BR112020004575A2

BR112020004575A2 - polinucleotídeo, vetor, microrganismo do gênero corynebacterium, métodos para produção de substância-alvo e para preparar uma composição fermentada, e, composição fermentada.

Info

Publication number: BR112020004575A2
Application number: BR112020004575-6A
Authority: BR
Inventors: Sun Hyoung CHOI; Jin Sook CHANG; Hyung Joon Kim; Byoung Hoon Yoon; Ji Yeon Lee; Yunjung Choi
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2018-03-09
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2020-09-24
Also published as: AU2019232209B2; US20210002654A1; US11352608B2; CA3073607C; CN110709517A; SG11202002185SA; ZA202001382B; KR102132342B1; JP7018128B2; AR114670A1; TW201940501A; CN110709517B; TWI714015B; WO2019172702A1; KR20190106815A; AU2019232209A1; EP3763819A4; JP2021514602A; EP3763819A1; BR112020004575B1

Abstract

A presente revelação se refere a um promotor inovador e um método para produzir aminoácidos L que usam o promotor, e mais especificamente, a um polinucleotídeo inovador que tem atividade de promotor, sendo que um vetor e um microrganismo do gênero Corynebacterium compreendem o polinucleotídeo, um método para produzir aminoácidos L que usa o microrganismo, e uma composição fermentada.

Description

1 / 28 POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM, MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIA-ALVO E PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO FERMENTADA, E, COMPOSIÇÃO FERMENTADA [CAMPO DA TÉCNICA]

[001] A presente revelação se relaciona com um promotor inovador e um método para produzir de L-aminoácido que usa o promotor, e mais especificamente, com um polinucleotídeo inovador que tem atividade de promotor, um vetor e um microrganismo do gênero Corynebacterium que compreende o polinucleotídeo, um método para produzir aminoácidos L que usa o microrganismo, e uma composição fermentada. [ANTECEDENTES DA TÉCNICA]

[002] L-ácido glutâmico é um aminoácido representativo produzido pela fermentação e tem um único e distintivo gosto, e, portanto, é um aminoácido importante usado amplamente no campo alimentar, assim como no campo médico e outros campos de alimento animal.

[003] É conhecido que um método típico para produzir L-ácido glutâmico inclui um método de fermentação que usa um microrganismo do gênero Brevibacterium ou Corynebacterium e uma bactéria corineforme que inclui uma cepa mutante da mesma (Fermentação de Aminoácido, Gakkai Shuppan Center: 195 a 215, 1986) ou que usa Escherichia coli ou microrganismos dos gêneros Bacillus, Streptomyces, Penicillum, Klebsiella, Erwinia, Pantoea, etc. (Patende nº US 3.220.929 e nº 6.682.912). Quando L- ácido glutâmico é produzido através de fermentação microbiana, vários materiais, além disso, com L-ácido glutâmico, que incluem ácidos orgânicos, são misturados em um produto fermentado.

[004] Esses ácidos orgânicos são compostos orgânicos ácidos, e incluem ácido lático, ácido acético, ácido fórmico, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido úrico, etc. Ácidos orgânicos em alimentos apresentam gostos

2 / 28 umami e azedo, e têm o efeito de prevenir apodrecimento pela redução do pH dos alimentos. É geralmente conhecido que ácido lático conta para a porção maior de ácidos orgânicos produzidos através de fermentação microbiana.

[005] No entanto, conforme a porção de ácidos láticos produzida por fermentação é maior, o gosto azedo nos fermentados produziu aumentos, e como resultado, a palatabilidade pode ser diminuída. Portanto, é necessário regular a quantidade de produção de ácido lático no produto fermentado produzido através de fermentação microbiana.

[006] Com esse antecedente, os presentes inventores têm feito esforços para reduzir a produtividade de ácido orgânico em um microrganismo que produz L-ácido glutâmico. Como resultado, os presentes inventores têm desenvolvido um polinucleotídeo inovador que tem a atividade promotora da presente revelação, e têm descoberto que o polinucleotídeo pode aumentar a produtividade de L-ácido glutâmico na cepa e que pode reduzir a produtividade de ácido lático, completando assim a presente revelação. [REVELAÇÃO] [PROBLEMA TÉCNICO]

[007] Um objetivo da presente revelação é fornecer um polinucleotídeo que tem atividade promotora, caracterizado pelo fato de que o trigésimo sétimo nucleotídeo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 é substituído por G.

