BR112019020962B1

BR112019020962B1 - Variante de desidrogenase de ácido 5-inosínico, polinucleotídeo, vetor, micro-organismo do gênero corynebacterium que produz ácido 5-inosínico e método de preparação de ácido 5- inosínico

Info

Publication number: BR112019020962B1
Application number: BR112019020962-0A
Authority: BR
Inventors: Ji Hye Lee; So-Jung Park; Min Ji Baek; Jin Sook Chang; Byoung Hoon Yoon
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2018-08-16
Publication date: 2022-06-14
Also published as: ZA201906063B; MX2019007397A; CN111183218B; US11066687B2; EP3705572A1; SG11201909227XA; CN111183218A; TWI710634B; JP6873244B2; CA3051217C; US20210139939A1; KR101956510B1; CA3051217A1; WO2020022547A1; MY193486A; AU2018386358B2; EP3705572A4; RU2728334C1; JP2020533947A; TW202012626A

Abstract

trata-se de uma variante de desidrogenase de ácido 5?-inosínico, um micro-organismo que inclui a mesma e um método de preparação de ácido 5?-inosínico que usa a mesma.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente revelação refere-se a uma variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico, um micro-organismo incluindo a mesma e um método de preparação do ácido 5’-inosínico usando a mesma.

2. DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

[002] O ácido 5’-inosínico (inosina-5’-monofosfato, a seguir denominado IMP), que é um material baseado em nucleotídeos, é um material intermediário do sistema metabólico da biossíntese de ácidos nucleicos e é usado em uma variedade de campos, como produtos médicos e aplicações médicas. O IMP é um material amplamente usado como aditivo de condimento alimentar ou usado em alimentos, juntamente com o ácido 5’-guanílico (guanina-5’-monofosfato, a seguir denominado GMP). O próprio IMP é conhecido por possuir um sabor de carne bovina, e é conhecido por melhorar o sabor do ácido glutâmico monossódico (doravante denominado MSG), como GMP. Portanto, o IMP recebeu muita atenção como um condimento à base de nucleotídeo.

[003] Os métodos de preparação de IMP incluem um método de degradação enzimática de ácidos ribonucleicos que são extraídos de células de levedura, um método de fosforilação química da inosina que é produzida por fermentação (Agri. Biol. Chem., 36, 1511 (1972), etc.), um método de cultivo de um micro-organismo capaz de produzir diretamente IMP e depois recuperar o IMP em uma cultura do mesmo, etc. Entre esses, o método mais comumente usado é o uso do microorganismo capaz de produzir diretamente o IMP.

[004] Enquanto isso, as enzimas em seu estado natural nem sempre exibem propriedades ótimas em termos de atividade, estabilidade, especificidade do substrato para isômeros ópticos, etc., que são requeridas em aplicações industriais. Portanto, várias tentativas foram feitas para melhorar as enzimas através de mutações de suas sequências de aminoácidos, etc., de modo que elas se tornem adequadas para o uso pretendido. Destes, o projeto racional e a mutagênese dirigida ao local de enzimas foram aplicados para melhorar as funções enzimáticas. No entanto, em muitos casos, há uma desvantagem em que as informações sobre a estrutura de uma enzima-alvo não sejam suficientes ou uma relação estrutura-função não seja clara e, portanto, os métodos não podem ser efetivamente aplicados. A este respeito, foi relatado que tentativas de melhoria enzimática foram feitas por um método de evolução direcionada de triagem de uma enzima com uma característica desejada de uma biblioteca de enzimas mutantes que é construída através da mutagênese aleatória do gene da enzima, levando à melhoria da sua atividade.

[005] Os presentes inventores conduziram extensos estudos para produzir IMP com alto rendimento pelo método de produzir IMP diretamente por fermentação microbiana e identificaram uma variante de uma proteína envolvida na produtividade de IMP, completando assim a presente revelação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Um objetivo da presente revelação é fornecer uma variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico.

[007] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um polinucleotídeo que codifica a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico.

[008] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um vetor incluindo o polinucleotídeo.

[009] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um micro-organismo que produz ácido 5’-inosínico, incluindo a variante de desidrogenase de ácido 5’- inosínico e o vetor.

[010] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um método de preparação de ácido 5’-inosínico, o método incluindo as etapas de cultura de um micro-organismo do gênero Corynebacterium em um meio; e recuperação de ácido 5’-inosínico do micro-organismo ou do meio.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS

[011] As modalidades preferenciais são descritas em detalhes a seguinte. Enquanto isso, as respectivas descrições e modalidades reveladas neste pedido também podem ser aplicadas a outras descrições e modalidades. Ou seja, todas as combinações de vários elementos revelados neste pedido se enquadram no escopo do presente pedido. Além disso, o escopo do presente pedido não é limitado pela descrição específica abaixo.

[012] A fim de alcançar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação fornece uma variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico que tem um polipeptídeo incluindo a substituição de um ou mais aminoácidos em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Especificamente, a presente revelação fornece a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico com o polipeptídeo incluindo a substituição de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que a substituição de aminoácidos inclui pelo menos qualquer uma selecionada a partir de o grupo consistindo na substituição de um aminoácido na posição 377 por treonina e substituição de um aminoácido na posição 499 a partir do terminal N por isoleucina. Outro aspecto da presente revelação fornece uma variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico com atividade de desidrogenase de ácido 5’- inosínico, a variante que tem uma sequência de aminoácidos incluindo a substituição do aminoácido na posição 377 por treonina, substituição do aminoácido em posição 499 por isoleucina na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou uma combinação das mesmas. Especificamente, a variante de desidrogenase de ácido 5’- inosínico pode incluir a substituição de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que a substituição de aminoácidos pode incluir pelo menos qualquer uma selecionada do grupo que consiste na substituição do aminoácido na posição 377 por treonina e substituição do aminoácido na posição 499 por isoleucina.

[013] Conforme usado no presente documento, o termo "desidrogenase de ácido 5’-inosínico" refere-se a uma proteína envolvida na produção de ácido 5’-inosínico (inosina-5’-monofosfato; IMP). Com relação aos objetivos da presente revelação, o termo pode ser usado de forma intercambiável com desidrogenase de inosina-5’- monofosfato, desidrogenase de IMP, desidrogenase de ácido inosínico, IMPDH, etc.

[014] Na presente revelação, a SEQ ID NO: 2 refere-se a uma sequência de aminoácidos com atividade de desidrogenase de ácido 5’-inosínico. Especificamente, a SEQ ID NO: 2 é uma sequência de uma proteína com atividade de desidrogenase de ácido 5’-inosínico, que é codificada pelo gene guaB. A sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 pode ser obtida no NCBI GenBank, que é um banco de dados público. Por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 pode ser derivada de Corynebacterium stationis, mas não está limitada a ela, e pode incluir qualquer sequência com a mesma atividade que a sequência de aminoácidos acima, sem limitação. Além disso, a sequência de aminoácidos pode incluir a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos com 80% ou mais de homologia ou identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, mas não está limitada a ela. Especificamente, a sequência de aminoácidos pode incluir a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de homologia ou identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. A sequência de aminoácidos com homologia ou identidade pode ser aquela da faixa acima, excluindo uma sequência com 100% de identidade, ou pode ser uma sequência que tem menos de 100 % identidade. Além disso, é evidente que uma proteína que possui uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição ou adição de alguns aminoácidos também se enquadra no escopo da presente invenção, desde que tenha homologia ou identidade e exiba eficácia correspondente àquela da proteína acima.

