KR101916622B1 - 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 imp 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 5'-이노신산 배출능을 가지는 신규폴리펩타이드, 이를 포함하는 미생물, 및 이를 이용한 5'-이노신산 제조방법에 관한 것이다.

Description

신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 IMP 생산방법 {Novel polypeptide and method of producing IMP using the same}
본 출원은 5'-이노신산 배출능을 가지는 신규 단백질 변이체, 이를 포함하는 미생물, 및 이를 이용한 5'-이노신산 제조방법에 관한 것이다.
핵산계 물질 중 하나인 5'-이노신산(5'-inosine monophosphate; 이하 IMP)은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로서, 의약품 및 각종 의료적 이용 등 다방면에 이용되고 있으며, 5'-구아닐산(5'-guanine monophosphate; 이하 GMP)과 더불어 식품 조미 첨가제 또는 식품용으로 널리 이용되고 있는 물질이다. IMP는 자체로 소고기 맛을 내는 것으로 알려져 있으나, GMP와 같이 모노소디움 글루탐산(MSG)의 풍미를 강화하는 것으로 알려져 정미성 핵산계 조미료로 각광을 받고 있다.
IMP를 제조하는 방법으로는, 효모 세포로부터 추출한 리보핵산을 효소적으로 분해하는 방법(일본 특허공고 제1614/1957호), 발효에 의해 생산된 이노신을 화학적으로 인산화하는 방법(Agri. Biol. Chem., 36, 1511(1972) 등) 및 IMP를 직접 생산 방법으로 생산하는 미생물을 배양하고 배양액 내의 IMP를 회수하는 방법 등이 있다. 이러한 방법 중에서 현재 가장 많이 사용되고 있는 방법은 IMP를 직접 생산 가능한 미생물을 이용한 방법이다.
한편, 자연상태에서 효소들은 산업적 활용에 있어서 요구되는 활성, 안정성, 광학 이성질체에 대한 기질 특이성 등에 있어 항상 최적의 특성을 나타내지 않으므로 아미노산 서열의 변이 등을 통해 목적하는 용도에 적합하게 효소를 개량하는 다양한 시도가 이루어져 왔다. 그 중, 효소의 합리적 디자인(rational design) 및 부분변이(site-directed mutagenesis) 방법이 효소 기능의 향상을 위해 적용된 예가 있으나, 많은 경우, 목적 효소의 구조에 대한 정보가 부족하거나 구조-기능의 상관관계가 명확하지 않아 효과적으로 적용될 수 없다는 단점을 가지고 있다. 이러한 경우, 효소 유전자의 무작위 변이를 통해 구축된 변이효소 라이브러리로부터 원하는 형질의 효소를 스크리닝하는 방향적 진화(directed evolution) 방법을 통해 효소의 개량을 시도하여 활성을 개선한다고 보고된 바 있다.
상기 미생물 발효를 통하여 직접 IMP을 생산하는 방법으로 고수율의 IMP을 생산하기 위해서는 IMP의 배출이 원활하게 이루어져야 한다. 본 목적을 달성하기 위해 발명자들은 광범위한 연구를 수행하였고, IMP 배출능에 관여하는 단백질을 규명하였을 뿐 아니라, 보다 높은 IMP 배출능을 갖는 단백질 변이체를 발굴함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 5'-이노신산을 배출하는 단백질 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 단백질 변이체 및 상기 벡터를 포함하는 5'-이노신산을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 미생물 또는 배지에서 5'-이노신산을 회수하는 단계를 포함하는 5'-이노신산 제조방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, 5'-이노신산을 배출하는 단백질 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원에서 용어, "5'-이노신산을 배출하는 단백질"은 5'-이노신산(5'-inosine monophosphate; IMP)을 세포외로 배출하는데 관여하는 단백질을 의미한다. 본 출원의 목적상 상기 용어는 IMP 배출능을 가지는 단백질, IMP 배출단백질, 5'-이노신산 배출능을 가지는 단백질, 5'-이노신산 배출 단백질 등과 혼용되어 사용될 수 있다. 구체적으로 ImpE로 나타낼 수 있으며, 더욱 구체적으로는 ImpE1, ImpE2로 나타낼 수 있다. 보다 더 구체적으로, 본출원의 5'-이노신산을 배출하는 단백질은 ImpE2로 나타낼 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 단백질은 코리네박테리움 속 유래일 수 있으며, 구체적으로는 코리네박테리움 스테이셔니스 유래인 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질은 예를 들어 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있으나, 상기 단백질과 동일한 활성을 갖는 서열은 제한 없이 포함하며, 당업자는 공지의 데이터베이스인 NCBI의 GenBank 등에서 서열 정보를 얻을 수 있다. 또한, 상기 단백질은, 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 IMP 배출 단백질은 서열번호 2 및 상기 서열번호 2 와 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 단백질로 사용될 수 있음은 자명하다.
또한, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 서열번호 4로 기재된 폴리뉴클레오티드 서열로 구성된 것일 수 있다. 또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1 X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
상기 "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원에 있어서 "5'-이노신산을 배출하는 단백질 변이체"는 서열번호 2의 아미노산 서열에서, 123번째 아미노산, 243번째 아미노산, 387번째 아미노산, 405번째 아미노산, 413번째 아미노산 또는 458번째 아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 5'-이노신산 배출능을 가지는 단백질 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 123번째 아미노산이 시스테인으로 치환(F123C)되거나, 243번째 아미노산이 발린으로 치환(I243V)되거나, 387번째 아미노산이 쓰레오닌으로 치환(S387T)되거나, 405번째 아미노산이 타이로신으로 치환(F405Y)되거나, 413번? 아미노산이 쓰레오닌으로 치환(M413T)되거나, 458번째 아미노산이 라이신으로 치환(N458K)되거나, 또는 이들의 조합으로 이루어지는 5'-이노신산을 배출하는 단백질 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 5'-이노신산 배출능을 가지는 단백질 변이체는 추가적으로 2번째 아미노산이 이소루신으로 치환되거나, 64번째 아미노산이 글루탐산 또는 아스파테이트로 치환되거나, 또는 이들의 조합으로 이루어지는, 5'-이노신산을 배출하는 단백질 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 5'-이노신산 배출능을 가지는 단백질 변이체는 서열번호 73, 74, 75, 76, 77 및 78로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 5'-이노신산 배출능을 가지는 단백질 변이체는 서열번호 73, 74, 75, 76, 77 및 78 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 단백질로 사용될 수 있음은 자명하다.
또한, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 73, 74, 75, 76, 77 및 78으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 서열번호 79, 80. 81, 82, 83 및 84로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성된 것일 수 있다. 또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건하에 하이드리드화하여, 서열번호 73, 74, 75, 76, 77 및 78로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 출원에서 5'-이노신산 배출능을 가지는 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 impE2 유전자이며, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 설명은 앞서 설명한 바와 같다.
본 출원에서 5'-이노신산 배출능을 가지는 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또한 앞서 설명한 바와 같다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. 본 출원의 또 하나의 양태로서, 본 출원은 상기 단백질 변이체를 포함하거나, 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여, 5’-이노신산을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다. 구체적으로 단백질 변이체 및/또는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물은 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환에 의해 제조되는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "5’-이노신산을 생산하는 미생물" 이란, 자연적으로 5’-이노신산 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 5’-이노신산의 생산능 또는 배출능이 없는 모균주에 5’-이노신산의 생산능 및 또는 배출능이 부여된 미생물을 의미한다. 본 출원에서 상기 5’-이노신산을 생산하는 미생물은 5’-이노신산을 배출하는 미생물, 5’-이노신산 배출능을 갖는 미생물과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 5’-이노신산을 생산하는 미생물은, 본 출원의 5’-이노신산을 배출하는 단백질 변이체, 상기 단백질 변이체 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어 단백질 변이체를 발현할 수 있는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적상 상기 숙주세포 또는 미생물은 상기 단백질 변이체를 포함하여 5’-이노신산을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다. 예를 들어, 에스케리키아(Escherichia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 엔테로박테리아(Enterobacteria) 속, 살모넬라 (Salmonella) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 등의 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다. 본 출원에서 용어 "5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus Corynebacterium) 미생물"이란, 천연형 또는 변이를 통하여 5'-이노신산 생산능을 가지고 있는 코리네박테리움 속 미생물을 의미한다. 구체적으로, 본 출원에서 5'-이노신산 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물이란 천연형 균주 자체 또는 외부 5'-이노신산 생산 기작과 관련된 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성을 강화시키거나 약화시켜 향상된 5'-이노신산 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물을 의미한다. 보다 구체적으로 본 출원에서 5'-이노신산 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 본 출원의 5'-이노신산을 배출하는 단백질 변이체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 향상된 5'-이노신산 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물을 의미한다. 상기 '향상된 5'-이노신산 생산능을 가지게된 코리네박테리움속 미생물'은 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물보다 5'-이노신산 생산능이 향상된 미생물을 의미한다. 상기 '비변형 미생물'은 천연형 균주 자체이거나, 상기 5'-이노신산을 배출하는 단백질 변이체를 포함하지 않는 미생물, 또는 상기 5'-이노신산을 배출하는 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 미생물을 의미한다.
본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis) 등이나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 또 하나의 양태로서, 상기 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 미생물 또는 배지에서 5'-이노신산을 회수하는 단계를 포함하는 5'-이노신산 제조방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45 ℃, 구체적으로는 25 내지 40 ℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 5’-이노신산은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 5'-이노신산을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 5'-이노신산을 수집할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 5'-이노신산을 회수 할 수 있다.
또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 5'-이노신산은 정제된 형태 또는 5'-이노신산을 함유한 미생물 발효액일 수 있다.
본 출원의 IMP를 배출하는 단백질 변이체를 이용하여, 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 경우, 고수율의 5'-이노신산 생산이 가능하다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예 1: IMP 배출단백질 발굴
IMP의 배출에 관여하는 코리네박테리움의 막 단백질을 동정하기 위해 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis) ATCC6872의 게노믹 DNA 라이브러리를 제작하였다.
이후 코리네박테리움속 야생형의 균주는 IMP를 생산하지 못하거나, IMP를 생산하더라도 아주 극미량이 생산될 뿐이므로, IMP 생산능을 확인하기 위하여, IMP 생산능을 갖는 ATCC6872 유래의 CJI0323 균주를 제작하였다. 제작된 CJI0323 균주에 ATCC6872의 게노믹 DNA 라이브러리를 이용하여 IMP 배출에 관여하는 막 단백질 스크리닝을 진행하였다. 구체적인 실험은 다음과 같다.
실시예1 -1: IMP 생산주 CJI0323 균주 선별
ATCC6782 유래의 IMP 생산주를 제작하기 위해 ATCC6872를 인산염 완충액(pH7.0) 또는 시트레이트 완충액(pH5.5)에 107 ~ 108 세포/ml 로 현탁시켰다. 여기에 UV 처리하여 실온 또는 32℃에서 20~40 분간 처리하여 돌연변이를 유발시켰다. 2회에 걸쳐 0.85% 식염수로 세척하고, 1.7% 한천을 함유한 최소배지에 내성을 부여하고자 하는 물질을 적정 농도로 함유한 배지에 희석하여 도말한 후 콜로니를 얻었다. 각각의 콜로니를 영양배지에서 배양하고 종배지에서 24시간 배양하였다. 발효배지에서 3~4일간 배양한 결과, 배양액에 축적된 IMP 생산량이 가장 우수한 콜로니를 선별하였다. 고농도 IMP 생산주를 제작하기 위해 아네닌 요구성, 구아닌 누출형, 라이소자임 감수성, 3,4-디하이드로프롤린 내성, 스트렙토마이신 내성, 아제티딘 카복실산 내성, 티아프롤린 내성, 아자세린 내성, 설파구아니딘 내성, 노르발린 내성, 트리메토프림 내성을 부여하기 위해 상기 과정을 각각의 물질에 대해 순차적으로 수행하였으며, 상기 물질들에 대한 내성이 부여되고 IMP 생산능이 우수한 CJI0323을 최종 선별하였다. 표 1에 ATCC6872 대비 CJI0323의 내성정도를 비교하여 나타냈다.