[008] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um vetor que compreende o polinucleotídeo; e um gene que codifica uma proteína-alvo ligada de modo operável ao polinucleotídeo.

[009] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um microrganismo do gênero Corynebacterium que compreender o polinucleotídeo; e um gene que codifica uma proteína-alvo ligada de modo operável ao polinucleotídeo.

3 / 28

[0010] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para produzir uma substância-alvo, que compreende: cultivar o microrganismo do gênero Corynebacterium em um meio; e que recupera uma substância-alvo do meio.

[0011] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para preparar uma composição fermentada, que compreende fermentar cultivando-se o microrganismo do gênero Corynebacterium em um meio.

[0012] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer uma composição fermentada preparada pelo método acima. [SOLUÇÃO TÉCNICA]

[0013] Abaixo no presente documento, a presente revelação será descrita em detalhe. Enquanto isso, cada descrição e modalidade reveladas na presente revelação podem ser aplicadas a outras descrições e modalidades. Isto é, todas as combinações de vários elementos revelados na presente revelação são abrangidas no escopo da presente revelação. Adicionalmente, as descrições específicas reveladas abaixo não devem ser construídas conforme limitam o escopo da presente revelação.

[0014] Para alcançar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação fornece um polinucleotídeo que tem atividade promotora, caracterizado pelo fato de que o trigésimo sétimo nucleotídeo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 é substituída por G.

[0015] Conforme usado no presente documento, o termo “sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2” pode referir-se a uma parte da sequência promotora de um gene que codifica desidrogenase lática (LDH).

[0016] Em particular, o termo “desidrogenase lática” refere-se a uma enzima que produz lactato, isto é, ácido lático, que usa pivurato como um substrato, e pode ser nomeado de modo intercambiável como “LDH” na presente revelação. Especificamente, o gene de desidrogenase lática pode

4 / 28 incluir a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 3, e a proteína da mesma pode incluir a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, mas esses não são limitados aos mesmos.

[0017] Conforme usado no presente documento, o termo “promotor” refere-se a uma sequência de a montante de nucleotídeo não transladado de uma região de codificação, a qual inclui um domínio de ligação de polimerase e tem uma atividade de iniciação de transcrição para um gene-alvo do promotor dentro do mRNA, que é, um domínio de DNA para qual um a polimerase se liga para iniciar a transcrição de mRNA. Em particular, o gene- alvo do promoter pode ser desidrogenase lática, porém sem limitação à mesma.

[0018] O polinucleotídeo da presente revelação é um no qual a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, isto é, a sequência promotora do gene de desidrogenase lática, é transformada. Especificamente, a mutação pode ser uma substituição de T, o qual é o trigésimo sétimo nucleotídeo da sequência acima, por G. Em concordância, o polinucleotídeo pode consistir na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1.

[0019] Em particular, o termo “modificação” refere-se a uma mudança fenotípica que é estável geneticamente ou não geneticamente, e pode ser referida de modo intercambiável “mutação” na presente revelação.

[0020] Especificamente, o polinucleotídeo pode ter atividade promotora que é modificada (aumentada ou diminuída) com relação à atividade de um polinucleotídeo, o qual não inclui a modificação de polinucleotídeo. Em concordância, as expressões de um gene-alvo ligado de modo operável ao polinucleotídeo e a atividade de uma proteína codificada pelo gene-alvo podem ser reguladas (aumentada ou diminuída), e adicionalmente, a expressão de outros genes se não o gene-alvo pode ser regulado.

[0021] Para os objetivos da presente revelação, o polinucleotídeo

5 / 28 pode ser um que atenue a atividade de desidrogenase lática.

[0022] Adicionalmente, o polinucleotídeo pode ser um que aumenta a quantidade de produção de L-ácido glutâmico e/ou que diminui a quantidade de produção de ácido lático.

[0023] Tem sido conhecido que a desidrogenase lática está envolvida na produção de ácido lático, mas a relação da mesma com a produção de L- ácido glutâmico não é conhecida e foi primeiramente identificada pelos presentes inventores. Em particular, os presentes inventores confirmaram pela primeira vez a diminuição na atividade de desidrogenase lática pela modificação do promotor de desidrogenase lática, assim como os efeitos do aumento da quantidade de produção de L-ácido glutâmico e diminuição da quantidade de produção de ácido lático devido ao mesmo.

