BR112019014101B1

BR112019014101B1 - Variante de proteína que tem uma atividade de exportação de inosina-5'-monofosfato, polinucleotídeo, vetor, micro-organismo do gênero corynebacterium que produz inosina-5'- monofosfato, método para preparar inosina-5'-monofosfato e uso da variante de proteína

Info

Publication number: BR112019014101B1
Application number: BR112019014101-4A
Authority: BR
Inventors: Jin Ah Rho; Byoung Hoon Yoon; So-Jung Park; Min Ji Baek; Ji Hye Lee
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2018-01-04
Filing date: 2019-01-04
Publication date: 2022-05-10
Also published as: CN110003315A; EP3674313A1; AU2019204119B2; EP3674313A8; US20230192780A1; CN110831959A; MX2019007995A; CN110831959B; WO2019135445A1; EP3674313A4; US11746130B2; JP2020505914A; US11384124B2; WO2019135639A1; RU2733422C1; ZA201903357B; US20220348616A1; KR101916622B1; AU2019204119A1; JP6648345B1

Abstract

A presente revelação se refere a uma variante de proteína inovadora que tem uma atividade de exportação de inosina-5'-monofosfato, a um micro-organismo que compreende a variante de proteína e a um método para preparar inosina-5'- monofosfato com o uso do micro-organismo.

Description

[CAMPO DA TÉCNICA]

[001] A presente revelação refere-se a uma variante de proteína inovadora que tem uma atividade de exportação de inosina-5'-monofosfato, a um micro-organismo que contém a variante de proteína, a um método para preparar inosina-5'-monofosfato com o uso do micro-organismo e a um método para aumentar a exportação de inosina- 5'-monofosfato com o uso do micro-organismo.

[ANTECEDENTES DA TÉCNICA]

[002] Inosina-5'-monofosfato (doravante, IMP), um material de ácido nucleico, é um intermediário da trajetória metabólica do ácido nucleico e é usado em muitos campos, tais como alimentos, medicamentos, várias aplicações médicas, etc. Em particular, IMP é amplamente usado como um aditivo para condimentos alimentares ou alimentos, juntamente com guanina-5'-monofosfato (doravante, GMP). Embora o próprio IMP seja conhecido por fornecer um sabor de carne, o mesmo é conhecido por intensificar o aroma de ácido glutâmico monossódico (MSG) e, assim, atrai a atenção como um condimento à base de ácido nucleico intensificador de sabor.

[003] Exemplos de métodos para produzir IMP incluem um método para degradar enzimaticamente ácido ribonucleico extraído de células de levedura (publicação de patente no JP 1614/1957), um método para fosforilar quimicamente inosina produzida por fermentação (Agri. Biol. Chem., 36, 1.511, (1972), etc.), um método para cultivar micro-organismos que podem produzir diretamente IMP e recuperar IMP no caldo de cultura, etc. Entre esses, o método mais frequentemente usado atualmente é um método que usa micro-organismos com capacidade para produzir diretamente IMP.

[004] Entretanto, visto que enzimas nem sempre exibem propriedades ideais na natureza em relação à atividade, estabilidade, especificidade de substrato para isômeros ópticos, etc. necessárias em aplicações industriais, várias tentativas foram feitas para aprimorar enzimas de modo a se adequarem ao uso pretendido por uma mutação de suas sequências de aminoácidos, etc. Entre essas, embora o projeto racional e a mutagênese sítio-dirigida de enzimas tenham sido aplicados para aprimorar a função enzimática, em muitos casos, essas tentativas mostraram-se desvantajosas pelo fato de que as informações sobre a estrutura de enzimas-alvo não são suficientes ou a correlação entre estrutura e função não está clara, impedindo, assim, sua aplicação eficaz. Adicionalmente, um método para aprimorar a atividade enzimática com a intenção de intensificar as enzimas através de evolução dirigida, que se trata de triar enzimas de traços desejados a partir de uma biblioteca de enzimas modificadas construídas através de mutagênese aleatória de genes enzimáticos, foi anteriormente relatado.

[REVELAÇÃO] [PROBLEMA DA TÉCNICA]

[005] Para produzir IMP em alto rendimento por produção direta de IMP através de fermentação microbiana, é essencial que a exportação de IMP seja realizada suavemente. Para alcançar o objetivo da presente revelação, os inventores da presente revelação conduziram estudos extensivos e, como resultado, identificaram as proteínas envolvidas na atividade de exportação de IMP e também constataram variantes de proteína que têm maior atividade de exportação de IMP, concluindo, assim, a presente revelação.

[SOLUÇÃO DA TÉCNICA]

[006] Um objetivo da presente revelação é fornecer uma variante de proteína que tem a atividade de exportação de IMP.

[007] Um outro objetivo da presente revelação é fornecer um polinucleotídeo que codifica a variante de proteína da presente revelação.

[008] Ainda um outro objetivo da presente revelação é fornecer um vetor que inclui o polinucleotídeo da presente revelação.

[009] Ainda um outro objetivo da presente revelação é fornecer um micro organismo que produz IMP, no qual o micro-organismo inclui a variante de proteína da presente revelação e o vetor da presente revelação.

[010] Ainda um outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para preparar IMP que inclui cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium da presente revelação em um meio e recuperar IMP a partir do micro-organismo ou do meio.

[011] Ainda um outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para aumentar a exportação de IMP que inclui uma etapa de intensificar uma atividade da proteína que exporta IMP em um micro-organismo do gênero Corynebacterium.

[012] Para alcançar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação fornece uma variante de proteína que tem uma atividade de exportação de IMP.

[013] Conforme usado no presente documento, o termo “uma proteína que exporta inosina-5'-monofosfato (IMP)” se refere a uma proteína envolvida na exportação extracelular de IMP. Para o propósito da presente revelação, o termo pode ser usado intercambiavelmente com uma proteína que tem uma atividade de exportação de IMP, uma proteína de exportação de IMP, uma proteína com capacidade para exportar IMP, uma proteína exportadora de IMP, etc.; especificamente, a proteína pode ser expressa como ImpE, mais especificamente, ImpE1 ou ImpE2 e, ainda mais especificamente, a proteína que exporta da presente revelação pode ser expressa como ImpE2, mas a expressão da proteína não se limita a esses. Adicionalmente, a proteína pode ser derivada de um micro-organismo do gênero Corynebacterium e, especificamente, de Corynebacterium stationis, mas o micro-organismo não se limita a esses.

[014] A proteína pode ser uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 ou uma que consista na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, mas qualquer sequência que tenha a mesma atividade que a proteína pode ser incluída sem limitação, e uma pessoa versada na técnica pode obter informações de sequência a partir do GenBank do NCBI, um banco de dados bem conhecido. Adicionalmente, a proteína da presente revelação que exporta IMP pode ser uma proteína que inclui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que tem uma homologia ou identidade com a sequência de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. Adicionalmente, é evidente que qualquer proteína que tenha uma sequência de aminoácidos com deleção, mutação, substituição ou adição em parte da sequência também pode ser incluída no escopo da presente revelação, desde que a sequência de aminoácidos tenha uma homologia ou identidade descrita acima e tenha um efeito correspondente àquele da proteína.

[015] Ou seja, embora descrita como “uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos representada por uma SEQ ID NO específica” ou “uma proteína que consiste em uma SEQ ID NO específica” na presente revelação, é evidente que uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição, substituição conservadora ou adição de alguns aminoácidos também encontra-se dentro do escopo da presente invenção desde que a proteína tenha uma atividade igual ou equivalente àquela da proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO correspondente. Por exemplo, na medida em que a proteína tem uma atividade igual ou equivalente àquela da variante de proteína da presente revelação, a expressão acima não exclui uma adição de sequência a montante ou a jusante da sequência de aminoácidos que não altera as funções da proteína, uma mutação de ocorrência natural na mesma, uma mutação silenciosa na mesma ou uma substituição conservadora, e mesmo em um caso de tal adição ou mutação de sequência, é evidente que a proteína também pertence ao escopo da presente revelação.

[016] Na presente revelação, “homologia” e “identidade” referem-se a um grau de relevância entre duas determinadas sequências de aminoácidos ou sequências de nucleotídeos e podem ser expressas como uma porcentagem.

[017] Os termos “homologia” e “identidade” são frequentemente usados de forma intercambiável entre si.

[018] A homologia ou identidade de sequência de sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos conservadas pode ser determinada por algoritmos-padrão de alinhamento e pode ser usada com penalidade por lacuna padrão estabelecida pelo programa a ser usado. Substancialmente, polinucleotídeos ou polipeptídeos homólogos ou idênticos podem geralmente hibridizar sob estringência moderada ou alta ao longo de todo o comprimento ou pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% ou cerca de 90% ou mais de todo o comprimento. Na hibridização, polinucleotídeos que incluem códons degenerados em vez de códons também são considerados.

[019] A possibilidade de quaisquer duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos terem uma homologia, similaridade ou identidade pode ser determinada, por exemplo, com o uso de um algoritmo de computador conhecido, tal como o programa “FASTA” (por exemplo, Pearson et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85: 2.444), com o uso de parâmetros padrão. Alternativamente, a mesma pode ser determinada com o uso do algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453), que é executado no programa Needleman do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277) (versão 5.0.0 ou versões posteriores) (pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.] et al., J Molec Bio 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994 e [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1.073). Por exemplo, a homologia, similaridade ou identidade pode ser determinada com o uso de BLAST ou ClustalW do Centro Nacional para Informações Biotecnológicas (NCBI).

[020] A homologia, similaridade ou identidade de sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada comparando-se informações de sequência com o uso, por exemplo, do programa de computador GAP (por exemplo, Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482), conforme publicado. Em resumo, o programa GAP define a homologia ou identidade como o valor obtido dividindo-se o número de símbolos alinhados de modo similar (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) pelo número total dos símbolos na menor das duas sequências. Parâmetros padrão para o programa GAP podem incluir (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14: 6.745, conforme revelado em Schwartz e Dayhoff, edições, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, páginas 353 a 358, 1979; (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada lacuna (ou uma penalidade por abertura de lacuna de 10 e uma penalidade por extensão de lacuna de 0,5); e (3) nenhuma penalidade para lacunas finais. Consequentemente, conforme usado no presente documento, o termo “homologia” ou “identidade” se refere à relevância entre sequências.