특성 ATCC6872 CJI0323
아데닌 요구성 비요구성 요구성
구아닌 누출형 비요구성 누출형
라이소자임 감수성 80 ug/ml 8 ug/ml
3,4-디하이드로프롤린 내성 1000 ug/ml 3500 ug/ml
스트렙토마이신 내성 500 ug/ml 2000 ug/ml
아제티딘 카복실산 내성 5 mg/ml 30 mg/ml
티아프롤린 내성 10 ug/ml 100 ug/ml
아자세린 내성 25 ug/ml 100 ug/ml
설파구아니딘 내성 50 ug/ml 200 ug/ml
노르발린 내성 0.2 mg/ml 2 mg/ml
트리메조프림 내성 20 ug/ml 100 ug/ml
- 최소배지: 포도당 2%, 황산나트륨 0.3%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.3%, 염화칼슘 10mg/l, 황산철 10mg/l, 황산아연 1mg/l, 염화망간 3.6mg/l, L-시스테인 20mg/l, 칼슘 판토테네이트 10mg/l, 티아민 염산염 5mg/l, 바이오틴 30ug/l, 아데닌 20mg/l, 구아닌 20mg/l, pH7.3
- 영양배지: 펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모 엑기스 1%, 한천 2%, pH 7.2
- 종배지: 포도당 1%, 펩톤 1%, 육즙 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100mg/l, 구아닌 100mg/l, pH 7.5
- 발효배지: 글루타민산 나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘 1.2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20mg/l, 황산망간 20mg/l, 황산아연 20mg/l, 황산구리 5mg/l, L-시스테인 23mg/l, 알라닌 24mg/l, 니코틴산 8mg/l, 비오틴 45㎍/l, 티아민염산 5mg/l, 아데닌 30mg/l, 인산(85%) 1.9%, 포도당 2.55%, 과당 1.45% 되게 첨가하여 사용하였다.
실시예 1-2: CJI0323의 발효역가 실험
종배지 2ml를 지름 18mm 시험관에 분주하고 가압 살균한 후, ATCC6872 및 CJI0323를 각각 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 29ml를 250ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃ 온도에서 15분간 가압 살균한 후, 종배양액 2ml을 접종하여 3일간 배양하였다. 배양 조건은 회전 수 170rpm, 온도 30℃, pH 7.5로 조절하였다.
배양 종료 후 HPLC (SHIMAZDU LC20A)를 이용한 방법에 의해 IMP의 생산량을 측정하였으며, 배양 결과는 아래 표 2와 같다.
균주명 IMP (g/L)
ATCC6872 0
CJI0323 9.52
실시예 1-3: 배출 단백질 발굴
1.7%의 한천을 첨가한 최소 배지내에 추가적으로 IMP를 첨가하여 CJI0323 균주의 생육 저하(growth inhibition)를 보이는 스크리닝 조건을 수립하였다. ATCC6872 게노믹 라이브러리 플라스미드를 CJI0323 균주에 전기천공법으로 형질전환시키고(van der Rest et al. 1999), 과량의 IMP가 첨가된 배지 조건에서 생육 저하가 해제되는 콜로니들을 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 플라스미드를 획득하여 시퀀싱 기법을 통해 염기서열을 분석하였다. 이로부터 과량의 IMP 첨가 조건에서 생육 저하를 해제시키는데 관여하는 막 단백질 1종을 동정하였다.
상기의 1종의 코리네박테리움 막 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열, 및 서열번호 4의 염기서열 (NCBI GenBank: NZ_CP014279, WP_066795121, MFS transporter) 로 확인되었다. 상기 막 단백질은 MFS transporter로 알려져 있으나 명확한 기능이 확인되지 않았으며, 더욱이 IMP 배출에 관한 기능은 알려져 있지 않다. 본 출원에서는 이를 ImpE2(WT)로 명명하였다.
실시예 2: ImpE1 , ImpE2 동정
실시예 2-1: impE1 , impE2 확인
상기 막 단백질 ImpE2의 기능을 알아보기 위해 NCBI에서 서열번호 4의 유전자 구조를 확인하였다 (NCBI GenBank: NZ_CP014279, WP_066795121, MFS transporter). impE2(서열번호4)의 ORF 시작 부분 7bp가 이의 impE2 upstream에 위치한 다른 유전자 (NCBI GenBank: NZ_CP014279, WP_066795119, transcriptional regulator)와 7bp 중첩되는 것을 확인하였다. impE2의 upstream에 위치한 유전자 및 해당 유전자로부터 코딩되는 단백질은 아직 기능이 확인되지 않았기에, 본 출원에서는 이를 ImpE1(WT)으로 명명하였다 (서열번호 1의 아미노산 서열 및 서열번호 3의 염기서열).
실시예 2-2: impE1 또는 impE2 결손 벡터 제작
실시예 1과 2-1을 통하여 동정한 IMP에 의한 생육 저하를 해제시키는 데 관여하는 ImpE1 또는 ImpE2를 IMP 생산 균주에서 결손 시켰을 경우, IMP 배출능이 줄어드는지 확인하기 위하여 각 유전자의 결손 벡터를 제작하고자 하였다.
벡터를 제작하기 위한 유전자 단편은 ATCC6872 게노믹 DNA를 주형으로 PCR을 통하여 획득하였다.
구체적으로, 상기 impE1에 대한 PCR은 서열번호 5, 6 프라이머 및 서열번호 7, 8 프라이머를, impE2에 대한 PCR은 서열번호 9, 10 프라이머 및 서열번호 11, 12 프라이머를 이용하였다(표 3).
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
5 impE1 kop-1 GCTCTAGACGAGAAAGCTAAAGCCGGTGA
6 impE1 kop-2 GTTTTTAGCTACCATTGTTACACCCCGTGCAAGTTT
7 impE1 kop-3 GCACGGGGTGTAACAATGGTAGCTAAAAACTCCACC
8 impE1 kop-4 GCTCTAGAAATAGTTGGGGAAGTCCACTC
9 impE2 kop-1 GCTCTAGACTTGGATGACCTGGTGGAAAA
10 impE2 kop-2 CTTGGAGAAAATTTCCTACCATTCCAGTCCTTTCGT
11 impE2 kop-3 GGACTGGAATGGTAGGAAATTTTCTCCAAGGGAAAT
12 impE2 kop-4 GGACTAGTGGATTGTGTTGACGCACGATG
65 impE1E2 kop-2 CTTGGAGAAAATTTCTGTTACACCCCGTGCAAGTTT
66 impE1E2 kop-3 GCACGGGGTGTAACAGAAATTTTCTCCAAGGGAAAT
이때 이용한 프라이머는 미국 국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)에 등록되어 있는 Corynebacterium stationis (ATCC6872) 유전자(NCBI Genbank: NZ_CP014279) 및 주변 염기서열에 대한 정보를 바탕으로 제작하였다.
PCR 조건은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 52℃ 3분 어닐링, 72℃ 1분 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 서열번호 5와 6 프라이머, 서열번호 7와 8 프라이머를 이용해 증폭된 impE1 유전자 두 단편을 주형으로 중첩 중합효소 연쇄 반응을 실시하여 1.8 kbp의 폴리뉴클레오티드 주형을 얻을 수 있었다. 얻어진 유전자의 단편을 제한효소 XbaI 으로 절단하였다. T4 리가아제를 이용하여 상기 유전자 단편으로 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDZ (대한민국 등록특허 제10-0924065호 및 국제 공개특허 제2008-033001호) 벡터에 클로닝하여 pDZ-△impE1를 제작하였다. 또한 서열번호 9와 10 프라이머를 이용해 증폭된 impE2 유전자 단편과 서열번호 11와 12 프라이머를 이용해 증폭된 impE2 유전자 두 단편을 주형으로 중첩 중합효소 연쇄 반응을 실시하여 1.7kbp의 폴리뉴클레오티드 주형을 얻을 수 있었다. 얻어진 유전자의 단편을 제한효소 XbaI, speI 으로 절단하였다. T4 리가아제를 이용하여 상기 유전자 단편으로 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDZ 벡터에 클로닝하여, pDZ-△impE2를 제작하였다.
실시예 2-3: impE1 , impE2 통합 결손 벡터 제작
상기 IMP에 의한 생육 저하를 해제시키는 데 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자 impE1과 impE2는 중첩되어 있으므로 두 유전자는 동시에 조절되어야 할 필요성이 있다. 따라서 impE1과 impE2가 모두 결손된 벡터를 제작하고자 하였다.
impE1과 impE2 PCR은 서열번호 5 와 65 프라이머 및 서열번호 66 와 12 프라이머를 이용하였다. 이때 이용한 프라이머는 미국 국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)에 등록되어 있는 코리네박테리움 스테이셔니스 (ATCC6872) 유전자(NCBI Genbank: NZ_CP014279) 및 주변 염기서열에 대한 정보를 바탕으로 제작하였다. 서열번호 5와 65 프라이머를 이용해 증폭된 impE1 유전자 단편과 서열번호 66과 12 프라이머를 이용해 증폭된 impE2 유전자 두 단편을 주형으로 중첩 중합효소 연쇄 반응을 실시하여 2.0kbp의 폴리뉴클레오티드 주형을 얻을 수 있었다. 얻어진 유전자의 단편을 각각 XbaI, speI 으로 절단하였다. T4 리가아제를 이용하여 상기 유전자 단편으로 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDZ 벡터에 클로닝하여, pDZ-△impE1E2를 제작하였다.
실시예 2-4: impE1 , impE2 결손 균주 제작
실시예 2-2에서 제작된 2종과 실시예 2-3에서 제작된 1종의 플라스미드를 각각 CJI0323에 일렉트로포레이션법으로 형질전환한 후 (Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545에 의한 형질 전환법 이용), 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신 (kanamycin) 25 mg/L를 함유한 배지에서 선별하였다. 선별된 1차 균주는 다시 2차 교차(cross-over)를 거쳐, 목표 유전자가 결손된 균주를 선정하였다. 최종 형질전환된 균주의 유전자 결손 여부는 서열번호 5, 8 및 서열번호 9, 12 및 서열번호 5, 12 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 확인하였다.
선별된 균주는 CJI0323_△impE1, CJI0323_△impE2, CJI0323_△impE1E2로 명명하고, 상기 균주들의 IMP의 생산능을 평가하였다.
종배지 2ml를 지름 18mm 시험관에 분주하고 가압 살균한 후, CJI0323, CJI0323_△impE1, CJI0323_△impE2, CJI0323_△impE1E2를 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 29ml를 250ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃ 온도에서 15분간 가압 살균한 후, 종배양액 2ml을 접종하여 3일간 배양하였다. 배양 조건은 회전 수 170rpm, 온도 30℃, pH 7.5로 조절하였다.
