CN110831959B - 新型多肽及使用其产生imp的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及具有输出5'‑肌苷一磷酸的活性的新型蛋白变体，包含所述蛋白变体的微生物，和使用所述微生物制备5'‑肌苷一磷酸的方法。

Description

新型多肽及使用其产生IMP的方法
[技术领域]
本公开涉及具有输出5'-肌苷一磷酸的活性的新型蛋白变体，含有所述蛋白变体的微生物，使用所述微生物制备5'-肌苷一磷酸的方法，以及用于使用所述微生物增加5'-肌苷一磷酸的输出的方法。
[背景技术]
5'-肌苷一磷酸(下文，IMP)是一种核酸物质，是核酸代谢途径的中间体，并且在许多领域(诸如食品、药物、各种医学应用等)中使用。具体而言，IMP是与5'-鸟嘌呤一磷酸(下文，GMP)一起广泛用作食品调味料或食品的添加剂。尽管已知IMP本身提供牛肉味道，但已知其增强谷氨酸钠(MSG)的风味，并且因此作为增强味道的基于核酸的调味料引起关注。
用于产生IMP的方法的实例包括酶促降解从酵母细胞提取的核糖核酸的方法(日本专利公开号1614/1957)，用于将通过发酵产生的肌苷化学磷酸化的方法(Agri. Biol. Chem., 36, 1511(1972)等)，用于培养可以直接产生IMP的微生物且在培养液中回收IMP的方法等。在这些中，目前最频繁使用的方法是使用能够直接产生IMP的微生物的方法。
同时，由于关于工业应用中所需的活性、稳定性、对光学异构体的底物特异性等方面，酶在自然界中并不总是表现出最佳特性，因此已经进行各种尝试以通过突变其氨基酸序列等来改进酶以适合于预期用途。在这些中，尽管酶的合理设计和定点诱变已应用于提高酶功能，但在许多情况下，显示这些尝试是不利的，因为关于靶酶的结构的信息不足或者结构-功能相关性不清楚，因此阻止了它们的有效应用。此外，先前报道了通过尝试经由定向进化增强酶来提高酶活性的方法，所述定向进化用于从通过酶基因的随机诱变构建的修饰酶的文库筛选期望性状的酶。
[公开内容]
[技术问题]
为了通过经由微生物发酵直接IMP产生以高产率产生IMP，顺利地进行IMP输出是必需的。为了实现本公开的目的，本公开的发明人已经进行了广泛的研究，并且作为结果，已经鉴定了参与输出IMP的活性的蛋白，并且也已经发现了具有更高的输出IMP的活性的蛋白变体，由此完成本公开。
[技术方案]
本公开的一个目的是提供具有输出IMP的活性的蛋白变体。
本公开的另一个目的是提供编码本公开的蛋白变体的多核苷酸。
本公开的又另一个目的是提供包含本公开的多核苷酸的载体。
本公开的又另一个目的是提供产生IMP的微生物，其中所述微生物包含本公开的蛋白变体和本公开的载体。
本公开的又另一个目的是提供用于制备IMP的方法，其包括在培养基中培养本公开的棒杆菌属的微生物，和从微生物或培养基回收IMP。
本公开的又另一个目的是提供用于增加IMP的输出的方法，其包括增强棒杆菌属的微生物中输出IMP的蛋白的活性的步骤。
为了实现上述目的，本公开的一个方面提供了具有输出IMP的活性的蛋白变体。
如本文所用，术语“输出5′-肌苷一磷酸(IMP)的蛋白”是指参与IMP的细胞外输出的蛋白。为了本公开的目的，该术语可以与具有输出IMP的活性的蛋白、IMP输出蛋白、能够输出IMP的蛋白、IMP-输出蛋白等互换使用；具体地，所述蛋白可以表示为ImpE，更具体地，ImpE1或ImpE2，并且甚至更具体地，本公开的输出蛋白可以表示为ImpE2，但蛋白的表示不限于此。此外，所述蛋白可以源自棒杆菌属的微生物，且特别是源自停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)，但微生物不限于此。
所述蛋白可以是包含由SEQ ID NO:2所代表的氨基酸序列的蛋白，或者由SEQ IDNO:2所代表的氨基酸序列组成的蛋白，但可以包括且不限于具有与所述蛋白相同的活性的任何序列，并且本领域普通技术人员可以从NCBI的GenBank(众所周知的数据库)获得序列信息。此外，输出IMP的本公开的蛋白可以是包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ IDNO:2的序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同源性或同一性的氨基酸序列的蛋白。此外，显而易见的是，具有在序列的一部分中具有缺失、突变、取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白也可以包括在本公开的范围内，只要所述氨基酸序列具有上述同源性或同一性并具有对应于所述蛋白的作用。
也就是说，尽管在本公开中描述为“具有由特定SEQ ID NO代表的氨基酸序列的蛋白”或“由特定SEQ ID NO组成的蛋白”，但显而易见的是，氨基酸序列具有一些氨基酸的缺失、修饰、取代、保守取代或添加的蛋白也落在本发明的范围内，只要所述蛋白具有与相应的SEQ ID NO的氨基酸序列组成的蛋白相同或等效的活性。例如，只要所述蛋白具有与本公开的蛋白变体相同或等效的活性，则上述表述不排除不改变蛋白的功能的氨基酸序列上游或下游的序列添加，其中的天然存在的突变，其中的沉默突变，或保守取代，且甚至在如此的序列添加或突变的情况下也是如此，显而易见的是该蛋白也属于本公开的范围。
在本公开中，“同源性”和“同一性”是指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关程度，并且可以表示为百分比。
术语“同源性”和“同一性”经常彼此互换使用。
保守多核苷酸或多肽序列的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法确定，并且可以用由所使用的程序建立的默认空位罚分使用。基本上，同源或相同的多核苷酸或多肽通常可以在中等或高严格性下沿着整个长度或在整个长度的至少约50%、约60%、约70%、约80%或约90%或更高进行杂交。在杂交中，还考虑包括简并密码子而不是密码子的多核苷酸。
任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以例如使用已知的计算机算法诸如使用默认参数的“FASTA”程序(例如，Pearson等人, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444)来确定。或者，其可以使用以下来确定：Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453)（其在EMBOSS包的Needleman程序(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人, 2000, Trends Genet.16:276-277) (版本5.0.0或其后的版本) (GCG程序包(Devereux, J., 等人, Nucleic Acids Research 12:387 (1984))中进行）、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul, [S.] [F.] 等人, J Molec Bio 215]: 403 (1990); Guide toHuge Computers, Martin J. Bishop, [编,] Academic Press, San Diego, 1994, 和[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073)。例如，可以使用NationalCenter for Biotechnology Information (NCBI)的BLAST或ClustalW来确定同源性、相似性或同一性。
多核苷酸或多肽序列的同源性、相似性或同一性可以通过使用例如如所公开的GAP计算机程序(例如，Smith和Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482)比较序列信息来确定。简而言之，GAP程序将同源性或同一性定义为通过将相似比对的符号(即，核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短者的符号的总数获得的值。GAP程序的默认参数可以包括：(1)一元比较矩阵(对于同一性，含有值1，且对于非同一性，含有值0)和Gribskov等人(1986) Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff, 编, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation,pp.353-358, 1979中所公开；(2)每个空位的罚分为3.0，且每个空位中的每个符号的额外罚分为0.10(或空位开放罚分为10，且空位延长罚分为0.5)；和(3)末端空位没有罚分。因此，如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指序列之间的相关性。