[021] Conforme usado no presente documento, o termo “variante” se refere a um polipeptídeo que, na substituição conservadora e/ou modificação de um ou mais aminoácidos, difere da sequência recitada, mas retém as funções ou propriedades da proteína. Uma variante difere das sequências identificadas distinguindo-se por diversas substituições, deleções ou adições de aminoácido. Tal variante pode geralmente ser identificada modificando-se um aminoácido da sequência de polipeptídeos e avaliando-se as propriedades da variante. Ou seja, as capacidades da proteína variante podem ser aumentadas, inalteradas ou diminuídas em comparação àquelas da proteína nativa. Além disso, alguns polipeptídeos modificados podem incluir aqueles modificados em que uma ou mais porções químicas (por exemplo, uma sequência-líder N-terminal, domínio transmembranar, etc.) são removidas. Outras variantes podem incluir variantes nas quais uma pequena porção foi removida do N e/ou C-terminal da proteína madura. Conforme usado no presente documento, o termo “substituição conservadora” se refere à reposição de um aminoácido com um outro aminoácido que tem propriedades estruturais e/ou químicas similares. A variante pode ter, por exemplo, uma ou mais substituições conservadoras, enquanto ainda retém uma ou mais atividades biológicas. Tal substituição de aminoácido pode geralmente se feita com base na similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática. Por exemplo, aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido glutâmico e ácido aspártico; aminoácidos aromáticos incluem fenilalanina, triptofano e tirosina; e aminoácidos hidrofóbicos incluem alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, glicina e triptofano.

[022] Adicionalmente, a variante também pode incluir deleção ou adição de aminoácidos, o que tem mínimos efeitos nas propriedades, e uma estrutura secundária de um polipeptídeo. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser conjugado com uma sequência-sinal (ou líder) na terminação N de uma proteína que está envolvida na transferência cotranslacional ou pós-translacional da proteína. O polipeptídeo também pode ser conjugado com uma outra sequência ou ligante para possibilitar a identificação, purificação ou síntese do polipeptídeo.

[023] Especificamente, a variante de proteína que tem a atividade de exportação de IMP da presente revelação pode ser uma variante de proteína que tem uma sequência de aminoácidos na qual, a partir da terminação N na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, pelo menos um aminoácido selecionado dentro o grupo que consiste no 123° aminoácido, no 243° aminoácido, no 387° aminoácido, no 405° aminoácido; no 413° aminoácido e no 458° aminoácido é substituído por um outro aminoácido, mas a substituição de aminoácido não se limita a essas.

[024] Por exemplo, a variante de proteína que tem a atividade de exportação de IMP da presente revelação pode ser uma variante de proteína que tem a atividade de exportação de IMP que tem, a partir da terminação N na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma substituição do 123° aminoácido por cisteína (isto é, F123C); uma substituição do 243° aminoácido por valina (isto é, I243V); uma substituição do 387° aminoácido por treonina (isto é, S387T); uma substituição do 405° aminoácido por tirosina (isto é, F405Y); uma substituição do 413° aminoácido por treonina (isto é, M413T); uma substituição do 458° aminoácido por lisina (isto é, N458K); ou uma combinação das mesmas, mas a substituição de aminoácido não se limita a essas. Mais especificamente, a variante de proteína que tem uma atividade de exportação de IMP pode ser uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOS: 73, 74, 75, 76, 77, 78, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153 e 155, ou uma sequência de aminoácidos que tem uma homologia de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% ou mais com essas sequências de aminoácidos. Adicionalmente, é evidente que qualquer proteína que tenha uma sequência de aminoácidos, em que parte da sequência de aminoácidos é deletada, modificada, substituída ou adiciona, também pode ser usada como a proteína da presente revelação, desde que a sequência de aminoácidos tenha a homologia de sequência descrita acima e apresente um efeito equivalente àquele dos polipeptídeos acima.

[025] Adicionalmente, a variante de proteína que tem a atividade de exportação de IMP da presente revelação pode ser uma variante de proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos que inclui, ainda, a partir da terminação N na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma substituição do 2° aminoácido por um outro aminoácido, uma substituição do 64° aminoácido por um outro aminoácido ou uma combinação das mesmas. Especificamente, a variante de proteína que tem a atividade de exportação de IMP da presente revelação pode ser uma variante de proteína que inclui, ainda, a partir da terminação N na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma substituição do 2° aminoácido por isoleucina, uma substituição do 64° aminoácido por ácido glutâmico ou aspartato ou uma combinação das mesmas.

[026] A “substituição por um outro aminoácido” não é limitada desde que o outro aminoácido seja um aminoácido diferente do aminoácido antes da substituição. Por exemplo, quando o 2° aminoácido a partir da terminação N na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 for substituído por um outro aminoácido, o outro aminoácido não é limitado desde que o outro aminoácido seja um aminoácido diferente de valina, e quando o 64° aminoácido a partir da terminação N na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 for substituído por um outro aminoácido, o outro aminoácido não é limitado desde que o outro aminoácido seja um aminoácido diferente de glicina.

[027] Um outro aspecto da presente revelação fornece um polinucleotídeo que codifica a variante de proteína da presente revelação ou um vetor que contém o polinucleotídeo da presente revelação.

[028] Conforme usado no presente documento, o termo “polinucleotídeo” se refere a um polímero de nucleotídeos no qual monômeros de nucleotídeo são estendidos em uma cadeia longa por ligações covalentes e que tem uma fita de DNA ou fita de RNA mais longa que um determinado comprimento.

[029] Em relação ao polinucleotídeo da presente revelação, com base na degenerescência de códon, é evidente que as proteínas que consistem na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, 74, 75, 76, 77, 78, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153 ou 155 ou os polinucleotídeos que podem ser traduzidos em proteínas que têm uma homologia com as proteínas acima também podem ser incluídos no escopo da presente revelação. Por exemplo, o polinucleotídeo da presente revelação pode ser uma sequência de polinucleotídeos que tem a sequência- base de SEQ ID NO: 79, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154 ou 156 e, mais especificamente, um polinucleotídeo que consiste na sequência-base de SEQ ID NO: 79, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154 ou 156. Adicionalmente, qualquer sequência que codifique uma proteína que tem uma atividade da proteína que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, 74, 75, 76, 77, 78, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153 ou 155, determinada por hibridização sob condições estringentes com uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência de genes conhecida (por exemplo, uma sequência complementar à totalidade ou parte das sequências de nucleotídeos acima), pode ser incluída sem limitação.

[030] O termo “condições estringentes” se refere a condições sob as quais a hibridização específica entre polinucleotídeos é possível. Tais condições são especificamente descritas em referências (por exemplo, J. Sambrook et al., supra). Por exemplo, as condições podem incluir a realização de hibridização entre genes que têm uma alta homologia, uma homologia de 40% ou superior, especificamente, 90% ou superior, mais especificamente, 95% ou superior, ainda mais especificamente, 97% ou superior e, com a máxima especificidade, 99% ou superior, enquanto não realiza a hibridização entre genes que têm uma homologia inferior às homologias acima; ou a realização de hibridização uma vez, especificamente, duas ou três vezes, sob condições de lavagem convencionais para hibridização de southern de 60 °C, 1 x SSC e SDS a 0,1%, especificamente, a uma concentração de sal e temperatura correspondentes a 60 °C, 0,1x SSC e SDS a 0,1% e, mais especificamente, 68 °C, 0,1x SSC e SDS a 0,1%.

[031] A hibridização requer que dois ácidos nucleicos tenham uma sequência complementar, embora disparidades entre bases possam ser possíveis, dependendo da estringência da hibridização. O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre bases nucleotídicas mutuamente hibridizáveis. Por exemplo, em relação ao DNA, adenosina é complementar à timina, e citosina é complementar à guanina. Consequentemente, a presente revelação também pode incluir fragmentos de ácido nucleico isolados complementares a toda a sequência, bem como sequências de ácidos nucleicos substancialmente similares.

[032] Especificamente, polinucleotídeos que têm uma homologia podem ser detectados em um valor de Tm de 55 °C com o uso de condições de hibridização que incluem uma etapa de hibridização e com o uso das condições descritas acima. Adicionalmente, o valor de Tm pode ser 60 °C, 63 °C ou 65 °C, mas não é limitado a esses, e pode ser apropriadamente ajustado por um indivíduo de habilidade comum na técnica de acordo com o propósito pretendido.

[033] A estringência adequada para a hibridização de polinucleotídeos depende do comprimento e da complementaridade dos polinucleotídeos, e as variáveis relacionadas são bem conhecidos na técnica (consultar Sambrook et al., supra, 9.50 a 9.51 e 11.7 a 11.8).

[034] Na presente revelação, o polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos da proteína que tem uma atividade de exportação de IMP pode ser o gene impE2, e a explicação do polinucleotídeo é conforme descrito acima.

[035] Na presente revelação, a explicação do polinucleotídeo que codifica a variante de proteína, que tem uma atividade de exportação de IMP, também é conforme descrito acima.

[036] Conforme usado no presente documento, o termo “vetor” se refere a um construto de DNA que inclui a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo, em que a proteína-alvo é ligada operacionalmente a uma sequência de controle adequada, de modo que a proteína-alvo possa ser expressa em um hospedeiro apropriado. A sequência de controle pode incluir um promotor com capacidade para iniciar a transcrição, qualquer sequência operadora para controlar a transcrição, uma sequência que codifica um domínio de ligação a ribossoma mRNA apropriado e uma sequência que controla a terminação de transcrição e tradução. O vetor, após ser transformado em uma célula hospedeira adequada, pode ser replicado ou funcionar independentemente do genoma hospedeiro, ou pode ser integrado ao próprio genoma hospedeiro.

[037] O vetor usado na presente revelação pode não ser particularmente limitado desde que o vetor seja replicável na célula hospedeira, e o mesmo pode ser construído com o uso de qualquer vetor conhecido na técnica. Os exemplos do vetor podem incluir plasmídeos naturais ou recombinantes, cosmídeos, vírus e bacteriófagos. Por exemplo, como um vetor de fago ou vetor de cosmídeo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc. podem ser usados; e como um vetor de plasmídeo, aqueles com base em pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET, etc. podem ser usados. Especificamente, vetores pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, etc. podem ser usados.

[038] Em uma modalidade, o polinucleotídeo que codifica a proteína-alvo pode ser substituído por um polinucleotídeo modificado (variante) dentro do cromossomo com o uso de um vetor para a inserção no cromossomo em uma célula. A inserção do polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada com o uso de um método conhecido na técnica, por exemplo, por recombinação homóloga, mas não se limita ao mesmo. Em particular, um marcador de seleção para confirmar a inserção no cromossomo pode ser adicionalmente incluído. O marcador de seleção é usado para seleção de uma célula transformada, isto é, para confirmar se o ácido nucleico-alvo foi inserido, e marcadores com capacidade para fornecer fenótipos selecionáveis, tais como resistência ao fármaco, requisito de nutrientes, resistência a agentes citotóxicos e expressão de proteínas de superfície, podem ser usados. Sob as circunstâncias em que agentes seletivos são tratados, apenas as células com capacidade para expressar os marcadores de seleção podem sobreviver ou expressar outros traços fenotípicos e, assim, as células transformadas podem ser facilmente selecionadas.

