BR112018000074B1

BR112018000074B1 - Micro-organismo que produz l-lisina e método para produzir l-lisina com o uso do mesmo

Info

Publication number: BR112018000074B1
Application number: BR112018000074-4A
Authority: BR
Inventors: Peter Lee; Hyung Joon Kim; Hyang Choi; Song Gi Ryu; Sang Mok Lee
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2015-07-03
Filing date: 2016-06-27
Publication date: 2024-03-05
Also published as: EP3318637A4; JP6646075B2; US20180195097A1; JP2018518977A; KR101793328B1; EP3318637B1; CN107922954A; RU2683551C1; ES2790382T3; EP3318637A1; KR20170005350A; WO2017007159A1; PL3318637T3; MY171648A; HUE048882T2; US11104925B2; BR112018000074A2; CN107922954B

Abstract

micro-organismo para produzir l-lisina e método para produzir l-lisina com o uso do mesmo. a presente invenção se refere a um micro-organismo que produz l-lisina e a um método para produzir l-lisina utilizando-se o mesmo. mais especificamente, a presente revelação se refere a um micro-organismo do gênero corynebacterium, que é modificado de modo que a atividade de uma proteína envolvida em hidrólise de parede celular seja desativada em comparação com a atividade endógena da mesma; e um método para produzir l-lisina com o uso do mesmo.

Description

[CAMPO DA TÉCNICA]

[001] A presente invenção refere-se a um micro-organismo que produz L- lisina e a um método para produzir L-lisina com o uso do mesmo.

[ANTECEDENTES DA TÉCNICA]

[002] L-aminoácidos, em particular L-lisina, que são usados em rações animais, agentes terapêuticos para seres humanos ou na indústria de cosméticos, são produzidos principalmente através da fermentação com o uso de uma cepa do gênero Corynebacterium ou uma cepa do gênero Escherichia. Consequentemente, vários estudos estão em andamento para desenvolver cepas que produzem L-lisina em alto rendimento e tecnologia de fermentação das mesmas. No entanto, a pesquisa sobre o controle de lise celular, que pode causar diminuição da produtividade em últimos estágios de fermentação, é ainda insuficiente.

[003] Enquanto isso, as hidrolases de parede celular são conhecidas como enzimas que degradam paredes celulares bacterianas, e estão presentes em todos os micro-organismos que têm peptidoglicano (Rice KC & Bayles KW. Microbiol Mol Biol Rev. 2008. 72, 85 a 109. Embora a pesquisa sobre tais hidrolases de parede celular tenha sido executada em várias bactérias, seu mecanismo de controle preciso é ainda desconhecido.

[004] Um modelo para o mecanismo de lise celular que ocorre durante o cultivo de micro-organismos foi proposto recentemente em pneumococcus (Mellroth P et al. J Biol Chem. 2012. 287: 11.018 a 11.029). Especificamente, quando as células são expostas a vários tipos de estresses, uma atividade de hidrolase de parede celular presente na parede externa das células aumenta, assim, iniciando a decomposição da parede celular. Quando as células são dissolvidas pela ação contínua de tal hidrolase de parede celular, a hidrolase de parede celular presente no citoplasma é exposta ao exterior das células. Relatou- se que as células circundantes são dissolvidas quando uma série de processos ocorre de modo contínuo de modo que a quantidade da hidrólise de parede celular exceda um limiar exterior das células. No entanto, uma correlação entre a lise celular gerada durante o processo de cultura por fermentação e a produção de aminoácidos é ainda desconhecida.

[REVELAÇÃO] [PROBLEMA DA TÉCNICA]

[005] Os presentes inventores têm feito esforços para pesquisarem de modo contínuo um traço eficaz com capacidade para aumentar a produtividade de L-lisina em um micro-organismo do gênero Corynebacterium, que é uma cepa de produção de L-lisina representativa. Como resultado, os presentes inventores confirmaram que a produtividade de L-lisina aumentou quando um gene que codifica uma proteína envolvida em hidrólise de parede celular foi deficiente, e que o aumento na produtividade de lisina foi afetado quando um gene adicional que codifica uma proteína que tem uma função similar foi deficiente, assim, completando a presente revelação.

[SOLUÇÃO DA TÉCNICA]

[006] Um objetivo da presente revelação é fornecer um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L-lisina.

[007] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para preparar L-lisina com o uso do micro-organismo do gênero Corynebacterium, que produz L-lisina.

[EFEITOS VANTAJOSOS]

[008] O micro-organismo de acordo com a presente revelação é um microorganismo do gênero Corynebacterium, que é modificado de modo que uma atividade de uma proteína envolvida na hidrólise de parede celular seja reduzida ou inativada em comparação com uma atividade endógena da mesma. Isto é, o micro-organismo de acordo com a presente revelação é uma nova cepa que leva a um aumento na produtividade em um último estágio de fermentação e, assim, é aplicada como um paradigma inovador do micro-organismo do gênero Corynebacterium, que produz L-lisina, assim, fornecendo um micro-organismo com capacidade para produzir L-lisina em alto rendimento. Consequentemente, a L-lisina preparada pode ser aplicada não apenas a rações animais ou a aditivos de ração animal, mas também a vários produtos tais como alimentos para seres humanos, aditivos alimentícios, medicamentos, etc.

[MELHOR MODO]

[009] A fim de alcançar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação fornece um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L-lisina, que é modificado de modo que uma atividade de uma proteína envolvida na hidrólise de parede celular seja inativada em comparação com uma atividade endógena da mesma.

[010] Conforme usado no presente documento, o termo “proteína envolvida em hidrólise de parede celular” se refere a uma proteína relevante com capacidade para hidrolisar uma parede celular em um micro-organismo do gênero Corynebacterium. A proteína envolvida em hidrólise de parede celular pode ser uma hidrolase associada à parede celular ou a uma N-acetilmuramoil- L-alanina amidase, mas não se limita à mesma.