배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 IMP의 생산량을 측정하였으며, 배양 결과는 아래 표 4와 같다.
균주명 IMP (g/L)
CJI0323 9.52
CJI0323_△impE1 1.92
CJI0323_△impE2 1.88
CJI0323_△impE1E2 1.80
이때, 모균주인 코리네박테리움 스테이셔니스 CJI0323과 배지 내 IMP 축적량을 비교한 결과, 상기의 표 4에 나타난 바와 같이 CJI0323_△impE1, CJI0323_△impE2, CJI0323_△impE1E2 균주가 동일한 조건하에서 모균주 대비 IMP의 농도가 대략 8g/L 감소함을 확인하여 ImpE1, ImpE2가 IMP 배출에 관여하는 단백질임을 확인하였다.
실시예 3: IMP 생산주 CJI0323의 impE1 , impE2 염기서열 확인
상기 실시예 1에서 고농도 IMP 생산을 하는 CJI0323 균주의 경우, 고농도의 IMP를 생산하기 위해서 IMP 배출능이 향상되었을 가능성이 있다. 따라서 CJHB 균주의 impE1 , impE2의 변이 여부를 확인하고자 하였다. CJI0323의 염색체 DNA를 중합효소 연쇄반응방법 (이하 'PCR 방법'이라 함)을 통하여 증폭하였다. 구체적으로, 먼저 상기 CJI0323의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 13과 14의 프라이머(표 5)를 이용하여 94 ℃에서 1 분간 변성, 58 ℃에서 30 초간 결합, 72 ℃에서 2 분간 Taq DNA 중합효소로 중합하는 조건을 28 회 반복하는 PCR 방법을 통하여 약 2.8kb 개 염기쌍의 단편을 증폭하였다.
서열번호 프라이머명 서열(5'-3')
13　 impE1E2 seqF GAACGGAGTCATCTCCTTTGC
14　 impE1E2 seqR CCAAACGCTCTGCAAGAAACTG
이를 동일한 프라이머로 염기서열을 분석한 결과, 야생형 ATCC6872의 염기서열 대비, impE1 유전자의 490 번째 뉴클레오티드인 g가 a로 치환되어 있음을 확인하였다. 이는 ImpE1단백질의 164 번째 아미노산인 글루탐산이 라이신으로 치환되는 변이임을 의미한다.
또한, impE2 유전자의 4 번째 뉴클레오티드인 g가 a로 치환되고(impE1 유전자의 666번째 뉴클레오티드인 g가 a로 치환된 것을 의미), 191번째 뉴클레오티드인 g가 a으로 치환되어 있음을 확인하였다. 이는 ImpE2 단백질의 2 번째 아미노산(ImpE1 단백질의 222번째 아미노산에 해당)인 발린이 이소루신으로 치환되고, 64번째 아미노산이 글라이신에서 글루탐산으로 치환되어 있음을 의미한다.
CJI0323 균주의 impE1 유전자는 impE1_CJI0323 (서열번호 87), 단백질은 ImpE1_CJI0323 (서열번호 85)로 명명하고, CJI0323 균주의 impE2 유전자는 impE2_CJI0323 (서열번호 88), 단백질은 ImpE2_CJI0323 (서열번호 86)로 명명하였다.
실시예 4: impE1 , impE2 변이 복원
실시예 4-1: impE1 또는 impE2 변이 복원 벡터 제작
상기 실시예 3에서 IMP 생산 균주 CJI0323 균주에서 impE1 , impE2의 변이 여부를 확인한 결과 impE1에 1개, impE2에 2개의 변이를 포함하고 있음을 확인하였다. CJI0323균주는 고농도로 IMP를 생산하는 균주이므로 상기 변이가 IMP 배출능을 향상시키는 변이일 가능성이 높다. 따라서, 변이가 없는 천연의 야생형인 ImpE로 복원한 후, 추가적으로 발굴되는 단백질 변이체가 보다 높은 IMP배출능을 갖는지 확인하기 위하여 다음의 실험을 진행하였다.
복원벡터를 제작하기 위해 천연의 야생형 균주인 코리네박테리움 스테이셔니스 (Corynebacterium stationis) ATCC6872를 주형으로 하여 PCR을 진행하였다. 서열번호 89 와 90 프라이머를 이용해 증폭된 impE1impE2 유전자 단편을 XbaI의 제한 효소로 처리하였으며, pDZ 벡터에 XbaI 제한 효소 자리에 클로닝하여, pDZ-impE1E2(WT)를 제작하였다.
실시예 4-2: impE1 또는 impE2 변이 복원 균주 제작
실시예 4-1에서 제작된 1 플라스미드를 CJI0323에 일렉트로포레이션법으로 형질전환한 후 (Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545에 의한 형질 전환법 이용), 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신 (kanamycin) 25 mg/L 를 함유한 배지에서 선별하였다. 선별된 1차 균주는 다시 2차 교차(cross-over)를 거쳐, 목표 유전자의 변이가 복원된 균주를 선정하였다. 최종 형질전환된 균주의 유전자 변이 복원 여부는 서열번호 89, 90 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고, 염기서열을 분석함으로써 확인하였다. 이후 제작된 균주 CJI0323_impE1E2(WT)로 명명하였다.
실시예 5: impE2 변이 발굴
상기 실시예 3의 결과를 통해 발굴된 3종 변이 중 가장 높은 5'-이노신산 배출능을 갖는 변이를 선별하고, 이보다 더 높은 배출능을 갖는 변이를 발굴하기 위하여 다음의 실험을 진행하였다.
실시예 5-1: impE1E2 변이 중 가장 높은 5'-이노신산 배출능을 갖는 변이 선별
ImpE1의 E164K 단독변이 벡터를 제작하기 위해 천연의 야생형 균주인 코리네박테리움 스테이셔니스 ( Corynebacterium stationis ) ATCC6872를 주형으로 하여 서열번호 91 와 92 프라이머 및 서열번호 93 와 94 프라이머를 이용하였다. 서열번호 91 와 92 프라이머를 이용해 증폭된 E164K-1 유전자 단편과 서열번호 93 와 94 프라이머를 이용해 증폭된 E164K-2 유전자 두 단편을 주형으로 중첩 중합효소 연쇄 반응을 실시하여 1.8 kbp의 폴리뉴클레오티드 주형을 얻을 수 있었다. 얻어진 유전자의 단편을 제한효소 XbaI 으로 절단하였다. T4 리가아제를 이용하여 상기 유전자 단편으로 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDZ 벡터에 클로닝하여, pDZ-impE1(E164K)를 제작하였다.
ImpE2의 V2I 단독변이 벡터를 제작하기 위해 ATCC6872를 주형으로 하여 서열번호 91와 95프라이머 및 서열번호 96과 94프라이머를 이용하였다. 서열번호 91 와 95 프라이머를 이용해 증폭된 V2I-1 유전자 단편과 서열번호 96과 94 프라이머를 이용해 증폭된 V2I-2 유전자 두 단편을 주형으로 중첩 중합효소 연쇄 반응을 실시하여 1.8kbp의 폴리뉴클레오티드 주형을 얻을 수 있었다. 얻어진 유전자의 단편을 제한효소 XbaI 으로 절단하였다. T4 리가아제를 이용하여 상기 유전자 단편으로 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDZ 벡터에 클로닝하여, pDZ-impE2(V2I) 를 제작하였다.
ImpE2의 G64E 단독변이 벡터를 제작하기 위해 ATCC6872를 주형으로 하여 서열번호 91과 97 프라이머 및 서열번호 98과 94 프라이머를 이용하였다. 서열번호 91과 97 프라이머를 이용해 증폭된 G64E-1 유전자 단편과 서열번호 98과 94 프라이머를 이용해 증폭된 G64E-2 유전자 두 단편을 주형으로 중첩 중합효소 연쇄 반응을 실시하여 1.8kbp의 폴리뉴클레오티드 주형을 얻을 수 있었다. 얻어진 유전자의 단편을 제한효소 XbaI 으로 절단하였다. T4 리가아제를 이용하여 상기 유전자 단편으로 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDZ 벡터에 클로닝하여, pDZ-impE2(G64E)를 제작하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
89 impE1E2 WT F GCTCTAGAGAACGGAGTCATCTCCTTTGC
90 impE1E2 WT R GCTCTAGACCAAACGCTCTGCAAGAAACTG
91 impE1 164K-1 GCTCTAGACTTGGATGACCTGGTGGAAAA
92 impE1 164K-2 CTGGGGCGCGTTGTTTTTCAGGATGCTCCCGAAGACG
93 impE1 164K-3 AACAACGCGCCCCAGAATTGG
94 impE1 164K-4 GCTCTAGAAATAGTTGGGGAAGTCCACTC
95 impE2 V2I-2 TGGAGTTTTTAGCTATCATTCCAGTCCTTTCGTGTAA
96 impE2 V2I-3 TAGCTAAAAACTCCACCCCAA
97 impE2 G64E-2 CCGAAAATCATCTGCTCCAAAGAGCTCATCAGCATGG
98 impE2 G64E-3 GCAGATGATTTTCGGTTCCGC
CJI0323_impE1E2(WT) 균주에 실시예 4-2에서 제작한 플라스미드 3종을 형질전환한 후 (Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545에 의한 형질 전환법 이용), 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신 (kanamycin) 25 mg/L를 함유한 배지에서 선별하였다. 선별된 1차 균주는 다시 2차 교차(cross-over)를 거쳐, 목표 유전자의 변이가 도입된 균주를 선정하였다. 최종 형질전환된 균주의 유전자 변이 도입 여부는 서열번호 13, 14 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고, 염기서열을 분석함으로써 확인하였다. 선별된 균주는 CJI0323_impE1(E164K), CJI0323_impE2(V2I), CJI0323_impE2(G64E)로 명명하였다.
종배지 2ml를 지름18mm 시험관에 분주하고 가압 살균한 후, CJI0323_impE1E2(WT), CJI0323_impE1E2(WT)_impE1(E164K), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(V2I), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(G64E)를 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 29ml를 250ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃ 온도에서 15분간 가압 살균한 후, 종배양액 2ml을 접종하여 3일간 배양하였다. 배양 조건은 회전 수 170rpm, 온도 30℃, pH 7.5로 조절하였다.
배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 IMP의 생산량을 측정하였으며, 배양 결과는 아래 표 7과 같다.
균주명 IMP (g/L)
CJI0323 9.52
CJI0323_impE1E2(WT) 2.32
CJI0323_impE1E2(WT)_impE1(E164K) 2.57
CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(V2I) 3.11
CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(G64E) 3.27
상기 결과와 같이 3종의 변이 각각 IMP 배출에 관여하고 있음을 확인하였으며, 그중 impE2(G64E)의 IMP 생산량이 가장 높음을 확인할 수 있었다.
실시예 5-2: impE2 변이 아미노산 치환 삽입용 벡터 제작
상기 결과를 통해 5'-이노신산 생산능이 향상된 대표적인 3종 변이 중 가장 높은 이노신산 배출능을 보이는 impE2(G64E)의 위치적 중요성을 확인하기 위하여, impE2의 아미노산 서열에서 64번째 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 변이 도입용 벡터를 제작하였다.
ImpE2(G64E) 변이 도입용 벡터 제작 과정은 다음과 같다.