[039] Ainda um outro aspecto da presente revelação fornece um micro organismo que pode produzir IMP que inclui a variante de proteína da presente revelação, um polinucleotídeo que codifica a variante de proteína da presente revelação ou o vetor da presente revelação. Especificamente, o micro-organismo da presente revelação pode ser um micro-organismo preparado por meio de transformação com o uso de um vetor que contém o polinucleotídeo que codifica a variante de proteína da presente revelação, mas o micro-organismo não se limita a esse.

[040] Conforme usado no presente documento, o termo “transformação” se refere a um processo para introduzir um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo em uma célula hospedeira, permitindo, assim, a expressão da proteína codificada pelo polinucleotídeo na célula hospedeira. Para o polinucleotídeo transformado, não importa se o mesmo é inserido no cromossomo da célula hospedeira e localizado no mesmo ou localizado fora do cromossomo, desde que o polinucleotídeo transformado possa ser expresso na célula hospedeira. Adicionalmente, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam a proteína-alvo. O polinucleotídeo pode ser inserido em qualquer forma desde que possa ser introduzido em uma célula hospedeira e expresso na mesma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é um construto genético que inclui todos os elementos essenciais necessário para autoexpressão. O cassete de expressão pode incluir convencionalmente um promotor ligado operacionalmente ao polinucleotídeo, a um sinal de terminação de transcrição, a um domínio de ligação ao ribossoma e a um sinal de terminação de tradução. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão autorreplicável. Adicionalmente, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira como tal e é ligado operacionalmente a uma sequência essencial para sua expressão na célula hospedeira, porém não se limita a isso.

[041] Adicionalmente, conforme usado no presente documento, o termo “ligado operacionalmente” se refere a uma ligação funcional entre uma sequência promotora, que inicia e medeia a transcrição do polinucleotídeo que codifica a proteína-alvo, isto é, um conjugado da presente revelação, e a sequência de genes acima.

[042] Conforme usado no presente documento, o termo “micro-organismo produtor de IMP” se refere a um micro-organismo que tem capacidade natural para produzir IMP; ou um micro-organismo cuja cepa parental não tem capacidade natural para produzir e/ou exportar IMP que é dotado de uma capacidade para produzir ou exportar IMP. Na presente revelação, o micro-organismo que produz IMP pode ser usado intercambiavelmente com um micro-organismo que exporta IMP ou um micro-organismo que tem uma atividade de exportação de IMP.

[043] O micro-organismo produtor de IMP é uma célula ou micro-organismo hospedeiro que inclui uma variante de proteína que tem uma atividade de exportação de IMP, ou um polinucleotídeo que codifica a variante de proteína, ou que é transformado com um vetor que contém o polinucleotídeo que codifica a variante de proteína, e tem, assim, capacidade para expressar a variante de proteína. Especificamente, o micro-organismo da presente revelação pode ser um micro-organismo do gênero Escherichia, um micro-organismo do gênero Serratia, um micro-organismo do gênero Erwinia, um micro-organismo do gênero Enterobacteria, um micro-organismo do gênero Salmonella, um micro-organismo do gênero Streptomyces, um micro-organismo do gênero Pseudomonas, um micro-organismo do gênero Brevibacterium, um micro-organismo do gênero Corynebacterium, etc., e mais especificamente, o micro-organismo da presente revelação pode ser um micro-organismo do gênero Corynebacterium.

[044] Conforme usado no presente documento, o termo “micro-organismo produtor de IMP do gênero Corynebacterium” se refere a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que tem capacidade natural para produzir IMP ou capacidade para produzir IMP por mutação. Especificamente, conforme usado no presente documento, o micro-organismo do gênero Corynebacterium com capacidade para produzir IMP pode ser uma cepa nativa do micro-organismo do gênero Corynebacterium com capacidade para produzir IMP; ou um micro-organismo do gênero Corynebacterium com capacidade intensificada para produzir IMP preparado inserindo-se um gene associado à produção de IMP ou intensificando-se ou atenuando-se o gene endógeno associado à produção de IMP. Mais especificamente, na presente revelação, o micro-organismo do gênero Corynebacterium com capacidade para produzir IMP pode ser um micro-organismo do gênero Corynebacterium que tem capacidade aprimorada para produzir IMP, incluindo-se uma variante de proteína que tem uma atividade de exportação de IMP ou um polinucleotídeo que codifica a variante de proteína, ou sendo transformado com um vetor que contém o polinucleotídeo que codifica a variante de proteína. O “micro-organismo do gênero Corynebacterium com capacidade intensificada para produzir IMP” pode ser um micro-organismo do gênero Corynebacterium com capacidade aprimorada para produzir IMP em comparação com aquele de sua cepa parental antes da transformação ou aquele de um micro-organismo não modificado do gênero Corynebacterium. O “micro-organismo não modificado do gênero Corynebacterium” pode ser um tipo nativo do micro-organismo do gênero Corynebacterium, ou um micro-organismo do gênero Corynebacterium que não contém a variante de proteína com capacidade para exportar IMP, ou um micro-organismo do gênero Corynebacterium que não é transformado com um vetor que contém um polinucleotídeo que codifica a variante de proteína com capacidade para exportar IMP.

[045] Em uma modalidade da presente revelação, o micro-organismo da presente revelação pode ser um micro-organismo no qual uma atividade de adenilossuccinato sintetase e/ou IMP desidrogenase é adicionalmente atenuada.

[046] Especificamente, o micro-organismo da presente revelação pode ser Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens ou Corynebacterium stationis, mas o micro-organismo não se limita a esses.

[047] Ainda um outro aspecto da presente revelação fornece um método para preparar IMP que inclui cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz IMP da presente revelação em um meio.

[048] Especificamente, o método da presente revelação pode incluir, ainda, uma etapa de recuperar IMP a partir do micro-organismo da presente revelação ou do meio da presente revelação.

[049] No método acima da presente revelação, o cultivo do micro-organismo pode ser realizado em um processo em batelada, processo contínuo, processo em batelada alimentada, etc. conhecidos na técnica, mas o processo de cultivo não é particularmente limitado a esses. Em particular, em relação às condições de cultivo, o pH da cultura pode ser ajustado para um pH adequado (por exemplo, pH 5 a 9, especificamente, pH 6 a 8 e, com a máxima especificidade, com um composto básico apropriado (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico), e a condição aeróbica da cultura pode ser mantida introduzindo-se oxigênio ou uma mistura gás contendo oxigênio na cultura. A temperatura de cultivo pode geralmente estar na faixa de 20 °C a 45 °C e, especificamente, 25 °C a 40 °C, por cerca de 10 a 160 horas, mas as condições de cultivo não se limitam a essas. O IMP produzido pelo cultivo acima pode ser secretado na cultura ou pode ser retido nas células.

[050] Adicionalmente, exemplos das fontes de carbono a serem usadas no meio de cultura podem incluir açúcares e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaços, amido e celulose); óleos e gorduras (por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco); ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico); álcoois (por exemplo, glicerol e etanol); e ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético), mas não se limitam a esses. Essas fontes de carbono podem ser usadas isoladamente ou em combinação, mas não se limitam a isso. Exemplos das fontes de nitrogênio a serem usadas no meio de cultura podem incluir compostos orgânicos que contêm nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, molho de carne, extrato de malte, milhocina, farinha de soja e ureia) ou compostos inorgânicos (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio), etc. Essas fontes de nitrogênio podem ser usadas isoladamente ou em combinação, mas não se limitam a isso. Exemplos das fontes de fósforo a serem usadas no meio de cultura podem incluir fosfato di-hidrogênio de potássio, fosfato hidrogênio de dipotássio, sais que contêm sódio correspondentes, etc., mas não se limitam a esses. Adicionalmente, sais metálicos (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos, vitaminas, etc., que são materiais promotores de crescimento essenciais, podem estar contidos no meio.

[051] Na presente revelação, o método para recuperar o IMP produzido na etapa de cultivo pode ser realizado coletando-se o IMP do caldo de cultura com o uso de um método apropriado conhecido na técnica. Por exemplo, métodos, tais como centrifugação, filtração, cromatografia de troca iônica, cristalização, HPLC, etc., podem ser usados, e o IMP desejado pode ser recuperado de uma cultura ou micro- organismo cultivado com o uso de um método apropriado conhecido na técnica.

[052] Adicionalmente, a etapa de recuperação pode incluir um processo de purificação e pode ser realizada com o uso de um método apropriado conhecido na técnica. Assim, o IMP a ser recuperado pode estar em uma forma purificada ou um caldo de fermentação de micro-organismo que contém IMP.

[053] Ainda um outro aspecto da presente revelação fornece uma composição para produzir IMP que contém uma variante de proteína com capacidade para exportar IMP da presente revelação ou um polinucleotídeo que codifica a variante de proteína.

[054] A composição da presente revelação pode conter, ainda, qualquer constituição que tenha capacidade para operar o polinucleotídeo sem limitação. Na composição da presente revelação, o polinucleotídeo pode estar em uma forma na qual o polinucleotídeo está incluído em um vetor, de modo que um gene ligado operacionalmente possa ser expresso em uma célula hospedeira em que o polinucleotídeo está introduzido.

[055] Adicionalmente, a composição pode conter, ainda, qualquer excipiente apropriado convencionalmente usado em composições para produzir IMP (por exemplo, conservantes, umectantes, agentes de dispersão, agentes de suspensão, agentes de tamponamento, agentes estabilizadores, agentes isotônicos, etc.), mas o excipiente apropriado não se limita a esses.

[056] Ainda um outro aspecto da presente revelação fornece o uso da variante de proteína da presente revelação para aumentar a produção de IMP em um micro-organismo do gênero Corynebacterium.

[057] Ainda um outro aspecto da presente revelação fornece um método para aumentar a exportação de IMP que inclui intensificar uma atividade da proteína que consiste na SEQ ID NO: 2 em um micro-organismo do gênero Corynebacterium. Especificamente, a intensificação da atividade da proteína que consiste na SEQ ID NO: 2 pode ser realizada introduzindo-se, aplicando-se ou incluindo-se uma variante de proteína com capacidade para exportar IMP, em que a variante de proteína consiste em uma sequência de aminoácidos que tem, a partir da terminação N na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma substituição do 123° aminoácido por um outro aminoácido, uma substituição do 243° aminoácido por um outro aminoácido, uma substituição do 387° aminoácido por um outro aminoácido, uma substituição do 405° aminoácido por um outro aminoácido; uma substituição do 413° aminoácido por um outro aminoácido, uma substituição do 458° aminoácido por um outro aminoácido ou uma combinação das mesmas. Os termos, “proteína com capacidade para exportar IMP”, “variante de proteína com capacidade para exportar IMP” e “micro-organismo do gênero Corynebacterium” são conforme descrito acima.

[058] Ainda um outro aspecto da presente revelação fornece o uso da variante de proteína da presente revelação para aumentar a exportação de IMP em um micro-organismo do gênero Corynebacterium.

[EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO]

[059] IMP pode ser produzido em alto rendimento cultivando-se um micro organismo do gênero Corynebacterium que produz IMP com o uso de uma variante de proteína que tem capacidade para exportar IMP.

[Descrição Detalhada da Invenção]

[060] A presente revelação será descrita em detalhes a seguir. Entretanto, cada uma das explicações e modalidades exemplificativas reveladas no presente documento pode ser aplicada a outras respectivas explicações e modalidades exemplificativas. Ou seja, todas as combinações de vários fatores revelados no presente documento pertencem ao escopo da presente revelação. Adicionalmente, o escopo da presente revelação não deve ser limitado pela revelação específica fornecida doravante.

EXEMPLO 1: CONSTATAÇÃO DE PROTEÍNAS DE EXPORTAÇÃO DE IMP

[061] Uma biblioteca de DNA genômico de ATCC6872 de Corynebacterium stationis foi preparada para a identificação de proteínas de membrana de Corynebacterium envolvidas na exportação de IMP. Então, visto que a cepa do tipo selvagem de Corynebacterium não pode produzir IMP, ou mesmo que produza IMP, produz apenas uma pequena quantidade do mesmo, uma cepa chamada CJI0323, que tem capacidade para produzir IMP, derivada da cepa ATCC6872, foi preparada para a identificação da capacidade para produzir IMP. A cepa CJI0323 preparada foi submetida a triagem de proteínas de membrana envolvidas na exportação de IMP com o uso da biblioteca de DNA genômico da cepa ATCC6872. Os detalhes específicos do experimento são os seguintes.

EXEMPLO 1-1: SELEÇÃO DE CEPA PRODUTORA DE IMP, CJI0323

[062] As células de ATCC6872 foram suspensas em um tampão de fosfato (pH 7,0) ou tampão de citrato (pH 5,5) a uma concentração de 107 células/ml a 108 células/ml para preparar uma cepa produtora de IMP derivada de ATCC6872, e as células foram submetidas a tratamento UV e colocadas à temperatura ambiente ou 32 °C por 20 a 40 minutos para induzir a mutação. As células resultantes foram lavadas duas vezes com uma solução salina a 0,85% e, então, diluídas e transferidas para placas em um meio, que foi preparado adicionando-se um material fornecedor de resistência a uma concentração apropriada a um meio mínimo que contém ágar a 1,7%, e colônias foram obtidas depois disso. Cada colônia foi cultivada em um meio nutriente e cultivada em um meio de semeadura por 24 horas. Após o cultivo das colônias por 3 a 4 dias em um meio de fermentação, a colônia com a maior quantidade de IMP produzido acumulada no meio de cultura foi selecionada. No curso de preparação de uma cepa com capacidade para produzir IMP em alta concentração, a fim de fornecer auxotrofia adenina, vazamento de guanina, suscetibilidade a lisozima, resistência à 3,4-di-hidroprolina, resistência à estreptomicina, resistência a ácido carboxílico de azetidina, resistência à tiaprolina, resistência à azaserina, resistência à sulfaguanidina, resistência à norvalina e resistência a trimetoprim, os procedimentos acima foram realizados sequencialmente para cada material. Como resultado, CJI0323, que mostrou resistência aos materiais acima e excelente capacidade para produzir IMP, foi finalmente selecionado. O grau de resistência entre ATCC6872 e CJI0323 foi comparado e os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo. [TABELA 1]

- Meio mínimo: glicose a 2%, sulfato de sódio a 0,3%, KH2SO4 a 0,1%, K2HPO4 a 0,3%, sulfato de magnésio a 0,3%, cloreto de cálcio (10 mg/l), sulfato de ferro (10 mg/l), sulfato de zinco (1 mg/l), cloreto de manganês (3,6 mg/l), L-cisteína (20 mg/l), pantotenato de cálcio (10 mg/l), cloridrato de tiamina (5 mg/l), biotina (30 μg/l), adenina (20 mg/l), guanina (20 mg/l), pH 7,3 - Meio nutriente: peptona a 1%, suco de carne a 1%, cloreto de sódio a 0,25%, extrato de levedura a 1%, ágar a 2%, pH 7,2 - Meio de semeadura: glicose a 1%, peptona a 1%, suco de carne a 1%, extrato de levedura a 1%, cloreto de sódio a 0,25%, adenina (100 mg/l), guanina (100 mg/l), pH 7,5 - Meio de fermentação: glutamato de sódio a 0,1%, cloreto de amônio a 1%, sulfato de magnésio a 1,2%, cloreto de cálcio a 0,01%, sulfato de ferro (20 mg/l), sulfato de manganês (20 mg/l), sulfato de zinco (20 mg/l), sulfato de cobre (5 mg/l), L- cisteína (23 mg/l), alanina (24 mg/l), ácido nicotínico (8 mg/l), biotina (45 μg/l), cloridrato de tiamina (5 mg/l), adenina (30 mg/l), ácido fosfórico a 1,9% (85%), glicose a 2,55%, frutose a 1,45%

EXEMPLO 1-2: EXPERIMENTOS NO TÍTULO DE FERMENTAÇÃO DE CJI0323

[063] O meio de semeadura (2 ml) foi dispensado em tubos de teste (diâmetro: 18 mm) que foram, então, submetidos à autoclave, e cada um inoculado com ATCC6872 e CJI0323. Depois disso, os resultantes foram cultivados sob agitação a 30 °C por 24 horas e, então, usados como uma solução de cultura de sementes. O meio de fermentação (29 ml) foi dispensado em frascos de Erlenmeyer (250 ml) para agitação, submetido à autoclave a 121 °C por 15 minutos, e a solução de cultura de sementes (2 ml) foi inoculada e cultivada por 3 dias. As condições de cultura foram definidas para 170 rpm, 30 °C e um pH de 7,5.

[064] Após a conclusão da cultura, a quantidade de IMP produzido foi medida por HPLC (SHIMAZDU LC20A) e os resultados da cultura são mostrados na Tabela 2 abaixo. [TABELA 2]

[065] A cepa CJI0323 foi nomeada CN01-0323 de Corynebacterium stationis, depositada em 7 de novembro de 2017 no Centro Coreano de Cultura de Micro- organismos (KCCM - Korean Culture Center of Microorganisms), uma autoridade internacional depositária sob o Tratado de Budapeste, e atribuído com o Número de Acesso KCCM12151P.

EXEMPLO 1-3: CONSTATAÇÃO DE PROTEÍNAS EXPORTADORAS

[066] As condições de triagem que mostram a inibição de crescimento da cepa CJI0323 foram estabelecidas adicionando-se, ainda, IMP ao meio mínimo contendo ágar a 1,7%. Os plasmídeos da biblioteca genômica da cepa ATCC6872 foram transformados na cepa CJI0323 por eletroporação (van der Rest et al. 1999), e as colônias nas quais a inibição de crescimento foi liberada sob as condições de meio suplementadas com uma quantidade em excesso de IMP foram selecionadas. Os plasmídeos foram obtidos a partir das colônias selecionadas e analisados por uma técnica de sequenciamento. Como resultado, um tipo de proteína de membrana envolvida na liberação da inibição de crescimento foi identificado sob a condição em que uma quantidade em excesso de IMP foi adicionada.

[067] O um tipo de proteína de membrana proveniente de Corynebacterium foi identificado com base na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 (NCBI GenBank: NZ_CP014279, WP_066795121, transportador MFS). A proteína de membrana é conhecida como o transportador MFS, mas sua função específica não foi confirmada e, além disso, sua função em relação à exportação de IMP ainda é desconhecida. Na presente revelação, a proteína de membrana foi nomeada ImpE2(WT).

EXEMPLO 2: IDENTIFICAÇÃO DE ImpEI E ImpE2 EXEMPLO 2-1: CONFIRMAÇÃO DE impE1 E impE2

[068] A fim de examinar as funções da proteína de membrana, ImpE2, a estrutura de gene de SEQ ID NO: 4 foi confirmada no NCBI (NCBI GenBank: NZ_CP014279, WP_066795121, transportador MFS). Como resultado, confirmou-se que a porção de partida de 7 bp do ORF de SEQ ID NO: 4 (impE2) se sobrepõe em 7 bases nucleotídicas com um gene diferente (NCBI GenBank: NZ_CP014279, WP_066795119, regulador transcricional), que está localizado a montante de impE2. Visto que as funções do gene localizado a montante de impE2 e a proteína codificada pelo gene não foram confirmadas, na presente revelação, a proteína foi nomeada ImpE1(WT) (a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3).

EXEMPLO 2-2: PREPARAÇÃO DE vetor deficiente de impE1 OU impE2

[069] A fim de confirmar se a deleção de ImpE1 ou ImpE2, que estão envolvidos na liberação da inibição de crescimento causada por IMP conforme identificado nos Exemplos 1 e 2-1, em uma cepa produtora de IMP pode reduzir sua capacidade de exportação de IMP, foram feitas tentativas para preparar vetores deficientes em cada um dos genes.

[070] Os fragmentos de gene para preparar os vetores foram obtidos por PCR com o uso do DNA genômico da cepa ATCC6872 como um modelo.

[071] Especificamente, a PCR para impE1 foi realizada com o uso de iniciadores de SEQ ID NOS: 5 e 6 e iniciadores de SEQ ID NOS: 7 e 8; e a PCR para impE2 foi realizada com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 9 e 10 e iniciadores de SEQ ID NOS: 11 e 12 (Tabela 3). [TABELA 3]

[072] Em particular, os iniciadores usados foram preparados com base nas informações sobre um gene de Corynebacterium stationis (ATCC6872) (NCBI Genbank: NZ_CP014279) registrado no NIH GenBank e nas sequências de nucleotídeos adjacentes ao mesmo.

[073] PCR foi realizada por desnaturação inicial a 94 °C por 5 minutos; 25 ciclos que consistem na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, anelamento a 52 °C por 3 minutos e polimerização a 72 °C por 1 minuto; e polimerização final a 72 °C por 5 minutos.

[074] A PCR de sobreposição foi realizada com o uso de dois fragmentos do gene impE1, que foram amplificados com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 5 e 6 e dos iniciadores de SEQ ID NOS: 7 e 8, como modelos, e como resultado, um modelo de polinucleotídeo (1,8 kbp) foi obtido. O fragmento de gene obtido foi clonado em um vetor linearizado pDZ (patente coreana no 10-0924065 e publicação de patente internacional no 2008-033001), que foi digerido com a enzima de restrição (Xba I) e ligado com o uso de ligase T4 e, assim, o vetor pDZ-ΔimpE1 foi preparado. Adicionalmente, a reação em cadeia de polimerase de sobreposição foi realizada com o uso de um fragmento do gene impE2, amplificado com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 9 e 10, e dois fragmentos do gene impE2, amplificados com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 11 e 12, como modelos, e como resultado, um modelo de polinucleotídeo (1,7 kbp) foi obtido. O fragmento de gene obtido foi digerido com enzimas de restrição, XbaI e SpeI. O fragmento de gene foi clonado com o uso de ligase T4 em um vetor linearizado pDZ, que já tinha sido digerido com a enzima de restrição (XbaI) e, assim, o vetor pDZ-ΔimpE2 foi preparado.