[011] Conforme descrito acima, desde que uma proteína tenha uma atividade de uma proteína relevante com capacidade para hidrolisar uma parede celular no micro-organismo, as sequências de proteína e gene podem ser obtidas a partir de um banco de dados conhecido. Além disso, Genbank de NCBI e etc. podem ser usados como exemplos do banco de dados conhecido, mas os mesmos não se limitam a isso.

[012] A hidrolase associada à parede celular pode ser uma proteína codificadora de gene NCgl1480, proteína codificadora de gene NCgl2107 ou proteína codificadora de gene NCgl2108 derivada de um micro-organismo do gênero Corynebacterium, especificamente de Corynebacterium glutamicum, mas sem se limitar à mesma. Como um exemplo específico, a hidrolase associada à parede celular pode ter o aminoácido de SEQ ID NOS: 1, 2 ou 3, mas pode incluir a sequência de proteínas que tem a atividade acima sem limitação. Além disso, quaisquer sequências de nucleotídeos podem ser incluídas na mesma sem limitação, desde que a mesma seja uma sequência de nucleotídeos que codifique uma proteína que tenha a atividade da hidrolase associada à parede celular. Como um exemplo específico, a mesma pode ser uma proteína codificada pelas sequências de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 5, 6 ou 7, mas sem se limitar às mesmas.

[013] A N-acetilmuramoil-L-alanina amidase pode ser uma proteína codificadora de gene NCgl2986 derivada de um micro-organismo do gênero Corynebacterium, especificamente de Corynebacterium glutamicum. Especificamente, a N-acetilmuramoil-L-alanina amidase pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, mas quaisquer sequências de aminoácidos da proteína que têm a atividade acima podem ser incluídas sem limitação. Além disso, qualquer sequência de nucleotídeos pode ser incluída sem limitação, desde que a sequência de nucleotídeos codifique uma proteína que tenha a atividade da N-acetilmuramoil-L-alanina amidase. Por exemplo, a mesma pode ser uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8, mas não é limitado à mesma.

[014] Cada uma das proteínas descritas acima pode incluir, sem limitação, além das sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOS, qualquer sequência de aminoácidos que tenha uma homologia das sequências de aminoácidos listadas acima de 80% ou mais alta, de preferência 90% ou mais alta, com mais preferência 95% ou mais alta, e com mais preferência ainda 97% ou mais alta, desde que as sequências de aminoácidos codifiquem proteínas que tenham um efeito substancialmente igual ao de cada uma das proteínas ou correspondente ao mesmo. Adicionalmente, é óbvio que qualquer proteína modificada que tem a homologia descrita acima pode pertencer ao escopo da presente revelação, embora a proteína possa ter uma sequência de aminoácidos com uma deleção, modificação, substituição ou adição parcial na mesma.

[015] Adicionalmente, os genes que codificam cada uma das proteínas da presente revelação podem incluir também, sem limitação, além das sequências de nucleotídeos descritas por SEQ ID NOS, qualquer sequência de genes que codifica as proteínas que tem homologia para cada uma das sequências de nucleotídeo listadas acima de 80% ou mais alta, de preferência 90% ou mais alta, com mais preferência de 95% ou mais alta, com mais preferência ainda 98% ou mais alta, e com a máxima preferência 99% ou mais alta, desde que as sequências de genes codifiquem uma proteína que tenha um efeito substancialmente igual ao de cada uma das proteínas ou correspondente ao mesmo. Adicionalmente, é óbvio que qualquer sequência de nucleotídeos que tem as homologias descritas acima pode pertencer ao escopo da presente revelação, embora a sequência possa ter uma deleção, modificação, substituição ou adição parcial na mesma.

[016] Conforme usado no presente documento, “homologia” se refere à similaridade nas sequências de nucleotídeos ou sequências de aminoácidos de gene que codifica uma proteína. Quando a homologia é suficientemente alta, os produtos do gene correspondente podem ser os mesmos ou podem ter uma atividade similar. Isto é, a mesma se refere a uma percentagem de identidade entre duas porções químicas de polinucleotídeo ou polipeptídeo. A correspondência de sequência a partir de uma porção química para outra pode ser determinada por uma técnica conhecida na arte. Por exemplo, a homologia pode ser determinada alinhando-se as informações de sequência de duas moléculas de polinucleotídeo ou duas moléculas de polipeptídeo diretamente utilizando-se um programa de computador que seja prontamente disponível e que tenha capacidade para alinhar informações de sequência. O programa de computador pode ser BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc), etc. Além disso, homologia pode ser determinada hibridizando-se os polinucleotídeos sob a condição para formar um filamento duplo estável nas regiões homólogas e, então, digerindo-se o filamento hibridizado por uma nuclease específica de filamento único para determinar um tamanho de um fragmento digerido.

[017] Conforme usado no presente documento, o termo “atividade endógena” se refere a uma atividade de proteína no estado antes de uma modificação de micro-organismo ou em seu estado nativo.

[018] Conforme usado no presente documento, o termo “atividade de uma enzima modificada para ser desativada em comparação com a sua atividade endógena” se refere a uma atividade em que um gene que codifica uma enzima não é expresso de forma alguma em comparação com a de uma cepa do tipo selvagem ou de uma cepa antes de uma modificação, ou se refere a uma redução ou eliminação de uma atividade mesmo quando o gene é expresso.

[019] Uma “inativação de uma atividade em comparação com a sua atividade endógena” se refere a uma redução ou eliminação da atividade quando comparada à que possuía em seu estado natural ou no estado antes de uma modificação. A redução é um conceito que se refere a um caso em que a atividade de uma enzima é reduzida em comparação com a que possuía originalmente pelo micro-organismo devido a uma modificação no gene codificador de enzima, um caso em que o nível de expressão de enzima global é menor do que da cepa do tipo natural do micro-organismo ou da cepa antes de uma modificação, ou uma combinação dos mesmos.