보고된 폴리뉴클레오티드 서열에 근거하여 코리네박테리움 스테이셔니스 CJI0323의 염색체 유전자를 분리하여, 이를 주형으로 서열번호 15과 각각의 서열번호 16-33의 프라이머쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 유전자 단편을 얻었다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 20회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 18종의 1kbp의 폴리뉴클레오티드를 획득하였다.
다음으로 코리네박테리움 스테이셔니스 CJI0323의 염색체 유전자를 분리하여, 서열번호 34과 각각의 서열번호 35-52의 프라이머쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 유전자 단편을 각각 얻었다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 20회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 18종의 1kbp의 폴리뉴클레오티드를 획득하였다.
상기 결과를 통해 획득한 두 단편을 주형으로 중첩 연장 PCR법을 실시하여 18종의 2kbp의 폴리뉴클레오티드 주형을 얻었다. 얻어진 유전자의 단편을 제한효소 XbaI으로 절단하였고 T4 리가아제를 이용하여 상기 유전자 단편으로 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDZ 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/L)dl 포함된 LB 고체배지에 도말하였다.
벡터제작을 위해 사용된 프라이머 서열 정보는 표 8과 같다.
서열번호 프라이머명 서열(5'-3')
15　 XbaI-impE2 64 1F GGGTCTAGAAAAGAGCTTAAGGCAGCTGCT
16　 impE2 64-R 1R GAAAATCATCTGGCGCAAAGAGCTCAT
17 impE2 64-H 1R GAAAATCATCTGGTGCAAAGAGCTCAT
　18 impE2 64-D 1R GAAAATCATCTGGTCCAAAGAGCTCAT
　19 impE2 64-K 1R GAAAATCATCTGCTTCAAAGAGCTCAT
　20 impE2 64-S 1R GAAAATCATCTGGGACAAAGAGCTCAT
　21 impE2 64-T 1R GAAAATCATCTGGGTCAAAGAGCTCAT
　22 impE2 64-N 1R GAAAATCATCTGGTTCAAAGAGCTCAT
　23 impE2 64-Q 1R GAAAATCATCTGCTGCAAAGAGCTCAT
　24 impE2 64-C 1R GAAAATCATCTGGCACAAAGAGCTCAT
　25 impE2 64-P 1R GAAAATCATCTGTGGCAAAGAGCTCAT
　26 impE2 64-A 1R GAAAATCATCTGAGCCAAAGAGCTCAT
　27 impE2 64-V 1R GAAAATCATCTGGACCAAAGAGCTCAT
　28 impE2 64-I 1R GAAAATCATCTGGATCAAAGAGCTCAT
　29 impE2 64-L 1R GAAAATCATCTGCAGCAAAGAGCTCAT
　30 impE2 64-M 1R GAAAATCATCTGCATCAAAGAGCTCAT
　31 impE2 64-F 1R GAAAATCATCTGGAACAAAGAGCTCAT
　32 impE2 64-Y 1R GAAAATCATCTGGTACAAAGAGCTCAT
　33 impE2 64-W 1R GAAAATCATCTGCCACAAAGAGCTCAT
　34 XbaI-impE2 64 2R GGGTCTAGACGGTCAATGAAGTCTCAACGG
　35 impE2 64-R 2F ATGAGCTCTTTGCGCCAGATGATTTTC
　36 impE2 64-H 2F ATGAGCTCTTTGCACCAGATGATTTTC
　37 impE2 64-D 2F ATGAGCTCTTTGGACCAGATGATTTTC
　38 impE2 64-K 2F ATGAGCTCTTTGAAGCAGATGATTTTC
　39 impE2 64-S 2F ATGAGCTCTTTGTCCCAGATGATTTTC
　40 impE2 64-T 2F ATGAGCTCTTTGACCCAGATGATTTTC
　41 impE2 64-N 2F ATGAGCTCTTTGAACCAGATGATTTTC
　42 impE2 64-Q 2F ATGAGCTCTTTGCAGCAGATGATTTTC
　43 impE2 64-C 2F ATGAGCTCTTTGTGCCAGATGATTTTC
　44 impE2 64-P 2F ATGAGCTCTTTGCCACAGATGATTTTC
　45 impE2 64-A 2F ATGAGCTCTTTGGCTCAGATGATTTTC
　46 impE2 64-V 2F ATGAGCTCTTTGGTCCAGATGATTTTC
　47 impE2 64-I 2F ATGAGCTCTTTGATCCAGATGATTTTC
　48 impE2 64-L 2F ATGAGCTCTTTGCTGCAGATGATTTTC
　49 impE2 64-M 2F ATGAGCTCTTTGATGCAGATGATTTTC
　50 impE2 64-F 2F ATGAGCTCTTTGTTCCAGATGATTTTC
　51 impE2 64-Y 2F ATGAGCTCTTTGTACCAGATGATTTTC
　52 impE2 64-W 2F ATGAGCTCTTTGTGGCAGATGATTTTC
PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 획득된 플라스미드 정보는 표 9과 같다.
번호 플라스미드 명
1 pDZ-impE2 64R
2 pDZ-impE2 64H
3 pDZ-impE2 64D
4 pDZ-impE2 64K
5 pDZ-impE2 64S
6 pDZ-impE2 64T
7 pDZ-impE2 64N
8 pDZ-impE2 64Q
9 pDZ-impE2 64C
10 pDZ-impE2 64P
11 pDZ-impE2 64A
12 pDZ-impE2 64V
13 pDZ-impE2 64I
14 pDZ-impE2 64L
15 pDZ-impE2 64M
16 pDZ-impE2 64F
17 pDZ-impE2 64Y
18 pDZ-impE2 64W
실시예 5-3: ImpE2 변이체의 64번 변이 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 균주 제작 및 5'-이노신산 생산능 비교
상기 실시예 3-1에서 제조한 변이 도입용 벡터 18종을 코리네박테리움 스테이셔니스 CJI0323에 형질전환하고 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(kanamycin) 25 mg/L를 함유한 배지에서 선별하였다. 선별된 1차 균주는 다시 2차 교차(cross-over)를 거쳐, 목표 유전자의 변이가 도입된 균주를 선정하였다. 최종 형질전환된 균주의 유전자 변이 도입 여부는 서열번호 13, 14 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고, 염기서열을 분석함으로써 확인하였다. 삽입된 변이에 따른 균주 명은 다음 표 10과 같다.
번호 균주 명
1 CJI0323::impE2(G64R)
2 CJI0323::impE2(G64H)
3 CJI0323:impE2(G64D)
4 CJI0323::impE2(G64K)
5 CJI0323::impE2(G64S)
6 CJI0323::impE2(G64T)
7 CJI0323::impE2(G64N)
8 CJI0323::impE2(G64Q)
9 CJI0323::impE2(G64C)
10 CJI0323::impE2(G64P)
11 CJI0323::impE2(G64A)
12 CJI0323::impE2(G64V)
13 CJI0323::impE2(G64I)
14 CJI0323:impE2(G64L)
15 CJI0323::impE2(G64M)
16 CJI0323::impE2(G64F)
17 CJI0323:impE2(G64Y)
18 CJI0323::impE2(G64W)
실시예 2와 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 5'-이노신산의 농도를 분석하였다(표 11).
impE2 변이의 5’-이노신산 생산 농도(g/L)
균주 평균
5'-이노신산
CJI0323 9.52
CJI0323_impE1E2(WT) 2.32
대조군 CJI0323_impE1(E164K)_impE2(V2I) 4.24
1 CJI0323::impE2(G64R) 4.42
2 CJI0323::impE2(G64H) 5.14
3 CJI0323::impE2(G64D) 11.53
4 CJI0323::impE2(G64K) 8
5 CJI0323::impE2(G64S) 5.7
6 CJI0323::impE2(G64T) 5.52
7 CJI0323::impE2(G64N) 5.9
8 CJI0323::impE2(G64Q) 4.8
9 CJI0323::impE2(G64C) 5.9
10 CJI0323::impE2(G64P) 4.75
11 CJI0323::impE2(G64A) 4.58
12 CJI0323::impE2(G64V) 4.56
13 CJI0323::impE2(G64I) 5.89
14 CJI0323::impE2(G64L) 5.6
15 CJI0323::impE2(G64M) 4.3
16 CJI0323::impE2(G64F) 5.89
17 CJI0323::impE2(G64Y) 4.6
18 CJI0323::impE2(G64W) 4.76
상기 결과와 같이, 모든 변이 균주는 대조군 대비 IMP 생산능이 증가되었으므로, 상기 impE2의 64번 변이위치는 ImpE단백질의 IMP 배출능 증가에 영향을 미치는 중요한 변이위치임을 재확인 할 수 있었다. 특히 ImpE2 의 아미노산 서열에서 64번째 아미노산인 글라이신이 글루탐산에서 다른 아미노산인 아스팔테이트로 치환되는 경우, 64번째 아미노산 변이가 없는 CJI0323_impE1(E164K)_impE2(V2I)균주 대비 172%나 증가하였다. 또한 5'-이노신산 생산능이 야생형으로 복원된 균주인 CJI0323_impE1E2(WT)대비 397%나 향상되었으며, CJI0323대비 20% 향상되는 것을 확인하였다.
실시예 6: 인공돌연변이법을 이용한 impE 변이 라이브러리
보다 높은 IMP 배출능을 갖는 단백질 변이체를 획득하고자 하기의 방법으로 염색체 내 1차 교차 삽입용 벡터 라이브러리를 제작하였다.
실시예 5-3의 결과에서 가장 높은 IMP 배출능을 갖는 것으로 확인된 균주 CJI0323::impE2(G64D)의 impE2를 대상으로 Error-prone PCR을 수행하고자 하였다. CJI0323::G64D가 보유하고 있는 64번째 아미노산 이후의 아미노산서열에 변이를 도입하기 위해 impE2의 193번째 염기서열부터 down stream 약 130bp염기서열까지 염기치환변이가 무작위적으로 도입된 impE 유전자 변이체(1.6 kbp)들을 획득하였다. Error-prone PCR은 Diversify PCR Random Mutagenesis Kit (Clontech)를 사용하여 수행하였으며, CJI0323::impE2(G64D)의 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 53 및 서열번호 54의 프라이머쌍(표 12)을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 유전자 단편을 얻었다
서열번호 프라이머명 서열(5'-3')
53　 impE lib F CAGATGATTTTCGGTTCCGCTC
54 impE lib R GACCGAGACAAAAACGCCAAACG
증폭된 유전자 단편에 변이가 1kb 당 0 내지 3.5개가 도입되도록 하였으며, PCR은 94에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분36초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 1.6 kbp의 폴리뉴클레오티드를 획득하였다.
증폭된 유전자 단편을 pCR2.1-TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 이용하여 pCR2.1-TOPO 벡터에 연결하였고, 대장균 DH5α에 형질전환하여 카나마이신(25mg/L)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 형질전환된 콜로니 20종을 선별한 후 플라스미드를 획득하여 콜리뉴클레오티드 서열을 분석한 결과 3.5 mutations/kb 빈도로 서로 다른 위치에 변이가 도입된 것을 확인하였다. 약 20,000개의 형질전환된 대장균 콜로니를 취하여 플라스미드를 추출하였고, 이를 pTOPO_impE library으로 명명하였다.