EXEMPLO 2-3: PREPARAÇÃO DE vetores deficientes de integração de impE1 E impE2

[075] Visto que os genes impE1 e impE2, que codificam proteínas envolvidas na liberação da inibição de crescimento causada por IMP, são sobrepostos, há uma necessidade de regular ambos os genes simultaneamente. Portanto, foram feitas tentativas para preparar um vetor no quanto tanto impE1 quanto impE2 sejam deficientes.

[076] Para a PCR dos genes impE1 e impE2, iniciadores de SEQ ID NOS: 5 e 65 e iniciadores de SEQ ID NOS: 66 e 12 foram usados. Os iniciadores usados foram preparados com base nas informações sobre um gene de Corynebacterium stationis (ATCC6872) (NCBI Genbank: NZ_CP014279) registrado no NIH GenBank e nas sequências de nucleotídeos adjacentes ao mesmo. PCR de sobreposição foi realizada com o uso de um fragmento do gene impE1, amplificado com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 5 e 65, e dois fragmentos do gene impE2, amplificados com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 66 e 12, como modelos, e como resultado, um modelo de polinucleotídeo (2,0 kbp) foi obtido. Os fragmentos de gene obtidos foram digeridos com XbaI e SpeI, respectivamente. Os fragmentos de gene foram clonados com o uso de ligase T4 em um vetor linearizado pDZ, que já tinha sido digerido com a enzima de restrição (XbaI) e, assim, o vetor pDZ-ΔimpE1E2 foi preparado.

EXEMPLO 2-4: PREPARAÇÃO DE cepas deficientes de impE1 E impE2

[077] Os dois tipos de plasmídeos preparados no Exemplo 2-2 e um tipo de plasmídeo preparado no Exemplo 2-3 foram, cada um, transformado na cepa CJI0323 por eletroporação (com o uso do método de transformação revelado em Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541 a 545). As cepas nas quais o vetor foi inserido no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém canamicina (25 mg/l). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a um segundo cruzamento. A deficiência genética nas cepas finalmente transformadas foi confirmada realizando-se PCR com o uso dos pares de iniciadores de SEQ ID NOS: 5 e 8, SEQ ID NOS: 9 e 12 e SEQ ID NOS: 5 e 12.

[078] As cepas selecionadas foram nomeadas CJI0323_ΔimpE1, CJI0323_ΔimpE2 e CJI0323_ΔimpE1E2. Adicionalmente, a capacidade para produzir IMP dessas cepas foi avaliada.

[079] O meio de semeadura (2 ml) foi dispensado em tubos de teste (diâmetro: 18 mm) que foram, então, submetidos à autoclave, cada um inoculado com CJI0323, CJI0323_ΔimpE1, CJI0323_ΔimpE2 e CJI0323_ΔimpE1E2, cultivados sob agitação a 30 °C por 24 horas e usados como soluções de cultura de sementes. O meio de fermentação (29 ml) foi dispensado em frascos de Erlenmeyer (250 ml) para agitação e submetido à autoclave a 121 °C por 15 minutos. Então, a solução de cultura de sementes (2 ml) foi inoculada e o resultante foi cultivado por 3 dias. As condições de cultura foram definidas para 170 rpm, 30 °C e um pH de 7,5.

[080] Após a conclusão da cultura, a quantidade de IMP produzido foi medida por HPLC, e os resultados da cultura são mostrados na Tabela 4 abaixo. [TABELA 4]

[081] A quantidade de IMP acumulada em cada cepa foi comparada com aquela da cepa parental, CJI0323 de Corynebacterium stationis. Como resultado, constatou- se que, conforme mostrado na Tabela 4 acima, as concentrações de IMP das cepas CJI0323_ΔimpE1, CJI0323_ΔimpE2 e CJI0323_ΔimpE1E2 foram reduzidas em cerca de 8 g/l sob as mesmas condições em comparação com a cepa CJI0323, confirmando que ImpE1 e ImpE2 são proteínas envolvidas na exportação de IMP.

EXEMPLO 3: CONFIRMAÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS DE ImpE1 E impE2 De cepa PRODUTORA DE IMP, CJI0323

[082] No caso da cepa CJI0323 que produz IMP em alta concentração no Exemplo 1, é possível que a cepa tenha uma capacidade aprimorada de exportação de IMP de modo a produzir IMP em alta concentração. Consequentemente, foi feita uma tentativa para confirmar a presença de qualquer mutação em impE1 e impE2 da cepa CJI0323.

[083] O DNA cromossômico da cepa CJI0323 foi amplificado por reação em cadeia de polimerase (doravante, “PCR”). Especificamente, primeiro, a PCR foi realizada por meio de repetição de 28 ciclos que consistem na desnaturação a 94 °C por 1 minuto, anelamento a 58 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 2 minutos com o uso do DNA cromossômico da cepa CJI0323 como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NOS: 13 e 14 (Tabela 5) e, assim, um fragmento de cerca de 2,8 kbp foi amplificado. [TABELA 5]

[084] Após a análise da sequência de nucleotídeos com o uso dos mesmos iniciadores, confirmou-se que o 490° nucleotídeo do gene impEI (isto é, g) foi substituído por “a”, em comparação com a sequência de nucleotídeos da cepa do tipo selvagem, ATCC6872. Essa substituição indica que houve uma mutação na qual o 164° aminoácido da proteína de ImpE1 (isto é, ácido glutâmico) foi substituído por lisina.

[085] Adicionalmente, confirmou-se que o 4° nucleotídeo do gene impE2 (isto é, g) foi substituído por “a” (isso significa que o 666° nucleotídeo do gene impE1 (isto é, g) foi substituído por “a”) e o 181° nucleotídeo do gene impEI (isto é, g) foi substituído por “a”. Essas substituições indicam que houve mutações em que o 2° aminoácido da proteína de ImpE2 (isto é, valina), que corresponde ao 222° aminoácido da proteína de ImpE1, foi substituído por isoleucina; e o 64° aminoácido da proteína de ImpE2 (isto é, glicina) foi substituído por ácido glutâmico.

[086] O nucleotídeo de impE1 da cepa CJI0323 foi nomeado impE1_CJI0323 (SEQ ID NO: 87) e a proteína do mesmo foi nomeada ImpE1_CJI0323 (SEQ ID NO: 85), enquanto o nucleotídeo de impE2 da cepa CJI0323 foi nomeado impE2_CJI0323 (SEQ ID NO: 88) e a proteína do mesmo foi nomeada ImpE2_CJI0323 (SEQ ID NO: 86).

EXEMPLO 4: RECUPERAÇÃO DE MUTAÇÕES EM impEI E impE2 EXEMPLO 4-1: PREPARAÇÃO DE VETORES PARA RECUPERAR MUTAÇÕES EM impE1 OU impE2

[087] No Exemplo 3, a presença de qualquer mutação em impE1 e impE2 da cepa produtora de IMP CJI0323 foi examinada. Como resultado, confirmou-se que impE1 tinha uma mutação e impE2 tinha duas mutações. Visto que a cepa CJI0323 produz IMP em uma alta concentração, é altamente provável que a mutação seja uma que possa aprimorar a capacidade para exportar IMP. Consequentemente, após recuperação do impE1 e do impE2 mutados para o ImpE do tipo selvagem nativo sem mutação, o experimento a seguir foi realizado para confirmar se variantes de proteínas adicionalmente constatadas têm capacidade para exportação de IMP aprimorada.

[088] Para preparar um vetor de recuperação, a PCR foi realizada com o uso de ATCC6872 de Corynebacterium stationis como um modelo.

[089] O fragmento de gene impE1impE2 amplificado com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 89 e 90 foi tratado com uma enzima de restrição, XbaI, e clonado no sítio de restrição de XbaI no vetor pDZ e, assim, o pDZ-impE1E2(WT) foi preparado.

EXEMPLO 4-2: PREPARAÇÃO DE VETORES COM MUTAÇÃO ÚNICA EM impE1 OU impE2

[090] O plasmídeo preparado no Exemplo 4-1 foi transformado na cepa CJI0323 por eletroporação (com o uso do método de transformação revelado em Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541 a 545). As cepas nas quais o vetor foi inserido no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém canamicina (25 mg/l). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a um segundo cruzamento. A recuperação da mutação nas cepas finalmente transformadas foi confirmada realizando-se PCR com o uso do par de iniciadores de SEQ ID NOS: 89 e 90, seguido por análise de sequenciamento de nucleotídeos. A cepa preparada foi chamada CJI0323_impE1E2(WT).

EXEMPLO 5: CONSTATAÇÃO DE MUTAÇÕES EM impE2

[091] Entre os três tipos de mutações constatadas através dos resultados no Exemplo 3, aquele que tem a maior capacidade de exportação de IMP foi selecionado, e o experimento a seguir foi realizado para constatar mutações que têm uma maior capacidade de exportação de IMP em comparação com o mesmo.

EXEMPLO 5-1: SELEÇÃO DE MUTAÇÕES QUE TÊM A MAIOR CAPACIDADE DE EXPORTAÇÃO DE IMP ENTRE MUTAÇÕES DE ImpE1E2

[092] Um vetor com uma única mutação E164K no gene ImpE1 foi preparado com o uso da cepa do tipo selvagem nativa, ATCC6872 de Corynebacterium stationis, como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NOS: 91 e 92 e iniciadores de SEQ ID NOS: 93 e 94. A PCR de sobreposição foi realizada com o uso de um fragmento de gene E164K-1 amplificado com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 91 e 92 e dois fragmentos de gene E164K-2 amplificados com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 93 e 94 e, assim, um modelo com uma polinucleotídeo de 1,8 kbp foi obtido. Os fragmentos de gene obtidos foram digeridos com XbaI e clonados em um vetor linearizado pDZ, que já tinha sido diferido com XbaI, com o uso de ligase T4 e, assim, o vetor pDZ-impE1(E164K) foi preparado.

[093] Um vetor com uma única mutação V2I no gene ImpE2 foi preparado com o uso da cepa ATCC6872 como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NOS: 91 e 95 e iniciadores de SEQ ID NOS: 96 e 94. A PCR de sobreposição foi realizada com o uso de um fragmento de gene V2I-1 amplificado com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 91 e 95 e dois fragmentos de gene V2I-2 amplificados com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 96 e 94 e, assim, um modelo com uma polinucleotídeo de 1,8 kbp foi obtido. Os fragmentos de gene obtidos foram digeridos com XbaI e clonados em um vetor linearizado pDZ, que já tinha sido diferido com XbaI, com o uso de ligase T4 e, assim, o vetor pDZ-impE2(V2I) foi preparado.