如本文所用，术语“变体”是指在一个或多个氨基酸的保守取代和/或改变中不同于所述序列、但保留蛋白的功能或特性的多肽。变体与鉴定的序列的不同之处在于通过几个氨基酸取代、缺失或添加来区分。通常可以通过改变多肽序列的一个氨基酸和评估变体的特性来鉴定此类变体。也就是说，与天然蛋白的能力相比，变体蛋白的能力可以增加、不变或降低。此外，一些改变的多肽可以包括其中去除一个或多个部分(例如，N-末端前导序列、跨膜结构域等)的改变的多肽。其他变体可以包括其中已从成熟蛋白的N-和/或C-末端除去小部分的变体。如本文所用，术语“保守取代”是指用另一种具有相似结构和/或化学特性的氨基酸替代一个氨基酸。所述变体可以具有例如一个或多个保守取代，同时仍保留一种或多种生物活性。这种氨基酸取代通常可以基于极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。例如，带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；且带负电荷的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；且疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸和色氨酸。
此外，所述变体还可以包括氨基酸的缺失或添加，其对多肽的特性和二级结构具有最小影响。例如，所述多肽可以在蛋白的N-末端与信号(或前导)序列缀合，所述信号(或前导)序列参与蛋白的共翻译或翻译后转移。所述多肽还可以与另一序列或接头缀合，以实现多肽的鉴定、纯化或合成。
具体地，本公开的具有输出IMP的活性的蛋白变体可以是具有这样的氨基酸序列的蛋白变体，其中，从SEQ ID NO:2的氨基酸序列的N末端起，至少一个选自第123个氨基酸、第243个氨基酸、第387个氨基酸、第405个氨基酸；第413个氨基酸和第458个氨基酸的氨基酸被另一氨基酸取代，但氨基酸取代不限于此。
例如，本公开的具有输出IMP的活性的蛋白变体可以是具有IMP-输出活性的蛋白变体，其可以是这样的蛋白变体，所述蛋白变体从SEQ ID NO:2的氨基酸序列的N末端起，具有用半胱氨酸取代第123个氨基酸(即，F123C)；用缬氨酸取代第243个氨基酸(即，I243V)；用苏氨酸取代第387个氨基酸(即，S387T)；用酪氨酸取代第405个氨基酸(即，F405Y)；用苏氨酸取代第413个氨基酸(即，M413T)；用赖氨酸取代第458个氨基酸(即，N458K)；或其组合，但氨基酸取代不限于此。更具体地，具有输出IMP的活性的蛋白变体可以是这样的蛋白，其具有选自SEQ ID NO: 73、74、75、76、77、78、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153和155的氨基酸序列，或与这些氨基酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%或更高的同源性的氨基酸序列。此外，显而易见的是，具有氨基酸序列(其中氨基酸序列的一部分被缺失、修饰、取代或添加)的任何蛋白也可以用作本公开的蛋白，只要所述氨基酸序列具有上述序列同源性，并显示与上述多肽的作用相同的作用。
此外，本公开的具有输出IMP的活性的蛋白变体可以是由这样的氨基酸序列组成的蛋白变体，所述氨基酸序列从SEQ ID NO:2的氨基酸序列的N-末端起，进一步包含用另一氨基酸取代第2个氨基酸，用另一氨基酸取代第64个氨基酸，或其组合。具体地，本公开的具有输出IMP的活性的蛋白变体可以是这样的蛋白变体，所述蛋白变体从SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的N-末端起，进一步包含用异亮氨酸取代第2个氨基酸，用谷氨酸或天冬氨酸取代第64个氨基酸，或其组合。
“用另一氨基酸取代”不受限制，只要其他氨基酸是与取代前的氨基酸不同的氨基酸。例如，当SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的N-末端起的第2个氨基酸被另一氨基酸取代时，另一氨基酸不受限制，只要所述另一氨基酸是除了缬氨酸以外的氨基酸，并且当SEQ IDNO:2的氨基酸序列中的N-末端起的第64个氨基酸被另一氨基酸取代时，另一氨基酸不受限制，只要所述另一氨基酸是除了甘氨酸以外的氨基酸。
本公开的另一个方面提供了编码本公开的蛋白变体的多核苷酸，或含有本公开的多核苷酸的载体。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指核苷酸的聚合物，其中核苷酸单体通过共价键在长链中延伸并且其具有长于某一长度的DNA链或RNA链。
关于本公开的多核苷酸，基于密码子简并性，显而易见的是，由SEQ ID NO: 73、74、75、76、77、78、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153或155的氨基酸序列组成的蛋白，或可以翻译成与上述蛋白具有同源性的蛋白的多核苷酸也可以包括在本公开的范围内。例如，本公开的多核苷酸可以是具有SEQ ID NO: 79、80、81、82、83、84、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154或156的碱基序列的多核苷酸序列，且更具体地，由SEQ ID NO: 79、80、81、82、83、84、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154或156的碱基序列组成的多核苷酸。此外，可以包括且不限于编码具有具有SEQ ID NO: 73、74、75、76、77、78、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153或155的氨基酸序列的蛋白的活性的蛋白的任何序列，其通过在严格条件下与可以从已知基因序列(例如，与上述核苷酸序列的全部或部分互补的序列)制备的探针杂交来测定。
术语“严格条件”是指使多核苷酸之间的特异性杂交成为可能的条件。此类条件在参考文献(例如，J. Sambrook等人，同上)中具体描述。例如，所述条件可以包括在具有高同源性、40%或更高、具体地90%或更高、更具体地95%或更高、甚至更具体地97%或更高且最具体地99%或更高的同源性的基因之间进行杂交，而不在具有低于上述同源性的同源性的基因之间进行杂交；或者在用于southern杂交的60℃、1×SSC和0.1%SDS的常规洗涤条件、具体地在对应于60℃、0.1×SSC和0.1% SDS、且更具体地68℃、0.1×SSC和0.1% SDS的盐浓度和温度下进行一次、具体地两次或三次杂交。
杂交需要两个核酸具有互补序列，尽管取决于杂交的严格性，碱基之间的错配可以是可能的。术语“互补”用于描述可以互相可杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺苷与胸腺嘧啶互补，且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可以包括与整个序列互补的分离的核酸片段以及实质上相似的核酸序列。
具体地，可以使用包括杂交步骤的杂交条件且使用上述条件来在55℃的Tm值下检测具有同源性的多核苷酸。此外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以根据预期目的由本领域普通技术人员适当地调整。
适合于多核苷酸的杂交的严格性取决于多核苷酸的长度和互补性，并且相关变量是本领域众所周知的(参见Sambrook等人，同上，9.50至9.51和11.7至11.8)。
在本公开中，编码具有IMP输出活性的蛋白的氨基酸序列的多核苷酸可以是impE2基因，并且多核苷酸的解释如上所述。
在本公开中，编码具有IMP-输出活性的蛋白变体的多核苷酸的解释也如上所述。
如本文所用，术语“载体”是指包含编码靶蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，其中所述靶蛋白与合适的控制序列可操作连接，使得靶蛋白可以在适当的宿主中表达。所述控制序列可以包括能够起始转录的启动子，用于控制转录的任何操纵子序列，编码适当的mRNA核糖体结合结构域的序列，以及控制转录和翻译的终止的序列。在转化至合适的宿主细胞后，所述载体可以独立于宿主基因组复制或发挥功能，或者可以整合至宿主基因组本身中。
本公开中使用的载体可以没有具体限制，只要所述载体在宿主细胞中可复制，并且其可以使用本领域已知的任何载体进行构建。载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和细菌噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等，并且作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等。