[020] A “eliminação de uma atividade” se refere a um caso em que um gene que codifica uma enzima não é expresso de maneira alguma em comparação àquele da cepa do tipo natural ou da cepa antes de uma modificação, e/ou se refere a um caso em que o gene é expresso, mas não exibe nenhuma atividade.

[021] O método de uma modificação para inativar a atividade de enzimapode ser alcançado pela aplicação de vários métodos bem conhecidos na técnica. Exemplos dos métodos podem incluir um método para substituir o gene que codifica a enzima no cromossomo com um gene que sofreu mutação de modo que a atividade de enzima possa ser reduzida, incluindo o caso em que a atividade de enzima é removida; um método para introduzir uma modificação na sequência de regulação de expressão do gene que codifica a enzima no cromossomo; um método para substituir a sequência de regulação de expressão do gene que codifica a enzima com uma sequência que tem uma atividade fraca ou nenhuma atividade; um método para deletar uma parte ou a totalidade do que codifica a enzima no cromossomo; um método para introduzir um oligonucleotídeo antissenso (por exemplo, RNA antissenso), que inibe a tradução do mRNA em uma enzima através de uma ligação complementar à transcrição do gene no cromossomo; um método para realizar a ligação de um ribossomo impossível formando-se uma estrutura secundária adicionando-se artificialmente uma sequência Shine-Dalgarno (SD) e sua sequência complementar na extremidade frontal da sequência SD do gene que codifica a enzima; um método de engenharia de transcrição reversa (RTE), que adiciona um promotor a ser inversamente transcrito na terminação 3‘ da fase de leitura aberta (ORF) da sequência correspondente, etc., e também incluem uma combinação dos mesmos, mas não se limitam aos mesmos.

[022] Especificamente, o método para deletar uma parte ou a totalidade do gene que codifica uma enzima pode ser realizado substituindo-se o polinucleotídeo, que codifica a proteína alvo endógena dentro do cromossomo através de um vetor para inserir o cromossomo em um micro-organismo, com um polinucleotídeo ou um marcador em que parte da sequência de ácidos nucleicos é deletada. Por exemplo, um método de deleção de gene através de recombinação homóloga pode ser usado.

[023] Conforme usado no presente documento, o termo “parte”, embora possa variar dependendo dos tipos de polinucleotídeo, pode se referir especificamente a 1 nucleotídeo a 300 nucleotídeos, mais especificamente 1 nucleotídeo a 100 nucleotídeos, e ainda mais especificamente 1 nucleotídeo a 50 nucleotídeos, mas não é limitado aos mesmos.

[024] Conforme usado no presente documento, o termo “recombinação homóloga” se refere à recombinação genética que ocorre por meio de permutação em um locus de uma cadeia genética que tem homologia mútua.

[025] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente revelação, as proteínas foram inativadas por meio de recombinação homóloga.

[026] Especificamente, o método para modificar uma sequência regulatória de expressão pode ser executado induzindo-se uma modificação na sequência regulatória de expressão através de deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa de uma sequência de ácidos nucleicos da sequência regulatória de expressão, ou uma combinação das mesmas; ou pode ser executado substituindo-se a sequência por um promotor mais fraco. A sequência regulatória de expressão inclui um promotor, uma sequência de operador, uma sequência que codifica um local de ligação de ribossomo, e uma sequência para regular a terminação de transcrição e tradução.

[027] Adicionalmente, o método para modificar uma sequência de genes no cromossomo pode ser executado induzindo-se uma modificação na sequência por deleção, inserção, substituição conservativa ou não conservativa da sequência de genes, ou uma combinação dos mesmos, de modo a reduzir adicionalmente a atividade enzimática; ou substituindo-se a sequência com uma sequência de genes aprimorada para ter uma atividade mais fraca adicional ou por uma sequência de genes aprimorada para não ter nenhuma atividade.

[028] Conforme usado no presente documento, o termo “micro-organismo que produz L-lisina” se refere a uma cepa de micro-organismos com capacidade para produzir L-lisina por meio de fermentação. Por exemplo, o mesmo inclui uma cepa com capacidade para aumentar a produtividade de L-lisina modificando-se a sequência através da manipulação da presente revelação de modo que uma atividade de uma proteína envolvida em hidrólise de parede celular seja inativada em comparação com a sua atividade endógena; e regulando-se a lise celular para a produção de lisina, que ocorre durante a fermentação, mas sem se limitar a isso.

[029] Na presente revelação, o micro-organismo que produz L-lisina pode incluir todos os micro-organismos do gênero Corynebacterium que tenham capacidade para serem modificados de modo que uma atividade de uma proteína envolvida em hidrólise de parede celular seja inativada em comparação com sua atividade endógena. Por exemplo, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum ou Brevibacterium fermentum pode ser usado, mas o micro-organismo não está limitado ao mesmo. Por exemplo, Corynebacterium glutamicum pode ser usado para o micro-organismo do gênero Corynebacterium. O micro-organismo modificado do gênero Corynebacterium é caracterizado pelo fato de que a produtividade de L-lisina é intensificada em comparação com um micro-organismo que não é modificado de modo que uma atividade de uma proteína envolvida em hidrólise de parede celular seja inativada em comparação com sua atividade endógena.

[030] Outro aspecto da presente revelação fornece um método para preparar L-lisina, incluindo: (i) cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium, que é modificado de modo que uma atividade de uma proteína envolvida em hidrólise de parede celular seja inativada em comparação com sua atividade endógena; e (ii) recuperar L-lisina a partir do meio de cultura ou do micro-organismo.

[031] O micro-organismo do gênero Corynebacterium, no qual a produtividade de L-lisina é aumentada, é conforme descrito acima.

[032] Conforme usado no presente documento, o termo “cultura” se refere ao cultivo de um micro-organismo sob condições ambientais artificialmente controladas. Na presente revelação, o método para cultivar L-lisina com o uso do micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser realizado com o uso de um método amplamente conhecido na técnica. Especificamente, exemplos da cultura incluem um processo de batelada e um processo de batelada alimentada ou batelada alimentada repetida em uma forma contínua, mas não estão limitados aos mesmos.

