BR112019015993B1

BR112019015993B1 - Micro-organismo de gênero corynebacterium que produz l-arginina e método para produzir l-arginina com o uso do mesmo

Info

Publication number: BR112019015993B1
Application number: BR112019015993-2A
Authority: BR
Inventors: Seon Hye Kim; Hyung Joon Kim; Haena OH; Byoung Hoon Yoon; Min Gyeong Kang
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2024-01-23
Also published as: AR114561A1; JP6806895B2; MX2019009383A; CN110234767B; US11345940B2; IL266290A; PH12019500940A1; RU2716573C1; CL2019002319A1; EP3546581A4; AU2018353929B2; US20210139937A1; EP3546581A2; CN110234767A; IL266290B2; BR112019015993A2; KR101999454B1; TW201940699A; WO2019124932A3; WO2019124932A2

Abstract

a presente revelação se refere a um micro-organismo do gênero corynebacterium que produz l-arginina, e um método para produzir l-arginina com o uso do mesmo.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente revelação refere-se a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L-arginina e a um método para produzir L-arginina com o uso do mesmo.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[002] L-Arginina é contida em sua forma livre em sementes de planta ou alho, e além de ser usada em suplementos dietéticos enriquecidos com aminoácidos, é amplamente usada em medicamentos, alimentos e similares. Exemplos das aplicações médicas de L-arginina incluem melhoradores de função hepática, melhoradores de função cerebral, terapêutica para a infertilidade masculina e formulações gerais de aminoácidos. Representantes entre os alimentos aos quais L- arginina é aplicada são aditivos de pasta de peixe, aditivos para bebidas saudáveis e substitutos de sal para pacientes com hipertensão. Portanto, L-arginina é um material que tem atraído muita atenção recentemente.

[003] Micro-organismos do gênero Corynebacterium, em particular Corynebacterium glutamicum, são micro-organismos gram-positivos usados amplamente na produção de L-aminoácidos. Para a produção de L-arginina, abordagens específicas ao material alvo, tais como um método para aumentar a expressão de um gene que codifica uma enzima envolvida principalmente em síntese de L-arginina em uma cepa de Corynebacterium, ou um método para deletar um gene desnecessário para a biossíntese de L-arginina, são usadas principalmente (Patente Coreana no 10-1102263). Entretanto, ainda existe uma necessidade crescente por pesquisa sobre métodos que possam produzir com eficiência L-arginina com alto rendimento.

[004] Sob tais circunstâncias, os presentes inventores realizaram esforços intensivos para desenvolver um micro-organismo capaz de produzir L-arginina com alta eficiência, e como um resultado, os mesmos concluíram a presente revelação confirmando-se que o rendimento de produção de L-arginina é aumentado em um micro-organismo do gênero Corynebacterium no qual um gene que codifica uma proteína, cuja função é desconhecida, é deletado.

REVELAÇÃO PROBLEMA DA TÉCNICA

[005] Um objetivo da presente revelação é fornecer um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L-arginina, em que uma proteína que inclui uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 é inativada.

[006] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para produzir L-arginina com o uso do micro-organismo.

SOLUÇÃO DA TÉCNICA

[007] Doravante, a presente revelação será descrita em detalhes. Entretanto, cada uma das explicações e modalidades exemplificativas reveladas no presente documento pode ser aplicada a outras explicações e modalidades exemplificativas. Isto é, todas as combinações de vários fatores revelados no presente documento pertencem ao escopo da presente revelação. Além disso, o escopo da presente revelação não deve ser limitado pela revelação específica fornecida doravante.

[008] A fim de alcançar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação fornece um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L-arginina, em que uma proteína que inclui uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 é inativada.

[009] Como usado no presente documento, o termo “L-arginina” se refere a um L-aminoácido que tem a fórmula química de C6H14N4O2, e é um aminoácido essencial condicionalmente presente em todos os organismos. L-Arginina é conhecida por ser produzida principalmente por micro-organismos do gênero Corynebacterium, mas sabe-se que esses são sujeitos a inibição de retroalimentação por arginina intracelular (Vehary Sakanyan, et al., Microbiology, 142:9 a 108, 1996). Portanto, esses micro-organismos são conhecidos por terem um limite em que produzem L- arginina com alto rendimento. Os presentes inventores constataram surpreendentemente que a produção de L-arginina foi aumentada quando uma proteína que inclui uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, cuja função é desconhecida, foi inativada fornecendo, desse modo, um micro-organismo inovador para produzir L-arginina.

[010] Como usado no presente documento, o termo “proteína que inclui uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1” se refere a uma proteína que está inerentemente presente em um micro-organismo do gênero Corynebacterium ou em uma proteína hipotética cuja função não é conhecida. Por exemplo, a proteína que inclui uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 pode ser uma proteína que consiste (essencialmente) na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, mas não é limitada a isso.