실시예 7: impE library 벡터가 삽입된 균주 선별
실시예 6에서 제조된 pTOPO_impE library 벡터를 IMP를 고농도로 생산하는 균주 CJI0323::impE2(G64D)에 일렉트로포레이션법으로 형질 전환한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 영양배지에 도말하여 변이 유전자가 삽입된 균주 10,000개의 콜로니를 확보 하였으며, 각 콜로니를 CJI0323::impE2(G64D)/pTOPO_impE(mt)1부터 CJI0323::impE2(G64D) /pTOPO_impE(mt)10000까지로 명명하였다.
- 영양배지: 펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모 엑기스 1%, 한천 2%, pH 7.2
- 종배지: 포도당 1%, 펩톤 1%, 육즙 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100mg/l, 구아닌 100mg/l, pH 7.5
- 발효배지: 글루타민산 나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘 1.2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20mg/l, 황산망간 20mg/l, 황산아연 20mg/l, 황산구리 5mg/l, L-시스테인 23mg/l, 알라닌 24mg/l, 니코틴산 8mg/l, 비오틴 45㎍/l, 티아민염산 5mg/l, 아데닌 30mg/l, 인산(85%) 1.9%, 포도당 2.55%, 과당 1.45% 되게 첨가하여 사용하였다.
확보된 10,000개의 콜로니를 각각 가압 살균한 종 배지 200㎕에 접종하여 96 deep well plate에서 마이크로플레이트 진탕기(Microplate shaker (TAITEC))를 이용하여 30℃ 온도, 1200rpm에서 24시간 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 가압 살균한 발효배지 290㎕를 96 deep well plate에 분주한 후 종 배양액 20㎕씩 접종하고, 상기 조건과 동일하게 72시간 진탕 배양하였다.
배양액에서 생산된 5'-이노신산의 생산량을 분석하기 위하여 배양 종료 후 배양 상층액 3 ㎕를 증류수 197 ㎕씩 분주된 96 well UV-plate에 옮겼다. 다음으로 마이크로플레이트 리더(Microplate reader)를 이용하여, 30초 동안 shaking하고, 25℃, 파장 270nm에서 스펙트로포토메타로 흡광도를 측정하고 대조구 CJI0323::impE2(G64D) 균주의 흡광도와 비교해 10% 이상 증가된 흡광도를 보이는 변이 균주 50개의 콜로니를 선별하였다. 그외 콜로니들은 대조구 대비 유사 또는 감소한 흡광도를 나타내었다.
선별된 50개의 균주는 상기와 같은 방법으로 흡광도 측정을 통한 5'-이노신산 생산량 확인을 반복 수행하였으며, CJI0323::impE2(G64D) 균주 대비 5'-이노신산 생산능이 향상된 균주 상위 4종을 선별하였다.
실시예 8: impE2 변이 라이브러리 선별주의 5'-이노신산 생산능 확인
상기 실시예 7에서 선별한 4종 균주들의 5'-이노신산 생산능을 비교하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 성분을 분석하였다.
가압 살균한 지름 18mm 시험관에 실시예 2와 동일한 종 배지 5ml에 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 실시예 2와 동일한 발효배지 29ml를 250ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃ 온도에서 15분간 가압 살균한 후, 종 배양액 2ml을 접종하여 4 내지 5일간 배양하였다. 배양 조건은 회전 수 170rpm, 온도 30℃, pH 7.5로 조절하였다. 배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 5'-이노신산의 생산량을 측정하였다.
4종의 균주 중 5'-이노신산 상위 4종의 균주를 선별하여 상기 배양 및 분석을 반복 수행하였으며, 분석된 5-이노신산 농도는 표 13과 같다.
선별된 CJI0323::impE2(G64D)/pTOPO_impE(mt) 5’-이노신산 생산 농도(g/L)
균주 평균
5'-이노신산
대조군 CJI0323::impE2(G64D) 11.53
1 CJI0323::impE2(G64D)/pTOPO_impE(mt)-627 13.47
2 CJI0323::impE2(G64D)/pTOPO_impE(mt)-3605 12.96
3 CJI0323::impE2(G64D)/pTOPO_impE(mt)-6765 13.17
4 CJI0323::impE2(G64D)/pTOPO_impE(mt)-9997 12.70
5'-이노신산 농도 분석 결과, 4종 선별주의 5'-이노신산 농도가 대조군 CJI0323::impE2(G64D) 균주 대비 최대 17% 증가함을 확인하였다.
실시예 9: 선별된 impE2 변이균주의 impE2 유전자 변이 확인
상기 실시예 8에서 선별된 4종 균주들의 impE2에 도입된 변이를 확인하기 위하여 impE2 변이체의 폴리뉴클레오티드 서열을 분석하였다. 폴리뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해 서열번호 13 및 서열번호 14 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다.
확보된 각각 변이형 impE2 유전자 단편들의 폴리뉴클레오티드 서열 분석을 진행하였다. impE2(WT)의 서열번호 4 또는 impE2(CJHB101::G64D)의 서열번호 100의 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하였으며, 이를 통해 변이형 ImpE2의 아미노산 서열을 확인하였다. 선별된 균주의 ImpE2 아미노산 서열의 변이 정보는 표 14와 같다.
선별 4종 impE2 아미노산 변이
균주 impE2 아미노산 변이
CJI0323::impE2(G64D)/pTOPO_impE(mt)-627 impE2(S387T, M413T, N458K)
CJI0323::impE2(G64D)/pTOPO_impE(mt)-3605 impE2(F123C)
CJI0323::impE2(G64D)/pTOPO_impE(mt)-6765 impE2(I243V)
CJI0323::impE2(G64D)/pTOPO_impE(mt)-9997 impE2(F405Y)
실시예 10: impE2 변이 염색체 도입용 벡터 제작
상기 실시예 9에서 확인된 impE2 변이 적용 효과를 확인하기 위하여 이를 염색체상에 도입할 수 있는 벡터를 제작하였으며, 제작과정은 다음과 같다.
impE2(G64D) 변이가 제외된 표 14의 library 변이만 포함된 벡터를 제작하였다. 구체적으로 코리네박테리움 스테이셔니스 ATCC6872의 염색체 유전자를 분리하여, 서열번호 56와 서열번호 57, 59, 61, 63의 프라이머쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 유전자 단편을 각각 얻었다. PCR법의 조건은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 20회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 0.2~1.0Kbp의 폴리뉴클레오티드를 획득하였다.
상기 선별된 4종의 염색체를 각각 주형으로하여 서열번호 58, 60, 62, 64와 서열번호 55의 프라이머쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 유전자 단편을 얻었다. PCR법의 조건은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분30초 중합을 20회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 0.6~1.4kbp의 폴리뉴클레오티드를 획득하였다. 두 단편을 주형으로 중첩 중합효소 연쇄 반응을 실시하여 얻어진 유전자의 단편을 제한효소 XbaI, speI으로 절단하였다. T4 리가아제를 이용하여 상기 유전자 단편으로 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDZ (대한민국 등록특허 제10-0924065호 및 국제 공개특허 제2008-033001호) 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/L)dl 포함된 LB 고체배지에 도말하였다.
다음으로 상기 선별된 변이체 중 3종 변이가 통합된 impE2(S387T, M413T, N458K)의 단독 변이 효과를 확인하기 위한 단독변이 벡터를 제작하기 위해 ATCC6872를 주형으로 서열번호 56와 서열번호 67, 69, 71의 프리이머쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 유전자 단편을 각각 얻었다. 이어 ATCC6872를 주형으로 서열번호 55번과 서열번호 68, 70, 72번의 프라이머쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 유전자 단편을 각각 얻었다. 상기 제작된 두 단편을 주형으로 중첩 중합효소 연쇄 반응을 실시하여 얻어진 유전자 단편을 제한효소 XbaI, SpeI으로 처리하였다. T4 리가아제를 이용하여 상기 유전자 단편으로 XbaI 제한효소로 절단시킨 pDZ 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다.
서열번호 프라이머명 서열(5'-3')
55 impE mt - R GGACTAGTTGAATGGCGCGATACTGTCGT
56 impEW mt - 1 GCTCTAGACCGCGGATAACGTCGGCATTA
57 impEW ttk - 2 CATCCACCACAAAGCAAACGC
58 impEW ttk - 3 CTTTGTGGTGGATGACCCAGATGACCGTTGAGACTT
59 impEW C - 2 AAATGGAGATACCTGAGATGT
60 impEW C - 3 CAGGTATCTCCATTTGCGTTATTGGCTCGACGCTCG
61 impEW v - 2 GGCCGCAAAACCCATCCAGTC
62 impEW v - 3 ATGGGTTTTGCGGCCGTCGCAATCACGACCAGCACC
63 impEW y - 2 ATACAAGGAAGCGAACTCCGA
64 impEW Y - 3 TTCGCTTCCTTGTATACGGTGTCGGCTTGGGCTTTG
PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별 한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드의 impE2에 삽입된 변이에 따라 pDZ-impE2(S387T, M413T, N458K), pDZ-impE2(F123C), pDZ-impE2(I243V), pDZ-impE2(F405Y), pDZ-impE2(S387T), pDZ-impE2(M413T), pDZ-impE2(N458K)으로 명명하였다.
실시예 11: 야생형 impE1 , impE2 기반 impE2 변이 도입 균주 제작 및 5'-이노신산 생산능 비교
상기 실시예 10에서 제조한 신규 변이 도입용 벡터 pDZ-impE2(S387T, M413T, N458K), pDZ-impE2(F123C), pDZ-impE(I243V), pDZ-impE2(F405Y), 4종을 2단계 상동염색체 재조합을 통해 실시예 4에서 제조된 5'-이노신산 생산균주인 코리네박테리움 스테이셔니스 CJI0323의 impE1E2가 WT으로 복원된 CJI0323_impE1E2(WT)에 형질전환 시켰다. 그 후 폴리뉴클레오티드 서열 분석을 통해 염색체 상의 impE2 변이가 도입된 균주를 선별하였으며, 각각 CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(S387T, M413T, N458K), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F123C), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(I243V), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F405Y)으로 명명 하였다.
실시예 7과 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 5'-이노신산의 농도를 분석하였으며, 배양시간 48시간 후 농도를 측정하였다(표 16).
impE2 변이 도입주의 5’-이노신산 생산 농도(g/L)
균주 평균
5'-이노신산
대조군 CJI0323_impE1E2(WT) 2.32
1 CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(S387T, M413T, N458K) 3.35
2 CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F123C) 2.62
3 CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(I243V) 2.74
4 CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F405Y) 2.90
신규 변이주 4종은 모균주 대비 5'-이노신산 농도는 최대 44% 증가함을 확인하였다. 본 출원의 ImpE 단백질 변이로 인한 IMP 생산량 증가는 매우 의미 있는 것으로 해석할 수 있다.
실시예 12: CJI0323 :: impE2 ( G64D ) 기반 impE2 변이 도입 균주 제작 및 5'-이노신산 생산능 비교
상기 실시예 10에서 제조한 신규 변이 도입용 벡터 pDZ-impE2(S387T, M413T, N458K), pDZ-impE2(F123C), pDZ-impE(I243V), pDZ-impE2(F405Y) 4종을 5'-이노신산 생산균주인 코리네박테리움 스테이셔니스 CJI0323::impE2(G64D)에 2단계 상동염색체 재조합을 통해 형질전환 시켰다. 그 후 폴리뉴클레오티드 서열 분석을 통해 염색체 상의 impE2 변이가 도입된 균주를 선별하였으며, 삽입된 impE2 변이에 따라 CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T, M413T, N458K), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C), CJI0323::impE2(G64D)_impEp(I243V), CJI0323::impE2(G64D)_impE2p(F405Y) 으로 명명하였다.
