JP2020505914A - 新規ポリペプチド及びこれを用いたimpの生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
IMPを製造する方法としては、酵母細胞から抽出したリボ核酸を酵素的に分解する方法(特許文献1)、発酵によって生産されたイノシンを化学的にリン酸化する方法(非特許文献1など)及びIMPを直接的に生産する微生物を培養して、培養液内のIMPを回収する方法などがある。これらの方法の中で、現在最も多く使われている方法は、IMPを直接生産が可能な微生物を用いた方法である。
一方、自然な状態での酵素は、産業的な利用において要求される活性、安定性、光学異性体に対する基質特異性などにおいて、常に最適の特性を示すものではないため、アミノ酸配列の変異などを介して目的とする用途に適するように酵素を改良する様々な試みがなされてきた。その中、酵素の合理的デザイン(rational design)及び部分変異(site-directed mutagenesis)方法が酵素機能を向上するために適用された例があるが、多くの場合、目的酵素の構造に関する情報が不足したり、構造−機能の相関関係が明確ではなく、効果的に適用できないという欠点がある。また、酵素遺伝子のランダム変異を介して構築された変異酵素ライブラリから目的の形質の酵素をスクリーニングする方向的進化(directed evolution)方法により酵素の改良を試みて活性を改善する方法も報告されていた。
本発明の他の目的は、前記本発明のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記本発明のタンパク質変異体及び前記本発明のベクターを含む5’−イノシン酸を生産する微生物を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記本発明のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階;及び前記微生物または前記培地から5’−イノシン酸を回収する段階を含む、5’−イノシン酸の製造方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記本発明の5’−イノシン酸排出タンパク質をコリネバクテリウム属微生物で強化する段階を含む、5’−イノシン酸の排出増加方法を提供することにある。
前記タンパク質は、配列番号2で記載されたアミノ酸配列を含むか、配列番号2で記載されたアミノ酸配列で構成されたタンパク質であってもよいが、前記タンパク質と同様の活性を有する配列は制限なく含み、当業者は、公知のデータベースであるNCBIのGenBankなどから配列情報を得ることができる。また、本出発明のIMP排出タンパク質は、配列番号2及び前記配列番号2と少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。また、このような相同性または同一性を有しながら、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明のタンパク質として使用できることは自明である。
すなわち、本明細書で「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質」または「特定配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質」と記載されていても、該当配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質と同一もしくは相応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明で使用できることは自明である。例えば、本発明のタンパク質変異体と同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、前記アミノ酸配列の前後に、タンパク質の機能を変更しない配列の追加、自然に発生しうる突然変異、そのサイレント突然変異(silent mutation)または保存的置換は除外せず、これらの配列の追加、あるいは突然変異を有する場合でも、本発明の範囲内に属することは自明である。
用語、相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられる。
保存された(conserved)ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に利用されてもよい。実質的に、相同性を有するか(homologous)または同一(identical)の配列は、中間または高い厳しい条件(stringent conditions)で、一般的に、配列全体または全長の少なくとも約50%、60%、70%、80%または90%以上でハイブリッドしてもよい。ハイブリッド化はポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
例えば、本発明の5’−イノシン酸排出能を有するタンパク質変異体は配列番号2のアミノ酸配列のN末端から123番目のアミノ酸がシステインに置換(F123C)、243番目のアミノ酸がバリンに置換(I243V)、387番目のアミノ酸がトレオニンに置換(S387T)、405番目のアミノ酸がチロシンに置換(F405Y)、413番目のアミノ酸がトレオニンに置換(M413T)、458番目のアミノ酸がリジンに置換(N458K)、または前記置換を組み合わせたアミノ酸配列を有する5’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体であってもよいが、これに制限されない。より具体的には、前記5’−イノシン酸排出能を有するタンパク質変異体は、配列番号73、74、75、76、77、78、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、 121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、または155を有するアミノ酸配列、またはこれと少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。さらに、このような相同性を有し、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列を有するタンパク質であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明のタンパク質として使用されることは自明である。