[033] O meio usado para o cultivo deve satisfazer os requisitos para uma cepa específica em uma forma apropriada (por exemplo, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). As fontes de carbono que podem ser usadas na presente revelação podem incluir açúcares e carboidratos, tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose; óleos e gorduras, tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e óleo de coco; ácidos graxos, tais como ácido palmítico, ácido esteárico, e ácido linoleico; álcoois, tais como glicerol e etanol; e ácidos orgânicos, tais como ácido glucônico, ácido acético e ácido pirúvico, mas não estão limitados aos mesmos. Essas substâncias podem ser usadas sozinhas ou em uma mistura. As fontes de nitrogênio que podem ser usadas na presente revelação podem incluir peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, água de maceração de milho, bolo de soja desengordurado e ureia ou compostos inorgânicos, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio, mas não estão limitadas aos mesmos. Essas fontes de nitrogênio também podem ser usadas sozinhas ou em uma mistura. As fontes de fósforo que podem ser usadas na presente revelação podem incluir di-hidrogeno fosfato de potássio ou fosfato de hidrogênio dipotássico, ou sais que contêm sódio correspondentes, mas não estão limitadas aos mesmos. Além disso, o meio de cultura pode conter um sal de metal, tal como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que é necessário para o crescimento. Por fim, além das substâncias descritas acima, fatores de crescimento essenciais, tais como aminoácidos e vitaminas, podem ser usados. Adicionalmente, os precursores adequados podem ser usados no meio de cultura. Essas substâncias podem ser adicionadas ao meio durante o cultivo de forma em batelada ou contínua. Tal variedade de métodos de cultura é revelada, por exemplo, na literatura (“Biochemical Engineering” por James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, páginas 138 a 176).

[034] Compostos básicos, tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia, ou compostos ácidos, tais como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, podem ser adicionados ao meio de cultura em uma forma adequada para ajustar o pH do meio de cultura. Além disso, um agente antiespumante, tal como um éster de poliglicol de ácido graxo, pode ser usado para suprimir a formação de bolhas. A fim de manter o meio de cultura em um estado aeróbico, oxigênio ou gás que contém oxigênio (por exemplo, ar) pode ser injetado no meio de cultura. A temperatura do meio de cultura pode ser normalmente 20 °C a 45 °C, de preferência, 25 °C a 40 °C, mas pode ser alterada dependendo das condições. A cultura pode ser continuada até a quantidade máxima de um L- aminoácido desejado ser produzida, e a mesma pode ser geralmente alcançada dentro de 10 horas a 160 horas. L-Lisina pode ser liberada no meio de cultura ou contida em células.

[035] O método da presente revelação para produzir L-lisina pode incluir uma etapa de recuperação de lisina a partir do micro-organismo ou do meio. Os métodos conhecidos na técnica, tais como centrifugação, filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização, HPLC, etc., podem ser usados para o método para recuperar L-lisina a partir do micro-organismo ou da cultura, mas o método não está limitado aos mesmos.

[036] A etapa de recuperação pode incluir um processo de purificação.

[MODO PARA INVENÇÃO]

[037] Abaixo no presente documento, a presente revelação será descrita em detalhes com modalidades exemplificativas anexas. Entretanto, as modalidades exemplificativas reveladas no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitantes do escopo da presente revelação.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE BIBLIOTECA DE MUTANTES ALEATÓRIAS COM O USO DE TRANSPOSON

[038] A fim de obter genes que aumentam a produtividade da lisina, uma biblioteca de vetor foi preparada pelo método a seguir. O plasmídeo obtido com o uso de EZ-Tn5™<R6KYori/KAN-2>Tnp Transposome™ Kit (Epicentre) foi transformado com o uso da cepa KCCM11016P (o micro-organismo tinha sido designado como KFCC10881 e redepositado junto à instituição depositária internacional sob o Tratado de Budapeste, e teve, então, designado o número de acesso de depósito de KCCM11016P; Patente n° KR10-0159812) como uma cepa original, e, então, espalhado sobre uma placa de meio complexo que contém canamicina (25 mg/l) para obter cerca de 20.000 colônias.

[039] 10 g de glicose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de carne, 5 g de extrato de levedura, 18,5 g de Infusão de Cérebro-Coração, 2,5 g de NaCl, 2 g de ureia, 91 g de sorbitol, 20 g de ágar (com base em 1 L de água destilada)

EXEMPLO 2: TRIAGEM DE BIBLIOTECA DE MUTANTES ALEATÓRIA COM O USO DE TRANSPOSON

[040] Cada uma de cerca de 20.000 colônias obtidas no Exemplo 1 foi inoculada em um meio de seleção (300 μl), e cultivada em placas de 96 cavidades de profundidade a 32 °C a 1.000 rpm durante cerca de 24 horas. Um método de ninidrina foi usado para analisar a quantidade de L-lisina produzida no meio de cultura (Moore, S., Stein, W. H., Photometric ninhydrin método for use in the chromatography of amino acids. J. Biol. Chem. 1948, 176, 367 a 388). Após a conclusão do cultivo, o sobrenadante de cultura (10 μl) e a solução de reação de ninidrina (190 μl) foram reagidos a 65 °C durante 30 minutos. Em seguida, a absorbância foi medida em um comprimento de onda de 570 nm com o uso de um espectrofotômetro, e cerca de 60 tipos de colônias foram selecionados como cepas modificadas que mostram alta absorbância em comparação com o controle, KCCM11016P. Outras colônias mostraram absorbância similar ou diminuída em comparação com a do controle, a cepa KCCM11016P.

[041] 60 tipos das cepas selecionadas foram cultivados da mesma forma que acima, e a reação de ninidrina foi realizada repetidamente. Como resultado, as 10 cepas principais que têm produtividade de L-lisina aprimorada em comparação com a cepa KCCM11016P foram selecionadas.