실시예 7와 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 5'-이노신산의 농도를 분석하였다(표 17).
impE2 변이 도입주의 5’-이노신산 생산 농도(g/L)
균주 평균
5'-이노신산
대조군 CJI0323::impE2(G64D) 11.53
1 CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T, M413T, N458K) 13.47
2 CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C) 12.90
3 CJI0323::impE2(G64D)_impE2(I243V) 13.17
4 CJI0323::impE2(G64D)_impE2 (F405Y) 12.70
신규 변이주 4종은 모균주 대비 5'-이노신산 농도는 최대 17% 증가함을 확인하였다. 본 출원의 ImpE 단백질 변이로 인한 IMP 생산량 증가는 매우 의미 있는 것으로 해석할 수 있다.
다음으로, 상기 제작된 pDZ-impE2(S387T, M413T, N458K), pDZ-impE2(F123C), pDZ-impE(I243V), pDZ-impE2(F405Y), pDZ-impE2(S387T), pDZ-impE2(M413T), pDZ-impE2(N458K)의 7종의 벡터를 단독 또는 조합하여, CJI0323_impE1E2(WT) 균주 및 CJI0323::impE2(G64D)균주에 형질전환하였다. 제작된 균주는 CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(S387T), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(M413T), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(N458K), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K)) CJI0323::impE2(G64D)_impE2 (S387T), CJI0323::impE2(G64D)_impE2 (M413T), CJI0323::impE2(G64D)_impE2 (N458K), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(I243V, S387T, M413T, N458K), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T, F405Y, M413T, N458K), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C,S387T, M413T, N458K), CJI0323::impE2(G64D)_impE2 (F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K)로 명명하였으며, 상기와 같은 방법으로 5'-이노신산 생산능을 측정하였다(표 18).
impE2 변이 단독 및 조합 도입 균주의 5’-이노신산 생산 농도(g/L)
균주 평균
5'-이노신산
대조군 CJI0323_impE1E2(WT) 2.32
대조군 CJI0323::impE2(G64D) 11.52
1 CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(S387T) 2.7
2 CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(M413T) 3.1
3 CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(N458K) 3.0
5 CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K) 4.7
6 CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T) 12.94
7 CJI0323::impE2(G64D)_impE2 (M413T) 13.0
8 CJI0323::impE2(G64D)_impE2(N458K) 13.1
10 CJI0323::impE2(G64D)_impE2(I243V, S387T, M413T, N458K) 13.6
11 CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T, F405Y, M413T, N458K) 13.7
12 CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C, S387T, M413T, N458K) 13.82
13 CJI0323::impE2(G64D)_impE2(I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K), 14.0
14 CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K) 14.27
상기 표에 나타낸 바와 같이, impE2(S387T), impE2(M413T), impE2(N458K) 단독변이는 야생형 대비 최대 33.6%%가 증가하였으며, 신규 변이들의 조합 도입 균주 모두 5'-이노신산 농도는 최대 102.5% 증가함을 확인하였다 또한 5'-이노신산을 생산하는 CJI0323::impE2(G64D) 균주에 신규 변이를 단독으로 도입한 경우 표 17 및 표 18에서 나타낸 바와 같이 IMP 배출능이 증가하였으며, 이들의 조합으로 도입되는 경우, 보다 높은 IMP 배출능을 가지는 것으로 확인되었다. 특히 CJI0323::impE2(G64D)균주의 변이와 신규 변이가 모두 통합된 경우, IMP 농도가 야생형 대비 약 515% 증가하였으며 CJI0323::impE2(G64D) 대비 약 24% 증가함을 확인하였다. 본 출원에서 발굴된 신규변이들은 단독으로도 IMP 배출능이 증가하였으며, 이들의 조합으로 도입되는 될 경우, 보다 높은 IMP 배출능을 가지는 것으로 확인되었다.
실시예 13: 야생형 IMP 생산주 기반 impE2 강화
실시예 13-1: 야생형 IMP 생산주 기반 impE2 변이 도입 균주 제작
야생형의 IMP 생산균주에서 impE2의 변이 도입 효과를 확인하기 위해 ATCC6872에서 IMP의 분해경로에 해당하는 아데닐로석시네이트 신타아제(adenylosuccinate synthetase) 및 IMP 디하이드로게나아제(IMP dehydrogenase)의 활성이 약화된 균주를 제작하였다. 상기 두 효소를 코딩하는 유전자 purA 및 guaB의 각 염기서열에서 1번째 염기를 a에서 t로 변경하여 개시코돈을 변경하였다. ATCC6872에서 상기 두 유전자의 발현이 약화된 균주는 CJI9088으로 명명하였다. 제조된 CJI9088균주에 상기 실시예 10에서 제작된 pDZ-impE2(S387T, M413T, N458K), pDZ-impE2(F123C), pDZ-impE(I243V), pDZ-impE2(F405Y) 벡터를 단독 또는 조합하여 일렉트로포레이션 방법으로 형질전환하여 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신 25mg/l를 함유한 배지에서 선별하였다. 선별된 1차 균주는 다시 2차 교차를 거쳐, 목표 유전자가 도입된 균주를 선정하였다. 최종 형질전환된 균주의 유전자 도입 여부는 서열번호 13, 14 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 확인하였다.
제작된 CJI9088 및 CJI9088_impE2(S387T, M413T, N458K), CJI9088_impE2(F123C), CJI9088_impE2(I243V), CJI9088_impE2(F405Y), CJI9088_impE2(F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K) 균주의 IMP 생산능을 평가하였다. 배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 IMP의 생산량을 측정하였으며, 배양 결과는 아래 표 19와 같다.
균주명 IMP (g/L)
CJI9088 0.52
CJI9088_impE2(S387T, M413T, N458K) 3.75
CJI9088_impE2(F123C) 0.94
CJI9088_impE2(I243V) 1.07
CJI9088_impE2(F405Y) 1.21
CJI9088_impE2(F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K) 4.32
배지 내 축적된 IMP를 확인한 결과, 모균주인 CJI9088대비 IMP 생산능이 80% 이상, 최대 730% 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 출원의 ImpE 단백질 변이로 인한 IMP 생산량 증가는 매우 의미 있는 것으로 해석할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Novel polypeptide and method of producing IMP using the same <130> KPA171025-KR <160> 100 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 222 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ImpE1 <400> 1 Leu His Ala Val Gln Glu Val Asn Asp Asn Glu Glu Asp Ser Leu Pro 1 5 10 15 Gly Ser Asp Leu Gly Leu Arg Glu Gln Lys Arg Leu Ala Thr Lys His 20 25 30 Arg Ile Glu Asp Ala Ala Thr Arg Leu Val Asp Glu Ser Ser Phe Asp 35 40 45 Lys Val Thr Ile Glu Glu Ile Cys Glu Ala Ala Gly Ile Ser Arg Arg 50 55 60 Thr Phe Phe Asn Tyr Phe Ser Thr Lys Glu Ser Ala Val Ile Gly Ala 65 70 75 80 Ser Ser Glu Pro Leu Thr Glu Lys Gln Arg Asn Asp Phe Leu Asn Ala 85 90 95 Asp Ala Ser Asn Leu Leu Gln Leu Met Val Glu Gln Ile Lys Gln His 100 105 110 Leu Glu Ser Ser His Gln Ser Gln Ala Ile His Asp Arg Arg Gln Arg 115 120 125 Ile Phe Ala Asp Pro Asp Val Ala Val Arg Ala Met Ala Phe Arg Lys 130 135 140 Glu Arg Ser Arg Glu Thr Met Glu Leu Ile Ala Gln Arg Leu Arg Glu 145 150 155 160 His Pro Glu Glu Gln Arg Ala Pro Glu Leu Asp Pro Glu Thr Glu Ala 165 170 175 Met Leu Leu Ser Gly Phe Ile Arg Glu Ala Thr Trp Met Ala Ile Ser 180 185 190 Arg Pro Asp Arg Asp Cys Ala Leu Pro Val Gly Asp Arg Ile Tyr Arg 195 200 205 Ala Met Glu Leu Val Lys Asn Tyr Thr Lys Gly Leu Glu Trp 210 215 220 <210> 2 <211> 549 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ImpE2 <400> 2 Met Val Ala Lys Asn Ser Thr Pro Ser Thr Ala Gly His Ala Ser Ala 1 5 10 15 His Thr Ala Glu Glu Phe Pro Val Ala Asn Ala Glu Met Ala Thr Pro 20 25 30 Ser Ala Ile Asp Pro Asn His Gly Lys Lys Thr Ala Asp Asn Val Gly 35 40 45 Ile Ile Phe Ala Ala Leu Met Leu Thr Met Leu Met Ser Ser Leu Gly 50 55 60 Gln Met Ile Phe Gly Ser Ala Leu Pro Thr Ile Val Gly Glu Leu Gly 65 70 75 80 Gly Val Asp Gln Met Ser Trp Val Ile Ser Ala Phe Met Val Thr Met 85 90 95 Thr Ile Ala Met Pro Leu Ala Gly Gln Leu Gly Asp Arg Met Gly Arg 100 105 110 Lys Trp Val Tyr Ile Ser Gly Ile Ser Ile Phe Val Ile Gly Ser Thr 115 120 125 Leu Gly Gly Phe Ala Asn Gly Met Gly Met Leu Ile Thr Gly Arg Ala 130 135 140 Ile Gln Gly Phe Gly Ala Gly Ile Met Met Ile Ser Ser Gln Ser Ile 145 150 155 160 Val Ala Glu Val Val Ser Ala Arg Glu Arg Gly Lys Phe Met Gly Ile 165 170 175 Met Gly Gly Val Phe Gly Val Ser Ser Val Leu Gly Pro Val Leu Gly 180 185 190 Gly Trp Phe Thr Asp Gly Pro Gly Trp Arg Trp Gly Leu Trp Ile Asn 195 200 205 Ile Pro Leu Gly Leu Leu Ala Ile Ile Val Cys Ala Phe Val Leu Lys 210 215 220 Leu Arg Val Gly Glu Gln Gly Phe Lys Gly Phe Asp Trp Met Gly Phe 225 230 235 240 Ala Ala Ile Ala Ile Thr Thr Ser Thr Leu Ile Leu Leu Thr Thr Trp 245 250 255 Gly Gly Ser Glu Tyr Glu Trp Thr Ser Pro Thr Ile Leu Ser Met Ala 260 265 270 Ala Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Thr Val Phe Ile Glu Ser Arg 275 280 285 Ala Ser Gln Pro Leu Ile Pro Val Gln Leu Phe Lys Asn Arg Asn Met 290 295 300 Val Leu Thr Thr Leu Ala Gly Thr Val Leu Gly Leu Ala Met Met Gly 305 310 315 320 Val Leu Gly Tyr Met Pro Thr Tyr Leu Gln Met Val His Thr Leu Thr 325 330 335 Pro Thr Glu Ala Gly Leu Met Met Ile Pro Met Met Val Gly Met Ile 340 345 350 Gly Val Ser Thr Gly Val Gly Phe Ile Ile Ala Lys Thr Gly Asn Tyr 355 360 365 Lys Tyr Tyr Pro Ile Ala Gly Leu Ala Ile Thr Ala Phe Ala Leu Trp 370 375 380 Trp Met Ser Gln Met Thr Val Glu Thr Ser Leu Thr Gly Ile Gly Val 385 390 395 400 Arg Phe Leu Val Phe Gly Val Gly Leu Gly Phe Val Met Gln Val Leu 405 410 415 Val Leu Ile Val Gln Asn Ser Phe Pro Val Ser Gln Val Gly Thr Ala 420 425 430 Thr Ala Ala Asn Asn Phe Phe Arg Gln Ile Gly Ser Ala Leu Gly Ala 435 440 445 Ser Ile Val Gly Ser Met Phe Ile His Asn Met Gln Asn Glu Met Ala 450 455 460 Thr Arg Leu Pro Asp Ala Leu Ala Ser Leu Gly Lys Glu Gly Ala Ala 465 470 475 480 Ile Ser Gln Gln Phe Gln Gly Ala Asp Ala Ala Asn