本発明において、用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体(monomer)が共有結合によって長く鎖状につながったヌクレオチドのポリマー(polymer)であって、一定の長さ以上のDNAまたはRNA鎖を意味する。
具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、55℃のTm値でハイブリダイズ段階を含むハイブリダイズ化条件を用い、上述した条件を用いて探知することができる。また、前記Tm値は、60℃、63℃または65℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節されうる。
ポリヌクレオチドをハイブリッド化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野でよく知られている(非特許文献8参照)。
本発明で5’−イノシン酸の排出能を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、impE2遺伝子であってもよく、前記ポリヌクレオチドについての説明は前述した通りである。
本発明で5’−イノシン酸の排出能を有するタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドも、前述した通りである。
本発明で使用する用語、「ベクター」は、適切な宿主内で目的のタンパク質を発現できるように、適切な調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するDNA製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
本発明で用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、及びCharon21Aなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系とpET系などを用いてもよい。具体的には、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BACベクターなどを用いてもよい。
本明細書において、用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入され位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをすべて含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするDNA及びRNAを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット(expression cassette)の形態で宿主細胞に導入されることができる。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター(promoter)、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに限定されない。
本明細書で使用される用語、「5’−イノシン酸を生産する微生物」とは、自然的に5’−イノシン酸生産能を有している微生物または5’−イノシン酸の生産能及び/または排出能のない親菌株に5’−イノシン酸の生産能及び排出能付与された微生物を意味する。本発明において、前記5’−イノシン酸を生産する微生物は、5’−イノシン酸を排出する微生物または5’−イノシン酸排出能を有する微生物と混用して使用してもよい。
前記5’−イノシン酸を生産する微生物は、本発明の5’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体を含むか、前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むか、または前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されて、タンパク質変異体を発現できる宿主細胞または微生物を含んでもよい。具体的には、本発明の微生物には、エシェリキア(Escherichia)属、セラチア(Serratia)属、エルウィニア(Erwinia)属、エンテロバクテリア(Enterobacteria)属、サルモネラ(Salmonella)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属またはコリネバクテリウム(Corynebacterium)属などの微生物菌株が含まれてもよく、より具体的には、本発明の微生物はコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
本発明において、コリネバクテリウム属微生物は、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum )、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、またはコリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)であってもよいが、必ずこれに限定されるものではない。
具体的には、本発明の方法は、本発明の微生物または本発明の培地から5’−イノシン酸を回収する段階をさらに含んでもよい。