[015] Conforme usado no presente documento, o termo "variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico" pode ser usado de forma intercambiável com um polipeptídeo variante com capacidade de produção de IMP, um polipeptídeo variante produtor de IMP, um polipeptídeo variante com produtividade de ácido 5’-inosínico, um polipeptídeo variante produtor de ácido 5’-inosínico, um polipeptídeo variante com atividade de desidrogenase de ácido 5’-inosínico, uma variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico, etc. Além disso, a proteína pode ser derivada do gênero Corynebacterium, especificamente, Corynebacterium stationis, mas não está limitado à mesma.

[016] A variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico pode incluir variação na posição 377 e/ou na posição 499 do terminal N na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. A variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico pode ser um que tem substituição do aminoácido na posição 377 por outro aminoácido, substituição do aminoácido na posição 499 por outro aminoácido ou substituição do aminoácido na posição 377 por outro aminoácido e substituição do aminoácido na posição 499 por outro aminoácido, e que tem atividade enfraquecida, em comparação com aqueles que incluem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou uma desidrogenase de ácido 5'-inosínico não modificada derivada do micro-organismo do tipo selvagem. Tal variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico significa aquelas com variação do aminoácido (ou aminoácidos) na posição 377 e/ou na posição 499 do terminal N na SEQ ID NO: 2 e/ou em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de homologia ou identidade com a SEQ ID NO: 2, como descrito acima.

[017] Especificamente, a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico pode ter substituição do aminoácido na posição 377 por treonina, substituição do aminoácido na posição 499 por isoleucina ou substituição do aminoácido na posição 377 por treonina e substituição do aminoácido na posição 499 por isoleucina na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, e o polipeptídeo pode ter atividade de desidrogenase de ácido 5’-inosínico enfraquecida, em comparação com o polipeptídeo incluindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 2, mas não está limitada a isso.

[018] Com relação aos objetivos da presente revelação, o micro-organismo, incluindo a variante de desidrogenase de ácido 5'-inosínico, é caracterizado pelo aumento da quantidade de IMP produzida. Isso é significativo, pois a quantidade de IMP produzida pode ser aumentada pela variante de desidrogenase de ácido 5’- inosínico da presente revelação, enquanto que uma cepa de tipo selvagem do gênero Corynebacterium não é capaz de produzir IMP ou, mesmo que possa produzir IMP, ela só é capaz de produzir uma quantidade muito pequena.

[019] Especificamente, a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico, incluindo a sequência de aminoácidos com substituição do aminoácido na posição 377 por outro aminoácido, substituição do aminoácido na posição 499 por outro aminoácido ou substituição do aminoácido na posição 377 por outro aminoácido e substituição do aminoácido na posição 499 por outro aminoácido na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 pode incluir pelo menos qualquer um selecionado do grupo que consiste na SEQ ID NOS: 6, 7 e 8. Mais especificamente, a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico com substituição do aminoácido na posição 377 por treonina, substituição do aminoácido na posição 499 por isoleucina ou substituição do aminoácido na posição 377 por treonina e substituição do aminoácido na posição 499 por isoleucina na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 pode incluir pelo menos qualquer um selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 6, 7 e 8. A variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico pode consistir em pelo menos qualquer uma selecionada no grupo que consiste na SEQ ID NOS: 6, 7 e 8. Além disso, a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínic pode incluir a sequência de aminoácidos que possui a SEQ ID NO: 6, 7 ou 8 ou uma sequência de aminoácidos com 80% ou mais de homologia ou identidade, mas não está limitada a ela. Especificamente, a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico da presente revelação pode incluir um polipeptídeo com a SEQ ID NO: 6, 7 ou 8 e um polipeptídeo com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de homologia ou identidade com a SEQ ID NO: 6, 7 ou 8. Além disso, é evidente que uma proteína com uma sequência de aminoácidos possuindo deleção, modificação, substituição ou adição de alguns aminoácidos, além do aminoácido na posição 377 ou 499, também se enquadra no escopo da presente invenção, desde que tenha homologia ou identidade e exiba eficácia correspondente à da proteína acima.

[020] Em outras palavras, mesmo que a presente revelação descreva uma 'proteína ou polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos representada por uma SEQ ID NO específica', é evidente que uma proteína com uma sequência de aminoácidos com deleção, alteração, substituição, substituição conservadora ou a adição de alguns aminoácidos também pode ser usada na presente revelação, desde que tenha atividade idêntica ou correspondente à do polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO correspondente. Por exemplo, desde que uma proteína tenha atividade idêntica ou correspondente à da variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico, ela não exclui a adição de sequências que não alteram a função da proteína na frente e no final da sequência de aminoácidos, mutação que ocorra naturalmente, mutação silenciosa ou substituição conservadora das mesmas. É aparente que uma proteína que possui tal adição ou mutação de sequência também se enquadra no escopo da presente revelação.

[021] A "substituição conservadora" significa a substituição de um aminoácido por outro aminoácido com propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes. Esta substituição de aminoácidos pode geralmente ser feita com base na semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática. Por exemplo, aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido glutâmico e ácido aspártico; aminoácidos aromáticos incluem fenilalanina, triptofano e tirosina; e aminoácidos hidrofóbicos incluem alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina e triptofano.

[022] Portanto, na presente revelação, a "variante" pode ainda incluir substituição e/ou modificação conservadora de um ou mais aminoácidos em 'uma proteína ou polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos representada por uma SEQ ID NO específica’. Por exemplo, certas variantes podem incluir variantes nas quais uma ou mais porções, como uma sequência líder do N terminal ou domínio transmembranar, foram removidas. Outras variantes podem incluir variantes nas quais uma porção foi removida do terminal N e/ou C da proteína madura. A variante também pode incluir outras modificações, incluindo a exclusão ou adição de aminoácidos, que têm efeitos mínimos nas propriedades e uma estrutura secundária do polipeptídeo. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser conjugado com uma sequência de sinal (ou líder) na extremidade do terminal N de uma proteína que direciona a translação ou a pós- tradução da transferência da proteína. O polipeptídeo também pode ser conjugado com outra sequência ou um ligante para facilitar a identificação, purificação ou síntese do polipeptídeo. O termo "variante" pode ser usado de forma intercambiável com modificação, proteína modificada, polipeptídeo modificado, mutante, muteína, divergente, etc., e qualquer termo pode ser usado sem limitação, desde que seja usado no sentido de ser modificado.

[023] Homologia e identidade significam um grau de parentesco entre duas sequências de aminoácidos ou sequências nucleotídicas e podem ser expressas como uma porcentagem.

[024] Os termos "homologia e identidade" podem frequentemente ser usados de forma intercambiável um com o outro.

[025] A homologia ou identidade da sequência de um polinucleotídeo ou polipeptídeo conservado pode ser determinada por um algoritmo de alinhamento padrão usado com penalidades de intervalo-padrão estabelecidas por um programa a ser usado. Substancialmente, sequências homólogas ou idênticas podem hibridizar sob condições moderadas ou altamente rigorosas ao longo de toda a sua sequência ou pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% ou cerca de 90% de todo o comprimento. No que diz respeito aos polinucleotídeos a serem hibridados, também podem ser contemplados polinucleotídeos incluindo um códon degenerado em vez de um códon.

[026] Se quaisquer duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas têm homologia, semelhança ou identidade pode ser determinadas por, por exemplo, um algoritmo de computador conhecido como o programa "FASTA" usando parâmetros- padrão como em Pearson et al. (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444 e, alternativamente, podem ser determinadas usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), conforme implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (versão 5.0.0 ou posterior) (incluindo o pacote de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, e [CARILLO ETA /.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073. Por exemplo, homologia, similaridade ou identidade podem ser determinadas usando BLAST ou ClustalW do Centro Nacional de Informação Biotecnológica.