[042] 10 g de glicose, 5,5 g de sulfato de amônio, 1,2 g de MgSO4 7H2O, 0,8 g de KH2PO4, 16,4 g de K2HPO4, 100 μg de biotina, 1.000 μg de HCl de tiamina, 2.000 μg de pantotenato de cálcio, 2.000 μg de nicotinamida (com base em 1 L de água destilada)

EXEMPLO 3: ANÁLISE DE PRODUTIVIDADE DE L-LISINA DE CEPAS DE MUTANTES ALEATÓRIAS SELECIONADAS

[043] A fim de selecionar por fim cepas que têm produtividade de L-lisina aumentada, um teste de reprodutibilidade foi executado em um frasco com o uso do meio abaixo para 10 tipos das cepas selecionadas no Exemplo 2. 10 tipos das cepas e do controle foram inoculados em um frasco com reentrâncias no fundo (250 ml) que contém o meio de semeadura abaixo (25 ml), e cultivados ao mesmo tempo em que agita-se a 30 °C e 200 rpm durante 20 horas. O meio de semeadura e o meio de produção têm as seguintes composições. Após a conclusão do cultivo, as concentrações de L-lisina na solução de cultura foram analisadas com o uso de HPLC, e as concentrações de L-lisina de cada uma das cepas mutantes são mostradas na Tabela 1 abaixo.

[044] 20 g de glicose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4^7H2O, 100 μg de biotina, 1.000 μg de HCl de tiamina, 2.000 μg de pantotenato de cálcio, 2.000 μg de nicotinamida (com base em 1 L de água destilada)

[045] 100 g de glicose, 40 g de (NH4)2SO4, 2,5 g de proteína de feijão de soja, 5 g de concentrado de água de lavagem de milho, 3 g de ureia, 1 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO4^7H2O, 100 μg de biotina, 1.000 μg de HCl de tiamina, 2.000 μg de pantotenato de cálcio, 3.000 μg de nicotinamida, 30 g de CaCO3 (com base em 1 L de água destilada) [TABELA 1] CONCENTRAÇÃO DE L-LISINA DE 10 CEPAS DE MUTANTES SELECIONADAS

[046] Entre os 10 mutantes selecionados acima, KCCM11016P/mt-1 e KCCM11016P/mt-8 foram finalmente selecionados como cepas que têm produtividade de L-lisina significativamente aprimorada.

EXEMPLO 4: CONFIRMAÇÃO DE GENES ENVOLVIDOS NA PRODUTIVIDADE DE L-LISINA EM CEPAS FINALMENTE SELECIONADAS E SELEÇÃO DE GENES DE CANDIDATO ADICIONAIS

[047] Nesse Exemplo, tentou-se a identificação de genes que são deficientes devido à inserção aleatória de um transposon a partir das cepas finalmente selecionadas no Exemplo 3. DNAs genômicos de KCCM11016P/mt- 1 e KCCM11016P/mt-8 foram extraídos e, então, digeridos. Depois disso, os resultantes foram ligados, transformados em E. coli DH5a, e, então, colocados em placas em um meio sólido de LB que contém canamicina (25 mg/l). Após a seleção de 20 tipos das colônias transformadas, partes que contêm plasmídeos dos genes conhecidos foram obtidas, e as sequências de nucleotídeo foram analisadas com o uso das sequências de SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10 no Kit EZ-Tn5™ <R6KYori/KAN-2>Tnp Transposome™ (Tabela 2). Como resultado, confirmou-se que cada um dos genes NCgl2108 e NCgl2986 foi inativado nas cepas de mutantes.[TABELA 2]

[048] Os genes NCgl2108 e NCgl2986 identificados como sendo deficientes nas cepas de mutantes selecionadas no Exemplo 3 estavam presentes de forma endógena em Corynebacterium, e, assim, identificados como proteínas envolvidas em hidrólise de parede celular.

[049] Com base nos resultados de seleção de 2 tipos de proteínas envolvidas em hidrólise de parede celular em cepas de mutantes aleatórias com o uso de transposons, considerou-se que a deficiência em genes envolvidos em hidrólise de parede celular é eficaz no aumento da produtividade de L-lisina. Consequentemente, uma pesquisa foi realizada no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (National Center for Biotechnology Information (NCBI)) para genes envolvidos em hidrólise de parede celular que não sejam os genes NCgl2108 e NCgl2986.

[050] Como resultado da pesquisa, os genes NCgl1480 e NCgl2107, que estão presentes de forma endógena em Corynebacterium, foram selecionados adicionalmente como proteínas envolvidas em hidrólise de parede celular. Consequentemente, a fim de confirmar se a deleção dos genes NCgl1480 e NCgl2107 afeta a produtividade de L-lisina, esses genes foram selecionados como genes candidatos à deleção adicional.

EXEMPLO 5: PRODUÇÃO DE PLASMÍDEOS PARA A INATIVAÇÃO DOS GENES NCgl1480, NCgl2107, NCgl2108 E NCgl2986

[051] Nesse Exemplo, a fim de confirmar se a inativação dos genes NCgl1480, NCgl2107, NCgl2108 e NCgl2986 afeta a produção de L-lisina, plasmídeos recombinantes para a deleção dos genes NCgl1480, NCgl2107, NCgl2108 e NCgl2986 selecionados no Exemplo 4 nos cromossomos das cepas de produção de L-lisina em Corynebacterium foram produzidos.