[011] Além disso, embora descrita como “uma proteína que consiste em um SEQ ID NO particular” na presente revelação, tal expressão não exclui uma mutação na proteína que pode ocorrer por uma adição de sequência sem significado a montante ou a jusante da sequência de aminoácido do SEQ ID NO correspondente, ou uma mutação que ocorre naturalmente na mesma, ou uma mutação silenciosa na mesma, desde que a proteína que tem tal mutação tenha uma atividade igual ou correspondente àquela da proteína que consiste em uma sequência de aminoácido do SEQ ID NO correspondente. Mesmo quando a adição ou mutação de sequência está presente, a mesma pertence obviamente ao escopo da presente revelação.

[012] Em uma modalidade exemplificativa, a proteína que inclui uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 pode incluir uma sequência de aminoácido que tem uma homologia ao SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%. A proteína que inclui uma sequência de aminoácido que tem uma homologia ao SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80% pode incluir uma proteína que inclui uma sequência de aminoácido que tem uma homologia à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, especificamente pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95% ou pelo menos 97%. É evidente que uma proteína que tem uma sequência de aminoácido em que a sequência é parcialmente deletada, modificada, substituída ou inserida é incluída no escopo da presente revelação, desde que uma sequência que tem uma homologia à sequência mostre atividade biológica praticamente equivalente ou correspondente a uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

[013] Além disso, a proteína que inclui uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 pode ser codificada por um gene que inclui a sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2. Além disso, a proteína pode ser codificada por um gene que consiste ou que consiste essencialmente na sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2, mas não é limitada a isso.

[014] Além disso, a proteína da presente revelação pode ser codificada não apenas por um gene que inclui a sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2, mas também por um gene que inclui um polinucleotídeo que tem uma homologia ao SEQ ID NO: 2 de pelo menos 80%.

[015] Especificamente, uma sequência de polinucleotídeo capaz de codificar uma proteína que inclui uma sequência de aminoácido que tem uma homologia ao SEQ ID NO: 1 acima de pelo menos 80% pode ser incluída no escopo da presente revelação, mas a proteína pode ser codificada por um gene que inclui uma sequência de polinucleotídeo que tem uma homologia à sequência de polinucleotídeo acima de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 80%, especificamente pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95% ou pelo menos 97%. Além disso, com base em degeneração do código genético, variantes das sequências que codificam a mesma sequência de aminoácido também podem ser incluídas no escopo da presente revelação.

[016] Como usado no presente documento, o termo “homologia” se refere à identidade com uma dada sequência de aminoácido ou sequência de nucleotídeo, e a homologia pode ser expressa como uma porcentagem. Na presente revelação, uma sequência de homologia que tem atividade idêntica ou similar à dada sequência de aminoácido ou sequência de polinucleotídeo é expressa como “homologia %”.

[017] A homologia à sequência de aminoácido ou sequência de nucleotídeo pode ser determinada, por exemplo, com o uso do algoritmo BLAST (consultar Karlin e Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. EUA, 90, 5873(1993)) ou FASTA (consultar Pearson, Methods Enzymol., 183, 63, 1990)). Com base no algoritmo BLAST, um programa chamado BLASTN ou BLASTX foi desenvolvido (consultar http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

[018] Como usado no presente documento, o termo “inativação” significa que a proteína não é expressa de forma alguma, ou a proteína é expressa, mas não exibe atividade ou uma redução na atividade, quando comparada com aquela de uma cepa parental, cepa nativa ou uma cepa antes de modificação. A redução se refere a um conceito que inclui um caso em que a atividade de uma proteína é reduzida comparada àquela de uma proteína possuída originalmente em um micro-organismo devido a modificação, deleção, etc. do gene que codifica a proteína, um caso em que o nível de atividade global de proteína em células é inferior àquele da cepa nativa ou àquele da cepa antes de modificação devido à inibição de expressão ou inibição de translação do gene que codifica o mesmo, ou uma combinação dos mesmos.

[019] Na presente revelação, foi identificado pela primeira vez que a inativação da proteína está relacionada à produtividade de L-arginina.

[020] Na presente revelação, a inativação pode ser alcançada por vários métodos bem conhecidos na técnica. Exemplos dos métodos podem incluir 1) um método para deletar a totalidade ou parte do gene que codifica a proteína; 2) um método para modificar uma sequência de controle de expressão para que a expressão do gene que codifica a proteína seja reduzida; 3) um método para modificar a sequência do gene que codifica a proteína para que a atividade da proteína seja removida ou atenuada; 4) um método para introduzir um oligonucleotídeo antissenso (por exemplo, RNA antissenso) o qual se liga de modo complementar a uma transcrição do gene que codifica a proteína; 5) um método para tornar a fixação de um ribossoma impossível formando-se uma estrutura secundária adicionando-se uma sequência de Shine-Dalgarno e sua sequência complementar na extremidade dianteira da sequência de Shine-Dalgarno do gene que codifica a proteína; 6) um método para engenharia de transcrição reversa (RTE), que adiciona um promotor para ser transcrito de modo reverso no término 3‘ do quadro de leitura aberta (ORF) da sequência de polinucleotídeo do gene que codifica a proteína, etc., e também pode incluir uma combinação dos mesmos, mas não são particularmente limitados a isso.