[027] A homologia, similaridade ou identidade de polinucleotídeos ou polipeptídeos podem ser determinadas pela comparação de informações de sequência usando um programa de computador GAP, como Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443, como revelado em Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2: 482. Resumidamente, o programa GAP define similaridade como o número de símbolos alinhados (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) que são semelhantes, divididos pelo número total de símbolos na menor das duas sequências. Os parâmetros-padrão do programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação unária (que contém um valor de 1 para identidades e 0 para não-identidades) e a matriz de comparação ponderada (ou matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS do NCBI NUC4.4))) de Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745, como descrito por Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, p. 353-358 (1979); (2) uma penalidade de 3,0 para cada intervalo e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada intervalo (ou penalidade de intervalo aberto 10, penalidade de extensão do intervalo 0,5); e (3) nenhuma penalidade por intervalos finais. Portanto, o termo "homologia" ou "identidade", conforme usado no presente documento, representa relevância entre as sequências.

[028] É evidente que um polinucleotídeo a ser traduzido, devido à degeneração do códon, em um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NOS: 6, 7 e 8, ou um polipeptídeo com homologia ou identidade também pode ser incluído. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ter uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 3, 4 e 5. Além disso, por hibridação sob condições rigorosas com uma sonda preparada a partir de uma sequência genética conhecida, por exemplo, uma sequência complementar a toda ou parte da sequência nucleotídica, uma sequência polinucleotídica que codifica uma variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico, que inclui uma sequência de aminoácidos com substituição do aminoácido na posição 377 por treonina ou substituição do aminoácido na posição 499 por isoleucina na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 pode ser incluída sem limitação.

[029] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um polinucleotídeo que codifica a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico ou um vetor incluindo o polinucleotídeo.

[030] Como usado aqui, o termo "polinucleotídeo" refere-se a uma faixa de DNA ou RNA que possui mais de um determinado comprimento como um polímero nucleotídico que é uma longa cadeia de monômeros nucleotídicos conectados por uma ligação covalente e, mais especificamente, a um fragmento de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.

[031] O polinucleotídeo que codifica a variante de desidrogenase de ácido 5’- inosínico da presente revelação pode incluir qualquer sequência polinucleotídica sem limitação, desde que codifique o polipeptídeo variante com atividade de desidrogenase de ácido 5’-inosínico da presente revelação. Na presente revelação, um gene que codifica a sequência de aminoácidos de desidrogenase de ácido 5’- inosínico é o gene guaB e, especificamente, o gene pode ser derivado de Corynebacterium stationis, mas não está limitado ao mesmo.

[032] Especificamente, devido à degenerescência do códon ou considerando códons preferidos por um micro-organismo no qual o polipeptídeo pode ser expresso, várias modificações podem ser feitas na região de codificação do polinucleotídeo da presente revelação dentro do escopo que não muda a sequência de aminoácidos do polipeptídeo. Qualquer sequência polinucleotídica pode ser incluída sem limitação, desde que codifique a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico com substituição do aminoácido na posição 377 por outro aminoácido, substituição do aminoácido na posição 499 por outro aminoácido, ou substituição do aminoácido na posição 377 por outro aminoácido e substituição do aminoácido na posição 499 por outro aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Por exemplo, o polinucleotídeo que codifica a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico da presente revelação pode ter uma sequência polinucleotídica que codifica uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOS: 6, 7 e 8, mas não está limitada às mesmas. Mais especificamente, o polinucleotídeo pode ter uma sequência polinucleotídica selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NOS: 3, 4 e 5, mas não está limitada às mesmas.

[033] Além disso, por hibridação sob condições rigorosas com uma sonda preparada a partir de uma sequência genética conhecida, por exemplo, uma sequência complementar a toda ou parte da sequência nucleotídica, uma sequência que codifica uma proteína com atividade da variante de desidrogenase de ácido 5’- inosínico com substituição do aminoácido na posição 377 por outro aminoácido, substituição do aminoácido na posição 499 por outro aminoácido ou substituição do aminoácido na posição 377 por outro aminoácido e substituição do aminoácido na posição 499 por outro aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 pode ser incluída sem limitação. As "condições rigorosas" significam condições que permitem a hibridação entre polinucleotídeos. Tais condições são descritas em detalhes na literatura (por exemplo, J. Sambrook et al., o mesmo que acima). As condições rigorosas podem incluir condições sob as quais genes com alta homologia ou identidade, por exemplo, genes com 40% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, ainda mais especificamente 97% ou mais, particularmente especificamente 99% ou mais de homologia ou identidade são capazes de hibridizar entre si, condições sob as quais os genes com menor homologia ou identidade não são capazes de hibridar entre si, ou condições que são condições comuns de lavagem para a hibridação Southern, por exemplo, uma concentração de sal e uma temperatura que correspondem a 60 °C, 1X SSC, 0,1% SDS, especificamente 60 °C, 0,1X SSC, 0,1% SDS, mais especificamente 68 °C, 0,1X SSC, 0,1% SDS, uma vez, especificamente, duas ou três vezes.

[034] A hibridação requer que dois ácidos nucleicos possuam sequências complementares, embora sejam possíveis incompatibilidades entre as bases, dependendo do rigor da hibridação. O termo "complementar" é usado para descrever a relação entre bases nucleotídicas que são capazes de hibridar. Por exemplo, em relação ao DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar à guanina. Por conseguinte, a presente revelação também pode incluir fragmentos de ácido nucleico isolados complementares às sequências completas, bem como sequências de ácidos nucleicos substancialmente semelhantes.

[035] Especificamente, um polinucleotídeo com homologia ou identidade pode ser detectado por condições de hibridação, incluindo uma etapa de hibridação a Tm de 55 °C e utilizando as condições descritas acima. Além disso, o valor de Tm pode ser 60 °C, 63 °C ou 65 °C, mas não está limitado a isso, e adequadamente controlada pelos especialistas na técnica de acordo com a finalidade.

[036] O rigor apropriado para a hibridação de polinucleotídeos depende do comprimento dos polinucleotídeos e do grau de complementação, e as variáveis são bem conhecidas na técnica (ver Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).

[037] Na presente revelação, o gene que codifica a sequência de aminoácidos da variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico é o gene guaB, e um polinucleotídeo que codifica a mesma é o mesmo que descrito acima.

[038] Na presente revelação, o polinucleotídeo que codifica a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico também é o mesmo que o descrito acima.

[039] Conforme usado no presente documento, o termo "vetor" significa uma construção de DNA que contém a sequência nucleotídica do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo desejado que está operacionalmente ligado a uma sequência reguladora adequada, de modo que o polipeptídeo desejado seja expresso em um hospedeiro adequado. As sequências reguladoras podem incluir um promotor para direcionar a transcrição, uma certa sequência operadora para regular tal transcrição, uma sequência que codifica um local de ligação ao ribossomo adequado no mRNA e uma sequência para regular a terminação da transcrição e tradução. Uma vez transformado em um hospedeiro adequado, o vetor pode se replicar ou funcionar independentemente do genoma do hospedeiro ou pode se integrar ao próprio genoma.

[040] O vetor usado na presente revelação pode não ser particularmente limitado, desde que o vetor seja replicável na célula hospedeira e qualquer vetor conhecido na técnica possa ser usado. Exemplos de vetores comumente usados podem incluir plasmídeos naturais ou recombinantes, cosmídeos, vírus e bacteriófagos. Por exemplo, como um vetor fágico ou um vetor cosmídeo, podem ser usados pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc. e, como vetor plasmídico, aqueles baseados em pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET, etc. podem ser usados. Especificamente, os vetores pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, etc. podem ser usados.