[052] Com base nas sequências de nucleotídeos relatadas no GenBank do U.S. National Institutes of Health (Genbank do NIH), sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 1, 2, 3 e 4 de NCgl1480, NCgl2107, NCgl2108 e NCgl2986, bem como sequências de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 5, 6, 7 e 8 que codificam os mesmos, foram obtidas. A fim de produzir fragmentos de gene, nos quais o quadro de leitura aberta de cada um dentre NCgl1480, NCgl2107, NCgl2108 e NCgl2986 é deletado internamente, os iniciadores de SEQ ID NOS: 11 a 14 para NCgl1480, 15 a 18 para NCgl2107, 19 a 22 para NCgl2108 e 23 a 26 para NCgl2986 foram produzidos com base nas SEQ ID NOS: 5, 6, 7 e 8 acima. As sequências dos mesmos são mostradas na Tabela 3 abaixo.[TABELA 3]

[053] A PCR foi realizada com o uso de DNA genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como um modelo juntamente com os pares de sequências de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 11 e 12, 13 e 14, 15 e 16, 17 e 18, 19 e 20, 21 e 22, 23 e 24, e 25 e 26, como iniciadores (Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories). A PCR foi realizada sob as condições a seguir: 30 ciclos, cada um consistindo em desnaturação a 95 °C por 30 segundos, recozimento a 50 °C por 30 segundos e alongamento a 72 °C por 1 minuto.

[054] Como resultado, dois pares de fragmentos de DNA de 319 bp e 410 bp (NCg11480-A e NCg11480-B, respectivamente) que contêm regiões a montante e a jusante do gene NCg11480; dois pares de fragmentos de DNA de 324 bp e 300 bp (NCgl2107-A e NCgl2107-B, respectivamente) que contêm regiões a montante e a jusante do gene NCgl2107; dois pares de fragmentos de DNA de 381 bp e 377 bp (NCgl2108-A e NCgl2108-B, respectivamente) que contêm regiões a montante e a jusante do gene NCgl2108; e dois fragmentos de DNA de fragmentos de DNA de 356 bp e 374 bp (NCgl2986-A e NCgl2986-B, respectivamente) que contêm regiões a montante e a jusante do gene NCgl2986 foram obtidos. Os fragmentos de DNA amplificados pela PCR foram conjugados com o plasmídeo pDZ (Patente n° KR10-0924065) com o uso de um Kit de Clonagem por Infusão (Invitrogen), transformados em DH5α E. coli, e, então, colocados em placas sobre um meio sólido de LB que contém canamicina (25 mg/l). Após selecionar as colônias transformadas com os plasmídeos, nos quais os genes desejados são inseridos através da PCR, os plasmídeos foram obtidos com o uso de um método de extração de plasmídeo convencionalmente conhecido na técnica. Os plasmídeos assim obtidos foram designados como pDZ-ΔNCgl1480, pDZ-ΔNCgl2107, pDZ-ΔNCgl2108 e pDZ-ΔNCgl2986, respectivamente. Em pDZ-ΔNCgl1480, um fragmento de gene de 1672 bp do gene NCgl1480 foi deletado; em pDZ-ΔNCgl2107, um fragmento de gene de 1026 bp do gene NCgl2107 foi deletado; em pDZ-ΔNCgl2108, um fragmento de gene de 576 bp do gene NCgl2108 foi deletado; e em pDZ-ΔNCgl2986, um fragmento de gene de 1092 bp do gene NCgl2986 foi deletado.

EXEMPLO 6: PRODUÇÃO E AVALIAÇÃO DE CEPA INATIVADA COM GENE DE PROTEÍNA ASSOCIADA À HIDRÓLISE DE PAREDE CELULAR DERIVADA DE CEPA DE PRODUÇÃO DE LISINA KCCM11016P

[055] Com base em KCCM11016P, a cepa de produção de L-lisina representativa do gênero Corynebacterium, a cepa inativada por gene de proteína associada à hidrólise de parede celular selecionada a partir do acima exposto foi preparada e tentou-se a avaliação quanto à sua produtividade de lisina.

[056] Cada um dos 4 plasmídeos recombinantes (pDZ-ΔNCgl1480, pDZ- ΔNCgl2107, pDZ-ΔNCgl2108 e pDZ-ΔNCgl2986) produzidos no Exemplo 5 foi transformado em Corynebacterium glutamicum KCCM11016P por um método de pulso elétrico, e as cepas em que o gene alvo foi inativado por recombinação homóloga foram preparadas por um método de PCR. As cepas inativadas preparadas foram denominadas KCCM11016P::ΔNCgl1480, KCCM11016P::ΔNCgl2107, KCCM11016P::ΔNCgl2108, e KCCM11016P::ΔNCgl2986, respectivamente.

[057] Cada uma das 4 cepas e uma cepa de controle foram inoculadas em um frasco com reentrâncias no fundo (25 ml) que contém 25 ml do meio de semeadura a seguir, e foram cultivadas ao mesmo tempo em que agita-se a 30 °C e 200 rpm por 20 horas. Depois disso, a cultura de semente (1 ml) foi inoculada em um frasco com reentrâncias no fundo (1 ml) que contém 24 ml do meio de produção a seguir, e foi cultivada ao mesmo tempo em que agita-se a 37 °C e 200 rpm por 96 horas. A composição de cada um dentre o meio de semeadura e o meio de produção é da seguinte forma.

[058] 20 g de glicose, 10 g de (NH4)2SO4, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4^H2O, 100 μg de biotina, 1.000 μg de HCl de tiamina, 2.000 μg de pantotenato de cálcio, 2.000 μg de nicotinamida (com base em 1 L de água destilada)

[059] 100 g de glicose, 40 g de (NH4)2SO4, 2,5 g de proteína de feijão de soja, 5 g de concentrado de água de lavagem de milho, 3 g de ureia, 1 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO4^H2O, 100 μg de biotina, 1.000 μg de HCl de tiamina, 2.000 μg de pantotenato de cálcio, 3.000 μg de nicotinamida, 30 g de CaCO3 (com base em 1 L de água destilada)

[060] Após a conclusão do cultivo, as concentrações de L-lisina foram analisadas com o uso de HPLC e são mostradas na Tabela 4 abaixo. Os resultados da Tabela 4 são os resultados de três experimentos repetidos, e a produtividade foi avaliada com base no valor médio.[TABELA 4]

[061] Como resultado, conforme mostrado na Tabela 4 acima, a produtividade de lisina da cepa em que cada um dos genes NCgl1480, NCgl2107, NCgl2108 e NCgl2986 foi inativado aumentou para 3,2%, 5,4%, 13% e 15%, respectivamente, em comparação com a da cepa original KCCM11016P.