本発明の方法において、前記微生物を培養する段階は、特に制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は、特にこれに制限されないが、塩基性化合物(例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア)または酸性化合物(例えば、リン酸または硫酸)を用いて適正pH(例えば、pH5〜9、具体的には、pH6〜8、最も具体的には、pH6.8)を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は20〜45℃、具体的には、25〜40℃を維持してもよく、約10〜160時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産された5’−イノシン酸は、培地中に分泌されるか細胞内に残留しうる。
また、前記回収段階は、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて行ってもよい。したがって、前記回収された5’−イノシン酸は、精製された形態または5’−イノシン酸を含有した微生物発酵液であってもよい 。
本発明の組成物は、さらに、前記ポリヌクレオチドを作動させることができる構成を制限なく含んでもよい。本発明の組成物で、前記ポリヌクレオチドは、導入された宿主細胞で作動可能に連結された遺伝子を発現させうるようにベクター内に含まれた形態であってもよい。
また、前記組成物は、5’−イノシン酸生産用組成物に通常使用される任意の適切な賦形剤をさらに含んでもよい。これらの賦形剤としては、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、または等張化剤などであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明は、もう一つの様態として、コリネバクテリウム属微生物で配列番号2のアミノ酸配列で構成されたタンパク質の活性を強化する段階を含む、5’−イノシン酸の排出増加方法を提供する。具体的には、前記配列番号2のアミノ酸配列で構成されたタンパク質の活性の強化は、前記配列番号2のアミノ酸配列のN末端から123番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、243番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換 、387番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、405番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、413番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、458番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、または前記置換が組み合わせされたアミノ酸配列からなる5’−イノシン酸排出タンパク質変異体を前記コリネバクテリウム属微生物に導入、適用または含めることにより行ってもよい。前記用語、「5’−イノシン酸排出タンパク質」、「5’−イノシン酸排出タンパク質変異体」及び「コリネバクテリウム属微生物」は、前述したとおりである。
本発明は、もう一つの様態として、コリネバクテリウム属微生物の5’−イノシン酸の排出増加のための、本発明のタンパク質変異体の用途を提供する。
IMP排出に関与するコリネバクテリウム属の膜タンパク質を同定するため、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)ATCC6872のゲノミックDNAライブラリを製作した。
以後、コリネバクテリウム属野生型の菌株は、IMPを生産できないか、IMPを生産しても、非常に極微量が生産されるだけなので、IMP生産能を確認するために、IMP生産能を有するATCC6872由来のCJI0323菌株を製作した。製作されたCJI0323菌株にATCC6872のゲノミックDNAライブラリを用いてIMP排出に関与する膜タンパク質のスクリーニングを行った。具体的な実験は、以下のとおりである。
ATCC6872由来のIMP生産株を作製するために、ATCC6872をリン酸塩緩衝液(pH7.0)、またはクエン酸緩衝液(pH5.5)に107〜108細胞/mlで懸濁させた。ここにUVを室温または32℃で20〜40分間処理して突然変異を誘発させた。2回にかけて0.85%食塩水で洗浄して希釈した後、1.7%寒天を含有した最小培地に耐性を付与しようとする物質を適正濃度に含有した培地に塗抹した後コロニーを得た。それぞれのコロニーを栄養培地で培養し、種培地で24時間培養した。発酵培地で3〜4日間培養した後、培養液に蓄積されたIMP生産量が最も優れたコロニーを選別した。高濃度IMP生産株を製作するために、アデニン要求性、グアニン漏出型、リゾチーム感受性、3,4−デヒドロプロリン耐性、ストレプトマイシン耐性、アゼチジンカルボン酸耐性、チアプロリン耐性、アザセリン耐性、スルファグアニジン耐性、ノルバリン耐性、トリメトプリム耐性を付与するために、前記過程をそれぞれの物質に対して順次行い、前記物質に対する耐性が付与されてIMP生産能の優れたCJI0323を最終選別した。下記の表1にATCC6872に比べたCJI0323の耐性程度を比較して示した。
−栄養培地:ペプトン1%、肉汁1%、塩化ナトリウム0.25%、酵母エキス1%、寒天2%、pH7.2
−種培地:ブドウ糖1%、ペプトン1%、肉汁1%、酵母エキス1%、塩化ナトリウム0.25%、アデニン100mg/l、グアニン100mg/l、pH7.5
−発酵培地:グルタミン酸ナトリウム0.1%、塩化アンモニウム1%、硫酸マグネシウム1.2%、塩化カルシウム0.01%、硫酸鉄20mg/l、硫酸マンガン20mg/l、硫酸亜鉛20mg/l、硫酸銅5mg/l、L−システイン23mg/l、アラニン24mg/l、ニコチン酸8mg/l、ビオチン45μg/l、チアミン塩酸5mg/l、アデニン30mg/l、リン酸(85%)1.9%、ブドウ糖2.55%、果糖1.45%になるように添加して用いた。