[041] Por exemplo, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo desejado pode ser inserido no cromossomo. A inserção do polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por recombinação homóloga, mas não está limitado ao mesmo. Um marcador de seleção para confirmar a inserção do vetor no cromossomo pode ser adicionalmente incluído. O marcador de seleção é usado para a seleção de células transformadas com o vetor, ou seja, para confirmar se a molécula de ácido nucleico desejada foi inserida, e marcadores capazes de fornecer fenótipos selecionáveis, como resistência a drogas, auxotrofia, resistência a agentes citotóxicos, e expressão de polipeptídeos de superfície podem ser usados. Nas circunstâncias em que os agentes seletivos são tratados, apenas as células capazes de expressar os marcadores de seleção podem sobreviver ou expressar outras características fenotípicas e, portanto, as células transformadas podem ser facilmente selecionadas. Em ainda outro aspecto da presente revelação, a presente revelação fornece um micro-organismo que produz ácido 5’-inosínico, incluindo a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico ou o polinucleotídeo que codifica o mesmo. Especificamente, o micro-organismo incluindo a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico e/ou o polinucleotídeo que codifica a mesma pode ser um micro-organismo preparado por transformação com um vetor incluindo o polinucleotídeo, mas não está limitado ao mesmo.

[042] Conforme usado no presente documento, o termo "transformação" refere- se a um processo de introdução de um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo em uma célula hospedeira, de modo que a proteína codificada pelo polinucleotídeo possa ser expressa na célula hospedeira. Não importa se o polinucleotídeo transformado é inserido no cromossomo de uma célula hospedeira e localizado nele ou localizado fora do cromossomo, desde que o polinucleotídeo transformado possa ser expresso na célula hospedeira. Além disso, o polinucleotídeo pode incluir DNA e RNA que codificam a proteína-alvo. O polinucleotídeo pode ser introduzido de qualquer forma, desde que o polinucleotídeo possa ser introduzido na célula hospedeira e expresso nela. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é uma construção de gene incluindo todos os elementos necessários para sua expressão autônoma. O cassete de expressão pode incluir um promotor, um sinal de terminação de transcrição, um local de ligação ao ribossomo e um sinal de terminação de tradução que pode estar operacionalmente ligado ao polinucleotídeo. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão que executa a autorreplicação. Além disso, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira, como deve ser operacionalmente ligado à sequência necessária para a expressão na célula hospedeira, mas não está limitado ao mesmo.

[043] Além disso, o termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma ligação funcional entre uma sequência de genes e uma sequência promotora que inicia e medeia a transcrição do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo desejado da presente revelação.

[044] O termo "micro-organismo incluindo o polipeptídeo variante" ou "micro organismo incluindo a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico", conforme usado no presente documento, significa um micro-organismo preparado que fornece habilidades para produzir IMP para um micro-organismo com habilidades naturalmente fracas de produzir IMP ou uma cepa progenitora sem habilidades para produzir IMP. Especificamente, o micro-organismo pode ser um micro-organismo que expressa a variante da desidrogenase de ácido 5’-inosínico com o polipeptídeo incluindo a substituição de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que a substituição de aminoácidos pode incluir pelo menos qualquer um selecionado do grupo que consiste na substituição do aminoácido na posição 377 por treonina e substituição do aminoácido na posição 499 a partir do terminal N com isoleucina. Além disso, o micro-organismo pode ser um microorganismo que expressa o polipeptídeo variante, em que o micro-organismo tem atividade desidrogenase do ácido 5‘-inosínico por substituição do aminoácido na posição 377 por outro aminoácido, substituição do aminoácido na posição 499 por outro aminoácido , ou substituição do aminoácido na posição 377 por outro aminoácido e substituição do aminoácido na posição 499 por outro aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, mas não está limitada a isso.

[045] O micro-organismo pode ser uma célula ou um micro-organismo que pode incluir o polinucleotídeo que codifica a variante de desidrogenase de ácido 5’- inosínico, ou pode ser transformado com o vetor incluindo o polinucleotídeo que codifica a variante da desidrogenase de ácido 5’-inosínico para expressar a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico e com relação aos objetos da presente revelação, a célula hospedeira ou o micro-organismo pode ser qualquer microorganismo, desde que inclua a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico para produzir ácido 5’-ininosínico.

[046] Na presente revelação, o micro-organismo produtor de ácido 5'-inosínico pode ser usado de forma intercambiável com um micro-organismo produtor de ácido 5'-inosínico ou um micro-organismo com produtividade de ácido 5'-inosínico.

[047] Como usado aqui, o termo "micro-organismo que produz ácido 5‘-inosínico" pode ser um micro-organismo em que ocorre uma modificação genética ou a atividade é aprimorada para produzir o ácido 5'-inosínico desejado, incluindo todos de um micro-organismo do tipo selvagem ou um micro-organismo em que ocorre uma modificação genética natural ou artificial, e o micro-organismo pode ser um micro-organismo em que um mecanismo específico é enfraquecido ou aprimorado pela inserção de um gene exógeno ou pelo aprimoramento ou inativação da atividade de um gene endógeno. Com relação aos objetos da presente revelação, o micro-organismo que produz o ácido 5'-inosínico pode ser caracterizado pelo fato de que o micro-organismo inclui a variante da desidrogenase de ácido 5'-inosínico para aumentar a produtividade do ácido 5'-inosínico desejado e, especificamente, o micro-organismo pode ser um micro-organismo do gênero Corynebacterium. Especificamente, na presente revelação, o micro-organismo produtor de ácido 5'-inosínico ou o micro-organismo com produtividade de ácido 5'-inosínico pode ser um micro-organismo em que uma porção dos genes envolvidos na via de biossíntese do ácido 5'-inosínico é aprimorada ou enfraquecida, ou uma porção dos genes envolvidos na via de degradação do ácido 5'-inosínico é aumentada ou enfraquecida. Por exemplo, o micro-organismo pode ser um micro-organismo em que a expressão do purF que codifica amidotransferase fosforibosilpirofosfato é aprimorada ou a expressão da purA que codifica sintetase adenilossuccinato é enfraquecida, mas não está limitada a ela.

[048] Conforme usado no presente documento, o termo "o micro-organismo do gênero Corynebacterium produtor de ácido 5’-inosínico" refere-se a um microorganismo do gênero Corynebacterium que possui produtividade de ácido 5’-inosínico naturalmente ou por mutação. Especificamente, conforme usado no presente documento, o micro-organismo do gênero Corynebacterium com produtividade de ácido 5'-inosínico pode ser um micro-organismo do gênero Corynebacterium que melhorou a produtividade do ácido 5’-inosínico ao aumentar ou enfraquecer a atividade do gene guaB que codifica a desidrogenase de ácido 5'-inosínico. Mais especificamente, conforme usado no presente documento, o micro-organismo do gênero Corynebacterium com produtividade de ácido 5'-inosínico pode ser um micro-organismo do gênero Corynebacterium que melhorou a produtividade de ácido 5’- inosínico incluindo a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico ou o polinucleotídeo que codifica a mesma ou por ser transformado com o vetor incluindo o polinucleotídeo que codifica a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico. O 'micro-organismo do gênero Corynebacterium, que melhorou a produtividade de ácido 5'-inosínico' significa um micro-organismo que melhorou a produtividade de ácido 5'- inosínico, em comparação com uma cepa-mãe antes da transformação ou um micro-organismo não modificado. O 'micro-organismo não modificado' significa uma cepa do tipo selvagem em si, ou um micro-organismo que não inclui a proteína variante produtora de ácido 5’-inosínico, ou um micro-organismo que não é transformado com o vetor, incluindo o polinucleotídeo que codifica a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico.

