadores 23 y 24. Los fragmentos del promotor de Ptrc que se obtienen de este modo se escindieron con HindIII y PstI y se ligaron con el vector pCL1920, se construye de esta manera un vector pCL1920-Ptrc.
Luego, para la construcción del vector pCL1920_Ptrc_trpO, se preparó el vector pCL1920-Ptrc por tratamiento con PstI y fosfatasa alcalina, y se amplificó el gen del operón triptófano a partir del ADN cromosómico de E. coli KCCM10812P (patente coreana núm. 10-0792095). El gen trpE, que es el primer gen del gen del operón correspondiente, tiene una forma de inhibición por retroalimentación. Para la amplificación se realizó PCR mediante el uso del ADN cromosómico de E. coli KCCM10812P como molde, junto con los cebadores 25 y 26 con la repetición de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 58 °C durante 30 segundos, y polimerización a 72 °C durante 5 minutos. Los fragmentos de ADN que se obtienen de este modo se trataron con PstI y se ligaron con el vector pCL1920-Ptrc que se preparó anteriormente, y el vector que se obtuvo como resultado se denomina pCL1920_Ptrc_trpO (SEQ ID NO: 15).
(3) Preparación de una cepa a la que se inserta un vector que contiene el operón triptófano
Después de preparar células competentes de la cepa que se prepara en el Ejemplo Comparativo 1 (1), se introdujo a la cepa el vector que se preparó en el Ejemplo Comparativo 1 (2) y, de esta manera, se preparó una cepa de tipo salvaje W3110 ApheAAtrpRAmtrAtnaAB/pCL1920-Ptrc-trpO que produce triptófano.
Ejemplo 1: Preparación de una cepa AeddAeda a partir de la cepa original del Ejemplo Comparativo 1
En la cepa de tipo salvaje W3110 ApheAAtrpRAmtrAtnaAB/pCL1920-Ptrc-trpO que se preparó en el Ejemplo Comparativo 1, el grupo de genes edd-eda se eliminó simultáneamente mediante recombinación homóloga y, de esta manera, se preparó una cepa en la que se inactivaron tanto la 6-fosfogluconato deshidratasa como la 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato, codificadas por el gen edd (SEQ ID NO: 2) y el gen eda (SEQ ID NO: 4).
Específicamente, para la preparación de la cepa anterior, se usó el método de inactivación de una sola etapa, que es una tecnología de generación de mutantes mediante el uso de la recombinasa lambda Red que desarrollaron Datsenko KA y otros. Como marcador para confirmar la inserción en un gen, se usa el gen de cloranfenicol de pUCprmfmloxC (publicación de solicitud de patente coreana núm. 2009-007554). Se amplificaron aproximadamente 1200 pares de fragmentos génicos por PCR con la repetición de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 1 minuto, mediante el uso de pUCprmfmloxC como molde junto con los cebadores 27 y 28 que tienen una parte del grupo de genes edd-eda y una secuencia de nucleótidos parcial del gen de resistencia al cloranfenicol del gen pUCprmfmloxC.
Adicionalmente, los fragmentos de ADN que se obtienen por amplificación por PCR se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 %, se eluyeron y se usaron como molde para la segunda PCR. La segunda PCR se diseñó para obtener 20 pares de secuencias de nucleótidos complementarias en las regiones 5' y 3' de los primeros fragmentos de ADN, y se amplificaron aproximadamente 1300 pares de fragmentos génicos por PCR con la repetición de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 1 minuto, mediante el uso del primer producto de PCR como molde junto con los cebadores 29 y 30, a los que se añadieron las regiones 5' y 3' del grupo de genes edd-eda. Los fragmentos de ADN que se obtienen de este modo se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 %, se eluyeron y se usaron para la recombinación.
La bacteria E. coli que se transformó con pKD46 de acuerdo con el método que desarrollaron Datsenko KA y otros, se preparó en un estado competente, y en esta se introdujo para su transformación el fragmento génico con un tamaño de 1300 pares de bases que se obtuvo por PCR. La cepa que se obtiene de este modo se selecciona de un medio LB que contiene cloranfenicol, y el producto de PCR que se obtiene mediante el uso de los cebadores 31 y 32 tenía un tamaño de 1626 pares de bases, lo que confirmó que el grupo de genes edd-eda se eliminó.