[021] Especificamente, o método para modificar a sequência de controle de expressão pode ser realizado aplicando-se uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o método pode ser executado induzindo-se uma modificação da sequência de controle de expressão na sequência de polinucleotídeo por meio de deleção, inserção, substituição não conservadora ou conservadora, ou uma combinação das mesmas para atenuar adicionalmente a atividade da sequência de controle de expressão, ou substituindo-se a sequência de controle de expressão por uma sequência de polinucleotídeo que tem uma atividade mais fraca. A sequência de controle de expressão pode incluir um promotor, uma sequência de operadores, uma sequência que codifica uma região de ligação de ribossoma e sequências que controlam a terminação de transcrição e translação, mas não é limitada a isso.

[022] Além disso, o método para modificar a sequência de nucleotídeo pode ser executado induzindo-se uma modificação na sequência por meio de deleção, inserção, substituição não conservadora ou conservadora, ou uma combinação das mesmas na sequência de nucleotídeo para atenuar adicionalmente a atividade da enzima; ou substituindo-se a sequência de nucleotídeo por uma sequência de nucleotídeo que foi melhorada para ter atividade mais fraca ou uma sequência de nucleotídeo que foi melhorada para não ter atividade, mas não é limitado a isso.

[023] Além disso, o método para deletar parte ou a totalidade do gene que codifica a proteína pode ser realizado substituindo-se um polinucleotídeo que codifica um proteína-alvo endógena dentro do cromossoma com um polinucleotídeo ou um gene marcador em que parte da sequência de nucleotídeo é deletada, por meio de um vetor para inserção cromossômica no micro-organismo. Em uma modalidade exemplificativa do método para deletar parte ou a totalidade do polinucleotídeo, um método para deletar o polinucleotídeo por recombinação homóloga pode ser usado, mas não é limitado a isso.

[024] Além disso, o método para deletar parte ou a totalidade do gene pode ser executado induzindo-se uma mutação com o uso de luz tal como UV, ou produtos químicos, e selecionando-se uma cepa que tem o gene alvo deletado dos mutantes obtidos. O método para deletar o gene pode incluir um método para usar uma técnica de recombinação genética. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeo ou um vetor que inclui uma sequência de nucleotídeo que tem homologia com um gene alvo é introduzida no micro-organismo para provocar recombinação homóloga. Ademais, a sequência de nucleotídeo ou vetor a ser introduzido pode incluir um marcador de seleção dominante.

[025] Como usado no presente documento, o termo “micro-organismo que produz L-arginina” ou “micro-organismo que tem produtividade de L-arginina” se refere a um micro-organismo naturalmente que tem uma capacidade para produzir L-arginina ou um micro-organismo que é preparado transmitindo-se uma capacidade para produzir L-arginina a uma cepa parental que não tem capacidade para produzir L- arginina. Por exemplo, a capacidade para produzir L-arginina pode ser transmitida inativando-se a atividade da proteína que inclui uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 e/ou aumentando-se expressão do gene que codifica enzimas que biossintetizam L-arginina.

[026] No presente documento, exemplos das enzimas que biossintetizam L- arginina incluem N-acetilglutamil fosfato redutase (ArgC), ornitina acetiltransferase (ArgJ), N-acetilglutamato quinase (ArgB), acetilornitina transaminase (ArgD), ornitina carbamoiltransferase (ArgF), sintetase de ácido argininosuccínico (ArgG), liase de ácido argininosuccínico (argH) e sintetase de fosfato de carbamoil. Essas enzimas são colocadas no operão Arg (argCJBDFRGH) e são reguladas por um repressor de arginina codificado por argR (J Bacteriol. dezembro de 2002; 184(23):6602 a 14.). Portanto, uma capacidade para produzir L-arginina pode ser transmitida atenuando- se o repressor de arginina (US2002-0045223) ou por superexpressão de pelo menos um dos genes de biossíntese.

[027] Na presente revelação, o micro-organismo que produz L-arginina é um micro-organismo no qual uma proteína que inclui uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 é inativada. Além disso, para o propósito da presente revelação, o micro-organismo pode ser qualquer micro-organismo capaz de produzir L-arginina inativando-se a proteína que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Como um exemplo específico, o micro-organismo pode incluir uma cepa de microorganismo tal como um micro-organismo do gênero Escherichia, um micro-organismo do gênero Serratia, um micro-organismo do gênero Erwinia, um micro-organismo do gênero Enterobacteria, um micro-organismo do gênero Salmonella, um micro-organismo do gênero Streptomyces, um micro-organismo do gênero Pseudomonas, um micro-organismo do gênero Brevibacterium ou um micro-organismo do gênero Corynebacterium, e pode ser especificamente um micro-organismo do gênero Corynebacterium. Para o propósito da presente revelação, o micro-organismo pode ser um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L-arginina.