[049] Conforme usado no presente documento, o "micro-organismo do gênero Corynebacterium" pode ser especificamente Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, Corynebacteris efficiens, Corynebacterium station, mas não está limitado aos mesmos.

[050] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método de preparação de ácido 5'-inosínico, que inclui a cultura do micro-organismo do gênero Corynebacterium produzindo ácido 5'-inosínico em um meio; e recuperação de ácido 5'-inosínico do micro-organismo ou do meio.

[051] No método, a etapa de cultura do micro-organismo pode ser realizada por uma cultura de batelada conhecida, cultura contínua, cultura de batelada alimentada, etc., mas não é particularmente limitada às mesmas. Nesse sentido, as condições de cultura não são particularmente limitadas, mas um pH ideal (por exemplo, pH 5 a pH 9, especificamente pH 6 a pH 8 e, mais especificamente pH 6,8) pode ser ajustado usando um composto básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou um composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico). Uma condição aeróbica pode ser mantida adicionando oxigênio ou uma mistura gasosa que contém oxigênio à cultura. A temperatura da cultura pode ser mantida de 20 °C a 45 °C, e especificamente de 25 °C a 40 °C, e a cultura pode ser realizada por cerca de 10 horas a cerca de 160 horas, mas não está limitada a isso. O ácido 5’- inosínico produzido pela cultura pode ser secretado no meio ou permanecer dentro das células.

[052] Além disso, em um meio de cultura pode ser usado, como fonte de carbono, açúcares e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose), óleos e gorduras (por exemplo, óleo de soja óleo de semente de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcoois (por exemplo, glicerol e etanol), ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético), etc. podem ser usados individualmente ou em uma mistura, mas a fonte de carbono não está limitada às mesmas. Como fonte de nitrogênio, um composto orgânico que contém nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, aguardente de milho, farinha de soja e ureia) ou um composto inorgânico (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio) etc. podem ser usados individualmente ou em uma mistura, mas a fonte de nitrogênio não está limitada às mesmas. Como fonte de fósforo, di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio, um sal que contém sódio correspondente ao mesmo, etc., podem ser usados individualmente ou em uma mistura, mas a fonte de fósforo não está limitada a ele. O meio também pode incluir materiais essenciais para promover o crescimento, como outros sais de metais (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos e vitaminas.

[053] Um método de recuperação do ácido 5'-inosínico produzido na etapa de cultura da presente revelação é coletar o ácido 5'-inosínico do líquido da cultura usando um método apropriado conhecido na técnica de acordo com o método de cultura. Por exemplo, centrifugação, filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização, HPLC, etc. podem ser usados e o ácido 5'-inosínico desejado pode ser recuperado do meio ou do micro-organismo usando um método apropriado conhecido na técnica.

[054] Além disso, a etapa de recuperação pode incluir um processo de purificação. O processo de purificação pode ser realizado usando um método apropriado conhecido na técnica. Portanto, o ácido 5'-inosínico recuperado pode ser uma forma purificada ou um líquido de fermentação de micro-organismos, incluindo o ácido 5’-inosínico (Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A.J. Nair., 2008).

[055] A seguir, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, é evidente para os especialistas na técnica às quais a presente revelação se refere que estes Exemplos são apenas para fins ilustrativos, e o escopo da presente invenção revelada não se destina a ser limitado por esses Exemplos.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DA CEPA BASEADA NO TIPO SELVAGEM PRODUTORA DE IMP

[056] A cepa do tipo selvagem do gênero Corynebacterium não pode produzir IMP ou pode produzir IMP em uma quantidade muito pequena. Portanto, uma cepa produtora de IMP foi preparada com base em Corynebacterium stationis ATCC6872. Mais especificamente, a cepa produtora de IMP foi preparada aumentando a atividade da PurF que codifica amidotransferase fosforibosilpirofosfato, que é a primeira enzima da biossíntese de purina, e a atividade de enfraquecimento da PurA que codifica a sintenase de adenilossuccinato PurA na via de degradação do ácido 5'-inosínico. EXEMPLO 1-1: PREPARAÇÃO DA CEPA MELHORADA POR PURF

[057] A fim de preparar uma cepa na qual o códon inicial do purF foi alterado, um vetor de inserção que contém purF foi primeiro preparado. Para clonar o gene purF no vetor de inserção, especificamente, a PCR foi realizada usando o DNA genômico de Corynebacterium stationis ATCC6872 como modelo e iniciadores de SEQ ID NOS: 9 e 10 e SEQ ID NOS: 11 e 12 por 30 ciclos de desnaturação a 94 °C por 30 s, recozimento a 55 °C por 30 s e extensão a 72 °C por 2 min. A PCR foi realizada usando dois fragmentos de DNA obtidos pela PCR acima como modelo e iniciadores de SEQ ID NOS: 9 e 12 por 30 ciclos de desnaturação a 94 °C por 30 s, recozimento a 55 °C por 30 s e extensão a 72 °C por 2 min para obter um fragmento de DNA. O fragmento de DNA obtido foi clivado pela enzima de restrição XbaI e clonado em um vetor (pDZ (patente coreana n° 10-0924065 e publicação internacional de patente n° 2008-033001)) que foi clivado pela mesma enzima. O vetor preparado pelo método acima foi designado como pDZ-purF-g1a.

[058] O vetor recombinante pDZ-purF-g1a foi transformado em Corynebacterium stationis ATCC6872 por eletroporação e, em seguida, as cepas nas quais o vetor foi inserido no DNA genômico por recombinação homóloga foram selecionadas em um meio que contém 25 mg/l de canamicina. As cepas primárias assim selecionadas foram sujeitas a cruzamento secundário e, em seguida, as cepas selecionadas foram submetidas a sequenciação, selecionando assim uma cepa desejada na qual a mutação foi introduzida, e essa cepa foi designada como cepa ATCC6872::purF (g1a).

EXEMPLO 1-2: PREPARAÇÃO DA CEPA purA ENFRAQUECIDA

[059] A fim de preparar uma cepa na qual o códon inicial de purA foi alterado, um vetor de inserção que contém purA foi preparado primeiro. Para clonar o gene purA no vetor de inserção, especificamente, a PCR foi realizada usando o DNA genômico de Corynebacterium stationis ATCC6872 como modelo e iniciadores de SEQ ID NOS: 13 e 14 e SEQ ID NOS: 15 e 16. Clonagem dos produtos de PCR foram realizadas como no Exemplo 1-1, e um vetor assim preparado foi designado como pDZ-purA-a1t.

[060] O vetor recombinante pDZ-purA-a1t foi transformado na cepa ATCC6872::purF (g1a) preparada no Exemplo 1-1 por eletroporação, e as cepas nas quais o vetor foi inserido no DNA genômico por recombinação homóloga foram selecionadas em um meio que contém 25 mg/l de canamicina. As cepas primárias assim selecionadas foram submetidas a cruzamento secundário e, em seguida, as cepas selecionadas foram submetidas a sequenciação, selecionando assim uma cepa desejada na qual a mutação foi introduzida.

[061] A cepa produtora de IMP finalmente selecionada com base no tipo selvagem Corynebacterium stationis ATCC6872 foi designada como CJI2331.

EXEMPLO 1-3: TESTE DE TITULAÇÃO DE FERMENTAÇÃO DE CJI2331

[062] 2 ml de um meio de cultura de sementes foram dispensados em tubos de ensaio com um diâmetro de 18 mm e autoclavados sob pressão. Cada um de ATCC6872 e CJI2331 foi inoculado e incubado a 30 °C por 24 h com agitação para ser usado como culturas de sementes. 29 ml de um meio de fermentação foram dispensados em frascos de Erlenmeyer com agitação de 250 ml e autoclavados sob pressão a 121 °C por 15 min, e 2 ml da cultura de sementes foram inoculados e incubados por 3 dias. As condições de cultura foram ajustadas a uma velocidade de rotação de 170 rpm, a uma temperatura de 30 °C e a pH 7,5.