[062] Esses resultados sugerem que a produtividade de L-lisina pode ser aprimorada inativando-se as proteínas envolvidas em hidrólise de parede celular, que podem causar fusão celular em um micro-organismo do gênero Corynebacterium.

[063] Consequentemente, os experimentos foram realizados, conforme exposto abaixo para determinar se os efeitos similares podem ou não ser exibidos em um caso em que as proteínas envolvidas em hidrólise de parede celular são inativadas em vários micro-organismos do gênero Corynebacterium.

EXEMPLO 7: PRODUÇÃO E AVALIAÇÃO DE CEPAS INATIVADAS POR PROTEÍNA ASSOCIADA À HIDRÓLISE DE PAREDE CELULAR DERIVADAS DA CEPA DE PRODUÇÃO DE L-LISINA KCCM10770P

[064] A fim de examinar se os efeitos de inativação de proteínas associadas à hidrólise de parede celular na cepa de produção de L-lisina Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Patente n° KR10-0924065) que têm uma via biossintética de lisina intensificada são similares aos resultados experimentais do Exemplo 6, as cepas nas quais cada uma das 4 proteínas envolvidas em hidrólise de parede celular foi inativada foram preparadas da mesma forma, conforme descrito no Exemplo 6. As cepas preparadas foram denominadas KCCM10770P::ΔNCgl1480, KCM10770P::ΔNCgl2107,KCCM10770P::ΔNCgl2108, e KCM10770P::ΔNCgl2986. A produtividade de L- lisina foi comparada entre as mesmas.

[065] A fim de comparar a produtividade de lisina das cepas acima, as cepas e uma cepa de controle foram cultivadas da mesma forma que no Exemplo 6. Após a conclusão do cultivo, as concentrações de L-lisina analisadas com o uso de HPLC são mostradas na Tabela 5 abaixo. Os resultados da Tabela 5 são os resultados de três experimentos repetidos, e a produtividade foi avaliada com base no valor médio. [TABELA 5]

[066] Como resultado, conforme mostrado na Tabela 5 acima, a produtividade de lisina da cepa em que cada um dos genes NCgl1480, NCgl2107, NCgl2108 e NCgl2986 foi inativado aumentou para 2,2%, 4,3%, 12,1% e 14,2%, respectivamente, em comparação com a da cepa original KCCM10770P.

[067] Consequentemente, constatou-se que em Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Patente N° KO10-0924065), a produtividade de L- lisina também pode ser aprimorada inativando-se as proteínas envolvidas em hidrólise de parede celular da mesma forma que no Exemplo 6.

EXEMPLO 8: PRODUÇÃO E AVALIAÇÃO DE CEPAS INATIVADAS POR PROTEÍNA ASSOCIADA À HIDRÓLISE DE PAREDE CELULAR DERIVADAS DA CEPA DE PRODUÇÃO DE L-LISINA KCCM11347P

[068] A fim de examinar os efeitos de inativação de proteínas associadas à hidrólise de parede celular na cepa de produção de L-lisina Corynebacterium glutamicum KCCM11347P (o micro-organismo foi designado como KFCC10750 e redepositado junto à instituição depositária internacional sob o Tratado de Budapeste, e, foi, então, designado com o número de acesso de depósito de KCCM11347P; Patente n° KR10-0073610) preparada por modificação artificial, as cepas, nas quais cada uma das 4 proteínas envolvidas em hidrólise de parede celular foi inativada, foram preparadas da mesma forma, conforme descrito no Exemplo 6. As cepas preparadas foram denominadas KCCM11347P::ΔNCgl 1480, KCCM11347P::ΔNCgl2107,KCCM11347P::ΔNCgl2108, e KCCM11347P::ΔNCgl2986. A produtividade de L- lisina foi comparada entre as mesmas.

[069] A fim de comparar a produtividade de lisina das cepas acima, as cepas e uma cepa de controle foram cultivadas da mesma forma que no Exemplo 6. Após a conclusão do cultivo, as concentrações de L-lisina foram analisadas com o uso de HPLC e são mostradas na Tabela 6 abaixo. Os resultados da Tabela 6 são os resultados de três experimentos repetidos, e a produtividade foi avaliada com base no valor médio.[TABELA 6]

[070] Como resultado, conforme mostrado na Tabela 6 acima, a produtividade de lisina da cepa em que cada um dos genes NCgl1480, NCgl2107, NCgl2108 e NCgl2986 foi inativado aumentou para 2%, 2,4%, 11,7% e 14,4%, respectivamente, em comparação com a da cepa original KCCM11347P.

[071] Consequentemente, constatou-se que em Corynebacterium glutamicum KCCM11347P (Patente N° CO10-0073610), a produtividade de L- lisina também pode ser aprimorada inativando-se as proteínas envolvidas em hidrólise de parede celular da mesma forma que nos Exemplos 6 e 7.

EXEMPLO 9: PRODUÇÃO E AVALIAÇÃO DE CEPAS INATIVADAS POR PROTEÍNA ASSOCIADA À HIDRÓLISE DE PAREDE CELULAR DERIVADAS DA CEPA DE PRODUÇÃO DE L-LISINA CJ3P

[072] A fim de examinar se os efeitos de inativação de proteínas associadas à hidrólise de parede celular em Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40), que produz L-lisina introduzindo-se 3 tipos de modificações [pyc(P458S), hom(V59A) e lysC(T311I)] em Corynebacterium glutamicum do tipo selvagem, são similares aos resultados experimentais dos Exemplos 6, 7 e 8, as cepas, nas quais cada uma das 4 proteínas envolvidas em hidrólise de parede celular foi inativada, foram preparadas da mesma forma, conforme descrito no Exemplo 6. As cepas preparadas foram denominadas CJ3P::ΔNCgl1480, CJ3P::ΔNCgl2107, CJ3P::ΔNCgl2108, e CJ3P::ΔNCgl2986. A produtividade de L-lisina foi comparada entre as mesmas.