在一个实施方案中，编码靶蛋白的多核苷酸可以使用用于插入细胞中的染色体的载体用染色体内的改变的多核苷酸(变体)替换。可以使用本领域已知的方法(例如通过同源重组)进行多核苷酸插入染色体，但不限于此。具体而言，可以进一步包括用于证实插入染色体的选择标记。所述选择标记用于选择转化的细胞，即，为了证实是否已经插入靶核酸，并且可以使用能够提供可选择的表型(诸如耐药性、营养物需求、对细胞毒性剂的抗性和表面蛋白的表达)的标记。在处理选择性试剂的情况下，只有能够表达选择标记的细胞才可以存活或表达其他表型性状，且因此可以容易地选择转化的细胞。
本公开的又另一个方面提供了可以产生IMP的微生物，其包含本公开的蛋白变体、编码本公开的蛋白变体的多核苷酸、或本公开的载体。具体地，本公开的微生物可以是通过使用含有编码本公开的蛋白变体的多核苷酸的载体进行转化而制备的微生物，但所述微生物不限于此。
如本文所用，术语“转化”是指这样的过程：将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞，由此使得由所述多核苷酸编码的蛋白能够在宿主细胞中表达。对于转化的多核苷酸，其是否插入宿主细胞的染色体并位于其中或位于染色体外是无关紧要的，只要转化的多核苷酸可以在宿主细胞中表达。此外，所述多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。所述多核苷酸可以以任何形式插入，只要可以将其引入宿主细胞并在其中表达。例如，所述多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞，所述表达盒是包含自主表达所需的所有必需元件的基因构建体。所述表达盒可以常规地包含与多核苷酸可操作连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。所述表达盒可以呈自我复制的表达载体的形式。此外，可以将所述多核苷酸原样引入宿主细胞中，并且与宿主细胞中其表达所必需的序列可操作连接，但不限于此。
此外，如本文所用，术语“可操作连接”是指启动子序列（其起始并介导编码靶蛋白(即，本公开的缀合物)的多核苷酸的转录）和上述基因序列之间的功能性连接。
如本文所用，术语“产生IMP的微生物”是指天然能够产生IMP的微生物；或其亲本菌株不能天然产生和/或输出IMP但其被提供有产生或输出IMP的能力的微生物。在本公开中，产生IMP的微生物可以与输出IMP的微生物或具有输出IMP的活性的微生物可互换使用。
产生IMP的微生物是宿主细胞或微生物，其包含具有输出IMP的活性的蛋白变体或编码所述蛋白变体的多核苷酸，或者其用含有编码所述蛋白变体的多核苷酸的载体转化，并且由此能够表达所述蛋白变体。具体地，本公开的微生物可以是埃希氏菌属的微生物，沙雷氏菌属的微生物，欧文氏菌属的微生物，肠杆菌属的微生物，沙门氏菌属的微生物，链霉菌属的微生物，假单胞菌属的微生物，短杆菌属的微生物，棒杆菌属的微生物等，且更具体地，本公开的微生物可以是棒杆菌属的微生物。
如本文所用，术语“产生IMP的棒杆菌属的微生物”是指棒杆菌属的微生物，其天然能够产生IMP或能够通过突变产生IMP。具体地，如本文所用，能够产生IMP的棒杆菌属的微生物可以是能够产生IMP的棒杆菌属的微生物的天然菌株；或通过插入与IMP产生相关的基因或通过增强或减弱与IMP产生相关的内源基因而制备的具有增强的产生IMP的能力的棒杆菌属的微生物。更具体地，在本公开中，能够产生IMP的棒杆菌属的微生物可以是这样的棒杆菌属的微生物，其通过包含具有输出IMP的活性的蛋白变体或编码所述蛋白变体的多核苷酸或通过用含有编码所述蛋白变体的多核苷酸的载体转化而具有提高的产生IMP的能力。“具有增强的产生IMP的能力的棒杆菌属的微生物”可以是这样的棒杆菌属的微生物，与转化前的其亲本菌株或棒杆菌属的未修饰微生物的相比，其具有提高的产生IMP的能力。“棒杆菌属的未修饰微生物”可以是棒杆菌属的微生物的天然类型，或不含能够输出IMP的蛋白变体的棒杆菌属的微生物，或未用含有编码能够输出IMP的蛋白变体的多核苷酸的载体转化的棒杆菌属的微生物。
在本公开的一个实施方案中，本公开的微生物可以是其中腺苷酸琥珀酸合成酶和/或IMP脱氢酶的活性进一步减弱的微生物。
具体地，本公开的微生物可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)或停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)，但所述微生物不限于此。
本公开的又另一个方面提供了用于制备IMP的方法，其包括在培养基中培养本公开的产生IMP的棒杆菌属的微生物。
具体地，本公开的方法可以进一步包括从本公开的微生物或本公开的培养基回收IMP的步骤。
在本公开的上述方法中，微生物的培养可以以本领域已知的分批方法、连续方法、补料分批方法等进行，但培养方法不特别限于此。具体而言，关于培养条件，可以将培养物的pH调节至合适的pH(例如，pH 5至9，具体地pH 6至8，并且最特别地用适当的碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)，并且培养的需氧条件可以通过向培养物中引入氧气或含氧气体混合物来维持。培养温度可以通常在20℃至45℃、且特别是25℃至40℃的范围内，持续约10至160小时，但培养条件不限于此。通过上述培养产生的IMP可以分泌至培养物中或可以保留在细胞中。
此外，待在培养基中使用的碳源的实例可以包括糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)；油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)；脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)；醇类(例如，甘油和乙醇)；和有机酸(例如，乙酸)，但不限于此。这些碳源可以单独使用或组合使用，但不限于此。待在培养基中使用的氮源的实例可以包括含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等。这些氮源可以单独使用或组合使用，但不限于此。待在培养基中使用的磷源的实例可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、相应的含钠盐等，但不限于此。此外，培养基中可以含有金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸、维生素等，其为必需的生长促进材料。
在本公开中，用于回收在培养的步骤中产生的IMP的方法可以通过使用本领域已知的适当方法从培养液收集IMP来进行。例如，可以使用方法诸如离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且可以使用本领域已知的适当方法从培养物或培养的微生物回收期望的IMP。
进一步，回收步骤可以包括纯化过程，并且可以使用本领域已知的适当方法进行。因此，待回收的IMP可以为纯化形式或含有IMP的微生物发酵液。
本公开的又另一个方面提供了用于产生IMP的组合物，其含有本公开的能够输出IMP的蛋白变体或编码所述蛋白变体的多核苷酸。
本公开的组合物可以非限制性地进一步含有能够操作所述多核苷酸的任何组成。在本公开的组合物中，所述多核苷酸可以呈这样的形式，其中所述多核苷酸包含在载体中，使得可操作连接的基因可以在其中引入所述多核苷酸的宿主细胞中表达。
此外，所述组合物可以进一步含有用于产生IMP的组合物中常规使用的任何适当的赋形剂(例如，防腐剂、保湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂等)，但适当的赋形剂不限于此。
本公开的又另一个方面提供了本公开的蛋白变体用于增加棒杆菌属的微生物中IMP产生的用途。
本公开的又另一个方面提供了用于增加IMP的输出的方法，其包括在棒杆菌属的微生物中增强由SEQ ID NO:2组成的蛋白的活性。具体地，可以通过引入、应用或包含能够输出IMP的蛋白变体来进行由SEQ ID NO:2组成的蛋白的活性的增强，其中所述蛋白变体由这样的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列从SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的N-末端起，具有用另一氨基酸取代第123个氨基酸，用另一氨基酸取代第243个氨基酸，用另一氨基酸取代第387个氨基酸，用另一氨基酸取代第405个氨基酸；用另一氨基酸取代第413个氨基酸，用另一氨基酸取代第458个氨基酸，或其组合。术语“能够输出IMP的蛋白”、“能够输出IMP的蛋白变体”和“棒杆菌属的微生物”如上所述。
本公开的又另一个方面提供了本公开的蛋白变体用于增加棒杆菌属的微生物中IMP的输出的用途。