Ser Leu Thr Pro 485 490 495 His Ala Val Ala Glu Leu Pro Asp Val Leu Arg Asp Ala Ile Leu Asn 500 505 510 Ser Tyr Asn Asp Gly Leu Thr Pro Val Ile Gly Met Met Val Pro Leu 515 520 525 Ala Ile Val Ala Met Leu Ile Leu Phe Pro Leu Arg Gln Glu Arg Leu 530 535 540 Lys Glu Thr Ile Glu 545 <210> 3 <211> 669 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> ImpE1 <400> 3 ttgcatgctg tgcaagaagt taatgacaat gaagaagact ccctccctgg cagtgacctc 60 gggttaaggg agcagaagcg attggcaacc aagcatcgca tcgaagacgc cgcgacacgg 120 ttggttgatg aatcgagctt tgacaaagta acaattgaag aaatttgcga agccgccggg 180 atttcccgac gcaccttttt taattatttc agcacgaaag aaagcgccgt tattggcgcg 240 tcctcggaac cgttgacgga aaagcaacgc aatgacttct tgaatgctga cgccagcaat 300 ctcctgcagc tgatggttga gcagatcaaa caacacttgg agtcttctca ccagagtcaa 360 gcgattcacg accgtcgtca gcgaatcttt gcggatccgg atgtcgcggt acgtgcaatg 420 gcgtttcgca aggaacgctc acgggaaacc atggagctaa tcgctcaacg tcttcgggag 480 catcctgaag aacaacgcgc cccagaattg gatccggaaa cagaggcgat gctgctgagc 540 ggattcattc gcgaagccac ctggatggct atctcacgac ccgatcgtga ttgtgcactg 600 ccagtgggtg accgcatcta tcgcgcgatg gaattggtaa agaattacac gaaaggactg 660 gaatggtag 669 <210> 4 <211> 1650 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> ImpE2 <400> 4 atggtagcta aaaactccac cccaagcacg gccggccacg ccagtgctca cactgcggaa 60 gaattcccag tggccaatgc tgaaatggca acgccttcag caatcgaccc aaaccacggt 120 aaaaagaccg cggataacgt cggcattatc ttcgctgcct tgatgctcac catgctgatg 180 agctctttgg ggcagatgat tttcggttcc gctctgccaa ccatcgtcgg cgagctcggc 240 ggcgtggacc agatgagctg ggtaatttca gcatttatgg tcaccatgac cattgctatg 300 ccactagccg gtcagctcgg tgaccgcatg ggccgcaagt gggtctacat ctcaggtatc 360 tccattttcg ttattggctc gacgctcggt ggctttgcca atggcatggg catgctgatc 420 accggacgtg caatccaggg cttcggtgcc ggcatcatga tgatttcctc gcagtcgatt 480 gtggctgagg ttgtctccgc acgtgagcgc ggcaagttca tgggtattat gggcggcgtc 540 tttggcgtct cctccgtact gggtccagtt ctcggtggct ggttcaccga tggtcccggt 600 tggcgttggg gcctgtggat caacattcca ctgggtctgc tggcaattat tgtctgcgct 660 ttcgtactga agctgcgcgt gggcgagcaa ggctttaagg gctttgactg gatgggtttt 720 gcggccatcg caatcacgac cagcaccctg attctgctca ccacttgggg cggaagcgaa 780 tacgagtgga cttccccaac tattttgtcc atggctgccg tagtcatcgt cggcgcgctg 840 ctcaccgtgt tcattgagtc gcgtgcatcc cagccgctga tcccggttca gctatttaag 900 aaccgcaaca tggttttgac caccctcgcc ggtactgttt tgggtctggc catgatgggc 960 gtgctcggct acatgccaac ctacctgcag atggtgcaca ccctgacgcc aactgaagca 1020 ggcttgatga tgatcccgat gatggtcggc atgatcggtg tctccactgg tgttggcttc 1080 atcatcgcta agaccggcaa ctacaagtac taccccatcg cgggcctggc catcacggcg 1140 tttgctttgt ggtggatgtc ccagatgacc gttgagactt cattgaccgg tatcggagtt 1200 cgcttccttg tattcggtgt cggcttgggc tttgtcatgc aggtactggt gctgattgtt 1260 caaaactcct tccctgtatc gcaggtcggt actgccacgg cggctaataa cttcttccgc 1320 cagattggtt cggcattggg tgcttccatc gtgggttcga tgttcattca caatatgcag 1380 aatgagatgg ctacccgttt gcctgatgcc cttgcatcgt tgggcaagga aggcgccgct 1440 atttcgcagc agttccaagg tgcagatgcc gccaactcct tgactccgca cgcagtcgca 1500 gagcttcccg atgtcctccg tgacgctatc ttaaattcct acaatgacgg tctgaccccc 1560 gtgattggca tgatggtgcc actggccatt gttgcaatgc tgattttgtt cccactgcgc 1620 caagagcgct tgaaggaaac catcgaataa 1650 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE1 kop-1 <400> 5 gctctagacg agaaagctaa agccggtga 29 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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impE1E2 seqR <400> 14 ccaaacgctc tgcaagaaac tg 22 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XbaI-impE2 64 1F <400> 15 gggtctagaa aagagcttaa ggcagctgct 30 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-R 1R <400> 16 gaaaatcatc tggcgcaaag agctcat 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-H 1R <400> 17 gaaaatcatc tggtgcaaag agctcat 27 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-D 1R <400> 18 gaaaatcatc tggtccaaag agctcat 27 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-K 1R <400> 19 gaaaatcatc tgcttcaaag agctcat 27 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-S 1R <400> 20 gaaaatcatc tgggacaaag agctcat 27 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-T 1R <400> 21 gaaaatcatc tgggtcaaag agctcat 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-N 1R <400> 22 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39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-S 2F <400> 39 atgagctctt tgtcccagat gattttc 27 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-T 2F <400> 40 atgagctctt tgacccagat gattttc 27 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-N 2F <400> 41 atgagctctt tgaaccagat gattttc 27 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-Q 2F <400> 42 atgagctctt tgcagcagat gattttc 27 <210> 43 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-C 2F <400> 43 atgagctctt tgtgccagat gattttc 27 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-P 2F <400> 44 atgagctctt tgccacagat gattttc 27 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-A 2F <400> 45 atgagctctt tggctcagat gattttc 27 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-V 2F <400> 46 atgagctctt tggtccagat gattttc 27 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-I 2F <400> 47 atgagctctt tgatccagat gattttc 27 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-L 2F <400> 48 atgagctctt tgctgcagat gattttc 27 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-M 2F <400> 49 atgagctctt tgatgcagat gattttc 27 <210> 50 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-F 2F <400> 50 atgagctctt tgttccagat gattttc 27 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-Y 2F <400> 51 atgagctctt tgtaccagat gattttc 27 <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 64-W 2F <400> 52 atgagctctt tgtggcagat gattttc 27 <210> 53 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE lib F <400> 53 cagatgattt tcggttccgc tc 22 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE lib R <400> 54 gaccgagaca aaaacgccaa acg 23 <210> 55 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Ile Glu Ser Arg 275 280 285 Ala Ser Gln Pro Leu Ile Pro Val Gln Leu Phe Lys Asn Arg Asn Met 290 295 300 Val Leu Thr Thr Leu Ala Gly Thr Val Leu Gly Leu Ala Met Met Gly 305 310 315 320 Val Leu Gly Tyr Met Pro Thr Tyr Leu Gln Met Val His Thr Leu Thr 325 330 335 Pro Thr Glu Ala Gly Leu Met Met Ile Pro Met Met Val Gly Met Ile 340 345 350 Gly Val Ser Thr Gly Val Gly Phe Ile Ile Ala Lys Thr Gly Asn Tyr 355 360 365 Lys Tyr Tyr Pro Ile Ala Gly Leu Ala Ile Thr Ala Phe Ala Leu Trp 370 375 380 Trp Met Ser Gln Met Thr Val Glu Thr Ser Leu Thr Gly Ile Gly Val 385 390 395 400 Arg Phe Leu Val Phe Gly Val Gly Leu Gly Phe Val Met Gln Val Leu 405 410 415 Val Leu Ile Val Gln Asn Ser Phe Pro Val Ser Gln Val Gly Thr Ala 420 425 430 Thr Ala Ala Asn Asn Phe Phe Arg Gln Ile Gly Ser Ala Leu Gly Ala 435 440 445 Ser Ile Val Gly Ser Met Phe Ile His Asn Met Gln Asn Glu Met Ala 450 455 460 Thr Arg Leu Pro Asp Ala Leu Ala Ser Leu Gly Lys Glu Gly Ala Ala 465 470 475 480 Ile Ser Gln Gln Phe Gln Gly Ala Asp Ala Ala Asn 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ggattcattc gcgaagccac ctggatggct atctcacgac ccgatcgtga ttgtgcactg 600 ccagtgggtg accgcatcta tcgcgcgatg gaattggtaa agaattacac gaaaggactg 660 gaatgatag 669 <210> 88 <211> 1650 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> ImpE2 NT - CJI0323 <400> 88 atgatagcta aaaactccac cccaagcacg gccggccacg ccagtgctca cactgcggaa 60 gaattcccag tggccaatgc tgaaatggca acgccttcag caatcgaccc aaaccacggt 120 aaaaagaccg cggataacgt cggcattatc ttcgctgcct tgatgctcac catgctgatg 180 agctctttgg agcagatgat tttcggttcc gctctgccaa ccatcgtcgg cgagctcggc 240 ggcgtggacc agatgagctg ggtaatttca gcatttatgg tcaccatgac cattgctatg 300 ccactagccg gtcagctcgg tgaccgcatg ggccgcaagt gggtctacat ctcaggtatc 360 tccattttcg ttattggctc gacgctcggt ggctttgcca atggcatggg catgctgatc 420 accggacgtg caatccaggg cttcggtgcc ggcatcatga tgatttcctc gcagtcgatt 480 gtggctgagg ttgtctccgc acgtgagcgc ggcaagttca tgggtattat gggcggcgtc 540 tttggcgtct cctccgtact gggtccagtt ctcggtggct ggttcaccga tggtcccggt 600 tggcgttggg gcctgtggat caacattcca ctgggtctgc tggcaattat tgtctgcgct 660 ttcgtactga