[073] A fim de comparar a produtividade de lisina das cepas acima, as cepas e uma cepa de controle foram cultivadas da mesma forma que no Exemplo 6. Após a conclusão do cultivo, as concentrações de L-lisina analisadas com o uso de HPLC são mostradas na Tabela 7 abaixo. Os resultados da Tabela 7 são os resultados de três experimentos repetidos, e a produtividade foi avaliada com base no valor médio.[TABELA 7]

[074] Como resultado, conforme mostrado na Tabela 7 acima, a produtividade de lisina da cepa em que cada um dos genes NCgl1480, NCgl2107, NCgl2108 e NCgl2986 foi inativado aumentou para 3%, 1,3%, 12,7% e 16%, respectivamente, em comparação com a da cepa original CJ3P.

[075] Consequentemente, constatou-se que em Corynebacterium glutamicum CJ3P, a produtividade de L-lisina também pode ser aprimorada inativando-se as proteínas envolvidas em hidrólise de parede celular da mesma forma que nos Exemplos 6, 7 e 8.

EXEMPLO 10: PRODUÇÃO DE AVALIAÇÃO DE CEPA INATIVADA SIMULTANEAMENTE POR PROTEÍNA ASSOCIADA À HIDRÓLISE DE PAREDE CELULAR DERIVADA DE CEPA DE PRODUÇÃO DE L-LISINA KCCM11016P

[076] Após confirmar a partir dos Exemplos acima que a produtividade de L-lisina foi aumentada quando cada uma das proteínas envolvidas em hidrólise de parede celular foi inativada na cepa de produção de L-lisina Corynebacterium, tentou-se a identificação de se a produtividade de L-lisina também aumentou quando as 2 proteínas relevantes foram simultaneamente inativadas.

[077] Portanto, o experimento a seguir foi executado para confirmar o efeito de inativação simultânea de proteínas envolvidas em hidrólise de parede celular na cepa de produção de L-lisina Corynebacterium. A cepa, na qual dois tipos dos genes de proteína (NCgl2108 e NCgl2986) envolvidos em hidrólise de parede celular, que são altamente eficazes na intensificação de produtividade de L-lisina quando cada uma das proteínas está deficiente, foram inativados simultaneamente foi preparada da mesma forma que no Exemplo 6. A cepa preparada foi designada como KCCM11016P::ΔNCgl2108/ΔNCgl2986. A produtividade de L-lisina foi comparada.

[078] A fim de comparar a produtividade de L-lisina da cepa acima, a cepa e uma cepa de controle foram cultivadas da mesma forma que no Exemplo 6. Após a conclusão do cultivo, as concentrações de L-lisina analisadas com o uso de HPLC são mostradas na Tabela 8 abaixo. Os resultados da Tabela 8 são os resultados de três experimentos repetidos, e a produtividade foi avaliada com base no valor médio.[TABELA 8]

[079] Como resultado, conforme mostrado na Tabela 8, a produtividade de lisina da cepa em que os genes NCgl2108 e NCgl2986 foram inativados simultaneamente foi aumentada para 21,6%, em comparação com a da cepa original KCCM11016P.

[080] Esse resultado sugere que a produtividade de L-lisina pode ser aprimorada mesmo quando não apenas uma proteína, mas também duas ou mais proteínas envolvidas em hidrólise de parede celular foram inativadas simultaneamente em um micro-organismo do gênero Corynebacterium.

[081] Nesse sentido, a cepa acima, KCCM11016P-ΔNCgl2986, foi denominada CA01-2292. CA01-2292 foi depositado junto ao Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), uma instituição depositária internacional, sob o Tratado de Budapeste, e foi, então, designado pelo número de acesso de depósito de KCCM11627P.

[082] Com base nesses resultados, confirmou-se que as cepas de produção de L-lisina tinham o efeito de intensificação da produtividade de L-lisina regulando-se a lise celular durante a fermentação na qual as proteínas envolvidas em hidrólise de parede celular foram inativadas em comparação com a sua atividade endógena. Adicionalmente, confirmou-se que a produtividade de L-lisina pode ser aprimorada quando não somente uma, mas também duas ou mais proteínas envolvidas em hidrólise de parede celular foram inativadas simultaneamente, fornecendo-se, assim, a cepa inovadora que produz L-lisina.

[083] Embora a presente revelação tenha sido descrita com referência a modalidades ilustrativas particulares, será entendido por aqueles versados na técnica a quem a presente revelação pertence que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem se afastar do espírito técnico ou características essenciais da presente revelação. Portanto, as modalidades descritas acima são consideradas ilustrativas em todos os aspectos e não restritivas. Além disso, o escopo da presente revelação é definido pelas reivindicações anexas e não pela descrição detalhada, e deve-se entender que todas as modificações ou variações derivadas dos significados e escopo da presente revelação e equivalentes dos mesmos são incluídas no escopo das reivindicações anexas.

Claims

1. Micro-organismo do gênero Corynebacterium tendo aumentada produtividade de L-lisina em comparação com um micro-organismo não modificado caracterizado por ser modificado de modo que uma atividade de uma proteína envolvida em hidrólise de parede celular seja inativada em comparação com uma atividade endógena da mesma, em que a proteína envolvida em hidrólise de parede celular é pelo menos uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em proteínas que compreendem sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 1 a 4.

2. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o micro-organismo do gênero Corynebacterium ser Corynebacterium glutamicum.

3. Método para preparar L-lisina caracterizado por compreender: (i) cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 2, em um meio; e (ii) recuperar a L-lisina a partir do meio de cultura ou do micro-organismo.