[028] O “micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L-arginina” se refere a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que tem uma capacidade de produzir L-arginina naturalmente ou devido à modificação. Já se sabe que o microorganismo do gênero Corynebacterium pode produzir L-arginina. Entretanto, sua capacidade de produzir L-arginina é notavelmente baixa, e genes ou mecanismos envolvidos na produção ainda não foram revelados. Portanto, na presente revelação, o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L-arginina se refere a um micro-organismo ele próprio nativo ou um micro-organismo do gênero Corynebacterium no qual a atividade de um gene estranho envolvido no mecanismo de produção de L-arginina é reforçada ou inativada de modo a ter uma capacidade melhorada de produzir L-arginina.

[029] Na presente revelação, o “micro-organismo do gênero Corynebacterium” pode incluir todos os micro-organismos do gênero Corynebacterium. Especificamente, o micro-organismo pode ser Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium maris, Corynebacterium lubricantis, Corynebacterium doosanense, Corynebacterium pilosum, Corynebacterium cystitidis, Corynebacterium uterequi, Corynebacterium renale ou Brevibacterium lactofermentum, e mais especificamente pode ser Corynebacterium glutamicum.

[030] A presente revelação fornece um método para produzir L-arginina, que compreende: cultivar o micro-organismo de acordo com a presente revelação em um meio.

[031] O micro-organismo de acordo com a presente revelação é como descrito acima.

[032] No método para a presente revelação, o cultivo do micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser executado com o uso de qualquer condição de cultura e método de cultivo conhecido na técnica.

[033] Como usado no presente documento, o termo “cultivo” significa que micro-organismos são desenvolvidos em condições ambientais controladas artificialmente de modo apropriado. Na presente revelação, o método para cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L-arginina pode ser executado com o uso de um método amplamente conhecido na técnica. Especificamente, um processo em lote ou um processo contínuo tal como um processo alimentado em lote ou um processo alimentado em lote repetido pode ser usado para o cultivo, mas o cultivo não é limitado a isso.

[034] Para uso no cultivo, um meio tem que satisfazer a exigência da cepa empregada. Meios de cultura adequados para uso em cultivo de cepas de Corynebacteria são bem conhecidos na técnica (por exemplo, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., EUA, 1981).

[035] Fontes de açúcar que podem ser usadas no meio incluem açúcares e carboidratos tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido ou celulose; óleos e gorduras tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino ou óleo de coco; ácidos graxos tais como ácido palmítico, ácido esteárico ou ácido linoleico; álcoois tais como glicerol ou etanol; e ácidos orgânicos tais como ácido acético. Essas substâncias podem ser usadas individualmente ou em uma mistura, mas não são limitadas a isso.

[036] Fontes de nitrogênio que podem ser usadas incluem compostos contendo nitrogênio orgânico, tais como peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, milhocina, farinha de soja, e ureia, ou compostos inorgânicos tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. As fontes de nitrogênio também podem ser usadas individualmente ou como uma mistura, mas não são limitadas a isso.

[037] Fontes de fósforo que podem ser usadas incluem di-hidrogenofosfato de potássio ou fosfato de hidrogênio dipotássico ou os sais de sódio correspondentes. O meio cultura pode, além disso, conter sais de metal tais como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, os quais são exigidos para desenvolvimento. Por fim, substâncias de desenvolvimento essenciais tais como aminoácidos e vitaminas podem ser usadas além das substâncias mencionadas acima. Além disso, precursores adequados podem ser adicionados ao meio de cultura. As ditas substâncias podem ser adicionadas à cultura em uma forma de lote ou contínua por um método adequado durante o cultivo.

[038] O pH do produto de cultura pode ser controlado com o uso de compostos básico tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia, ou amônia aquosa; ou compostos ácidos tais como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico em uma maneira adequada. Formação de espuma pode ser controlada com o uso de agentes antiespumantes tais como ésteres de poliglicóis de ácido graxo. Condições aeróbicas podem ser mantidas introduzindo-se oxigênio ou misturas de gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) na cultura. A temperatura da cultura pode ser usualmente de 20 °C a 45 °C, especificamente de 25 °C a 40 °C. A cultura pode ser continuada até que uma quantidade desejada de L-aminoácidos tenha sido produzida. Especificamente, o tempo de cultivo pode ser 10 horas a 160 horas.

[039] No método para a presente revelação, o cultivo pode ser realizado de modo contínuo ou em um processo em lote ou em um processo alimentado em lote ou processo alimentado em lote repetido. Esse cultivo pode ser realizado com o uso de qualquer método bem conhecido na técnica.

[040] A separação de L-arginina de um produto de cultura pode ser executada por um método convencional conhecido na técnica. Para o método de separação acima, podem ser usados métodos tais como centrifugação, filtração, cromatografia de troca iônica, cristalização, etc. Por exemplo, um sobrenadante, obtido centrifugando-se o produto de cultura em uma velocidade baixa e removendo-se biomassa, pode ser separado por cromatografia de troca iônica, mas o método não é limitado a isso.

[041] No método para a presente revelação, a recuperação de L-arginina a partir do micro-organismo ou do meio pode ser incluída adicionalmente depois do cultivo.

[042] A recuperação pode incluir um processo de purificação.