種培地2mlを直径18mmの試験管に分注して加圧殺菌した後、ATCC6872及びCJI0323をそれぞれ接種し、30℃の温度で24時間振とう培養して種培養液として用いた。発酵培地29mlを250mlの振とう用三角フラスコに分注して121℃の温度で15分間加圧殺菌した後、種培養液2mlを接種して3日間培養した。培養条件は、回転数170rpm、温度30℃、pH7.5に調節した。
培養終了後、HPLC(SHIMAZDU LC20A)を用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表2のとおりである。
1.7%の寒天を添加した最小培地内にさらにIMPを添加してCJI0323菌株の生育低下(growth inhibition)を示すスクリーニング条件を確立した。ATCC6872ゲノミックライブラリプラスミドをCJI0323菌株に電気穿孔法で形質転換させて(非特許文献9)、過量のIMPが添加された培地条件で生育低下が解除されるコロニーを選別した。選別されたコロニーからプラスミドを獲得し、シーケンスの技法により塩基配列を分析した。これから、過量のIMP添加条件で生育低下を解除させるのに関与する膜タンパク質の1種を同定した。
前記1種のコリネバクテリウム膜タンパク質は、配列番号2のアミノ酸配列、及び配列番号4の塩基配列(NCBI GenBank:NZ_CP014279、WP_066795121、MFS transporter)と確認された。前記膜タンパク質は、MFSトランスポーターとして知られているが、明確な機能が確認されておらず、さらにIMP排出に関する機能は知られていない。本明細書では、これをImpE2(WT)と命名した。
実施例2−1:impE1、impE2の確認
前記膜タンパク質ImpE2の機能を調べるため、NCBIから配列番号4の遺伝子構造を確認した(NCBI GenBank:NZ_CP014279、WP_066795121、MFS transporter)。impE2(配列番号4)のORFの開始部分の7bpがそのimpE2上流に位置した他の遺伝子(NCBI GenBank:NZ_CP014279、WP_066795119、transcriptional regulator)と7bpオーバーラップされることを確認した。impE2の上流に位置した遺伝子及び該当遺伝子からコードされるタンパク質は、まだ機能が確認されなかったので、本明細書ではこれをImpE1(WT)と命名した(配列番号1のアミノ酸配列及び配列番号3の塩基配列)。
実施例1と2−1を介して同定したIMPによる生育低下を解除させるのに関与するImpE1またはImpE2をIMP生産菌株で欠損させた場合、IMPの排出能が減少するのかを確認するために、各遺伝子の欠損ベクターを製作した。
ベクターを製作するための遺伝子断片は、ATCC6872ゲノミックDNAを鋳型としてPCRを介して獲得した。
具体的には、前記impE1のPCRは、配列番号5、6のプライマー及び配列番号7、8のプライマーを、impE2のPCRは、配列番号9、10のプライマー及び配列番号11、12のプライマーを用いた(表3)。
前記IMPによる生育低下を解除させるのに関与するタンパク質をコードする遺伝子impE1とimpE2はオーバーラップされているので、二つの遺伝子は同時に調節されるべく必要がある。したがって、impE1とimpE2の両方が欠損したベクターを製作した。
impE1とimpE2のPCRは、配列番号5と65のプライマー及び配列番号66と12のプライマーを用いた。この時用いたプライマーは、米国国立衛生研究所ジェンバンク(NIH GenBank)に登録されているコリネバクテリウム・スタティオニス(ATCC6872)遺伝子(NCBI Genbank:NZ_CP014279)及び周辺塩基配列に対する情報に基づいて製作した。配列番号5と65のプライマーを用いて増幅されたimpE1遺伝子断片と配列番号66と12のプライマーを用いて増幅されたimpE2遺伝子の二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、2.0kbpのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を、それぞれXbaI、speIで切断した。T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターにクローニングして、pDZ−△impE1E2を製作した。
実施例2−2で製作した2種と実施例2−3で製作した1種のプラスミドをそれぞれCJI0323に電気穿孔法で形質転換した後(非特許文献10による形質転換法利用)、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株はカナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株は再び2次交差(cross−over)を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が欠損されたかどうかは、配列番号5、8及び配列番号9、12及び配列番号5、12のプライマー対を用いてPCRを行うことにより確認した。
選別された菌株は、CJI0323_△impE1、CJI0323_△impE2、CJI0323_△impE1E2と命名し、前記菌株のIMPの生産能を評価した。
種培地2mlを直径18mmの試験管に分注して加圧殺菌した後、CJI0323、CJI0323_△IMPE1、CJI0323_△IMPE2、CJI0323_△IMPE1E2を接種し、30℃の温度で24時間振とう培養して種培養液として用いた。発酵培地29mlを250mlの振とう用三角フラスコに分注して121℃の温度で15分間加圧殺菌した後、種培養液2mlを接種して3日間培養した。培養条件は、回転数170rpm、温度30℃、pH7.5に調節した。
培養終了後、HPLCを用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表4のとおりである。