[发明的有利效果]
可以通过培养使用能够输出IMP的蛋白变体的产生IMP的棒杆菌属的微生物以高产率产生IMP。
[发明详述]
将如下详细描述本公开。同时，本文公开的每个解释和示例性实施方案都可以应用于其他各自的解释和示例性实施方案。也就是说，本文公开的各种因素的所有组合都属于本公开的范围。此外，本公开的范围不应受下文提供的具体公开内容的限制。
实施例1：IMP输出蛋白的发现
制备停滞棒杆菌ATCC6872的基因组DNA文库，用于鉴定参与IMP的输出的棒杆菌的膜蛋白。然后，由于棒杆菌的野生型菌株不能产生IMP，或者即使其确实产生IMP，但其仅产生少量IMP，所以制备了衍生自ATCC6872菌株的能够产生IMP的被称为CJI0323的菌株，用于鉴定产生IMP的能力。使用ATCC6872菌株的基因组DNA文库，对制备的CJI0323菌株进行参与IMP输出的膜蛋白的筛选。实验的具体细节如下。
实施例1-1：产生IMP的菌株CJI0323的选择
将ATCC6872细胞以107个细胞/mL至108个细胞/mL的浓度悬浮于磷酸盐缓冲液(pH7.0)或柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)中，以制备ATCC6872衍生的产生IMP的菌株，并将细胞进行UV处理并置于室温或32℃下20至40分钟以诱导突变。将所得细胞用0.85%盐水溶液洗涤两次，且然后稀释并铺板在培养基上，所述培养基通过向含有1.7%琼脂的基本培养基中以适当浓度添加提供抗性的物质来制备，并且其后获得菌落。将每个菌落在营养培养基中培养，并在种子培养基中培养24小时。在发酵培养基中培养菌落3至4天之后，选择在培养基中积累的具有产生的IMP的最高量的菌落。在制备能够以高浓度产生IMP的菌株的过程中，为了提供腺嘌呤营养缺陷型、鸟嘌呤渗漏型、溶菌酶敏感性、3,4-二氢脯氨酸抗性、链霉素抗性、氮杂环丁烷羧酸抗性、硫代脯氨酸抗性、重氮丝氨酸抗性、磺胺胍抗性、正缬氨酸抗性和甲氧苄啶抗性，对于每种物质，依次进行上述程序。作为结果，最终选择显示对上述物质的抗性和优异的产生IMP的能力的CJI0323。比较ATCC6872和CJI0323之间的抗性程度，并且结果显示于下表1中。
[表1]
特征 <i>ATCC6872</i> <i>CJI0323</i>
腺嘌呤营养缺陷型 非营养缺陷型 营养缺陷型
鸟嘌呤渗漏型 非营养缺陷型 渗漏营养缺陷型
溶菌酶敏感性 80 µg/mL 8 µg/mL
3,4-二氢脯氨酸抗性 1000 µg/mL 3500 µg/mL
链霉素抗性 500 µg/mL 2000 µg/mL
氮杂环丁烷羧酸抗性 5 mg/mL 30 mg/mL
硫代脯氨酸抗性 10 µg/mL 100 µg/mL
重氮丝氨酸抗性 25 µg/mL 100 µg/mL
磺胺胍抗性 50 µg/mL 200 µg/mL
正缬氨酸抗性 0.2 mg/mL 2 mg/mL
甲氧苄啶抗性 20 µg/mL 100 µg/mL
-基本培养基：2%葡萄糖，0.3%硫酸钠，0.1% KH2SO4，0.3% K2HPO4，0.3%硫酸镁，氯化钙(10 mg/L)，硫酸铁(10mg/L)，硫酸锌(1 mg/L)，氯化锰(3.6 mg/L)，L-半胱氨酸(20mg/L)，泛酸钙(10 mg/L)，盐酸硫胺素(5 mg/L)，生物素(30 μg/ L)，腺嘌呤(20 mg/L)，鸟嘌呤(20 mg/L)，pH 7.3
- 营养培养基：1%蛋白胨，1%肉汁，0.25%氯化钠，1%酵母提取物，2%琼脂，pH 7.2
- 种子培养基：1%葡萄糖，1%蛋白胨，1%肉汁，1%酵母提取物，0.25%氯化钠，腺嘌呤(100 mg/L)，鸟嘌呤(100 mg/L)，pH 7.5
-发酵培养基：0.1%谷氨酸钠，1%氯化铵，1.2%硫酸镁，0.01%氯化钙，硫酸铁(20mg/L)，硫酸锰(20 mg/L)，硫酸锌(20 mg/L)，硫酸铜(5 mg/L)，L-半胱氨酸(23 mg/L)，丙氨酸(24 mg/L)，烟酸(8 mg/L)，生物素(45 μg/L)，盐酸硫胺素(5 mg/L)，腺嘌呤(30 mg/L)，1.9%磷酸(85%)，2.55%葡萄糖，1.45%果糖。
实施例1-2：关于CJI0323的发酵滴度的实验
将种子培养基(2 mL)分配至试管(直径：18 mm)中，然后将其高压灭菌，并将各自用ATCC6872和CJI0323接种。其后，将所得物在30℃下振荡培养24小时，且然后用作种子培养溶液。将发酵培养基(29 mL)分配至Erlenmeyer烧瓶(250 mL)中用于振荡，在121℃下高压灭菌15分钟，并向其中接种种子培养溶液(2 mL)并培养3天。培养条件被设定至170 rpm，30℃，和pH 7.5。
在完成培养后，通过HPLC (SHIMAZDU LC20A)测量产生的IMP的量，并且培养的结果显示于下表2中。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
CJI0323菌株被命名为停滞棒杆菌 CN01-0323，其在2017年11月7日保藏至韩国微生物保藏中心(KCCM)(布达佩斯条约下的国际保藏机构)，并指定登记号KCCM12151P。
实施例1-3：输出蛋白的发现
通过向含有1.7%琼脂的基本培养基中额外添加IMP来建立显示CJI0323菌株的生长抑制的筛选条件。通过电穿孔(van der Rest等人，1999)将ATCC6872菌株的基因组文库的质粒转化至CJI0323菌株中，并且选择其中在补充有过量IMP的培养基条件下释放生长抑制的那些菌落。从选择的菌落获得质粒，并通过测序技术分析。作为结果，在其中添加过量IMP的条件下鉴定参与释放生长抑制的一种膜蛋白。
基于SEQ ID NO:2的氨基酸序列和SEQ ID NO:4的核苷酸序列(NCBI GenBank:NZ_CP014279，WP_066795121，MFS转运蛋白)鉴定一种来自棒杆菌的膜蛋白。所述膜蛋白已知为MFS转运蛋白，但其具体功能尚未证实，并且进一步，其关于IMP输出的功能仍然未知。在本公开中，所述膜蛋白被命名为ImpE2(WT)。
实施例2：ImpE1和ImpE2的鉴定
实施例2-1：impE1和impE2的证实
为了检查膜蛋白ImpE2的功能，在NCBI (NCBI GenBank:NZ_CP014279，WP_066795121，MFS转运蛋白)中证实SEQ ID NO:4的基因结构。作为结果，证实SEQ ID NO:4(impE2)的ORF的7 bp起始部分与不同的基因(NCBI GenBank:NZ_CP014279，WP_066795119，转录调节蛋白)在7个核苷酸碱基中重叠，所述不同的基因位于impE2的上游。由于位于impE2的上游的基因和由该基因编码的蛋白的功能尚未证实，所以在本公开中，该蛋白被命名为ImpE1(WT)(SEQ ID NO:1的氨基酸序列和SEQ ID NO:3的核苷酸序列)。
实施例2-2：impE1-或impE2-缺陷的载体的制备
为了证实在产生IMP的菌株中ImpE1或ImpE2（其如实施例1和2-1中所鉴定的，参与释放由IMP引起的生长抑制）的缺失是否可以降低其IMP-输出能力，进行尝试以制备每种基因缺陷的载体。
使用ATCC6872菌株的基因组DNA作为模板，通过PCR获得用于制备载体的基因片段。
具体地，使用SEQ ID NO:5和6的引物以及SEQ ID NO:7和8的引物进行impE1的PCR；并且使用SEQ ID NO:9和10的引物以及SEQ ID NO:11和12的引物进行impE2的PCR(表3)。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
具体而言，使用的引物基于在NIH GenBank中登记的停滞棒杆菌(ATCC6872)(NCBI Genbank:NZ_CP014279)的基因和与其相邻的核苷酸序列的信息制备。
通过如下进行PCR：在94℃下初始变性5分钟；25个由以下组成的循环：在94℃下变性30秒，在52℃下退火3分钟，和在72℃下聚合1分钟；和最后在72℃下聚合5分钟。
使用impE1基因的两个片段(其使用SEQ ID NO:5和6的引物以及SEQ ID NO:7和8的引物进行扩增)作为模板进行重叠PCR，并且作为结果，获得多核苷酸模板(1.8 kbp)。将获得的基因片段克隆至用限制性酶(XbaI)消化的线性化的pDZ载体(韩国专利号10-0924065和国际专利公开号2008-033001)中，并使用T4连接酶连接，且由此制备pDZ-Δ impE1载体。此外，使用impE2基因的片段(其使用SEQ ID NO:9和10的引物扩增)和impE2基因的两个片段(其使用SEQ ID NO:11和12的引物扩增)作为模板进行重叠聚合酶链式反应，并且作为结果，获得多核苷酸模板(1.7 kbp)。用限制性酶XbaI和SpeI消化获得的基因片段。使用T4连接酶将基因片段克隆至已经用限制性酶(XbaI)消化的线性化的pDZ载体中，且由此制备pDZ-ΔimpE2载体。
实施例2-3：impE1-和impE2-整合缺陷的载体的制备