[094] Um vetor com uma única mutação G64E no gene ImpE2 foi preparado com o uso da cepa ATCC6872 como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NOS: 91 e 97 e iniciadores de SEQ ID NOS: 98 e 94. A PCR de sobreposição foi realizada com o uso de um fragmento de gene G64E-1 amplificado com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 91 e 97 e dois fragmentos de gene G64E-2 amplificados com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 98 e 94 e, assim, um modelo com uma polinucleotídeo de 1,8 kbp foi obtido. Os fragmentos de gene obtidos foram digeridos com XbaI e clonados em um vetor linearizado pDZ, que já tinha sido diferido com XbaI, com o uso de ligase T4 e, assim, o vetor pDZ-impE2(G64E) foi preparado. [TABELA 6]

[095] Os três tipos de plasmídeos preparados no Exemplo 4-2 foram transformados na cepa CJI0323_impE1E2(WT) (com o uso do método de transformação revelado em Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541 a 545). As cepas nas quais o vetor foi inserido no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém canamicina (25 mg/l). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a um segundo cruzamento. A introdução da mutação nas cepas finalmente transformadas foi confirmada realizando- se PCR com o uso do par de iniciadores de SEQ ID NOS: 13 e 14, seguido por análise de sequenciamento de nucleotídeos. As cepas selecionadas foram nomeadas CJI0323_impE1(E164K), CJI0323_impE2(V2I) e CJI0323_impE2(G64E).

[096] As cepas CJI0323_impE1(E164K), CJI0323_impE2(V2I) de Corynebacterium stationis e CJI0323_impE2(G64E) de Corynebacterium stationis foram depositadas em 2 de novembro de 2018 no Centro Coreano de Cultura de Micro-organismos (KCCM), uma autoridade internacional depositária sob o T ratado de Budapeste, e foram atribuídas com os Números de Acesso KCCM12359P, KCCM12360P e KCCM12361P, respectivamente.

[097] O meio de semeadura (2 ml) foi dispensado em tubos de teste (diâmetro: 18 mm) que foram, então, submetidos à autoclave, cada um inoculado com CJI0323_impE1E2(WT), CJI0323_impE1(E164K), CJI0323_impE2(V2I) e CJI0323_impE2(G64E), cultivados sob agitação a 30 °C por 24 horas e usados como soluções de cultura de sementes. O meio de fermentação (29 ml) foi dispensado em frascos de Erlenmeyer (250 ml) para agitação e submetido à autoclave a 121 °C por 15 minutos. Então, as soluções de cultura de sementes (2 ml) foram inoculadas e os resultantes foram cultivados por 3 dias. As condições de cultura foram definidas para 170 rpm, 30 °C e um pH de 7,5.

[098] Após a conclusão da cultura, a quantidade de IMP produzido foi medida por HPLC, e os resultados da cultura são mostrados na Tabela 7 abaixo. [TABELA 7]

[099] Conforme mostrado acima, confirmou-se que cada um dos três tipos de mutações está envolvido na exportação de IMP e que a cepa CJI0323_impE2(G64E) teve a maior quantidade de produção de IMP entre os três tipos de mutações.

EXEMPLO 5-2: PREPARAÇÃO DE VETORES PARA INSERÇÃO SUBSTITUTA DE AMINOÁCIDOS NA MUTAÇÃO DE impE2

[0100] Para confirmar a importância posicional da mutação de impE2(G64E) entre os três tipos representativos de mutações com capacidade intensificada para produzir IMP conforme identificado nos resultados acima, um vetor para introduzir uma mutação para substituir o 64° aminoácido na sequência de aminoácidos de impE2 por um aminoácido diferente foi preparado.

[0101] O procedimento para preparar o vetor para a introdução da mutação de ImpE2(G64E) é o seguinte.

[0102] Com base nas sequências de polinucleotídeos relatadas, os genes cromossômicos de CJI0323 de Corynebacterium stationis foram isolados, e fragmentos de gene foram obtidos realizando-se PCR com o uso do DNA cromossômico de CJI0323 de Corynebacterium stationis como um modelo juntamente com pares de iniciadores entre o iniciador de SEQ ID NO: 15 e cada uma das SEQ ID NOS: 16 a 33. PCR foi realizada por desnaturação inicial a 94 °C por 5 minutos; 20 ciclos que consistem na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 1 minuto; e polimerização final a 72 °C por 5 minutos. Como resultado, 18 tipos de polinucleotídeos de 1 kbp foram obtidos.

[0103] Então, os genes cromossômicos de CJI0323 de Corynebacterium stationis foram isolados, e fragmentos de gene foram obtidos realizando-se PCR com o uso do DNA cromossômico de CJI0323 de Corynebacterium stationis como um modelo juntamente com pares de iniciadores entre o iniciador de SEQ ID NO: 34 e cada uma das SEQ ID NOS: 35 a 52. PCR foi realizada por desnaturação inicial a 94 °C por 5 minutos; 20 ciclos que consistem na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 1 minuto; e polimerização final a 72 °C por 5 minutos. Como resultado, 18 tipos de polinucleotídeos de 1 kbp foram obtidos.

[0104] A PCR de sobreposição foi realizada com o uso de dois fragmentos obtidos a partir dos resultados acima como um modelo e, assim, 18 tipos de polinucleotídeos de 2 kbp a serem usados como modelo foram obtidos. Os fragmentos de gene obtidos foram digeridos com uma enzima de restrição, XbaI, ligados ao vetor linearizado pDZ, que já tinha sido digerido com uma enzima de restrição, XbaI, transformados em DH5α de E. coli, e os transformados foram transferidos para placas em um meio LB sólido que contém canamicina (25 mg/l).

[0105] As informações de sequência sobre os iniciadores usados para a preparação do vetor são mostradas na Tabela 8 abaixo. [TAB ELA 8]

[0106] Após selecionar as colônias transformadas com o vetor no qual o gene-alvo foi inserido, os plasmídeos foram obtidos com o uso de um método de extração de plasmídeo convencionalmente conhecido. As informações sobre os plasmídeos obtidos são mostradas na Tabela 9 abaixo. [TABELA 9]

EXEMPLO 5-3: PREPARAÇÃO DE CEPAS EM QUE O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 64 DA VARIANTE (ImpE2) É SUBSTITUÍDO POR UM OUTRO AMINOÁCIDO, E COMPARAÇÃO DA CAPACIDADE PARA PRODUZIR IMP

[0107] Os 18 tipos de plasmídeos preparados no Exemplo 3-1 foram transformados na cepa CJI0323. As cepas nas quais o vetor foi inserido no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém canamicina (25 mg/l). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a um segundo cruzamento. A introdução da mutação nas cepas finalmente transformadas foi confirmada realizando-se PCR com o uso do par de iniciadores de SEQ ID NOS: 13 e 14, seguido por análise de sequenciamento de nucleotídeos. Os nomes de cepa de acordo com as mutações inseridas são mostrados na Tabela 10 abaixo. [TABELA 10]

[0108] As cepas foram cultivadas da mesma maneira que no Exemplo 2 e a concentração de IMP das mesmas foi analisada (Tabela 11). [TABELA 11]

[0109] Conforme mostrado acima, todas as cepas modificadas mostraram um aumento na capacidade para produzir IMP em comparação com a cepa CJI0323_impE1E2(WT) e, assim, reconfirmou-se que a 64° mutação de aminoácido do impE2 é um sítio importante que tem um efeito significativo no aumento da capacidade da proteína ImpE em relação à exportação de IMP. Em particular, no caso em que o 64° aminoácido (isto é, glicina) é substituído por um aminoácido diferente (isto é, aspartato), a capacidade para exportar IMP foi aumentada em 172% em comparação com a cepa CJI0323_impE1(E164K)_impE2(V2I), que não teve mutação no 64° aminoácido. Adicionalmente, confirmou-se que no caso em que o 64° aminoácido (isto é, glicina) é substituído por um aminoácido diferente (isto é, aspartato), a capacidade para produzir IMP foi aprimorada em 397% em comparação com a cepa CJI0323_impE1E2(WT), que é a cepa recuperada para uma cepa do tipo selvagem, e em 20% em comparação com a cepa CJI0323.

EXEMPLO 6: BIBLIOTECA DE MUTAÇÃO DE impE COM O USO DE MUTAGÊNESE ARTIFICIAL

[0110] Para obter uma variante de proteína que tem uma capacidade aprimorada para exportar IMP, preparou-se uma biblioteca de vetores para uma primeira inserção cruzada no cromossomo pelo seguinte método.

[0111] Nesse sentido, foi feita uma tentativa para realizar PCR propensa a erro com relação a impE2 da cepa CJI0323:impE2(G64D), a qual se confirmou ter a maior capacidade para exportar IMP pelos resultados do Exemplo 5-3. Para introduzir uma mutação na sequência de aminoácidos possuída pela cepa CJI0323::G64D em uma posição a jusante do 64° aminoácido da mesma, variantes do gene impE (1,6 kbp) em que substituições de nucleotídeos são aleatoriamente introduzidas a partir do 193° nucleotídeo do impE2 até cerca de 130 bp a jusante do mesmo foram obtidas. A PCR propensa a erro foi realizada com o uso do Kit de Mutagênese Aleatória Diversify PCR (Clontech), e fragmentos de gene foram obtidos por PCR com o uso do DNA genômico da cepa CJI0323::impE2(G64D) como um modelo juntamente com um par de iniciadores de SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 54 (Tabela 12). [TABELA 12]

[0112] Mutações foram introduzidas nos fragmentos de gene amplificados em uma quantidade de 0 a 3,5 mutações por 1 kb de cada fragmento de gene. PCR foi realizada por desnaturação inicial a 94 °C por 5 minutos; 30 ciclos que consistem na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, anelamento a 60 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 1 minuto e 36 segundos; e polimerização final a 72 °C por 5 minutos. Como resultado, um polinucleotídeo de 1,6 kbp foi obtido.

[0113] O fragmento de gene amplificado foi ligado ao vetor pCR2.1-TOPO com o uso do kit de clonagem pCR2.1-TOPO TA (Invitrogen), transformado em DH5α de E. coli, e os transformados foram transferidos para placas em um meio LB sólido que contém canamicina (25 mg/l). Vinte tipos das colônias transformadas foram selecionados, e plasmídeos foram obtidos a partir dos mesmos. Após análise das sequências de polinucleotídeos desses plasmídeos, confirmou-se que mutações foram introduzidas em diferentes posições em uma frequência de 3,5 mutações/kb. Cerca de 20.000 colônias transformadas de E. coli foram selecionadas, e seus plasmídeos foram extraídos. A biblioteca resultante foi nomeada biblioteca pTOPO_impE.