[0024] No presente documento, “L-ácido glutâmico” ou “L- glutamato” refere-se a um tipo de aminoácido e é classificado como um aminoácido não essencial. L-ácido glutâmico é conhecido por ser o mais comum neurotransmissor excitatório no sistema nervoso central. Além disso, já que o L-ácido glutâmico tem um gosto umami, o glutamato monossódico (MSG) tem sido desenvolvido a partir do mesmo e é amplamente usado como um melhorador de sabor. É geralmente produzido através de fermentação de microrganismo que produzem L-ácido glutâmico.

[0025] Adicionalmente, o termo “ácido lático” é um tipo de ácido orgânico que tem um gosto azedo. Além disso, o ácido lático é usado como um agente de gosto azedo para extratos de frutas, xaropes, e refrigerante para propósitos comestíveis, e é usado para prevenir a propagação de bactéria saprogênica nos estágios iniciais de fermentação de álcoois. O ácido lático é geralmente produzido por fermentação em microrganismos que produzem ácido lático. Além disso, se produzido em excesso, a qualidade do produto fermentado pode deteriorar devido ao gosto azedo de modo excessivo, e, portanto, a concentração de ácido lático precisa ser apropriadamente regulada

6 / 28 durante a cultura.

[0026] Especificamente, o polinucleotídeo pode ser um composto da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1.

[0027] Adicionalmente, a sequência de nucleotídeo da presente revelação pode ser modificada por métodos de mutagênese conhecidos, assim como uma evolução direcionada, mutagênese sítio-direcionada, etc.

[0028] Portanto, o polinucleotídeo pode compreender um polinucleotídeo que inclui a sequência de nucleotídeo que tem uma homologia à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 60%, especificamente pelo menos 70%, mais especificamente pelo menos 80%, e ainda mais especificamente pelo menos 83%, 84%, 88%, 90%, 93%, 95%, ou 97%. É aparente que uma sequência de polinucleotídeo que tem tal homologia, uma parte da qual é deletada, modificada, substituída, ou adicionada, está também dentro do escopo da presente revelação, desde que a sequência de polinucleotídeo resultante tenha uma atividade biológica substancialmente equivalente ou que corresponda à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1.

[0029] Conforme usado no presente documento, o termo “homologia” pode indicar o grau de compatibilidade com a sequência de nucleotídeo dada, e pode ser apresentada como uma percentagem (%). Na presente revelação, uma sequência de homologia que tem uma atividade a qual é idêntica ou similar à sequência de nucleotídeo dada é apresentada como “% homologia”. A homologia à sequência de nucleotídeo pode ser determinada por, por exemplo, BLAST algoritmo (ver Karlin e Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993) ou FASTA (ver Pearson, Methods Enzymol., 183, 63, 1990). Baseado nesses algoritmos, os programas chamados BLASTN ou BLASTX têm sido desenvolvidos (ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

[0030] Conforme usado no presente documento, o termo “condições rigorosas” refere-se às condições as quais permitem hibridação específica

7 / 28 entre polinucleotídeos. Por exemplo, tais condições rigorosas são especificamente descritas na literatura (por exemplo, J. Sambrook et al.). Por exemplo, as condições rigorosas podem incluir condições nas quais genes que têm uma alta homologia (por exemplo, 60% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, ainda mais especificamente 97% ou mais, e ainda mais especificamente 99% ou mais) podem hibridizar uns com os outros, considerando que genes que têm uma menor homologia dos mesmos não podem hibridizar uns com os; ou condições para hibridização de Southern convencional (isto é, condições para lavagem uma, e especificamente duas ou três vezes em uma concentração de sal e temperatura que corresponde a 60 °C, 1×SSC, 0,1% SDS, especificamente a 60 °C, 0,1×SSC, 0,1% SDS; e mais especificamente em 68 °C, 0,1×SSC, 0,1% SDS). A hibridização requer que dois nucleotídeos tenham sequências complementares, embora incompatibilidades entre bases sejam possíveis dependendo da gravidade de hibridização. O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeo que são capazes de serem hibridizadas umas com as outras. Por exemplo, com relação ao DNA, adenosina é complementar à timina e citosina é complementar à guanina. Portanto, a presente revelação pode também incluir sequências de nucleotídeo similar de modo substancial assim como fragmentos de polinucleotídeo isolados complementares à toda a sequência.