[063] Após a conclusão da cultura, a quantidade de IMP produzida foi medida por HPLC (SHIMAZDU LC20A), e os resultados da cultura são como na Tabela 3 abaixo. Os resultados a seguir sugerem que a cepa aprimorada por purF e enfraquecida por purA tem produtividade de IMP.

- Meio de cultura de sementes: 1% de glicose, 1% de peptona, 1% de extrato de carne, 1% de extrato de levedura, 0,25% de cloreto de sódio, 100 mg/l de adenina, 100 mg/l de guanina, pH 7,5 - Meio de fermentação: 0,1% de glutamato de sódio, 1% de cloreto de amônio, 1,2% de sulfato de magnésio, 0,01% de cloreto de cálcio, 20 mg/l de sulfato de ferro, 20 mg/l de sulfato de manganês, 20 mg/l de sulfato de zinco, 5 mg/l de sulfato de cobre, 23 mg/l de l-cisteína, 24 mg/l de alanina, 8 mg/l de ácido nicotínico, 45 μg/l de biotina, 5 mg/l de cloridrato de tiamina, 30 mg/l de cloridrato de adenina, 30 mg/l de adenina, 1,9% de ácido fosfórico (85%) , 2,55% de glicose, 1,45% de frutose.

EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE VARIANTE ENFRAQUECIDA DE DESIDROGENASE DE ÁCIDO 5’-INOSÍNICO

[064] Para identificar uma mutação na desidrogenase de ácido 5’-inosínico que melhora a produtividade do IMP, foi preparada uma biblioteca mutante de guaB, que é um gene que codifica a desidrogenase de ácido 5’-inosínico. EXEMPLO 2-1: PREPARAÇÃO DO VETOR QUE CONTÉM guaB

[065] A fim de preparar uma biblioteca de mutantes guaB, um vetor recombinante que contém guaB foi primeiro preparado. A PCR foi realizada usando o DNA genômico de Corynebacterium stationis ATCC6872 como modelo e iniciadores das SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18, e um produto de PCR foi clonado no vetor E. coli pCR2.1 usando um TOPO Cloning Kit (Invitrogen) para obter pCR-guaB.

EXEMPLO 2-2: PREPARAÇÃO DA BIBLIOTECA DE MUTANTES guaB

[066] Uma biblioteca de mutantes guaB foi preparada com base no vetor preparado no Exemplo 2-1. A biblioteca foi preparada usando um kit de PCR propenso a erros (kit de mutagênese aleatória clontech Diversify® PCR). Sob condições em que mutações podem ocorrer, a PCR foi realizada usando os iniciadores das SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20. Especificamente, nas condições em que 0 a 3 mutações por 1.000 bp podem ocorrer, o pré-aquecimento foi realizado a 94 °C por 30 segundos, seguidos por 25 ciclos de 94 °C por 30 segundos e 68 °C por 1 minuto e 30 segundos. Um produto de PCR assim obtido foi submetido a PCR usando um megainiciador (500 ng a 125 ng) por 25 ciclos de 95 °C por 50 s, 60 °C por 50 s e 68 °C por 12 minutos e, em seguida, tratado com DpnI, e transformado em E. coli DH5α e espalhado em meio sólido de LB que contém canamicina (25 mg/l). Foram selecionados 20 tipos de colônias transformadas e, em seguida, foram obtidos plasmídeos, seguidos por análise de sequenciamento. Como resultado, foi confirmado que mutações foram introduzidas em locais diferentes a uma frequência de 2 mutações/kb. Foram tomadas cerca de 20.000 colônias de E. coli transformadas e os plasmídeos foram extraídos e designados como uma biblioteca de pTOPO-guaB.

EXEMPLO 2-3: AVALIAÇÃO DA BIBLIOTECA PREPARADA E SELEÇÃO DA CEPA

[067] A biblioteca de pTOPO-guaB preparada no Exemplo 2-2 foi transformada na cepa CJI2331 preparada no Exemplo 1 por eletroporação e depois espalhada em um meio nutriente que contém 25 mg/l de canamicina para obter 10.000 colônias nas quais o gene mutante foi inserido. Cada uma das colônias foi designada como CJI2331_pTOPO_guaB (mt) 1 a CJI2331_pTOPO_guaB (mt) 10000. - Meio nutriente: 1% de peptona, 1% de extrato de carne, 0,25% de cloreto de sódio, 1% de extrato de levedura, 2% de ágar, pH 7,2

[068] Cada uma das 10.000 colônias obtidas foi inoculada em 200 μl de um meio de cultura de sementes autoclavado sob pressão e cultivada em uma placa de 96 poços com agitação a 30 °C, 1.200 rpm por 24 h usando um agitador de microplacas (TAITEC) e, em seguida, usado como uma cultura de sementes. Dispensaram-se 290 μl de meio de fermentação autoclavado sob pressão em uma placa de 96 poços e inocularam-se 20 μl de cada uma das culturas de sementes, seguido de cultura com agitação nas mesmas condições acima por 72 h.

[069] Para analisar a produção de ácido 5'-inosínico no meio de cultura, após a conclusão da cultura, 3 μl de sobrenadante da cultura foram transferidos para uma placa UV de 96 poços, cada poço que contém 197 μl de água destilada. Em seguida, um leitor de microplacas foi usado para realizar agitação por 30 segundos e um espectrofotômetro para medir a densidade óptica a 25 °C, 270 nm e comparado com a densidade óptica da cepa CJI2331 para selecionar 50 colônias de mutantes mostrando 10% ou mais aumento na densidade óptica. Outras colônias apresentaram densidade óptica semelhante ou diminuída, em comparação com a regulatória.

[070] As densidades ópticas das 50 cepas selecionadas foram medidas da mesma maneira que acima para examinar repetidamente as quantidades de produção de ácido 5'-inosínico. Foram selecionadas três linhagens de CJI2331_pTOPO_guaB (mt) 133, CJI2331_pTOPO_guaB (mt) 1209 e CJI2331_pTOPO_guaB (mt) 8927, que apresentaram notável melhora na produtividade do ácido 5'-inosínico, em comparação com a cepa CJI2331.

EXEMPLO 2-4: IDENTIFICAÇÃO DA MUTAÇÃO POR SEQUENCIAÇÃO

[071] A fim de identificar mutações genéticas das cepas mutantes, cada uma das células CJI2331_pTOPO_guaB (mt) 133, CJI2331_pTOPO_guaB (mt) 1209 e CJI2331_pTOPO_guaB (mt) 8927 foi submetida a PCR usando os iniciadores da SEQ ID NOS: 21 e 22, seguidos por sequenciação. Seus genes guaB foram comparados com os da cepa de tipo selvagem ATCC6872 e CJI2331.

[072] Como resultado, todas as três linhagens incluem mutação no gene guaB em diferentes locais.

[073] Especificamente, foi confirmado que a cepa CJI2331_pTOPO_guaB (mt) 133 tem uma mutação de substituição de treonina na posição 499 em isoleucina, a cepa CJI2331_pTOPO_guaB (mt) 1209 tem uma mutação de substituição de alanina na posição 377 em treonina e CJPO233 e CJPO233 (mt) a cepa 8927 tem uma mutação de substituição de alanina na posição 377 para treonina e uma mutação de substituição de treonina na posição 499 para isoleucina na sequência de aminoácidos do gene GuaB representada pela SEQ ID NO: 2. Portanto, nos seguintes Exemplos 3 e 4, foi examinado se cada uma das mutações acima afetou a quantidade de IMP produzida pelo micro-organismo do gênero Corynebacterium.