前記実施例1で高濃度IMP生産をするCJI0323菌株の場合、高濃度のIMPを生産するためにIMP排出能が向上した可能性がある。したがって、CJ0323菌株のimpE1、impE2が変異されたかどうかを確認した。CJI0323の染色体DNAをポリメラーゼ連鎖反応の方法(以下「PCR方法」という)を介して増幅した。具体的には、まず、前記CJI0323の染色体DNAを鋳型として、配列番号13と14のプライマーを用いて(表5)94℃で1分間変性、58℃で30秒間結合、72℃で2分間Taq DNAポリメラーゼで重合する条件を28回繰り返すPCR方法を通じて、約2.8kbの塩基対の断片を増幅した。
CJI0323菌株のimpE1ヌクレオチドはimpE1_CJI0323(配列番号87)、タンパク質はImpE1_CJI0323(配列番号85)と命名し、CJI0323菌株のimpE2ヌクレオチドはimpE2_CJI0323(配列番号88)、タンパク質はImpE2_CJI0323(配列番号86)と命名した。
実施例4−1:impE1またはimpE2変異の復元ベクターの製作
前記実施例3でIMP生産菌株であるCJI0323菌株で、impE1、impE2が変異されたかどうかを確認した結果、impE1に1つ、impE2に2つの変異が含まれていることを確認した。CJI0323菌株は高濃度でIMPを生産する菌株であるため、前記変異がIMP排出能を向上させる変異である可能性が高い。したがって、変異のない天然の野生型であるImpEに復元した後、さらに発掘されるタンパク質変異体がより高いIMP排出能を有するかどうかを確認するために、次の実験を行った。
復元ベクターを製作するために、天然の野生型菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)ATCC6872を鋳型としてPCRを行った。配列番号89と90のプライマーを用いて増幅されたimpE1impE2遺伝子断片をXbaIの制限酵素で処理し、pDZベクターのXbaI制限酵素の位置にクローニングして、pDZ−impE1E2(WT)を製作した。
実施例4−1で製作した1プラスミドをCJI0323に電気穿孔法で形質転換した後(非特許文献10による形質転換法利用)、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株はカナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株は再び2次交差(cross−over)を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子変異が復元したかどうかは、配列番号89、90のプライマーを用いてPCRを行い、塩基配列を分析することで確認した。以後、製作された菌株をCJI0323_impE1E2(WT)と命名した。
前記実施例3の結果を通して発掘された3種の変異のうち、最も高い5’−イノシン酸排出能を有する変異を選別し、これより高い排出能を有する変異を発掘するために次の実験を行った。
ImpE1のE164K単独変異のベクターを製作するために、天然の野生型菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)ATCC6872を鋳型として配列番号91と92のプライマー及び配列番号93と94のプライマーを用いた。配列番号91と92のプライマーを用いて増幅されたE164K−1遺伝子断片と、配列番号93と94のプライマーを用いて増幅されたE164K−2遺伝子の二つの断片とを鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、1.8kbpのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素XbaIで切断した。T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターにクローニングして、pDZ−impE1(E164K)を製作した。
ImpE2のV2I単独変異ベクターを製作するために、ATCC6872を鋳型として配列番号91と95のプライマーと配列番号96と94のプライマーを用いた。配列番号91と95のプライマーを用いて増幅されたV2I−1遺伝子断片と、配列番号96と94のプライマーを用いて増幅されたV2I−2遺伝子の二つの断片とを鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、1.8kbpのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素XbaIで切断した。 T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターにクローニングして、pDZ−impE2(V2I)を製作した。
ImpE2のG64E単独変異のベクターを製作するために、ATCC6872を鋳型として配列番号91と97のプライマー及び配列番号98と94のプライマーを用いた。配列番号91と97のプライマーを用いて増幅されたG64E−1遺伝子断片と、配列番号98と94のプライマーを用いて増幅されたG64E−2遺伝子の二つの断片とを鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、1.8kbpのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素XbaIで切断した。T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターにクローニングして、pDZ−impE2(G64E)を製作した。
前記コリネバクテリウム・スタティオニスCJI0323_impE1(E164K)、コリネバクテリウム・スタティオニスCJI0323_impE2(V2I)及びコリネバクテリウム・スタティオニスCJI0323_impE2(G64E)菌株は、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター(Korean Culture Center of Microorganisms、KCCM)に2018年11月2日付で寄託し、それぞれ寄託番号KCCM12359P、KCCM12360P及びKCCM12361Pを与えられた。