由于编码参与释放由IMP引起的生长抑制的蛋白的impE1和impE2基因是重叠的，所以需要同时调节两个基因。因此，进行尝试以制备其中impE1和impE2两者均缺陷的载体。
对于impE1和impE2基因的PCR，使用SEQ ID NO:5和65的引物以及SEQ ID NO:66和12的引物。使用的引物基于在NIH GenBank中登记的停滞棒杆菌(ATCC6872) (NCBIGenbank:NZ_CP014279)的基因和与其相邻的核苷酸序列的信息制备。使用impE1基因的片段(其使用SEQ ID NO:5和65的引物扩增)和impE2基因的两个片段(其使用SEQ ID NO:66和12的引物扩增)作为模板进行重叠PCR，并且作为结果，获得多核苷酸模板(2.0 kbp)。分别用XbaI和SpeI消化获得的基因片段。使用T4连接酶将基因片段克隆至已经用限制性酶(XbaI)消化的线性化的pDZ载体中，且由此制备pDZ-ΔimpE1E2载体。
实施例2-4：impE1-和impE2-缺陷的菌株的制备
将实施例2-2中制备的两种质粒和实施例2-3中制备的一种质粒各自通过电穿孔转化至CJI0323菌株中(使用Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541至545中公开的转化方法)。在含有卡那霉素(25 mg/L)的培养基上选择其中通过同源序列的重组将载体插入染色体中的菌株。对选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO:5和8、SEQID NO:9和12以及SEQ ID NO:5和12的引物对进行PCR来证实最终转化的菌株中的遗传缺陷。
将选择的菌株命名为CJI0323_ΔimpE1、CJI0323_ΔimpE2和CJI0323_ΔimpE1E2。此外，评估这些菌株的产生IMP的能力。
将种子培养基(2 mL)分配至试管(直径：18mm)中，然后将其高压灭菌，各自用CJI0323、CJI0323_ΔimpE1、CJI0323_ΔimpE2和CJI0323_ΔimpE1E2接种，在30℃下振荡培养24小时，并用作种子培养溶液。将发酵培养基(29 mL)分配至Erlenmeyer烧瓶(250 mL)中用于振荡并在121℃下高压灭菌15分钟。然后，向其中接种种子培养溶液(2 mL)，并将所得物培养3天。培养条件被设定至170 rpm，30℃，和pH 7.5。
在完成培养后，通过HPLC测量产生的IMP的量，并且培养的结果显示于下表4中。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
将每种菌株中积累的IMP量与亲本菌株停滞棒杆菌 CJI0323的IMP量进行比较。作为结果，发现，如上表4中所示，与CJI0323菌株相比，在相同条件下菌株CJI0323_ΔimpE1、 CJI0323_ΔimpE2和CJI0323_ΔimpE1E2的IMP浓度降低约8g/L，证实了ImpE1和ImpE2是参与IMP输出的蛋白。
实施例3：产生IMP的菌株CJI0323的impE1和impE2的核苷酸序列的证实
在实施例1中以高浓度产生IMP的CJI0323菌株的情况下，所述菌株可能具有提高的IMP-输出能力，从而以高浓度产生IMP。因此，进行尝试以证实CJI0323菌株的impE1和impE2中存在任何突变。
通过聚合酶链式反应(下文称为“PCR”)扩增CJI0323菌株的染色体DNA。具体地，首先，通过使用CJI0323菌株的染色体DNA作为模板连同SEQ ID NO:13和14的引物(表5)重复28个由以下组成的循环来进行PCR：在94℃下变性1分钟，在58℃下退火30秒，以及在72℃下聚合2分钟，由此扩增约2.8 kbp的片段。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
在使用相同的引物分析核苷酸序列后，证实与野生型菌株ATCC6872的核苷酸序列相比，impE1基因的第490个核苷酸(即g)被‘a’取代。该取代表明存在突变，其中ImpE1蛋白的第164个氨基酸(即，谷氨酸)被赖氨酸取代。
此外，证实impE2基因的第4个核苷酸(即，g)被‘a’取代(这意味着impE1基因的第666个核苷酸(即，g)被‘a’取代)，并且impE1基因的第191个核苷酸(即，g)被‘a’取代。这些取代表明存在突变，其中ImpE2蛋白的第2个氨基酸(即，缬氨酸)(其对应于ImpE1蛋白的第222个氨基酸)被异亮氨酸取代；并且ImpE2蛋白的第64个氨基酸(即，甘氨酸)被谷氨酸取代。
将CJI0323菌株的impE1核苷酸命名为impE1_CJI0323 (SEQ ID NO: 87)，并且其蛋白被命名为ImpE1_CJI0323 (SEQ ID NO: 85)，而CJI0323菌株的impE2核苷酸被命名为impE2_CJI0323 (SEQ ID NO: 88)，并且其蛋白被命名为ImpE2_CJI0323 (SEQ ID NO:86)。
实施例4：impE1和impE2中的突变的恢复
实施例4-1：用于恢复impE1或impE2中的突变的载体的制备
在实施例3中，检查产生IMP的菌株CJI0323的impE1和impE2中是否存在任何突变。作为结果，证实impE1具有一个突变并且impE2具有两个突变。由于CJI0323菌株以高浓度产生IMP，所以所述突变非常可能是可以提高IMP输出能力的突变。因此，在将突变的impE1和impE2恢复至没有突变的天然野生型ImpE之后，进行以下实验以证实额外发现的蛋白变体是否具有提高的IMP-输出能力。
为了制备恢复载体，使用停滞棒杆菌 ATCC6872作为模板进行PCR。
使用SEQ ID NO:89和90的引物扩增的impE1impE2基因片段用限制性酶XbaI处理，并克隆至pDZ载体上的XbaI限制性位点中，且由此制备pDZ-impE1E2(WT)。
实施例4-2：在impE1或impE2中具有单个突变的载体的制备
将实施例4-1中制备的质粒通过电穿孔转化至CJI0323菌株中(使用Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541至545中公开的转化方法)。在含有卡那霉素(25mg/L)的培养基上选择其中通过同源序列的重组将载体插入染色体中的菌株。对选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO:89和90的引物对进行PCR，随后进行核苷酸测序分析，证实最终转化的菌株中的突变的恢复。制备的菌株被命名为CJI0323_impE1E2(WT)。
实施例5：impE2中的突变的发现
在通过实施例3的结果发现的三种突变中，选择具有最高IMP输出能力的突变，并且进行以下实验以发现与其相比具有更高IMP输出能力的突变。
实施例5-1：impE1E2突变中具有最高IMP输出能力的突变的选择
使用天然野生型菌株停滞棒杆菌 ATCC6872作为模板连同SEQ ID NO:91和92的引物以及SEQ ID NO:93和94的引物制备ImpE1基因中具有单个E164K突变的载体。使用使用SEQ ID NO:91和92的引物扩增的E164K-1基因片段和使用SEQ ID NO:93和94的引物扩增的两个E164K-2基因片段进行重叠PCR，且由此获得具有1.8 kbp多核苷酸的模板。将获得的基因片段用XbaI消化，并使用T4连接酶克隆至已经用XbaI消化的线性化pDZ载体中，且由此制备pDZ-impE1(E164K)载体。
使用ATCC6872菌株作为模板连同SEQ ID NO:91和95的引物以及SEQ ID NO:96和94的引物制备ImpE2基因中具有单个V2I突变的载体。使用使用SEQ ID NO:91和95的引物扩增的V2I-1基因片段和使用SEQ ID NO:96和94的引物扩增的两个V2I-2基因片段进行重叠PCR，且由此获得具有1.8 kbp多核苷酸的模板。将获得的基因片段用XbaI消化，并使用T4连接酶克隆至已经用XbaI消化的线性化pDZ载体中，且由此制备pDZ-impE2(V2I)载体。
使用ATCC6872菌株作为模板连同SEQ ID NO:91和97的引物以及SEQ ID NO:98和94的引物制备ImpE2基因中具有单个G64E突变的载体。使用使用SEQ ID NO:91和97的引物扩增的G64E-1基因片段和使用SEQ ID NO:98和94的引物扩增的两个G64E-2基因片段进行重叠PCR，且由此获得具有1.8 kbp多核苷酸的模板。将获得的基因片段用XbaI消化，并使用T4连接酶克隆至已经用XbaI消化的线性化pDZ载体中，且由此制备pDZ-impE2(G64E)载体。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