EXEMPLO 7: SELEÇÃO DE CEPAS EM QUE VETORES DE BIBLIOTECA DE impE SÃO INSERIDOS

[0114] Os vetores da biblioteca pTOPO_impE preparados no Exemplo 6 foram transformados por eletroporação na cepa CJI0323::impE2(G64D) com capacidade para produzir IMP em alta concentração e os transformados foram transferidos para placas em um meio nutriente que contém canamicina (25 mg/l). Como resultado, 10.000 colônias de cepas, nas quais genes modificados foram inseridos, foram obtidas, e essas colônias foram nomeadas CJI0323::impE2(G64D)/pTOPO_impE(mt)1 a CJI0323::impE2(G64D) /pTOPO_impE(mt)10000. - Meio nutriente: peptona a 1%, suco de carne a 1%, cloreto de sódio a 0,25%, extrato de levedura a 1%, ágar a 2%, pH 7,2 - Meio de semeadura: glicose a 1%, peptona a 1%, suco de carne a 1%, extrato de levedura a 1%, cloreto de sódio a 0,25%, adenina (100 mg/l), guanina (100 mg/l), pH 7,5 - Meio de fermentação: glutamato de sódio a 0,1%, cloreto de amônio a 1%, sulfato de magnésio a 1,2%, cloreto de cálcio a 0,01%, sulfato de ferro (20 mg/l), sulfato de manganês (20 mg/l), sulfato de zinco (20 mg/l), sulfato de cobre (5 mg/l), L- cisteína (23 mg/l), alanina (24 mg/l), ácido nicotínico (8 mg/l), biotina (45 μg/l), cloridrato de tiamina (5 mg/l), adenina (30 mg/l), ácido fosfórico a 1,9% (85%), glicose a 2,55%, frutose a 1,45%

[0115] Cada uma das 10.000 colônias obtidas foi inoculada com um meio de semeadura em autoclave (200 μl), cultivada sob agitação em uma placa de 96 poços profundos do agitador Microplate (TAITEC) a 1.200 rpm a 30 °C por 24 horas e usada como uma solução de cultura de sementes. Um meio de fermentação em autoclave (290 μl) foi dispensado em uma placa de 96 poços profundos e a solução de cultura de sementes (200 μl) foi inoculada na mesma, e o resultante foi cultivado sob agitação por 72 horas sob as mesmas condições descritas acima.

[0116] Para analisar a quantidade de IMP produzida na solução de cultura, após a conclusão da cultura, o sobrenadante da solução de cultura (3 μl) foi transferido para uma placa UV de 96 poços, na qual água destilada (197 μl) foi dispensada em cada poço. Então, o resultante foi agitado a 25 °C por 30 segundos com o uso do agitador Microplate (TAITEC), e a absorvância a 270 nm foi medida com o uso do espectrofotômetro. Após a comparação entre a absorvância acima e a da cepa CJI0323::impE2(G64D), 50 colônias das cepas que mostram um aumento da absorvância de 10% ou mais foram selecionadas. Outras colônias mostraram uma absorvância similar ou menor em comparação com a de controle.

[0117] A quantidade de IMP produzida nas 50 cepas selecionadas foi repetidamente confirmada medindo-se a absorvância com o uso do mesmo método, e como resultado, as 4 cepas superiores com capacidade aprimorada para produzir IMP em comparação com a cepa CJI0323::impE2(G64D) foram selecionadas.

EXEMPLO 8: CONFIRMAÇÃO DE CAPACIDADE PARA PRODUZIR IMP DE CEPAS SELECIONADAS A PARTIR DA BIBLIOTECA DE MUTAÇÃO DE impE2

[0118] Para comparar a capacidade para produzir IMP das quatro cepas selecionadas no Exemplo 7, essas quatro cepas foram cultivadas pelo seguinte método, e os componentes das soluções de cultura resultadas foram analisados.

[0119] Um meio de semeadura (5 ml), que é o mesmo do Exemplo 2, foi dispensado em tubos de teste submetidos à autoclave (diâmetro: 18 mm) e cultivado sob agitação a 30 °C por 24 horas para ser usado como soluções de cultura de sementes. Um meio de fermentação (29 ml), que é o mesmo do Exemplo 2, foi dispensado em frascos de Erlenmeyer (250 ml) para agitação e submetido à autoclave a 121 °C por 15 minutos. Então, as soluções de cultura de sementes (2 ml) foram inoculadas e os resultantes foram cultivados por 4 a 5 dias. As condições de cultura foram definidas para 170 rpm, 30 °C e um pH de 7,5. Após a conclusão da cultura, a quantidade de IMP produzido foi medida por HPLC.

[0120] Entre essas cinquenta cepas, as quatro cepas superiores em relação à capacidade para produzir IMP foram selecionadas, e o cultivo e a análise foram realizados repetidamente. As concentrações de IMP analisadas são mostradas na Tabela 13 abaixo. [TABELA 13]

[0121] Como resultado da análise de concentração de IMP, confirmou-se que as concentrações do IMP das quatro cepas selecionadas mostraram um aumento máximo de 17% em comparação com a cepa de controle, CJI0323::impE2(G64D).

EXEMPLO 9: CONFIRMAÇÃO DE MUTAÇÃO DO GENE impE2 EM CEPAS SELECIONADAS COM MUTAÇÃO DE impE2

[0122] Para confirmar as mutações introduzidas no gene impE2 das quatro cepas selecionadas no Exemplo 8, as sequências de polinucleotídeos de mutações de impE2 foram analisadas. Para determinar essas sequências de polinucleotídeos, PCR foi realizada com o uso de um par de iniciadores de SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14.

[0123] A análise foi realizada para cada uma das sequências de polinucleotídeos dos fragmentos de gene impE2 modificados obtidos acima. Essas sequências de polinucleotídeos foram comparadas com a SEQ ID NO: 4 de impE2 (WT) ou SEQ ID NO: 100 de impE2 (CJHB101::G64D), e como resultado, as sequências de aminoácidos do impE2 modificado foram confirmadas. As informações sobre as mutações das sequências de aminoácidos de impE2 nas cepas selecionadas são mostradas na Tabela 14 abaixo. [TABELA 14]

EXEMPLO 10: PREPARAÇÃO DE VETORES PARA INSERÇÃO DE CROMOSSOMO COM MUTAÇÕES DE impE2

[0124] Para confirmar os efeitos da aplicação de mutações de impE2, que foram identificadas no Exemplo 9, vetores com capacidade para introduzir essas mutações de impE2 no cromossomo foram preparados. O processo de preparação de vetor é o seguinte.

[0125] Apenas os vetores que incluem as mutações da biblioteca mostradas na Tabela 14, excluindo as mutações de impE2(G64D), foram preparados. Especificamente, os genes cromossômicos de ATCC6872 de Corynebacterium stationis foram isolados, e fragmentos de gene foram obtidos por PCR com o uso dos pares de iniciadores entre SEQ ID NO: 56 e cada uma das SEQ ID NOS: 57, 59, 61 e 63. PCR foi realizada por desnaturação inicial a 94 °C por 5 minutos; 20 ciclos que consistem na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 1 minuto; e polimerização final a 72 °C por 5 minutos para obter fragmentos de PCR.

[0126] Os fragmentos de gene foram obtidos por PCR com o uso de cada um dos cromossomos das quatro cepas selecionadas como um modelo juntamente com os pares de iniciadores entre SEQ ID NO: 55 e cada uma das SEQ ID NOS: 58, 60, 62 e 64. PCR foi realizada por desnaturação inicial a 94 °C por 5 minutos; 20 ciclos que consistem na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 1 minuto e 30 segundos; e polimerização final a 72 °C por 5 minutos para obter fragmentos de PCR. A PCR de sobreposição foi realizada com o uso de dois fragmentos, e os fragmentos de gene obtidos foram digeridos com uma enzima de restrição (XbaI I). Os fragmentos de gene resultantes foram ligados com o uso de ligase T4 a um vetor linearizado pDZ (patente coreana no 10-0924065 e publicação de patente internacional no 2008-033001), que já tinha sido digerido com uma enzima de restrição (XbaI), transformados em DH5α de E. coli, e os transformados foram transferidos para placas em um meio LB sólido que contém canamicina (25 mg/l).

[0127] Para preparar vetores com uma única mutação para confirmar os efeitos das únicas mutações do impE2 (S387T, M413T e N458K), em que três tipos de mutações entre as variantes selecionadas são integrados, PCR foi realizada com o uso da cepa ATCC6872 como um modelo juntamente com pares de iniciadores entre SEQ ID NO: 56 e cada uma das SEQ ID NOS: 67, 69 e 71 e, assim, fragmentos de gene foram obtidos. Então, PCR foi realizada com o uso da cepa ATCC6872 como um modelo juntamente com pares de iniciadores entre SEQ ID NO: 55 e cada uma das SEQ ID NOS: 68, 70 e 72 e, assim, fragmentos de gene foram obtidos. PCR de sobreposição foi realizada com o uso dos dois fragmentos preparados acima, e os fragmentos de gene obtidos dessa forma foram digeridos com uma enzima de restrição (XbaI). Os fragmentos de gene resultantes foram ligados com o uso de ligase T4 ao vetor linearizado pDZ, que já tinha sido digerido com uma enzima de restrição (XbaI), transformados em DH5α de E. coli, e os transformados foram transferidos para placas em um meio LB sólido que contém canamicina. [TABELA 15]

[0128] Após selecionar as colônias transformadas com o vetor no qual o gene-alvo foi inserido, os plasmídeos foram obtidos com o uso de um método de extração de plasmídeo convencionalmente conhecido. Os plasmídeos foram nomeados pDZ- impE2(S387T, M413T, N458K), pDZ-impE2(F123C), pDZ-impE2(I243V), pDZ- impE2(F405Y), pDZ-impE2(S387T), pDZ-impE2(M413T) e pDZ-impE2(N458K), de acordo com a mutação inserida em impE2 de cada plasmídeo.

EXEMPLO 11: PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM MUTAÇÃO impE2 COM BASE EM impE1, impE2 DO TIPO SELVAGEM E COMPARAÇÃO ENTRE SUAS CAPACIDADES PARA PRODUZIR IMP

[0129] Os quatro tipos de vetores preparados no Exemplo 10 para introduzir mutações inovadoras (isto é, pDZ-impE2(S387T, M413T, N458K), pDZ- impE2(F123C), pDZ-impE(I243V) e pDZ-impE2(F405Y)) foram transformados por uma recombinação de duas etapas de cromossomos homólogos na cepa CJI0323_impE1E2(WT), em que o impE1E2 de CJI0323 de Corynebacterium stationis (uma cepa produtora de IMP preparada no Exemplo 4) foi recuperado para WT. Então, as cepas em que as mutações de impE2 foram introduzidas no cromossomo foram selecionadas por análise de sequências dos polinucleotídeos, e as cepas foram nomeadas CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(S387T, M413T, N458K), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F123C), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(I243V) e CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F405Y), respectivamente.