EXEMPLO 3: EXAME DA PRODUTIVIDADE DE IMP EM CJI2331

[074] As mutações identificadas no Exemplo 2 foram introduzidas no CJI2331, que é uma cepa produtora de IMP derivada de ATCC6872, e a produtividade de IMP foi examinada.

EXEMPLO 3-1: PREPARAÇÃO DA CEPA INTRODUZIDA À MUTAÇÃO

[075] A fim de introduzir as mutações identificadas no Exemplo 2, os oligonucleotídeos reversos que contém as mutações-alvo foram projetados em um comprimento de 75-mer, respectivamente.

[076] Especificamente, 30 μg de um oligonucleotídeo da SEQ ID NO: 23 ou 24 foram transformados na cepa CJI2331 por um método de pulso elétrico (Appl. Microbiol. Biothcenol., 1999,52: 541-545) e 1 ml de foi adicionado um meio líquido complexo, seguido de cultura com agitação a 30 °C e 160 rpm por 30 min. Depois disso, a cultura foi incubada em gelo por 10 min e centrifugada a 4 °C e 4000 rpm por 10 min, e o sobrenadante foi descartado para obter um pellet de células. Em seguida, foram adicionados 1 ml de uma solução de glicerol a 10% a 4 °C, seguido por mistura. A mistura foi centrifugada a 4 °C e 4.000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi descartado e um sedimento celular foi lavado. O sedimento celular foi lavado mais uma vez e foram adicionados 0,1 ml de solução de glicerol a 10% a 4 °C para preparar as células para transformação subsequente. Depois disso, as células foram transformadas com o oligonucleotídeo da SEQ ID NO: 23 ou 24 pelo método de pulso elétrico acima, e este procedimento foi repetido dez vezes. As células foram espalhadas em uma placa de ágar complexa para obter colônias (Nat. Protoc., 2014 Out; 9 (10): 2301-16).

[077] A análise de sequenciamento das colônias obtidas foi realizada. Como resultado, verificou-se que as mutações-alvo foram introduzidas nas cepas. A cepa introduzida com a mutação A377T na proteína codificada pelo gene guaB foi designada como CJI2331_guaB_m1, e a cepa introduzida com a mutação T499I na mesma proteína foi designada como CJI2331_guaB_m2.

[078] Além disso, a fim de preparar uma cepa mutante incluindo ambas as mutações A377T e T499I, 30 μg do oligonucleotídeo da SEQ ID NO: 24 foram transformados na cepa CJI2331_guaB_m1 e as colônias foram obtidas da mesma maneira que acima (Nat. Protoc., Out de 2014; 9 (10): 2301-16). A análise de sequenciamento das colônias obtidas foi realizada e uma cepa introduzida com as mutações A377T e T499I na proteína codificada pelo gene guaB foi selecionada e designada como CJI2331_guaB_m1m2.

EXEMPLO 3-2: EXAME DA PRODUTIVIDADE DE IMP EM CEPAS INTRODUZIDAS À MUTAÇÃO

[079] 2 ml de um meio de cultura de sementes foram dispensados em tubos de ensaio com um diâmetro de 18 mm e autoclavados sob pressão. Cada um de ATCC6872 e CJI2331 foi inoculado e incubado a 30 °C por 24 h com agitação para ser usado como culturas de sementes. 29 ml de um meio de fermentação foram dispensados em frascos de Erlenmeyer com agitação de 250 ml e autoclavados sob pressão a 121 °C por 15 min, e 2 ml da cultura de sementes foram inoculados e incubados por 3 dias. As condições de cultura foram ajustadas a uma velocidade de rotação de 170 rpm, a uma temperatura de 30 °C e a pH 7,5.

[080] Após a conclusão da cultura, a quantidade de IMP produzida foi medida por HPLC (SHIMAZDU LC20A) e os resultados são os seguintes na Tabela 7. Conforme mostrado nos resultados a seguir, a cepa CJI2331_guaB_m1 ou CJI2331_guaB_m2 com mutação A377T ou A mutação T499I na proteína codificada pelo gene guaB mostrou melhora na concentração de IMP de 0,42 g/l (40%) ou 0,21 g/l (20%), respectivamente, em comparação com a cepa reguladora CJI2331. Além disso, a cepa CJI2331_guaB_m1m2 com as mutações A377T e T499I mostrou a maior melhoria na concentração de IMP de 0,58 g/l (50%), sugerindo que a melhoria mais eficaz na concentração de IMP pode ser obtida quando as duas mutações são incluídas.

EXEMPLO 4: EXAME DA PRODUTIVIDADE DE IMP EM CEPAS PRODUTORAS DE IMP DERIVADAS DE ATCC6872 EXEMPLO 4-1: SELEÇÃO DA CEPA PRODUTORA DE IMP DERIVADA DE ATCC6872

[081] A fim de preparar uma cepa produtora de IMP derivada de ATCC6872, ATCC6872 foi suspenso em um tampão de fosfato (pH 7,0) ou um tampão de citrato (pH 5,5) a uma densidade de 107 células/ml a 108 células/ml, e então tratado com UV à temperatura ambiente ou 32 °C por 20 minutos a 40 minutos para induzir mutações. A cepa foi lavada duas vezes com uma solução salina a 0,85% e espalhada em um meio mínimo que contém 1,7% de ágar que foi suplementado com uma substância para fornecer resistência a uma concentração adequada, e assim foram obtidas colônias. Cada colônia foi cultivada em meio nutriente e cultivada em meio de cultura de sementes por 24 h, e depois cultivada em meio de fermentação por 3 a 4 dias. Como resultado, foi selecionada uma colônia que apresentou a melhor produção de IMP acumulada no meio de cultura. Para preparar uma cepa que produz uma alta concentração de IMP, adenina-auxotrófica, guanina do tipo gotejante, sensibilidade à lisozima, resistência à 3,4-desidroprolina, resistência à estreptomicina, resistência ao ácido azetidina carboxílico, resistência à tiaprolina, resistência à azaserina, resistência à sulfaguanidina, resistência à norvalina, e a resistência ao trimetoprim foram fornecidas pelo procedimento acima, sequencialmente. O CJI2335, fornecido com as resistências acima e com excelente produtividade de IMP, foi finalmente selecionado. A resistência de CJI2335 em relação a ATCC6872 foi comparada e mostrada na Tabela 8 a seguir. TABELA 8

- Meio mínimo: 2% de glicose, 0,3% de sulfato de sódio, 0,1% de fosfato de potássio monobásico, 0,3% de fosfato de potássio dibásico, 0,3% de sulfato de magnésio, 10 mg/l de cloreto de cálcio, 10 mg/l de cloreto de cálcio, 10 mg/l de sulfato de ferro, 1 mg/l de sulfato de zinco , 3,6 mg/l cloreto de manganês, 20 mg/l l-cisteína, 10 mg/l pantotenato de cálcio, 5 mg/l cloridrato de tiamina, 30 μg/l de biotina, 20 mg/l de biotina, 20 mg/l de adenina, 20 mg/l de guanina, ajustado para pH 7,3.

EXEMPLO 4-2: TESTE DE TITULAÇÃO DE FERMENTAÇÃO DE CJI2335

[082] 2 ml de um meio de cultura de sementes foram dispensados em tubos de ensaio com um diâmetro de 18 mm e autoclavados sob pressão. Cada um de ATCC6872 e CJI2335 foi inoculado e incubado a 30 °C por 24 h com agitação para ser usado como culturas de sementes. 29 ml de um meio de fermentação foram dispensados em frascos de Erlenmeyer com agitação de 250 ml e autoclavados sob pressão a 121 °C por 15 min, e 2 ml da cultura de sementes foram inoculados e incubados por 3 dias. As condições de cultura foram ajustadas a uma velocidade de rotação de 170 rpm, a uma temperatura de 30 °C e a pH 7,5.