将实施例4-2中制备的三种质粒转化至CJI0323_impE1E2(WT)菌株中(使用Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541至545中公开的转化方法)。在含有卡那霉素(25mg/L)的培养基上选择其中通过同源序列的重组将载体插入染色体中的菌株。对选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO:13和14的引物对进行PCR，随后进行核苷酸测序分析，证实最终转化的菌株中的突变的引入。将选择的菌株命名为CJI0323_impE1(E164K)、CJI0323_impE2(V2I)和CJI0323_impE2(G64E)。
CJI0323_impE1(E164K)、停滞棒杆菌 CJI0323_impE2(V2I)和停滞棒杆菌 CJI0323_impE2(G64E)菌株在2018年11月2日保藏至韩国微生物保藏中心(KCCM)(布达佩斯条约下的国际保藏机构)，并分别指定登记号KCCM12359P、KCCM12360P和KCCM12361P。
将种子培养基(2 mL)分配至试管(直径：18mm)中，然后将其高压灭菌，各自用CJI0323_impE1E2(WT)、CJI0323_impE1(E164K)、CJI0323_impE2(V2I)和CJI0323_impE2(G64E)接种，在30℃下振荡培养24小时，并用作种子培养溶液。将发酵培养基(29 mL)分配至Erlenmeyer烧瓶(250 mL)中用于振荡并在121℃下高压灭菌15分钟。然后，向其中接种种子培养溶液(2 mL)，并将所得物培养3天。培养条件被设定至170 rpm，30℃，和pH 7.5。
在完成培养后，通过HPLC测量产生的IMP的量，并且培养的结果显示于下表7中。
Figure DEST_PATH_IMAGE006
如上所示，证实三种突变中的每一种都参与IMP输出，并且CJI0323_impE2(G64E)菌株在三种突变中具有最大量的IMP产生。
实施例5-2：用于在impE2突变中取代插入氨基酸的载体的制备
为了证实如上述结果中鉴定的具有增强的产生IMP的能力的代表性三种突变中impE2(G64E)突变的位置重要性，制备用于引入用不同氨基酸取代impE2的氨基酸序列中的第64个氨基酸的突变的载体。
制备用于引入ImpE2(G64E)突变的载体的程序如下。
基于报道的多核苷酸序列，分离停滞棒杆菌 CJI0323的染色体基因，并且通过使用停滞棒杆菌 CJI0323的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:15的引物和SEQ ID NO:16至33各自之间的引物对进行PCR来获得基因片段。通过如下进行PCR：在94℃下初始变性5分钟；20个由以下组成的循环：在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合1分钟；和最后在72℃下聚合5分钟。作为结果，获得18种1 kbp多核苷酸。
然后，分离停滞棒杆菌 CJI0323的染色体基因，并且通过使用停滞棒杆菌 CJI0323的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:34的引物和SEQ ID NO:35至52各自之间的引物对进行PCR来获得基因片段。通过如下进行PCR：在94℃下初始变性5分钟；20个由以下组成的循环：在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合1分钟；和最后在72℃下聚合5分钟。作为结果，获得18种1 kbp多核苷酸。
使用从上述结果获得的两个片段作为模板进行重叠PCR，且由此获得18种待用作模板的2 kbp多核苷酸。将获得的基因片段用限制性酶XbaI消化，连接至已经用限制性酶XbaI消化的线性化的pDZ载体，转化至大肠杆菌DH5α中，并将转化体铺板在含有卡那霉素(25 mg/L)的固体LB培养基上。
关于用于制备载体的引物的序列信息显示于下表8中。
Figure DEST_PATH_IMAGE007
Figure DEST_PATH_IMAGE008
在选择用其中插入靶基因的载体转化的菌落之后，使用常规已知的质粒提取方法获得质粒。关于获得的质粒的信息显示于下表9中。
Figure DEST_PATH_IMAGE009
实施例5-3：其中变体(ImpE2)的位置64的氨基酸被另一种氨基酸取代的菌株的制备，以及产生IMP的能力的比较
将实施例3-1中制备的18种质粒转化至CJI0323菌株中。在含有卡那霉素(25 mg/L)的培养基上选择其中通过同源序列的重组将载体插入染色体中的菌株。对选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO:13和14的引物对进行PCR，随后进行核苷酸测序分析，证实最终转化的菌株中的突变的引入。根据插入的突变的菌株名称显示于下表10中。
Figure DEST_PATH_IMAGE010
以与实施例2中相同的方式培养菌株，并分析来自其的IMP的浓度(表11)。
Figure DEST_PATH_IMAGE011
如上所示，与CJI0323_impE1E2(WT)菌株相比，所有修饰菌株均显示产生IMP的能力的增加，且因此，再次证实impE的第64个氨基酸突变是重要位点，其对ImpE蛋白就IMP输出而言的能力的增加具有显著影响。具体而言，在第64个氨基酸(即甘氨酸)被不同的氨基酸(即，天冬氨酸)取代的情况下，与在第64个氨基酸中没有突变的CJI0323_impE1(E164K)_ impE2(V2I)菌株的相比，输出IMP的能力增加172%。此外，证实了在第64个氨基酸(即甘氨酸)被不同的氨基酸(即，天冬氨酸)取代的情况下，产生IMP的能力与作为恢复至野生型菌株的菌株的CJI0323_impE1E2(WT)菌株相比提高397%，并且与CJI0323菌株相比提高20%。
实施例6：使用人工诱变的impE突变的文库
为了获得具有提高的输出IMP的能力的蛋白变体，通过以下方法制备用于染色体内第一次交换插入的载体文库。
在这方面，进行尝试以就CJI0323::impE2(G64D)菌株的impE2而言进行易错PCR，其通过实施例5-3的结果证实具有最大的输出IMP的能力。为了在CJI0323::G64D菌株所具有的氨基酸序列中在其第64个氨基酸下游位置处引入突变，获得impE基因变体(1.6 kbp)，其中核苷酸取代从impE2的第193个核苷酸随机引入至其下游约130 bp。使用DiversifyPCR随机诱变试剂盒(Clontech)进行易错PCR，并使用CJI0323::impE2(G64D)菌株的基因组DNA作为模板以及SEQ ID NO: 53和SEQ ID NO: 54的引物对(表12)通过PCR获得基因片段。
Figure DEST_PATH_IMAGE012
将突变以0至3.5个突变/1 kb每个基因片段的量引入扩增的基因片段。通过如下进行PCR：在94℃下初始变性5分钟；30个由以下组成的循环：在94℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，和在72℃下聚合1分钟36秒；和最后在72℃下聚合5分钟。作为结果，获得1.6 kbp多核苷酸。
使用pCR2.1-TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)将扩增的基因片段连接至pCR2.1- TOPO载体，转化至大肠杆菌DH5α中，并将转化体铺板在含有卡那霉素(25 mg/L)的固体LB培养基上。选择20种转化的菌落，并从中获得质粒。在分析这些质粒的多核苷酸序列之后，证实突变以3.5个突变/ kb的频率在不同位置引入。选择约20,000个转化的大肠杆菌菌落并提取其质粒。所得文库被命名为pTOPO_impE文库。
实施例7：其中插入impE文库载体的菌株的选择
将实施例6中制备的pTOPO_impE文库载体通过电穿孔转化至能够以高浓度产生IMP的CJI0323::impE2(G64D)菌株中，并将转化体铺板在含有卡那霉素(25 mg/L)的营养培养基上。作为结果，获得10,000个菌株，其中插入了修饰基因，并且这些菌落被命名为CJI0323::impE2(G64D)/pTOPO_impE(mt)1至CJI0323::impE2(G64D) /pTOPO_impE(mt)10000。
- 营养培养基：1%蛋白胨，1%肉汁，0.25%氯化钠，1%酵母提取物，2%琼脂，pH 7.2
- 种子培养基：1%葡萄糖，1%蛋白胨，1%肉汁，1%酵母提取物，0.25%氯化钠，腺嘌呤(100 mg/L)，鸟嘌呤(100 mg/L)，pH 7.5
-发酵培养基：0.1%谷氨酸钠，1%氯化铵，1.2%硫酸镁，0.01%氯化钙，硫酸铁(20mg/L)，硫酸锰(20 mg/L)，硫酸锌(20 mg/L)，硫酸铜(5 mg/L)，L-半胱氨酸(23 mg/L)，丙氨酸(24 mg/L)，烟酸(8 mg/L)，生物素(45 μg/L)，盐酸硫胺素(5 mg/L)，腺嘌呤(30 mg/L)，1.9%磷酸(85%)，2.55%葡萄糖，1.45%果糖