[0031] Especificamente, o polinucleotídeo que tem homologia pode ser detectado usando condições de hibridização que inclui um passo de hibridização em um valor Tm de 55 °C e que usa as condições descritas acima. Além disso, o valor Tm pode ser 60 °C, 63 °C, ou 65 °C, porém sem limitação do mesmo. Uma das pessoas de habilidade comum na técnica podem apropriadamente ajustar o valor Tm de acordo com seus propósitos. O rigor apropriado de hibridizar os polinucleotídeos depende do comprimento e do grau de complementaridade dos polinucleotídeos, e as variáveis são muito

8 / 28 conhecidas na técnica (ver Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).

[0032] Em particular, a expressão “consiste da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1” significa que, quando usam uma enzima de restrição, a adição, exclusão, e/ou mutação de um nucleotídeo não são excluídas, as quais podem ocorrer durante o processo de ligação com um gene-alvo quando o polinucleotídeo correspondente é ligado ao gene-alvo usado como um promotor.

[0033] Por exemplo, o polinucleotídeo que tem a atividade de um promotor que consiste da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 pode ser incluído sem limitação desde que inclua a sequência de nucleotídeo a qual tem a atividade promotora da presente revelação e a qual é hibridizada sob condições rigorosas com uma sequência complementar para todas ou uma parte da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1.

[0034] Adicionalmente, o polinucleotídeo da presente revelação pode ser ligado de modo operável a um gene que codifica uma proteína-alvo.

[0035] Conforme usado no presente documento, o termo “sequência regulamentar de expressão gene” refere-se a uma sequência a qual inclui o polinucleotídeo da presente revelação e é capaz de expressar um gene-alvo ligado de modo operável ao polinucleotídeo.

[0036] Conforme usado no presente documento, o termo “ligado de modo operável” significa que o polinucleotídeo da presente revelação que tem atividade promotora é ligado de modo funcional à sequência de gene para transcrição iniciar e mediar transcrição de um gene-alvo. Ligação operável com a sequência de gene pode ser acionada usando uma técnica recombinante de gene conhecida na técnica, e clivagem e ligação de DNA específico de sítio podem ser desempenhados usando-se uma enzima restritiva e ligase conhecidas na técnica, porém essas não são limitadas à mesma.

[0037] Adicionalmente, a sequência regulamentar de expressão gene da presente revelação pode adicionalmente incluir qualquer sequência

9 / 28 operadora para transcrição reguladora de genes a não ser promotores para desempenhar a transcrição de genes, assim como uma sequência que codifica um sítio de ligação com ribossomo mRNA adequado, DNA, etc. para regular a terminação de transição e translação.

[0038] Por exemplo, uma sequência regulamentar adequada para procariotas pode adicionalmente incluir, além disso, com promotores, sítios de ligação com ribossomo, porém sem limitação aos mesmos. O polinucleotídeo da presente revelação que tem atividade promotora pode consistir em uma sequência para regulamentar a expressão gene conforme descrita acima, conforme requerida por uma pessoa de habilidade comum na técnica.

[0039] Na presente revelação, o gene-alvo refere-se a um gene que codifica uma proteína-alvo cuja expressão será regulada em um microrganismo.

[0040] Por exemplo, o gene pode ser um gene envolvido na produção de um produto selecionado do grupo que consiste de aminoácidos (ácido glutâmico, etc.), ácidos orgânicos (ácido lático, etc.), e combinações dos mesmos, porém sem limitação aos mesmos. Especificamente, o gene pode ser um gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de aminoácidos (ácido glutâmico, etc.) e/ou um gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de ácidos orgânicos (ácido lático, etc.), porém sem limitação aos mesmos. Mais especificamente, o gene pode ser um gene que codifica desidrogenase lática (LDH), porém sem limitação à mesma. A sequência do gene que codifica a LDH pode ser facilmente obtida por pessoas de habilidade comum na técnica através de um banco de dados conhecido assim como GenBank dos Institutos Nacionais da Saúde (NIH).

[0041] Por exemplo, a sequência regulamentar de expressão gene da presente revelação é ligada de modo operável a uma sequência de gene que codifica LDH, e, portanto, a quantidade de produção de ácido glutâmico em

10 / 28 um microrganismo pode ser aumentada e a quantidade de produção de ácido lático pode ser reduzida.

[0042] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um vetor que compreende o gene; o polinucleotídeo; e um gene que codifica uma proteína-alvo ligada de modo operável ao polinucleotídeo.

[0043] O polinucleotídeo é conforme descrito acima.

[0044] Especificamente, a proteína-alvo pode ser desidrogenase lática (LDH).