[083] Após a conclusão da cultura, a quantidade de IMP produzida foi medida por HPLC (SHIMAZDU LC20A), e os resultados são os da Tabela 9 a seguir.

EXEMPLO 4-3: PREPARAÇÃO DO VETOR DE INSERÇÃO QUE CONTÉM MUTAÇÃO DE guaB

[084] A fim de introduzir cepas com a mutação selecionada no Exemplo 3, um vetor de inserção foi preparado. Um vetor para introdução da mutação guaB foi preparado como se segue. A PCR foi realizada usando o gene guaB (A377T) da cepa CJI2331_pTOPO_guaB (mt) 1209 e o gene guaB (T499I) da cepa CJI2331_pTOPO_guaB (mt) 133 selecionado no Exemplo 2 como modelo e iniciadores da SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26. A PCR foi realizada por desnaturação a 94 °C por 5 min e, em seguida, por 20 ciclos a 94 °C por 30 s, a 55 °C por 30 s, a 72 °C por 1 min, seguida de polimerização a 72 °C por 5 min. Os fragmentos de genes resultantes foram cada um clivado por Xbal. Cada um dos fragmentos de genes que foram clivados pela enzima de restrição XbaI foi clonado em um vetor pDZ linear usando a ligase T4, e assim foram preparados pDZ-guaB (A377T) e pDZ-guaB (T499I).

EXEMPLO 4-4: INTRODUÇÃO DO MUTANTE NA CEPA CJI2335 E AVALIAÇÃO

[085] A fim de confirmar a sequência nucleotídica do gene guaB da cepa CJI2335 selecionada no Exemplo 4-1, o DNA genômico de CJI2335 foi amplificado por PCR. Especificamente, a PCR foi realizada pela primeira vez usando DNA cromossômico de CJI2335 como modelo e iniciadores de SEQ ID NOS: 21 e 22 por 28 ciclos de polimerização a 94 °C por 1 min, a 58 °C por 30 segundos e a 72 °C por 2 min com Taq DNA polimerase para amplificar guaB de cerca de 2,1 kb. A sequência foi realizada usando os mesmos iniciadores e, como resultado, a sequência foi a mesma do gene guaB do tipo selvagem ATCC6872, indicando que não há mutação no gene guaB.

[086] CJI2335 foi transformado com cada um dos vetores pDZ-guaB (A377T) e pDZ-guaB (T499I) preparados no Exemplo 4-3, e as cepas nas quais o vetor foi inserido no DNA genômico por recombinação homóloga foram selecionadas em um meio que contém 25 mg/l de canamicina. As estirpes primárias assim selecionadas foram sujeitas a cruzamento secundário para selecionar estirpes nas quais a mutação no gene-alvo foi introduzida. A introdução da mutação genética nas cepas transformadas desejadas foi examinada por PCR usando os iniciadores da SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22 e, em seguida, foi realizada a sequenciação para confirmar a introdução da mutação nas cepas. Especificamente, a cepa introduzida com a mutação A377T na proteína codificada pelo gene guaB foi designada como CJI2335_guaB_m1, e a cepa introduzida com a mutação T499I na proteína codificada pelo gene guaB foi designada como CJI2335_guaB_m2. Além disso, para preparar uma cepa mutante com ambas as mutações A377T e T499I, a cepa CJI2335_guaB_m1 foi transformada com o vetor pDZ-guaB (T499I) e as colônias foram obtidas da mesma maneira que acima. Para análise de sequenciamento das colônias obtidas, uma cepa introduzida com as mutações A377T e T499I na proteína codificada pelo gene guaB foi selecionada e designada como CJI2335_guaB_m1m2.

[087] Como mostrado na Tabela 12, a cepa CJI2335_guaB_m1 ou CJI2335_guaB_m2 com a mutação A377T ou a mutação T499I na proteína codificada pelo gene guaB apresentou concentração de IMP de 2,2 g/l (40%) ou 1,0 g/l (18,5%), respectivamente, indicando melhoria, em comparação com a cepa reguladora CJI2335. Além disso, a cepa CJI2331_guaB_m1m2 com ambas as mutações A377T e T499I mostrou melhora na concentração de IMP de 2,7 g/l (50%), indicando que quando as duas mutações são incluídas, uma melhoria mais eficaz pode ser obtida na concentração de IMP.

[088] Estes resultados sustentam que quando a variante da desidrogenase de ácido 5’-inosínico da presente revelação é introduzida em vários tipos do micro-organismo do gênero Corynebacterium com produtividade de IMP, a produtividade do ácido 5'-inosínico pode ser grandemente melhorada.

[089] O CJI2335 foi depositado no Centro de Cultura Coreano de Micro organismos em 22 de junho de 2018, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste e com o número de acesso atribuído KCCM12278P. Além disso, a cepa CJI2335_guaB_m1m2 preparada, também chamada CJI2347, foi depositada no Centro de Cultura Coreano de Micro-organismos em 22 de junho de 2018, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste e com o número de acesso atribuído KCCM12279P.

[090] Com base na descrição acima, será entendido pelos especialistas na técnica que a presente revelação pode ser implementada em uma forma específica diferente sem alterar o espírito técnico ou as características essenciais da mesma. Portanto, deve ser entendido que a modalidade acima não é limitativa, mas ilustrativa em todos os aspectos. O escopo da presente revelação é definido pelas reivindicações anexas, e não pela descrição que as precede, e, portanto, todas as alterações e modificações que se enquadram dentro dos limites e limites das reivindicações, ou equivalentes de tais critérios e limites, devem, portanto, ser adotadas por as reclamações. Nome da instituição depositária: Coleção Coreana para Culturas Tipo (estrangeira) Número de acesso ao depósito: KCCM12278P Data do depósito: 20180622 Nome da instituição depositária: Coleção Coreana para Culturas Tipo (estrangeira) Número de acesso ao depósito: KCCM12279P Data do depósito: 20180622

EFEITO DA INVENÇÃO

[091] Quando o micro-organismo Corynebacterium do gênero produtor de ácido 5’-inosínico é cultivado usando uma variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico da presente revelação, é possível produzir ácido 5’-inosínico com alto rendimento.

Claims

1. Variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico caracterizada por ter i) substituição de um aminoácido na posição 377 por treonina, ii) substituição de um aminoácido na posição 499 por isoleucina, ou iii) substituição do aminoácido na posição 377 por treonina e substituição do aminoácido na posição 499 por isoleucina em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

2. Polinucleotídeo caracterizado por codificar a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico, de acordo com a reivindicação 1, que é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, e suas sequências degeneradas.

3. Vetor caracterizado por compreender o polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 2.

4. Micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz ácido 5’- inosínico, sendo que o micro-organismo é caracterizado por compreender a variante de desidrogenase de ácido 5’-inosínico de acordo com a reivindicação 1 ou o vetor de acordo com a reivindicação 3.

5. Micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz ácido 5’- inosínico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o microorganismo do gênero Corynebacterium ser Corynebacterium stationis.

6. Método de preparação de ácido 5’-inosínico caracterizado por compreender: cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium de acordo com a reivindicação 4 em um meio; e recuperar o ácido 5’-inosínico do micro-organismo ou do meio.

7. Método de preparação de ácido 5’-inosínico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o micro-organismo do gênero Corynebacterium ser Corynebacterium stationis.