[0130] As cepas CJI032_impE1E2(WT)_impE2(F123C) de Corynebacterium stationis, CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(I243V) de Corynebacterium stationis e CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F405Y) de Corynebacterium stationis foram depositadas em 2 de novembro de 2018 no Centro Coreano de Cultura de Microorganismos (KCCM), uma autoridade internacional depositária sob o Tratado de Budapeste, e atribuídas com os Números de Acesso KCCM12362P, KCCM12363P e KCCM12365P, respectivamente.

[0131] As cepas foram cultivadas da mesma maneira que no Exemplo 7, e suas concentrações de IMP foram analisadas. Após 48 horas de cultura, as concentrações foram medidas (Tabela 16). [TABELA 16]

[0132] Com relação à concentração de IMP, confirmou-se que as quatro cepas modificadas inovadoras mostraram um aumento máximo de 44% em comparação com a cepa CJI0323_impE1E2(WT). O aumento na quantidade de produção de IMP devido às mutações da proteína ImpE da presente revelação pode ser interpretado como sendo muito significativo.

EXEMPLO 12: PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM MUTAÇÃO DE impE2 COM BASE EM CJI0323::impE2(G64D) E COMPARAÇÃO ENTRE AS CAPACIDADES PARA PRODUZIR IMP

[0133] Os quatro tipos de vetores preparados no Exemplo 10 para introduzir mutações inovadoras (isto é, pDZ-impE2(S387T, M413T, N458K), pDZ- impE2(F123C), pDZ-impE(I243V) e pDZ-impE2(F405Y)) foram transformados na cepa CJI0323_impE2(G64D) (isto é, uma cepa produtora de IMP) por uma recombinação de duas etapas de cromossomos homólogos. Então, as cepas em que as mutações de impE2 foram introduzidas no cromossomo foram selecionadas por análise de sequências dos polinucleotídeos, e as cepas foram nomeadas CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T, M413T, N458K), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C), CJI0323::impE2(G64D)_impEp(I243V) e CJI0323::impE2(G64D)_impE2p(F405Y), respectivamente, de acordo com a mutação de impE2 inserida.

[0134] As cepas foram cultivadas da mesma maneira que no Exemplo 7, e suas concentrações de IMP foram analisadas (Tabela 17). [TABELA 17]

[0135] Com relação à concentração de IMP, confirmou-se que as quatro cepas modificadas inovadoras mostraram um aumento máximo de 17% em comparação com a cepa CJI0323::impE2(G64D). O aumento na quantidade de produção de IMP devido às mutações da proteína ImpE da presente revelação pode ser interpretado como sendo muito significativo.

[0136] Então, os sete tipos de vetores preparados acima (isto é, pDZ- impE2(S387T, M413T, N458K), pDZ-impE2(F123C), pDZ-impE(I243V), pDZ- impE2(F405Y), pDZ-impE2(S387T), pDZ-impE2(M413T) e pDZ-impE2(N458K)), isoladamente ou em combinação, foram transformadas na cepa CJI0323_impE1E2(WT) ou na cepa CJI0323::impE2(G64D). As cepas preparadas foram nomeadas CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(S387T), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(M413T), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(N458K), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K)) CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(M413T), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(N458K), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(I243V, S387T, M413T, N458K), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T, F405Y, M413T, N458K), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C, S387T, M413T, N458K) e CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K), e suas capacidades para produzir IMP foram medidas da mesma maneira descrita acima (Tabela 18).

[0137] As cepas CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(S387T) de Corynebacterium stationis, CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(M413T) de Corynebacterium stationis e CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(N458K) foram depositadas em 2 de novembro de 2018 no Centro Coreano de Cultura de Micro-organismos (KCCM), uma autoridade internacional depositária sob o Tratado de Budapeste, e atribuídas com os Números de Acesso KCCM12364P, KCCM12366P e KCCM12367P, respectivamente. [TABELA 18]

[0138] Conforme mostrado nas tabelas acima, confirmou-se que as mutações únicas (isto é, impE2(S387T), impE2(M413T) e impE2(N458K)) mostraram um aumento máximo de 33,6% em comparação com a cepa do tipo selvagem, e todas as cepas com uma combinação de mutações inovadoras mostraram um aumento máximo de 102,5%. Adicionalmente, quando uma mutação inovadora foi isoladamente introduzida na cepa CJI0323::impE2(G64D), a capacidade para produzir IMP foi aumentada conforme mostrado nas Tabelas 17 e 18, ao passo que quando uma combinação de mutações foi introduzida na cepa, mostrou-se que a cepa tinha uma capacidade mais aprimorada para produzir IMP. Em particular, quando tanto uma mutação da cepa CJI0323::impE2(G64D) quanto uma mutação inovadora (ou mutações inovadoras) são integradas na cepa, a capacidade para produzir IMP é aumentada cerca de 515% em comparação com a cepa do tipo selvagem, enquanto mostra um aumento de cerca de 24% em comparação com a cepa CJI0323::impE2(G64D). Também se confirmou que as mutações inovadoras constatadas na presente revelação mostraram aumento da capacidade para produzir IMP mesmo por uma única mutação e, quando essas mutações foram introduzidas em combinação, a capacidade para produzir IMP foi ainda maior.

EXEMPLO 13: INTENSIFICAÇÃO DE impE2 COM BASE EM CEPAS PRODUTORAS DE IMP EXEMPLO 13-1: PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM MUTAÇÃO DE impE2 COM BASE EM CEPA PRODUTORA DE IMP

[0139] Para confirmar os efeitos de introduzir uma mutação de impE2 na cepa, preparou-se uma cepa produtora de IMP na qual as atividades de adenilossuccinato sintetase e IMP desidrogenase que correspondem à trajetória de degradação de IMP na cepa ATCC6872 foram atenuadas. O códon de iniciação foi alterado mudando-se a primeira base de “a” para “t” em cada sequência de nucleotídeos dos dois genes purA e guaB, que codificam as duas enzimas. A cepa na qual a expressão dos dois genes foi atenuada na cepa ATCC6872 foi nomeada CJI9088. Os vetores pDZ- impE2(S387T, M413T, N458K), pDZ-impE2(F123C), pDZ-impE(I243V) e pDZ- impE2(F405Y) preparados no Exemplo 10 foram transformados na cepa CJI9088, isoladamente ou em combinação, por eletroporação. Então, as cepas nas quais os vetores foram inseridos no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém canamicina (25 mg/l). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a um segundo cruzamento, e as cepas nas quais a modificação de um gene-alvo foi introduzida foram selecionadas. A introdução da modificação nas cepas finalmente transformadas foi confirmada realizando-se PCR com o uso do par de iniciadores de SEQ ID NOS: 13 e 14, seguido por análise de sequenciamento de nucleotídeos.

[0140] A capacidade das cepas preparadas (isto é, CJI9088, CJI9088_impE2(S387T, M413T, N458K), CJI9088_impE2(F123C), CJI9088_impE2(I243V), CJI9088_impE2(F405Y) e CJI9088_impE2(F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K) para produzir IMP foi avaliada. Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de IMP foi medida por HPLC, e os resultados são mostrados na Tabela 19 abaixo. [TABELA 19]

[0141] Após confirmar a quantidade de IMP acumulado no meio de cultura, confirmou-se que essas cepas mostraram um aumento de produção de IMP em pelo menos 80%, e um aumento máximo de 730%, em comparação com a cepa parental, CJI9088. Consequentemente, o aumento na quantidade de produção de IMP devido às mutações da proteína ImpE da presente revelação pode ser interpretado como sendo muito significativo.

[0142] A partir do que foi mencionado anteriormente, uma pessoa versada na técnica à qual a presente revelação se refere terá a capacidade para compreender que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem modificar os conceitos técnicos ou as características essenciais da presente revelação. Nesse aspecto, as modalidades exemplificativas reveladas no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitantes do escopo da presente revelação. Pelo contrário, a presente revelação é destinada a abranger não só as modalidades exemplificativas, mas também várias alternativas, modificações, equivalentes e outras modalidades que podem estar incluídas dentro do espírito e escopo da presente revelação conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims

1. Variante de proteína que exporta monofosfato de 5’-inosina, sendo que a variante de proteína é caracterizada por compreender uma substituição do 123° aminoácido por cisteína, uma substituição do 243° aminoácido por valina, uma substituição do 387° aminoácido por treonina, uma substituição do 405° aminoácido por tirosina, uma substituição do 413° aminoácido por treonina, uma substituição do 458° aminoácido por lisina, ou uma combinação dos mesmos, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

2. Variante de proteína, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a variante de proteína é caracterizada por compreender, ainda, uma substituição do 2° aminoácido por isoleucina, uma substituição do 64° aminoácido por ácido de glutâmico ou aspartato, ou uma combinação dos mesmos.

3. Polinucleotídeo que codifica a variante de adenilosuccinato sintetase, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou sequência degenerada da mesma, (i) o códon consistindo em 367° a 369° nucleotídeos ser substituído por um códon que codifica cisteína; (ii) o códon consistindo de 727° a 729° nucleotídeos ser substituído por um códon que codifica valina; (iii) o códon consistindo de 1159° a 1161° nucleotídeos ser substituído por um códon que codifica treonina; (iv) o códon consistindo de 1213° a 1215° nucleotídeos ser substituído por um códon que codifica tirosina; (v) o códon consistindo de 1237° a 1239° nucleotídeos ser substituído por um códon que codifica treonina; (vi) o códon consistindo de 1372° a 1374° nucleotídeos ser substituído por um códon que codifica lisina; ou uma combinação de (i) a (vi).

4. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou na sua sequência degenerada, (i) o códon consistindo de 4 a 6 nucleotídeos ser substituído com um códon que codifica isoleucina; (ii) o códon consistindo de 190° a 192° nucleotídeos ser substituído por um códon que codifica ácido glutâmico ou aspartato; ou uma combinação de (i) e (ii).

5. Vetor caracterizado por compreender o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 3 ou 4.

6. Microrganismo do gênero Corynebacterium que produz monofosfato de 5’-inosina caracterizado por compreender a variante de proteína, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, ou um vetor que compreende o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 3 ou 4.

7. Microrganismo do gênero Corynebacterium, de acordo com a reivindicação 6, sendo que o microrganismo do gênero Corynebacterium é caracterizado por ser Corynebacterium stationis.

8. Método para preparar monofosfato de 5’-inosina caracterizado por compreender cultivar o microrganismo do gênero Corynebacterium, conforme definido na reivindicação 6, em um meio e recuperar o monofosfato de 5’-inosina do microrganismo ou meio.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o microrganismo do gênero Corynebacterium ser Corynebacterium stationis.