将获得的10,000个菌落各自用高压灭菌的种子培养基(200 μL)接种，在微孔板振荡器(TAITEC)的96-深孔板中以1,200 rpm在30℃下振荡培养24小时，并用作种子培养溶液。将高压灭菌的发酵培养基(290 μL)分配至96-深孔板中，并向其中接种种子培养溶液(200μL)，并将所得物在与上述相同的条件下振荡培养72小时。
为了分析培养溶液中产生的IMP的量，在培养完成后，将培养溶液的上清液(3 μL)转移至96-孔UV板中，其中已经向每个孔中分配蒸馏水(197 μL)。然后，将所得物使用微孔板振荡器(TAITEC)在25℃下振荡30秒，并使用分光光度计测量270 nm处的吸光度。将上述吸光度与CJI0323::impE2(G64D)菌株的吸光度进行比较后，选择显示吸光度增加10%或更高的菌株的50个菌落。与对照的吸光度相比，其他菌落显示相似或降低的吸光度。
通过使用相同的方法测量它们的吸光度，重复证实选择的50个菌株中产生的IMP的量，并且作为结果，选择与CJI0323::impE2(G64D)菌株的相比产生IMP的能力提高的前四个菌株。
实施例8：选自impE2突变文库的菌株的产生IMP的能力的证实
为了比较实施例7中选择的四种菌株的产生IMP的能力，通过以下方法培养这四种菌株，并分析所得培养溶液的组分。
将与实施例2中相同的种子培养基(5 mL)分配至高压灭菌的试管(直径：18 mm)中并在30℃下振荡培养24小时以用作种子培养溶液。将与实施例2中相同的发酵培养基(29mL)分配至Erlenmeyer烧瓶(250 mL)中用于振荡并在121℃下高压灭菌15分钟。然后，向其中接种种子培养溶液(2 mL)，并将所得物培养4至5天。培养条件被设定至170 rpm，30℃，和pH 7.5。在完成培养后，通过HPLC测量产生的IMP的量。
在这五十种菌株中，选择就产生IMP的能力而言的前四种菌株，并且重复进行培养和分析。分析的IMP的浓度显示于下表13中。
Figure DEST_PATH_IMAGE013
作为IMP浓度分析的结果，证实与对照菌株CJI0323::impE2(G64D)的相比，四种选择的菌株的IMP的浓度显示17%的最大增加。
实施例9：具有impE2突变的选择菌株中impE2基因突变的证实
为了证实引入实施例8中选择的四种菌株的impE2基因的突变，分析impE2突变的多核苷酸序列。为了测定这些多核苷酸序列，使用SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物对进行PCR。
对上面获得的修饰的impE2基因片段的每个多核苷酸序列进行分析。将这些多核苷酸序列与impE2 (WT)的SEQ ID NO:4或impE2 (CJHB101::G64D)的SEQ ID NO:100进行比较，并且作为结果，证实了修饰的impE2的氨基酸序列。关于选择的菌株中impE2的氨基酸序列突变的信息显示于下表14中。
Figure DEST_PATH_IMAGE014
实施例10：具有impE2突变的用于插入染色体的载体的制备
为了证实在实施例9中鉴定的impE2突变的应用的效果，制备了能够将这些impE2突变引入染色体的载体。载体制备过程如下。
仅制备包括表14中所示的文库突变(排除impE2(G64D)突变)的载体。具体地，分离停滞棒杆菌 ATCC6872的染色体基因，并使用SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57、59、61和63各自之间的引物对通过PCR获得基因片段。通过如下进行PCR：在94℃下初始变性5分钟；20个由以下组成的循环：在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合1分钟；和最后在72℃下聚合5分钟，以获得PCR片段。
使用四种选择的菌株的每个染色体作为模板连同SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:58、60、62和64各自之间的引物对通过PCR获得基因片段。通过如下进行PCR：在94℃下初始变性5分钟；20个由以下组成的循环：在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合1分钟30秒；和最后在72℃下聚合5分钟，以获得PCR片段。使用两个片段进行重叠PCR，并用限制性酶(XbaI)消化获得的基因片段。使用T4连接酶将所得基因片段连接至已经用限制性酶(XbaI)消化的线性化的pDZ载体(韩国专利号10-0924065和国际专利公开号2008-033001)，转化至大肠杆菌DH5α中，并将转化体铺板在含有卡那霉素(25 mg/L)的固体LB培养基上。
为了制备具有单一突变的载体用于证实impE2的单一突变(S387T、M413T和N458K)的影响(其中整合选择的变体中的三种突变)，使用ATCC6872菌株作为模板连同SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:67、69和71各自之间的引物对进行PCR，且由此获得基因片段。然后，使用ATCC6872菌株作为模板连同SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:68、70和72各自之间的引物对进行PCR，且由此获得基因片段。使用上面制备的两个片段进行重叠PCR，并用限制性酶(XbaI)消化因此获得的基因片段。将所得基因片段使用T4连接酶连接至已经用限制性酶(XbaI)消化的线性化的pDZ载体，转化至大肠杆菌DH5α中，并将转化体铺板在含有卡那霉素的固体LB培养基上。
Figure DEST_PATH_IMAGE015
在选择用其中插入靶基因的载体转化的菌落之后，使用常规已知的质粒提取方法获得质粒。根据插入每种质粒的impE2的突变，质粒被命名为pDZ-impE2(S387T, M413T, N458K)、pDZ-impE2(F123C)、pDZ-impE2(I243V)、pDZ-impE2(F405Y)、pDZ-impE2(S387T)、pDZ-impE2(M413T)和pDZ-impE2(N458K)。
实施例11：基于野生型impE1、impE2的用impE2突变引入的菌株的制备及其产生 IMP的能力的比较
实施例10中制备的用于引入新型突变的四种载体(即pDZ-impE2(S387T, M413T, N458K)、pDZ-impE2(F123C)、pDZ-impE(I243V)和pDZ-impE2(F405Y))通过同源染色体的两步重组转化至CJI0323_impE1E2(WT)菌株中，其中停滞棒杆菌 CJI0323(实施例4中制备的产生IMP的菌株)的impE1E2恢复至WT。然后，通过多核苷酸的序列分析选择其中在染色体上引入impE2突变的菌株，并将菌株分别命名为CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(S387T, M413T, N458K)、CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F123C)、CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(I243V)和CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F405Y)。
停滞棒杆菌 CJI032_impE1E2(WT)_impE2(F123C)、停滞棒杆菌 CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(I243V)和停滞棒杆菌 CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F405Y)菌株于2018年11月2日保藏至韩国微生物保藏中心(KCCM)(布达佩斯条约下的国际保藏机构)，并且分别分配登记号KCCM12362P、KCCM12363P和KCCM12365P。
以与实施例7中相同的方式培养菌株，并分析它们的IMP浓度。在培养48小时之后，测量浓度(表16)。
Figure DEST_PATH_IMAGE016
就IMP浓度而言，证实了与CJI0323_impE1E2(WT)菌株的相比，四种新型修饰菌株显示44%的最大增加。由于本公开的ImpE蛋白的突变导致的IMP产生量的增加可以被解释为非常有意义的。
实施例12：基于CJI0323::impE2(G64D)的用impE2突变引入的菌株的制备及产生 IMP的能力的比较