[EFEITOS VANTAJOSO]

[043] O micro-organismo da presente revelação, o qual produz L-arginina, pode produzir L-arginina com alta eficiência. Além disso, a L-arginina produzida pode ser aplicada não apenas a alimentos para animais ou aditivos de alimentos para animais, mas também a vários produtos tais como alimentação ou aditivos de alimentação humana, medicamentos, etc.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[044] Doravante, a presente revelação será descrita em detalhes com as modalidades exemplificativas anexas. Entretanto, as modalidades exemplificativas reveladas no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitantes ao escopo da presente revelação.

EXEMPLO 1: CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA DE MUTANTES ALEATÓRIA COM O USO DE TRANSPOSON

[045] Para obter uma cepa que tenha produtividade de L-arginina aumentada, uma biblioteca de vetores foi construída da seguinte maneira.

[046] Em primeiro lugar, com o uso de Corynebacterium glutamicum KCCM10741P(Patente Coreana no 0791659) como uma cepa parental, um plasmídeo obtido com o uso do Kit EZ-Tn5™ <R6KYori/KAN-2>Tnp Transposome™ (Epicentre) foi transformado na cepa parental por um método de pulso elétrico (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541 a 545). Em seguida, a cepa foi espalhada em uma placa de meio complexo contendo canamicina (25 mg/l), e, desse modo, cerca de 20.000 colônias foram obtidas. PLACA DE MEIO COMPLEXO (pH 7,0)

[047] 10 g de glicose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de carne bovina, 5 g de extrato de levedura, 18,5 g de infusão cérebro-coração, 2,5 g de NaCl, 2 g de ureia, 91 g de sorbitol, 20 g de ágar (por litro de água destilada)

EXEMPLO 2: TRIAGEM DA BIBLIOTECA DE MUTANTES ALEATÓRIA COM O USO DE TRANSPOSON

[048] Cada uma das cerca de 20.000 colônias obtidas no Exemplo 1 foi inoculada em 300 μl do seguinte meio seletivo e cultivada em uma placa de 96 poços profundos a 30 °C em 1.000 rpm por cerca de 24 horas. MEIO SELETIVO (pH 8,0)

[049] 10 g de glicose, 5,5 g de sulfato de amônio, 1,2 g de MgSO47H2O, 0,8 g KH2PO4, 16,4 g de K2HPO4, 100 μg de biotina, 1 mg de tiamina HCl, 2 mg de pantotenato de cálcio, 2 mg de nicotinamida (por litro de água destilada)

[050] Para analisar a quantidade de L-arginina produzida na cultura, foi usado o método da ninidrina (Moore, S., Stein, W. H., Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids. J. Biol. Chem. 1948, 176, 367 a 388).

[051] Após a conclusão do cultivo, 10 μl do sobrenadante de cultura foi reagido com 190 μl de uma solução de reação de ninidrina a 65 °C por 30 minutos, e então, a absorção em um comprimento de onda de 570 nm foi medida com um espectrofotômetro. Com base nos resultados da medição, cerca de 60 colônias que mostram absorção superior à Corynebacterium glutamicum cepa KCCM10741P usada como o controle foram selecionadas como cepas mutantes. Foi confirmado que outras colônias mostraram absorção similar ou inferior àquela da Corynebacterium glutamicum cepa KCCM10741P usada como o controle.

[052] Cerca de 60 cepas selecionadas como descrito acima foram cultivadas novamente da mesma maneira como descrito acima, e então, submetidas à reação de ninidrina. Como um resultado, as dez principais cepas mutantes que aumentaram a produtividade de L-arginina comparadas à Corynebacterium glutamicum cepa KCCM10741P usada como a cepa parental foram selecionadas.

EXEMPLO 3: ANÁLISE DE PRODUTIVIDADE DE L-ARGININA DE CEPAS MUTANTES ALEATÓRIAS SELECIONADAS

[053] A fim de selecionar, por fim, cepas cuja produtividade de L-arginina foi de modo reproduzível aumentada a partir das dez mutantes selecionadas no Exemplo 2, cultura em frasco foi realizada com o uso do seguinte meio. Após a conclusão do cultivo, a concentração de L-arginina na cultura foi analisada por HPLC. A concentração de L-arginina produzida por cada uma das cepas mutantes é mostrada na Tabela 1 abaixo.

MEIO DE PRODUÇÃO (pH 7,0)

[054] 6% de glicose, 3% de sulfato de amônio, 0,1% de fosfato monopotássico, 0,2% de sulfato de magnésio hepta-hidratado, 1,5% de milhocina (CSL), 1% de NaCl, 0,5% de extrato de levedura, 100 mg/l de biotina, 3% de CaCO3, (por litro de água destilada) TABELA 1: CONCENTRAÇÕES DE L-ARGININA PRODUZIDA POR 10 CEPAS MUTANTES SELECIONADAS ALEATORIAMENTE

[055] Entre as 10 cepas mutantes selecionadas, KCCM10741P/mt-10 foi, por fim, selecionada como uma cepa cuja produtividade de L-arginina foi aumentada significativamente.