[0045] Conforme usado no presente documento, o termo “vetor” refere-se a uma molécula de DNA artificial que tem um material genético capaz de expressar um gene-alvo em um hospedeiro adequado, e refere-se a uma construção de DNA que inclui o polinucleotídeo ou uma sequência regulamentar de expressão adequada; e uma sequência de nucleotídeo do gene que codifica uma proteína-alvo ligada de modo operável à sequência regulamentar.

[0046] O vetor usado na presente revelação não é particularmente limitado desde que possa ser expressado em uma célula do hospedeiro, e qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado para transformar a célula do hospedeiro. Exemplos do vetor convencional pode incluir plasmídeos recombinantes e naturais, cosmídeos, vírus e bacteriófagos.

[0047] Por exemplo, conforme um vetor fago ou vetor cosmídeo, pWE15, M13, λLB3, λBL4, λⅨII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, Charon21A, etc. podem ser usados; e um vetor plasmídeo, esses baseados em pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET, etc. podem ser usados.

[0048] Adicionalmente, um promotor endógeno no cromossomo pode ser substituído pelo polinucleotídeo da presente revelação que tem atividade promotora por via do vetor para inserção cromossômica na célula do hospedeiro. Por exemplo, vetores pECCG117, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pCES208, pXMJ19, etc. podem

11 / 28 ser usados, porém sem limitação aos mesmos.

[0049] Adicionalmente, a inserção do polinucleotídeo dentro do cromossomo pode ser realizada através de qualquer método conhecido pela técnica, por exemplo, através de recombinação homóloga.

[0050] Uma vez que o vetor da presente revelação pode ser inserido dentro do cromossomo por incluir uma recombinação homóloga, o marcador de seleção pode ser adicionalmente incluído para confirmar uma inserção de gene bem-sucedida dentro do cromossomo. O marcador de seleção é para rastreio das células as quais são transformadas com o vetor, em outras palavras, para determinar se o polinucleotídeo está inserido. Os marcadores que fornecem fenótipos selecionáveis assim como resistência medicamentosa, auxotrofia, resistência a agentes tóxicos, ou expressão de proteínas de superfície podem ser usados. Em um ambiente tratado com um agente seletivo, apenas as células que expressam o marcador de seleção podem sobreviver, ou as células mostram um diferente fenótipo, e, portanto, as células transformadas com sucesso podem ser selecionadas através desse método.

[0051] Conforme usado no presente documento, o termo “transformação” refere-se à introdução do vetor que compreende o polinucleotídeo ou a sequência regulatória de expressão gene e o gene que codifica uma proteína-alvo dentro da célula do hospedeiro a fim de permitir a expressão do gene na célula do hospedeiro. Adicionalmente, desde que o gene-alvo possa ser expressado na célula do hospedeiro, não importa se o polinucleotídeo transformado e o gene que codifica a proteína-alvo são localizados no cromossomo da célula do hospedeiro ou na parte exterior do cromossomo, e ambos os casos estão incluídos.

[0052] O método de transformação pode incluir todos os métodos de introdução à sequência regulatória de expressão gene e o gene que codifica uma proteína-alvo dentro da célula, e pode ser executado selecionando-se

12 / 28 uma técnica padrão adequada conhecida na técnica que depende da célula do hospedeiro. Por exemplo, uma técnica padrão adequada pode ser selecionada dentre electroporação, precipitação com fosfato de cálcio (CaPO4),m precipitação com cloreto de cálcio (CaCl2), microinjeção, uma técnica de polietilenoglicol (PEG), uma técnica de DEAE-dextrano, uma técnica de lipossomas catiônicos, e uma técnica de acetato de lítio-DMSO, porém sem limitações aos mesmos.

[0053] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um microrganismo do gênero Corynebacterium que compreende o polinucleotídeo; e um gene que codifica um gene-alvo ligado ao polinucleotídeo.

[0054] O polinucleotídeo e o gene que codifica um gene-alvo ligado de modo operável ao polinucleotídeo são conforme descritos acima.

[0055] Conforme usado no presente documento, o termo “microrganismo” inclui todos os tipos de microrganismos selvagem e um microrganismo modificado geneticamente de modo natural ou artificial, e pode ser um microrganismo que tem um mecanismo reforçado ou atenuado particular, devido a inserção de um gene exterior ou reforço ou atenuação de atividade de um gene endógeno.