agctgcgcgt gggcgagcaa ggctttaagg gctttgactg gatgggtttt 720 gcggccatcg caatcacgac cagcaccctg attctgctca ccacttgggg cggaagcgaa 780 tacgagtgga cttccccaac tattttgtcc atggctgccg tagtcatcgt cggcgcgctg 840 ctcaccgtgt tcattgagtc gcgtgcatcc cagccgctga tcccggttca gctatttaag 900 aaccgcaaca tggttttgac caccctcgcc ggtactgttt tgggtctggc catgatgggc 960 gtgctcggct acatgccaac ctacctgcag atggtgcaca ccctgacgcc aactgaagca 1020 ggcttgatga tgatcccgat gatggtcggc atgatcggtg tctccactgg tgttggcttc 1080 atcatcgcta agaccggcaa ctacaagtac taccccatcg cgggcctggc catcacggcg 1140 tttgctttgt ggtggatgtc ccagatgacc gttgagactt cattgaccgg tatcggagtt 1200 cgcttccttg tattcggtgt cggcttgggc tttgtcatgc aggtactggt gctgattgtt 1260 caaaactcct tccctgtatc gcaggtcggt actgccacgg cggctaataa cttcttccgc 1320 cagattggtt cggcattggg tgcttccatc gtgggttcga tgttcattca caatatgcag 1380 aatgagatgg ctacccgttt gcctgatgcc cttgcatcgt tgggcaagga aggcgccgct 1440 atttcgcagc agttccaagg tgcagatgcc gccaactcct tgactccgca cgcagtcgca 1500 gagcttcccg atgtcctccg tgacgctatc ttaaattcct acaatgacgg tctgaccccc 1560 gtgattggca tgatggtgcc actggccatt gttgcaatgc tgattttgtt cccactgcgc 1620 caagagcgct tgaaggaaac catcgaataa 1650 <210> 89 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE1E2 WT F <400> 89 gctctagaga acggagtcat ctcctttgc 29 <210> 90 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE1E2 WT R <400> 90 gctctagacc aaacgctctg caagaaactg 30 <210> 91 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE1 164K-1 <400> 91 gctctagact tggatgacct ggtggaaaa 29 <210> 92 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE1 164K-2 <400> 92 ctggggcgcg ttgtttttca ggatgctccc gaagacg 37 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE1 164K-3 <400> 93 aacaacgcgc cccagaattg g 21 <210> 94 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE1 164K-4 <400> 94 gctctagaaa tagttgggga agtccactc 29 <210> 95 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 V2I-2 <400> 95 tggagttttt agctatcatt ccagtccttt cgtgtaa 37 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 V2I-3 <400> 96 tagctaaaaa ctccacccca a 21 <210> 97 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 G64E-2 <400> 97 ccgaaaatca tctgctccaa agagctcatc agcatgg 37 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impE2 G64E-3 <400> 98 gcagatgatt ttcggttccg c 21 <210> 99 <211> 549 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> impE2 CJI0323 64D <400> 99 Met Ile Ala Lys Asn Ser Thr Pro Ser Thr Ala Gly His Ala Ser Ala 1 5 10 15 His Thr Ala Glu Glu Phe Pro Val Ala Asn Ala Glu Met Ala Thr Pro 20 25 30 Ser Ala Ile Asp Pro Asn His Gly Lys Lys Thr Ala Asp Asn Val Gly 35 40 45 Ile Ile Phe Ala Ala Leu Met Leu Thr Met Leu Met Ser Ser Leu Asp 50 55 60 Gln Met Ile Phe Gly Ser Ala Leu Pro Thr Ile Val Gly Glu Leu Gly 65 70 75 80 Gly Val Asp Gln Met Ser Trp Val Ile Ser Ala Phe Met Val Thr Met 85 90 95 Thr Ile Ala Met Pro Leu Ala Gly Gln Leu Gly Asp Arg Met Gly Arg 100 105 110 Lys Trp Val Tyr Ile Ser Gly Ile Ser Ile Phe Val Ile Gly Ser Thr 115 120 125 Leu Gly Gly Phe Ala Asn Gly Met Gly Met Leu Ile Thr Gly Arg Ala 130 135 140 Ile Gln Gly Phe Gly Ala Gly Ile Met Met Ile Ser Ser Gln Ser Ile 145 150 155 160 Val Ala Glu Val Val Ser Ala Arg Glu Arg Gly Lys Phe Met Gly Ile 165 170 175 Met Gly Gly Val Phe Gly Val Ser Ser Val Leu Gly Pro Val Leu Gly 180 185 190 Gly Trp Phe Thr Asp Gly Pro Gly Trp Arg Trp Gly Leu Trp Ile Asn 195 200 205 Ile Pro Leu Gly Leu Leu Ala Ile Ile Val Cys Ala Phe Val Leu Lys 210 215 220 Leu Arg Val Gly Glu Gln Gly Phe Lys Gly Phe Asp Trp Met Gly Phe 225 230 235 240 Ala Ala Ile Ala Ile Thr Thr Ser Thr Leu Ile Leu Leu Thr Thr Trp 245 250 255 Gly Gly Ser Glu Tyr Glu Trp Thr Ser Pro Thr Ile Leu Ser Met Ala 260 265 270 Ala Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Thr Val Phe Ile Glu Ser Arg 275 280 285 Ala Ser Gln Pro Leu Ile Pro Val Gln Leu Phe Lys Asn Arg Asn Met 290 295 300 Val Leu Thr Thr Leu Ala Gly Thr Val Leu Gly Leu Ala Met Met Gly 305 310 315 320 Val Leu Gly Tyr Met Pro Thr Tyr Leu Gln Met Val His Thr Leu Thr 325 330 335 Pro Thr Glu Ala Gly Leu Met Met Ile Pro Met Met Val Gly Met Ile 340 345 350 Gly Val Ser Thr Gly Val Gly Phe Ile Ile Ala Lys Thr Gly Asn Tyr 355 360 365 Lys Tyr Tyr Pro Ile Ala Gly Leu Ala Ile Thr Ala Phe Ala Leu Trp 370 375 380 Trp Met Ser Gln Met Thr Val Glu Thr Ser Leu Thr Gly Ile Gly Val 385 390 395 400 Arg Phe Leu Val Phe Gly Val Gly Leu Gly Phe Val Met Gln Val Leu 405 410 415 Val Leu Ile Val Gln Asn Ser Phe Pro Val Ser Gln Val Gly Thr Ala 420 425 430 Thr Ala Ala Asn Asn Phe Phe Arg Gln Ile Gly Ser Ala Leu Gly Ala 435 440 445 Ser Ile Val Gly Ser Met Phe Ile His Asn Met Gln Asn Glu Met Ala 450 455 460 Thr Arg Leu Pro Asp Ala Leu Ala Ser Leu Gly Lys Glu Gly Ala Ala 465 470 475 480 Ile Ser Gln Gln Phe Gln Gly Ala Asp Ala Ala Asn Ser Leu Thr Pro 485 490 495 His Ala Val Ala Glu Leu Pro Asp Val Leu Arg Asp Ala Ile Leu Asn 500 505 510 Ser Tyr Asn Asp Gly Leu Thr Pro Val Ile Gly Met Met Val Pro Leu 515 520 525 Ala Ile Val Ala Met Leu Ile Leu Phe Pro Leu Arg Gln Glu Arg Leu 530 535 540 Lys Glu Thr Ile Glu 545 <210> 100 <211> 1650 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> impE2 CJI0323 64D <400> 100 atgatagcta aaaactccac cccaagcacg gccggccacg ccagtgctca cactgcggaa 60 gaattcccag tggccaatgc tgaaatggca acgccttcag caatcgaccc aaaccacggt 120 aaaaagaccg cggataacgt cggcattatc ttcgctgcct tgatgctcac catgctgatg 180 agctctttgg accagatgat tttcggttcc gctctgccaa ccatcgtcgg cgagctcggc 240 ggcgtggacc agatgagctg ggtaatttca gcatttatgg tcaccatgac cattgctatg 300 ccactagccg gtcagctcgg tgaccgcatg ggccgcaagt gggtctacat ctcaggtatc 360 tccattttcg ttattggctc gacgctcggt ggctttgcca atggcatggg catgctgatc 420 accggacgtg caatccaggg cttcggtgcc ggcatcatga tgatttcctc gcagtcgatt 480 gtggctgagg ttgtctccgc acgtgagcgc ggcaagttca tgggtattat gggcggcgtc 540 tttggcgtct cctccgtact gggtccagtt ctcggtggct ggttcaccga tggtcccggt 600 tggcgttggg gcctgtggat caacattcca ctgggtctgc tggcaattat tgtctgcgct 660 ttcgtactga agctgcgcgt gggcgagcaa ggctttaagg gctttgactg gatgggtttt 720 gcggccatcg caatcacgac cagcaccctg attctgctca ccacttgggg cggaagcgaa 780 tacgagtgga cttccccaac tattttgtcc atggctgccg tagtcatcgt cggcgcgctg 840 ctcaccgtgt tcattgagtc gcgtgcatcc cagccgctga tcccggttca gctatttaag 900 aaccgcaaca tggttttgac caccctcgcc ggtactgttt tgggtctggc catgatgggc 960 gtgctcggct acatgccaac ctacctgcag atggtgcaca ccctgacgcc aactgaagca 1020 ggcttgatga tgatcccgat gatggtcggc atgatcggtg tctccactgg tgttggcttc 1080 atcatcgcta agaccggcaa ctacaagtac taccccatcg cgggcctggc catcacggcg 1140 tttgctttgt ggtggatgtc ccagatgacc gttgagactt cattgaccgg tatcggagtt 1200 cgcttccttg tattcggtgt cggcttgggc tttgtcatgc aggtactggt gctgattgtt 1260 caaaactcct tccctgtatc gcaggtcggt actgccacgg cggctaataa cttcttccgc 1320 cagattggtt cggcattggg tgcttccatc gtgggttcga tgttcattca caatatgcag 1380 aatgagatgg ctacccgttt gcctgatgcc cttgcatcgt tgggcaagga aggcgccgct 1440 atttcgcagc agttccaagg tgcagatgcc gccaactcct tgactccgca cgcagtcgca 1500 gagcttcccg atgtcctccg tgacgctatc ttaaattcct acaatgacgg tctgaccccc 1560 gtgattggca tgatggtgcc actggccatt gttgcaatgc tgattttgtt cccactgcgc 1620 caagagcgct tgaaggaaac catcgaataa 1650

Claims (8)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열에서 123번째 아미노산이 시스테인으로 치환되거나, 243번째 아미노산이 발린으로 치환되거나, 387번째 아미노산이 쓰레오닌으로 치환되거나, 405번째 아미노산이 타이로신으로 치환되거나, 413번째 아미노산이 쓰레오닌으로 치환되거나, 458번째 아미노산이 라이신으로 치환되거나, 또는 이들의 조합으로 이루어지는, 5'-이노신산을 배출하는 단백질 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 5'-이노신산을 배출하는 단백질 변이체는 추가적으로 2번째 아미노산이 이소루신으로 치환되거나, 64번째 아미노산이 글루탐산 또는 아스파테이트로 치환되거나, 또는 이들의 조합으로 이루어지는, 5'-이노신산을 배출하는 단백질 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항의 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  5. 제1항 또는 제2항의 단백질 변이체; 또는 제1항 또는 제2항의 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하여, 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis )인 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
  7. 제5항의 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 미생물 또는 배지에서 5'-이노신산을 회수하는 단계를 포함하는 5'-이노신산 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis )인 5'-이노신산 제조방법.


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