实施例10中制备的用于引入新型突变的四种载体(即pDZ-impE2(S387T, M413T, N458K)、pDZ-impE2(F123C)、pDZ-impE(I243V)和pDZ-impE2(F405Y))通过同源染色体的两步重组转化至CJI0323_impE2(G64D)菌株(即产生IMP的菌株)中。然后，通过多核苷酸的序列分析选择其中在染色体上引入impE2突变的菌株，并且根据插入的impE2突变，将菌株分别命名为CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T, M413T, N458K)、CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C)、CJI0323::impE2(G64D)_impEp(I243V)和CJI0323::impE2(G64D)_impE2p(F405Y)。
以与实施例7中相同的方式培养菌株，并分析它们的IMP浓度(表17)。
Figure DEST_PATH_IMAGE017
就IMP浓度而言，证实了与CJI0323::impE2(G64D)菌株相比，四种新型修饰菌株显示17%的最大增加。由于本公开的ImpE蛋白的突变导致的IMP产生量的增加可以被解释为非常有意义的。
然后，将上述制备的七种载体(即，pDZ-impE2(S387T, M413T, N458K)、pDZ-impE2(F123C)、pDZ-impE(I243V)、pDZ-impE2(F405Y)、pDZ-impE2(S387T)、pDZ-impE2(M413T)和pDZ-impE2(N458K))单独或组合转化至CJI0323_impE1E2(WT)菌株或CJI0323::impE2(G64D)菌株中。将制备的菌株命名为CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(S387T)、CJI0323_ impE1E2(WT)_impE2(M413T)、CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(N458K)、CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K)) CJI0323::impE2(G64D)_ impE2(S387T)、CJI0323::impE2(G64D)_impE2(M413T)、CJI0323::impE2(G64D)_impE2(N458K)、CJI0323::impE2(G64D)_impE2(I243V, S387T, M413T, N458K)、CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T, F405Y, M413T, N458K)、CJI0323::impE2(G64D)_impE2(I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K)、CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C, S387T, M413T, N458K)和CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K)，并以与上述相同的方式测量其产生IMP的能力(表18)。
停滞棒杆菌 CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(S387T)、停滞棒杆菌 CJI0323_ impE1E2(WT)_impE2(M413T)和CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(N458K)菌株于2018年11月2日保藏至韩国微生物保藏中心(KCCM)(布达佩斯条约下的国际保藏机构)，并且分别分配登记号KCCM12364P、KCCM12366P和KCCM12367P。
Figure DEST_PATH_IMAGE018
如上表中所示，证实单一突变(即impE2(S387T)、impE2(M413T)和impE2(N458K))与野生型菌株的相比显示33.6%的最大增加，并且所有具有新型突变的组合的菌株都显示102.5%的最大增加。此外，当将单独的新型突变引入CJI0323::impE2(G64D)菌株中时，产生IMP的能力增加，如表17和18中所示，而当将突变的组合引入菌株中时，显示所述菌株具有更加提高的产生IMP的能力。具体而言，当将CJI0323::impE2(G64D)菌株的突变和新型突变整合至菌株中时，产生IMP的能力与野生型菌株的相比增加约515%，同时显示与CJI0323:: impE2(G64D)菌株的相比约24%增加。还证实，显示本公开中发现的新型突变甚至通过单一突变也增加产生IMP的能力，并且当组合引入这些突变时，产生IMP的能力甚至进一步增加。
实施例13：基于产生IMP的菌株的impE2的增强
实施例13-1：基于产生IMP的菌株的用impE2突变引入的菌株的制备
为了证实将impE2突变引入菌株的效果，制备产生IMP的菌株，其中对应于ATCC6872菌株中的IMP的降解途径的腺苷酸琥珀酸合成酶和IMP脱氢酶的活性得到减弱。通过在编码两种酶的两种基因purA和guaB的每个核苷酸序列中将第一碱基从‘a’改变为‘t’来改变起始密码子。其中两种基因的表达在ATCC6872菌株中减弱的菌株被命名为CJI9088。将实施例10中制备的pDZ-impE2(S387T, M413T, N458K)、pDZ-impE2(F123C)、pDZ-impE(I243V)和pDZ-impE2(F405Y)载体单独或组合通过电穿孔转化至CJI9088菌株中。然后，在含有卡那霉素(25 mg/L)的培养基上选择其中通过同源序列的重组将载体插入染色体中的菌株。对选择的初始菌株进行第二次交换，并选择其中引入靶基因的修饰的菌株。通过使用SEQ ID NO:13和14的引物对进行PCR，随后进行核苷酸测序分析，证实最终转化的菌株中的修饰的引入。
评估制备的菌株(即CJI9088、CJI9088_impE2(S387T, M413T, N458K)、CJI9088_ impE2(F123C)、CJI9088_impE2(I243V)、CJI9088_impE2(F405Y)和CJI9088_impE2(F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K)产生IMP的能力。在完成培养后，通过HPLC测量IMP产生量，并且结果显示于下表19中。
Figure DEST_PATH_IMAGE019
在证实培养基中累积的IMP量后，证实这些菌株显示与亲本菌株CJI9088相比IMP产生增加至少80%，且最大增加730%。因此，由于本公开的ImpE蛋白的突变导致的IMP产生量的增加可以被解释为非常有意义的。
从前述内容，本公开所属领域的技术人员将能够理解，本公开可以以其他特定形式体现而不修改本公开的技术概念或本质特征。在这方面，本文公开的示例性实施方案仅用于说明目的，并且不应被解释为限制本公开的范围。相反，本公开旨在不仅涵盖示例性实施方案，而且还涵盖可以包括在由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内的各种替代方案、变化、等同方案和其他实施方案。
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Claims (8)

1.输出5'-肌苷一磷酸的蛋白变体，其中所述蛋白变体在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中用半胱氨酸取代第123个氨基酸，用缬氨酸取代第243个氨基酸，用苏氨酸取代第387个氨基酸，用酪氨酸取代第405个氨基酸，用苏氨酸取代第413个氨基酸，和/或用赖氨酸取代第458个氨基酸。
2.输出5'-肌苷一磷酸的蛋白变体，其中所述蛋白变体在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中用半胱氨酸取代第123个氨基酸，用缬氨酸取代第243个氨基酸，用苏氨酸取代第387个氨基酸，用酪氨酸取代第405个氨基酸，用苏氨酸取代第413个氨基酸，和/或用赖氨酸取代第458个氨基酸，
并且所述蛋白变体进一步用异亮氨酸取代第2个氨基酸和/或用谷氨酸或天冬氨酸取代第64个氨基酸。
3.多核苷酸，其编码根据权利要求1或2所述的蛋白变体。
4.载体，其包含根据权利要求3所述的多核苷酸。
5.产生5'-肌苷一磷酸的棒杆菌属的微生物，其包含权利要求1或2的蛋白变体、权利要求3的多核苷酸或权利要求4的载体。
6.根据权利要求5所述的棒杆菌属的微生物，其中所述棒杆菌属的微生物是停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)。
7.用于制备5'-肌苷一磷酸的方法，其包括在培养基中培养权利要求5的棒杆菌属的微生物；和从所述微生物或培养基回收5'-肌苷一磷酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述棒杆菌属的微生物是停滞棒杆菌。
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