EXEMPLO 4: IDENTIFICAÇÃO DE CAUSAS DE PRODUTIVIDADE DE L- ARGININA AUMENTADA DE CEPA POR FIM SELECIONADA

[056] Nesse Exemplo, um experimento foi realizado na cepa mutante, por fim, selecionada no Exemplo 3 a fim de identificar genes deletados por inserção aleatória do transposon.

[057] DNA genômico foi extraído de KCCM10741P/mt-10, digerido, e então, ligado, e o produto de ligação foi transformado em E. coli DH5α. As células de E. coli transformadas foram transferidas para placas em um meio sólido de LB contendo canamicina (25 mg/l). Vinte colônias transformadas foram selecionadas, e então, plasmídeos contendo uma porção de gene desconhecida foram obtidos. As sequências de nucleotídeo foram analisadas com o uso de iniciador 1 (SEQ ID NO: 3) e iniciador 2 (SEQ ID NO: 4) do Kit EZ-Tn5™ <R6KYori/KAN-2>Tnp Transposome™. Como um resultado, foi confirmado que o gene deletado e inativado tinha a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 que codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 Iniciador 1 (SEQ ID NO: 3): ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC Iniciador 2 (SEQ ID NO: 4): CTACCCTGTGGAACACCTACATCT

[058] Consequentemente, a fim de confirmar se a proteína que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 tem um efeito na capacidade para produzir L-arginina mediante inativação da proteína, o gene acima foi selecionado como um gene candidato para deleção.

EXEMPLO 5: CONSTRUÇÃO DE VETOR RECOMBINANTE PARA DELEÇÃO DO GENE QUE COMPREENDE A SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO DE SEQ ID NO: 2

[059] Nesse Exemplo, a fim de confirmar a influência da inativação do gene que compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 e aquela da produção de L-arginina, foi construído um plasmídeo recombinante para deletar o gene, selecionado no Exemplo 4, no cromossoma da Corynebacterium da cepa que produz L-arginina.

[060] Em primeiro lugar, iniciadores 3 a 6 mostrados na Tabela 2 foram sintetizados a fim de preparar um vetor recombinante capaz de deletar o gene no cromossoma do micro-organismo do gênero Corynebacterium. TABELA 2

[061] Especificamente, a fim de deletar a região de ORF (SEQ ID NO: 2) do gene, iniciador 3 (SEQ ID NO: 5), iniciador 4 (SEQ ID NO: 6), iniciador 5 (SEQ ID NO: 7) e iniciador 6 (SEQ ID NO: 8) foram sintetizados para que um local de enzima de restrição XhoI esteja presente tanto no término 5‘ quanto no término 3'. PCR foi executado com o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum KCCM10741P como um modelo com o uso de iniciadores 3 a 6 acima. Como um resultado, foi confirmado que cada um dos fragmentos de DNA correspondente às porções dianteira e traseira da parte em que a proteína codificada pelo gene é codificada foi amplificada por 500 bp, respectivamente. No presente documento, depois de desnaturação a 95 °C por 5 minutos, PCR foi executado por um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 94 °C por 30 segundos, hibridização a 56 °C por 30 segundos, e polimerização a 72 °C por 1 minuto. Depois disso, a reação de polimerização foi executada a 72 °C por 7 minutos. A seguir, um vetor pDZ (Patente Coreana no 10-0924065), o qual não é replicável em Corynebacterium glutamicum, foi tratado com uma enzima de restrição XhoI e, então, o produto de PCR obtido foi clonado por fusão. A clonagem por fusão foi executada com o uso de um Kit InFusion® HD Cloning (Clontech). Depois disso, o resultante foi transformado em E. coli DH5α, e, então, transferido para placas em um meio sólido de LB contendo canamicina (25 mg/l).

[062] Uma colônia transformada com um plasmídeo que tem o gene desejado inserido no mesmo foi selecionada por PCR, e então, o plasmídeo foi isolado com o uso de uma técnica de extração de plasmídeo. O plasmídeo foi denominado “pDZ- ΔRS1”.

EXEMPLO 6: CONSTRUÇÃO DE CORYNEBACTERIUM GLU7AMICUMKCCM10741P COM A DELEÇÃO DO GENE QUE COMPREENDE A SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO DE SEQ ID NO: 2, E AVALIAÇÃO DE PRODUTIVIDADE DE L-ARGININA DA CEPA CONSTRUÍDA

[063] Com base na cepa que produz L-arginina do gênero Corynebacterium, que é a cepa KCCM10741P, foi construída uma cepa na qual o gene que compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 é deletado, e a produtividade de L- arginina da cepa construída foi avaliada.

[064] Especificamente, o plasmídeo recombinante pDZ-ΔRS1 preparado no Exemplo 5 foi transformado em Corynebacterium glutamicum KCCM10741P, que é uma cepa que produz L-arginina, por recombinação homóloga no cromossoma (Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541 a 545, 1999).