培養終了後、HPLCを用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表7のとおりである。
前記結果を通して5’−イノシン酸の生産能の向上された代表的な3種の変異のうち、最も高いイノシン酸の排出能を示すimpE2(G64E)の位置的重要性を確認するために、impE2のアミノ酸配列で64番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換する変異導入用ベクターを製作した。
ImpE2(G64E)変異導入用ベクターの製作過程は次のとおりである。
報告されたポリヌクレオチド配列に基づいてコリネバクテリウム・スタティオニスCJI0323の染色体遺伝子を分離し、これを鋳型として、配列番号15と配列番号16〜33とのそれぞれのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介して遺伝子断片を得た。PCRは、94℃で5分間変性した後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で1分間の重合を20回繰り返した後、72℃で5分間重合反応を行った。その結果、18種の1kbpのポリヌクレオチドを獲得した。
前記結果を介して獲得した二つの断片を鋳型として、オーバーラップ伸長PCR法を行い、18種の2kbpのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素XbaIで切断し、T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターに連結した後、大腸菌DH5αに形質転換して、カナマイシン(25mg/L)が含まれたLB固体培地に塗抹した。
ベクター製作のために用いたプライマー配列の情報は、表8のとおりである。
前記実施例3−1で製造した変異導入用ベクターの18種をコリネバクテリウム・スタティオニスCJI0323に形質転換して、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株はカナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株は再び2次交差(cross−over)を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子変異が導入するかどうかは、配列番号13、14のプライマーを用いてPCRを行い、塩基配列を分析することで確認した。挿入された変異による菌株名は次の表10のとおりである。
より高いIMP排出能を有するタンパク質変異体を獲得するために、下記の方法で染色体内の1次交差挿入用ベクターのライブラリを製作した。
実施例5−3の結果で最も高いIMP排出能を有するものと確認された菌株CJI0323::impE2(G64D)のimpE2を対象にError−Prone PCRを行った。CJI0323::G64Dが保有している64番目のアミノ酸の後のアミノ酸配列に変異を導入するために、impE2の193番目の塩基配列から下流の約130bpの塩基配列まで、塩基置換変異がランダムに導入されたimpE遺伝子変異体(1.6kbp)を獲得した。Error−Prone PCRはDiversify PCR Random Mutagenesis Kit(Clontech)を使用して行い、CJI0323::impE2(G64D)のゲノムDNAを鋳型として、配列番号53、及び配列番号54のプライマー対(表12)を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介して遺伝子断片を得た。
実施例6で製造したpTOPO_impE library ベクターをIMPを高濃度で生産する菌株CJI0323::impE2(G64D)に電気穿孔法で形質転換した後、カナマイシン25mg/Lを含有した栄養培地に塗抹して変異遺伝子が挿入された菌株、10,000個のコロニーを確保し、各コロニーをCJI0323::impE2(G64D)/pTOPO_impE(mt)1から CJI0323::impE2(G64D)/pTOPO_impE(mt)10000までと命名した。
−種培地:ブドウ糖1%、ペプトン1%、肉汁1%、酵母エキス1%、塩化ナトリウム0.25%、アデニン100mg/l、グアニン100mg/l、pH7.5
−発酵培地:グルタミン酸ナトリウム0.1%、塩化アンモニウム1%、硫酸マグネシウム1.2%、塩化カルシウム0.01%、硫酸鉄20mg/l、硫酸マンガン20mg/l、硫酸亜鉛20mg/l、硫酸銅5mg/l、L−システイン23mg/l、アラニン24mg/l、ニコチン酸8mg/l、ビオチン45μg/l、チアミン塩酸5mg/l、アデニン30mg/l、リン酸(85%)1.9%、ブドウ糖2.55%、果糖1.45%になるように添加して用いた。
選別された50個の菌株は、前記と同様に吸光度を測定し、5’−イノシン酸生産量の確認を繰り返して行った。そして、CJI0323::impE2(G64D)菌株に比べて5’−イノシン酸の生産能が向上した菌株の上位4種を選別した。
前記実施例7で選別した4種の菌株の5’−イノシン酸生産能を比較するために、以下のような方法で培養し、培養液の成分を分析した。
加圧殺菌した直径18mmの試験管に実施例2と同じ種培地5mlを接種し、30℃の温度で24時間振とう培養して種培養液として用いた。実施例2と同じ発酵培地29mlを250mlの振とう用三角フラスコに分注して121℃の温度で15分間加圧殺菌した後、種培養液2mlを接種して4〜5日間培養した。培養条件は、回転数170rpm、温度30℃、pH7.5に調節した。培養終了後、HPLCを用いた方法により5’−イノシン酸の生産量を測定した。
50種の菌株の中で、5’−イノシン酸の上位4種の菌株を選別して、前記培養及び分析を繰り返し行い、分析された5’−イノシン酸の濃度は、表13の通りである。
実施例9:選別されたimpE2変異菌株のimpE2遺伝子変異の確認