[0056] Na presente revelação, o microrganismo pode incluir o polinucleotídeo, especificamente o polinucleotídeo e/ou um gene que codificam um gene-alvo ligado de modo operável ao polinucleotídeo. Alternativamente, o microrganismo pode incluir o polinucleotídeo ou a sequência regulatória de expressão gene e o vetor que inclui o polinucleotídeo ou a sequência regulatória de expressão gene e o gene que codifica uma proteína-alvo, porém sem limitação aos mesmos. Além disso, o polinucleotídeo, o gene que codifica a proteína-alvo, e o vetor podem ser introduzidos dentro do microrganismo através de transformação, porém sem limitação aos mesmos. Adicionalmente, desde que o gene possa ser

13 / 28 expressado no microrganismo, não importa se o polinucleotídeo e o gene que codifica uma proteína-alvo são localizados no cromossomo ou na parte exterior do cromossomo.

[0057] Para os objetivos da presente revelação, o microrganismo que inclui o polinucleotídeo e o gene que codifica uma proteína-alvo podem ser um no qual a quantidade de produção de L-ácido glutâmico é aumentada e a quantidade de produção de ácido lático é reduzida.

[0058] Por exemplo, o microrganismo pode ter o polinucleotídeo no qual a atividade de desidrogenase lática é atenuada.

[0059] Na presente revelação, o microrganismo pode ser incluído sem limitação desde que seja um microrganismo no qual o polinucleotídeo da presente revelação que tem atividade promotora é introduzido para que opere como um promotor.

[0060] Especificamente, o microrganismo pode ser um microrganismo do gênero Corynebacterium; mais especificamente pode ser Corynebacterium glutamicum ou Corynebacterium flavum; e mais especificamente pode ser Corynebacterium glutamicum, porém sem limitação aos mesmos.

[0061] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para produzir uma substância-alvo, que compreende: cultivar o microrganismo do gênero Corynebacterium em um meio; e recuperar uma substância-alvo do meio.

[0062] O polinucleotídeo e o microrganismo são conforme descritos acima.

[0063] Na presente revelação, a substância-alvo pode ser um aminoácido. Especificamente, o aminoácido pode ser um aminoácido de tipo L salvo menção ao contrário, e pode ser um aminoácido selecionado do grupo que consiste em glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, treonina, serina, cisteína, glutamina, metinina, asparato, asparagina, ácido glutâmico, lisina,

14 / 28 arginina, histidina, fenilanina, tirosina, triptofano, prolina, e uma combinação dos mesmos, porém sem limitação aos mesmos.

[0064] Mais especificamente, o aminoácido pode ser ácido glutâmico, porém sem limitação ao mesmo.

[0065] Conforme usado no presente documento, o termo “cultivo” refere-se ao cultivo de um microrganismo sob condições ambientais controladas artificialmente. Na presente revelação, o método para produzir uma substância-alvo que usa um microrganismo com o polinucleotídeo pode ser executado por um método amplamente conhecido na técnica. Especificamente, o cultivo pode ser executado em um processo de lote ou em um processo contínuo assim como um processo de lotes descontínuos alimentados ou um processo de lotes descontínuos alimentados repetidos, porém sem limitação aos mesmos. O meio usado para o cultivo precisa satisfazer os requerimentos de um empregado de cepa particular. O meio de cultivo adequado para usar na cultura da cepa Corynebacterium é conhecido na técnica (por exemplo, Manual de Métodos para Bacteriologia Geral pela Sociedade Americana para Bacteriologia, Washington D.C., USA, 1981).

[0066] Fontes de carbono que podem ser usadas no meio de cultivo podem ser sacarídeos e carboidratos assim como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido, e celulose; óleos e lipídeos assim como um óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de amendoim, e óleo de coco; ácidos gordurosos assim como ácido palmítico, ácido estérico, ácido linoleico; álcoois assim como glicerol e etanol; e ácidos orgânicos assim como ácido acético. Esses materiais podem ser usados separadamente ou em combinação, porém sem limitação dos mesmos.

[0067] Exemplos de fontes nitrogenadas que podem ser usadas incluem peptona, extrato de levedura, caldo, extrato de malte, milhocina, farinha de soja e ureia, ou compostos inorgânicos assim como sulfato de amónio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, e nitrato

15 / 28 de amônio. Essas fontes nitrogenadas podem também serem usadas separadamente ou em combinação, porém sem limitação das mesmas.