[065] A seguir, o transformante foi desenvolvido em uma placa de meio sólido contendo 4% de sacarose para permitir que ocorra uma segunda recombinação. Após a conclusão da segunda recombinação, deleção do gene no cromossoma da cepa de Corynebacterium glutamicum transformada foi confirmada por PCR com o uso de iniciador 3 e iniciador 6. A cepa recombinante foi denominada “Corynebacterium glutamicum KCCM10741P-RS1”.

[066] A fim de analisar a produtividade de L-arginina, a cepa Corynebacterium glutamicum KCCM10741P-RS1 construída e a cepa parental Corynebacterium glutamicum KCCM10741P foram cultivadas da seguinte maneira.

[067] Cada uma dentre a cepa parental Corynebacterium glutamicum KCCM10741P e a cepa Corynebacterium glutamicum KCCM10741P-RS1 construída no Exemplo 6 foi inoculada em um balão de Erlenmeyer com saliências no fundo de 250 ml contendo 25 ml do seguinte meio de semeio e cultivado em agitação em 200 rpm a 30 °C por 20 horas. A seguir, 1 ml de cada uma das culturas semeadas foi inoculada em um balão de Erlenmeyer com saliências no fundo de 250 ml contendo 24 ml do seguinte meio de produção e cultivado em agitação em 200 rpm a 30 °C por 72 horas. A composição do meio de semeio e a composição do meio de produção foram como segue.

MEIO DE SEMEIO (pH 7,0)

[068] 20 g de glicose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO47H2O, 100 μg de biotina, 1 mg de tiamina HCl, 2 mg de pantotenato de cálcio, 2 mg de nicotinamida (por litro de água destilada)

MEIO DE PRODUÇÃO (pH 7,0)

[069] 6% de glicose, 3% de sulfato de amônio, 0,1% de fosfato monopotássico, 0,2%de sulfato de magnésio hepta-hidratado, 1,5% de milhocina (CSL), 1% de NaCl, 0,5% de extrato de levedura, 100 mg/l de biotina (por litro de água destilada)

[070] Após a conclusão do cultivo, a quantidade de L-arginina produzida foi medida por HPLC, e a concentração de L-arginina analisada é mostrada na Tabela 3 abaixo. TABELA 3: ANÁLISE DE PRODUTIVIDADE DE L-ARGININA DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM KCCM10741P EM QUE O GENE QUE COMPREENDE A SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO DE SEQ ID NO: 2 É DELETADO

[071] Com base nos resultados acima, foi confirmado que KCCM10741P-RS1, em que o gene é deletado de Corynebacterium glutamicum KCCM10741P (isto é, a cepa que produz L-arginina), tinha a produtividade de L-arginina que é aumentada por 25% em média comparada à cepa parental.

[072] A cepa KCCM10741P-RS1 foi denominada “CA06-2830”, e foi depositada para o Centro Coreano de Cultura de Micro-organismos (KCCM), o qual é uma autoridade depositária internacional sob o Tratado de Budapeste, em 15 de dezembro de 2017, e atribuída como a Adesão no KCCM12187P.

[073] Portanto, foi confirmado que a produtividade de L-arginina poderia ser melhorada deletando-se o gene que compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 do micro-organismo do gênero Corynebacterium.

EXEMPLO 7: CONSTRUÇÃO DE VETOR RECOMBINANTE PARA ATENUAR O GENE QUE COMPREENDE A SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO DE SEQ ID NO: 2

[074] A fim de construir um vetor recombinante capaz de atenuar o gene que compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 no cromossoma da cepa do gênero Corynebacterium, o códon de iniciação do gene foi substituído de ATG para TTG para atenuar o gene. Ademais, a fim de construir um fragmento para o mesmo, o iniciador 3 e os iniciadores 7 a 9 mostrados na Tabela 4 abaixo foram sintetizados. TABELA 4

[075] A fim de amplificar a região de ORF (SEQ ID NO: 2) do gene, iniciador 3 (SEQ ID NO: 5), iniciador 7 (SEQ ID NO: 9), iniciador 8 (SEQ ID NO: 10) e iniciador 9 (SEQ ID NO: 11) foram sintetizados para que um local de enzima de restrição XhoI esteja presente tanto no término 5‘ quanto no término 3‘. PCR foi executado com o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum KCCM10741P como um modelo com o uso de iniciador 3, iniciador 7, iniciador 8 e iniciador 9. No presente documento, depois de desnaturação a 95 °C por 5 minutos, PCR foi executado por um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 94 °C por 30 segundos, hibridização a 56 °C por 30 segundos, e polimerização a 72 °C por 1 minuto. Depois disso, a reação de polimerização foi executada a 72 °C por 7 minutos. A seguir, um vetor pDZ (Patente Coreana no 10-0924065), o qual não é replicável em Corynebacterium glutamicum, foi tratado com uma enzima de restrição XhoI e, então, o produto de PCR obtido foi clonado por fusão. A clonagem por fusão foi executada com o uso de um Kit In-Fusion® HD Cloning (Clontech). Depois disso, o resultante foi transformado em E. coli DH5α, e, então, transferido para placas em um meio sólido de LB contendo canamicina (25 mg/l).