A la primera cepa recombinante que tiene resistencia al cloranfenicol, después de eliminar pKD46, se introdujo pJW168, se elimina de esta manera el gen marcador de cloranfenicol de la bacteria (Gene, (2000) 247, 255 - 64). La bacteria que se obtiene finalmente fue un producto que se amplifica por PCR, que se obtiene mediante el uso de los cebadores 31 y 32, que tiene un tamaño de 580 pares, de este modo se confirma que se realizó la eliminación deseada. Adicionalmente, después de preparar la cepa en un estado competente, la cepa se transformó mediante la introducción en esta del vector que se preparó en el Ejemplo Comparativo 1, se prepara de esta manera una cepa W3110ApheAAtrpRAmtrAtnaABAeddAeda/pCL1920-Ptrc-trpO que produce triptófano.
Ejemplo 2: Confirmación de la capacidad de producir triptófano de la cepa AeddAeda
La evaluación del título se realizó mediante el uso de la cepa que se preparó en el Ejemplo Comparativo 1 y el Ejemplo 1. Para la evaluación del título, la bacteria se inoculó con un asa de platino, se cultivó en medio LB sólido durante la noche y se inoculó con un asa de platino en cada matraz con 25 ml de medio de título que tiene la composición que se muestra en la Tabla 1 más abajo. Después de la inoculación, la cepa se cultivó a 37 °C a una velocidad de 200 rpm durante 42 horas, y los resultados que se obtienen se muestran en la Tabla 2 más abajo. Todos los resultados usados representan el valor promedio de los resultados que se obtienen en tres matraces diferentes.
Tabla 1
Tabla 2
Como resultado del experimento anterior, como se mostró en la Tabla 2 anterior, cuando se eliminó el grupo de genes edd-eda sugerido en la presente solicitud, no hubo una diferencia significativa en el consumo de glucosa en comparación con el de la cepa original del Ejemplo Comparativo 1, sin embargo, se demostró que la cantidad de producción de triptófano aumenta en aproximadamente un 32 % en comparación con la de la cepa original. Se cree que este resultado se debe al hecho de que la reacción procedió a ribulosa 5-fosfato sin pérdida de 6-fosfogluconato, que es un sustrato, por la eliminación en la ruta de Entner Doudoroff y, de este modo, no solo aumentó la cantidad de NADPH sino también la cantidad de 5-fosforribosil-1-pirofosfato (PRPP) y eritrosa 4-fosfato (E4P), se mejora de esta manera la capacidad de producir triptófano.
Ejemplo 3: Preparación de una cepa AeddAeda a partir de la cepa original depositada
La cepa E. coli KCCM11166P productora de L-triptófano (patente coreana núm. 10-1261147) que se depositó en el Centro de Cultivo de Microorganismos de Corea (KCCM) se trató de la misma manera que en el Ejemplo 1 y, de esta manera, se preparó una cepa KCCM11166PAeddAeda, en la que se eliminó el grupo de genes edd-eda.
Tabla 3
Ejemplo 4: Confirmación de la capacidad de producir triptófano de la cepa AeddAeda
La evaluación del título se realiza mediante el uso de la cepa depositada KCCM11166P y la cepa que se preparó en el Ejemplo 3.
Para la evaluación del título, la bacteria se inoculó con un asa de platino, se cultiva en medio LB sólido durante la noche y se inoculó con un asa de platino en cada matraz con 25 ml de medio de título que tiene la composición que se muestra en la Tabla 4 más abajo. Después de la inoculación, la cepa se cultivó a 37 °C a una velocidad de 200 rpm durante 42 horas, y los resultados que se obtienen se muestran en la Tabla 5 más abajo. Todos los resultados usados representan el valor promedio de los resultados que se obtienen en tres matraces diferentes.
Claims (6)
1. Un microorganismo del género Escherichia que produce L-triptófano, en donde se inactivan las actividades endógenas de la 6-fosfogluconato deshidratasa (Edd) y la 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa (Eda).
2. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la 6-fosfogluconato deshidratasa tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1.
3. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
4. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el microorganismo del género Escherichia es Escherichia coli.
5. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde una totalidad o una parte del gen pheA, el gen trpR, el gen mtr y el gen tnaAB se elimina adicionalmente.
6. Un método para preparar L-triptófano, que comprende:
cultivar el microorganismo del género Escherichia de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un medio; y
recuperar el L-triptófano del medio de cultivo o del microorganismo que se cultiva.
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