[0068] Fontes fosforosas que podem ser usadas no meio de cultivo podem incluir fosfato de hidrogênio, di-hidrogenofosfato de potássio, ou que corresponde à sais que contém sódio. Além disso, o meio de cultivo pode conter sais metálicos essenciais para o crescimento de células, e pode ser suplementado com materiais essenciais para o crescimento, assim como aminoácidos e vitaminas, além disso, com os materiais acima. Adicionalmente, precursores adequados para o meio de cultivo podem ser usados. As substâncias brutas acima podem ser adequadamente lançadas dentro do cultivo em um lote ou modo contínuo.

[0069] Durante o cultivo do microrganismo, o pH do cultivo pode ser ajustado por um composto básico apropriado assim como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, ou amoníaco, ou um composto ácido assim como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico. A espuma deve ser ajustada por um agente antiespumante assim como um éster poliglicólico de ácido gordo. As condições aeróbicas do cultivo podem ser mantidas introduzindo-se oxigênio ou misturas de gás que contém oxigênio (por exemplo, ar).

[0070] A temperatura do cultivo (meio) pode ser geralmente 20 °C a 45 °C, especificamente 25 °C a 40 °C. Cultivo pode ser continuado até a quantidade de produção desejada da substância-alvo ser obtida, especificamente para 10 horas a 160 horas.

[0071] A recuperação da substância-alvo do cultivo (meio) pode ser executada por um método de separação convencional conhecido na técnica. Para o método de separação, métodos tais como centrifugação, filtração, cromatografia, cristalização, etc. podem ser usados. Por exemplo, um sobrenadante obtido centrifugando-se o meio de cultivo em uma baixa velocidade para remover biomassa pode ser separado por cromatografia de troca iônica, porém sem limitação do mesmo. Em um método alternativo, a

16 / 28 substância-alvo pode ser recuperada sem um processo de purificação adicional, desempenhando-se processos de separação de células bacterianas do produto de cultivo (meio) e filtração. Em outro método alternativo, a substância-alvo pode ser recuperada, e o passo de recuperação pode adicionalmente incluir um processo de purificação.

[0072] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para preparar uma composição fermentada, que compreende fermentação cultivando-se o microrganismo do gênero Corynebacterium em um meio.

[0073] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece uma composição fermentada preparada pelo método acima.

[0074] O polinucleotídeo e microrganismo são conforme descritos acima, e o passo de cultivar o microrganismo em um meio está também descrito acima.

[0075] Conforme usado no presente documento, o termo “a composição fermentada” refere-se a uma composição obtida cultivando-se o microrganismo da presente revelação em um meio. Adicionalmente, a composição de fermentação pode incluir uma composição na forma de um líquido ou pó obtido após cultivar o microrganismo seguido de um pós- tratamento adequado. Em particular, o processo de pós-tratamento adequado pode incluir, por exemplo, um processo de cultivar o microrganismo, um processo de remover células bacterianas, um processo de concentração, um processo de filtração, e um processo de transportadoras misturadas, e pode adicionalmente incluir um processo de secagem. Em alguns casos, o processo de pós-tratamento pode não incluir um processo de purificação. A composição fermentada, obtida cultivando-se o microrganismo da presente revelação, é caracterizada em que a quantidade de produção de ácido glutâmico é aumentada enquanto a quantidade de produção de ácido lático é reduzida, que torna possível, desse modo, fornece um gosto ótimo.

[0076] Adicionalmente, “a composição de fermentação” não exclui

17 / 28 produtos de tempero (por exemplo, produtos de sopa em pó, produtos condimentados para lanche, etc.) que contém a composição na forma de um líquido ou pó. Adicionalmente, “a composição de fermentação” não exclui casos nos quais uma substância obtida por um processo de não fermentação ou outra substância obtida por um processo não natural são adicionalmente incluídos, desde que a composição obtida se cultivando o microrganismo da presente revelação esteja contida no mesmo. [EFEITOS VANTAJOSOS]

[0077] O promotor inovador da presente revelação pode ser introduzido dentro de um microrganismo que produz aminoácidos, através do mesmo amentando a quantidade de produção de aminoácidos no microrganismo e reduzindo a quantidade de produção de ácidos orgânicos. Especificamente, quando L-ácido glutâmico é preparado usando o promotor inovador da presente revelação, a quantidade de L-ácido glutâmico e ácidos orgânicos em um produto fermentado são ajustáveis para melhorar o gosto e a palatabilidade do produto fermentado. [DESCRIÇÃO DETALHADA DA REALIZAÇÃO]