[076] Uma colônia transformada com um plasmídeo que tem o gene desejado inserido no mesmo foi selecionada por PCR, e então, o plasmídeo foi isolado com o uso de uma técnica de extração de plasmídeo. O plasmídeo foi denominado “pDZ- ΔRS2”.

EXEMPLO 8: CONSTRUÇÃO DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM KCCM10741P EM QUE O GENE QUE COMPREENDE A SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO DE SEQ ID NO: 2 É ATENUADA, E AVALIAÇÃO DE PRODUTIVIDADE DE L-ARGININA DA CEPA CONSTRUÍDA

[077] O plasmídeo recombinante pDZ-ΔRS2 preparado no Exemplo 7 foi transformado em Corynebacterium glutamicum KCCM10741P, a qual é uma cepa que produz L-arginina, por recombinação homóloga no cromossoma (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541 a 545, 1999).

[078] A seguir, o transformante foi desenvolvido em uma placa de meio sólido contendo 4% de sacarose para permitir que ocorra uma segunda recombinação. A sequência de nucleotídeo da cepa de Corynebacterium glutamicum transformada obtida depois da segunda recombinação foi analisada com o uso de iniciador 3 e iniciador 9 para identificar a cepa em que o códon de iniciação do gene que compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 é substituído por TTG. A cepa recombinante foi denominada “Corynebacterium glutamicum KCCM10741P- RS2”.

[079] Cada uma dentre a cepa parental Corynebacterium glutamicum KCCM10741P e a cepa Corynebacterium glutamicum KCCM10741P-RS2 construída acima foi cultivada da mesma maneira como no Exemplo 6 a fim de analisar a produtividade de L-arginina. Depois disso, a quantidade de L-arginina produzida foi medida por HPLC, e a concentração de L-arginina analisada é mostrada na Tabela 5 abaixo. TABELA 5: ANÁLISE DE PRODUTIVIDADE DE L-ARGININA DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM KCCM10741P EM QUE O GENE QUE COMPREENDE A SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO DE SEQ ID NO: 2 É ATENUADA

[080] Como mostrado nos resultados acima, foi confirmado que, quando o gene que compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 foi atenuado na cepa que produz L-arginina KCCM10741P, a produtividade de L-arginina da cepa foi aumentada por 12% em média.

[081] Portanto, foi confirmado que a produtividade de L-arginina poderia ser melhorada atenuando-se a expressão do gene que compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 no micro-organismo do gênero Corynebacterium.

[082] Dos resultados acima, pode ser visto que na cepa em que o gene que compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 é deletado ou atenuado, a produtividade de L-arginina é aumentada, e isso sugere que L-arginina pode ser produzida em massa no micro-organismo quando a atividade da proteína codificada pelo gene é inativada.

[083] Embora a presente revelação tenha sido descrita com referência às modalidades ilustrativas particulares, será compreendido pelas pessoas versadas na técnica à qual a presente revelação pertence que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem que se afaste do espírito técnico ou características essenciais da presente revelação. Portanto, as modalidades descritas acima são consideradas como ilustrativas em todos os aspectos e não restritivas. Além disso, o escopo da presente revelação é definido pelas reivindicações anexas em vez da descrição detalhada, e deve ser compreendido que todas as modificações ou variações derivadas dos significados e escopo da presente revelação e equivalentes da mesma são incluídas no escopo das reivindicações anexas.

NÚMERO DE ADESÃO

[084] Instituição Depositária: Centro Coreano de Cultura de Micro-organismos (KCCM) (Autoridade Depositária Internacional) Número de Adesão: KCCM12187P Data de Depósito: 15 de dezembro de 2017

Claims

1. Micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L-arginina, CARACTERIZADO pelo fato de que uma proteína inerentemente presente no microorganismo não modificado do gênero Corynebacterium e o gene, consistindo na SEQ ID NO: 2 ou na sequência degenerada da mesma que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, é deletado ou inativado.

2. Micro-organismo do gênero Corynebacterium, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a inativação é 1) deletar a totalidade ou parte do gene que codifica a proteína; 2) modificar uma sequência de controle de expressão de modo que a expressão do gene que codifica a proteína seja reduzida; 3) introduzir um oligonucleotídeo antisenso que se liga complementarmente a um transcrito do gene que codifica a proteína; 4) impossibilitar a ligação de um ribossomo pela formação de uma estrutura secundária pela adição de uma sequência Shine-Dalgarno e sua sequência complementar na extremidade frontal da sequência Shine-Dalgarno do gene que codifica a proteína; 5) engenharia de transcrição reversa (RTE), que adiciona um promotor para ser transcrito reversamente no terminal 3' do quadro de leitura aberta (ORF) da sequência de polinucleotídeos do gene que codifica a proteína; ou 6) uma combinação destes.

3. Micro-organismo do gênero Corynebacterium, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o micro-organismo é Corynebacterium glutamicum.

4. Método para produzir L-arginina CARACTERIZADO pelo fato de que compreende cultivar o micro-organismo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em um meio.

5. Método para produzir L-arginina, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda recuperar L-arginina do micro-organismo ou do meio.