前記実施例8で選別された4種の菌株のimpE2に導入された変異を確認するために、impE2変異体のポリヌクレオチド配列を分析した。ポリヌクレオチド配列を決定するために配列番号13及び配列番号14のプライマー対を用いてPCRを行った。
確保された各変異型impE2遺伝子断片のポリヌクレオチド配列の分析を行った。impE2(WT)の配列番号4またはimpE2(CJ0323::G64D)の配列番号100のポリヌクレオチド配列と比較し、これにより変異型ImpE2のアミノ酸配列を確認した。選別された菌株のImpE2アミノ酸配列の変異の情報は、表14のとおりである。
前記実施例9で確認されたimpE2変異適用効果を確認するために、これを染色体上に導入することができるベクターを製作し、製作過程は次の通りである。
impE2(G64D)変異が除外された表14のライブラリ変異のみを含むベクターを製作した。具体的には、コリネバクテリウム・スタティオニスATCC6872の染色体遺伝子を分離して、配列番号56と配列番号57、59、61、63のプライマー対を用い、ポリメラーゼ連鎖反応を介してそれぞれの遺伝子断片を得た。PCR法の条件は、94℃で5分間変性した後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で1分間の重合を20回繰り返した後、72℃で5分間重合反応を行ってPCR断片を獲得した。
前記選別された4種の染色体をそれぞれ鋳型とし、配列番号58、60、62、64と配列番号55のプライマー対を用い、ポリメラーゼ連鎖反応を介して遺伝子断片を得た。PCR法の条件は、94℃で5分間変性した後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で1分30秒間の重合を20回繰り返した後、72℃で5分間重合反応を行ってPCR断片を獲得した。二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、得られた遺伝子の断片を制限酵素XbaIで切断した。T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZ(特許文献2及び3)ベクターに連結した後、大腸菌DH5αに形質転換してカナマイシン(25mg/L)が含まれたLB固体培地に塗抹した。
前記実施例10で製造した新規変異導入用のベクター、pDZ−impE2(S387T、M413T、N458K)、pDZ−impE2(F123C)、pDZ−impE2(I243V)、pDZ−impE2(F405Y)の4種を2段階相同染色体の組換えを介して実施例4で製造した5’−イノシン酸生産菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニスCJI0323のimpE1E2がWTに復元されたCJI0323_impE1E2(WT)に形質転換させた。その後、ポリヌクレオチド配列の分析により、染色体上のimpE2変異が導入された菌株を選別し、それぞれCJI0323_impE1E2(WT)_impE2(S387T、M413T、N458K)、CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F123C)、CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(I243V )、CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F405Y)と命名した。
前記実施例10で製造した新規変異導入用ベクター、pDZ−impE2(S387T、M413T、N458K)、pDZ−impE2(F123C)、pDZ−impE2(I243V)、pDZ−impE2(F405Y)の4種を5’−イノシン酸の生産菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニスCJI0323::impE2(G64D)に2段階の相同染色体の組換えを介して形質転換させた。その後ポリヌクレオチド配列の分析により、染色体上のimpE2変異が導入された菌株を選別し、挿入されたimpE2変異に応じてCJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T、M413T、N458K)、CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C)、CJI0323::impE2(G64D)_impE2(I243V)、CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F405Y)と命名した。
実施例7と同様の方法で培養して、そこから5’−イノシン酸の濃度を分析した(表17)。
次に、前記製作されたpDZ−impE2(S387T、M413T、N458K)、pDZ−impE2(F123C)、pDZ−impE2(I243V)、pDZ−impE2(F405Y)、pDZ−impE2(S387T)、pDZ−impE2(M413T )、pDZ−impE2(N458K)の7種のベクターを単独または組み合わせて、CJI0323_impE1E2(WT)菌株及びCJI0323::impE2(G64D)菌株に形質転換した。製作された菌株は、CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(S387T)、CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(M413T)、CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(N458K)、CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F123C、I243V、S387T、F405Y、M413T、N458K))、CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T)、CJI0323::impE2(G64D)_impE2(M413T)、CJI0323::impE2(G64D)_impE2(N458K)、CJI0323::impE2(G64D)_impE2(I243V、S387T、M413T 、N458K)、CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T、F405Y、M413T、N458K)、CJI0323::impE2(G64D)_impE2(I243V、S387T、F405Y、M413T、N458K)、CJI0323::impE2(G64D)_impE2 (F123C、S387T、M413T、N458K)、CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C、I243V、S387T、F405Y、M413T、N458K)と命名し、前記のような方法で5’−イノシン酸生産能を測定した(表18)。
実施例13−1:野生型IMP生産株基盤impE2変異導入菌株の製作
野生型のIMP生産菌株でimpE2の変異導入の効果を確認するために、ATCC6872でIMPの分解経路に該当するアデニロコハク酸シンテターゼ (adenylosuccinate synthetase)及びIMPデヒドロゲナーゼ(IMP dehydrogenase)の活性が弱化された菌株を製作した。前記二つの酵素をコードする遺伝子purA及びguaBの各塩基配列から1番目の塩基をaからtに変更して開始コドンを変更した。ATCC6872における前記二つの遺伝子の発現が弱化された菌株はCJI9088と命名した。製造されたCJI9088菌株に、前記実施例10で製作したpDZ−impE2(S387T、M413T、N458K)、pDZ−impE2(F123C)、pDZ−impE2(I243V)、pDZ−impE2(F405Y)ベクターを単独または組み合わせて電気穿孔法で形質転換し、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株は再び2次交差を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が導入されたかどうかは、配列番号13、14プライマー対を用いてPCRを行うことにより確認した。
製作されたCJI9088及びCJI9088_impE2(S387T、M413T、N458K)、CJI9088_impE2(F123C)、CJI9088_impE2(I243V)、CJI9088_impE2(F405Y)、CJI9088_impE2(F123C、I243V、S387T、F405Y、M413T、N458K)菌株のIMP生産能を評価した。培養終了後、HPLCを用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表19の通りである。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
Claims (13)
- 配列番号2のアミノ酸配列のN末端から123番目のアミノ酸がシステインに置換、243番目のアミノ酸がバリンに置換、387番目のアミノ酸がトレオニンに置換、405番目のアミノ酸がチロシンに置換、413番目のアミノ酸がトレオニンに置換、458番目のアミノ酸がリジンに置換、または前記置換を組み合わせたアミノ酸配列からなる、5’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体。
- 前記5’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体が、さらに、配列番号2のアミノ酸配列のN末端から2番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、64番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、または前記置換を組み合わせたアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の5’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体。
- 請求項1に記載のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項1に記載のタンパク質変異体、請求項3に記載のポリヌクレオチドまたは請求項4に記載のベクターを含む、5’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)である、請求項5に記載の5’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、アデニロコハク酸シンテターゼ(adenylosuccinate synthetase)またはIMPデヒドロゲナーゼ(IMP dehydrogenase)の活性がさらに弱化された、請求項5に記載の5’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
- 請求項5に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含む、5’−イノシン酸の製造方法。
- 前記方法が、前記微生物または培地から5’−イノシン酸を回収する段階をさらに含む、 請求項8に記載の5’−イノシン酸の製造方法。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)である、請求項8に記載の5’−イノシン酸の製造方法。
- コリネバクテリウム属微生物の5’−イノシン酸の生産増加のための、請求項1に記載のタンパク質変異体の用途。
- コリネバクテリウム属微生物で配列番号2のアミノ酸配列から構成されたタンパク質の活性を強化する段階を含む、5’−イノシン酸の排出増加方法。
- コリネバクテリウム属微生物の5’−イノシン酸の排出増加のための、請求項1に記載のタンパク質変異体の用途。
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