[0078] Abaixo, no presente documento, a presente revelação vai se descrita em detalhe com realizações exemplares acompanhantes. No entanto, as realizações exemplares reveladas no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas limitando o escopo da presente revelação. EXEMPLO 1: SELEÇÃO DE CEPA MUTANTE PARA REDUZIR

PRODUTIVIDADE DE ÁCIDO LÁTICO EXEMPLO 1-1: INDUÇÃO DE MUTAÇÃO ALEATÓRIA POR

IRRADIAÇÃO UV

[0079] A fim de selecionar cepas mutantes nas quais a produtividade de L-glutde selecion, o qual selecionar cepas mutantes nas quais a produtividade de enas para propa pr de a proppropionar cepas

18 / 28 mutantepalatabilidade de um produto fermentado, o diminual , o tipo selvagem Corynebacterium glutamicum (ATCC13869) foi plantado em meios de nutriente que conttado em m foi cultivado em 30 30 para 16 horas. Centenas das colmeios obtidas dessa forma foram irradiadas com UV em temperatura ambiente para induzir uma mutante aleatente no genoma na cepa. EXEMPLO 1-2: EXPERIMENTAÇÃO EM TITULAÇÃO DE

FERMENTAÇÃO DE CEPA DE INDUÇÃO DE MUTAÇÃO E SELEÇÃO DE CEPA

[0080] Depois disso, a experimentação em titulação de fermentação das cepas mutantes, nas quais a mutação aleatória foi induzida, foi executada.

[0081] Cada colônia foi subcultivada nos meios de nutriente, e depois cultivada em meio de fermentação por 5 horas. Depois disso, 25% entre 40 foi adicionado a cada meio em uma concentração de 0,4%, e depois cada colônia foi cultivada novamente por 32 horas. MEIO DE NUTRIENTE:

[0082] Glicose 1%, suco de carne 0,5%, polipeptona 1%, cloreto de sódio 0,25%, extrato de levedura 0,5%, ágar 2%, ureia 0,2%, pH 7,2. MEIO DE FERMENTAÇÃO:

[0083] Açúcar bruto 6%, carbonato de cálcio 5%, sulfato de amónio 2,25%, monosfato de potássio 0,1%, sulfato de magnésio 0,04%, sulfato de ferro (10 mg/l), biotina (0,3 mg/l), cloridrato de tiamina (0,2 mg/l).

[0084] Cada uma dentre as colônias foram cultivadas sob as condições acima, e depois cepas mutantes que produzem L-ácido glutâmico, cuja quantidade de produção é igual a ou superior ao produzido pelo tipo selvagem Corynebacterium glutamicum (ATCC13869), foram selecionadas. Além disso, com relação às cepas mutantes selecionadas, a concentração de L-ácido glutâmico foi medida por YSI, e a concentração de ácido lático foi medida por HPLC. As concentrações medidas de L-ácido glutâmico e ácido lático são mostradas na Tabela 1.

19 / 28 [TABELA 1] Cepa L-ácido glutâmico (g/l) Ácido lático (g/l) ATCC13869 14,5 1,5 ATCC13869-m1 15,1 1,2 ATCC13869-m2 14,0 0,7 ATCC13869-m3 17,7 1,5 ATCC13869-m4 13,9 2,0 ATCC13869-m5 14,4 1,8 ATCC13869-m6 16,7 0,9 ATCC13869-m7 18,8 0,4 ATCC13869-m8 16,2 0,7 ATCC13869-m9 18,9 0,1 ATCC13869-m10 12,4 2,1 ATCC13869-m11 13,8 2,1 ATCC13869-m12 15,7 1,4 ATCC13869-m13 15,3 0,8 ATCC13869-m14 16,4 1,0 ATCC13869-m15 17,2 1,1 ATCC13869-m16 18,2 0,7

[0085] Baseado na Tabela 1, “ATCC13869-m7” e “ATCC13869-m9” foram selecionadas conforme as cepas nas quais a quantidade de L-ácido glutâmico produzido foi melhorado e a quantidade de ácido lático produzido foi diminuído comparado com aqueles produzidos na cepa selvagem. EXEMPLO 2: CONFIRMAÇÃO DE MUTAÇÃO ATRAVÉS DE

ENCADEAMENTO GENÉTICO

[0086] A fim de confirmar a mutação de gene das cepas mutantes, genes nas cepas ATCC13869-m7 e ATCC13869-m9 foram comparados com aqueles da cepa selvagem.

[0087] Como resultado, foi constatado que as cepas ATCC13869-m7 e ATCC13869-m9 continham a mesma mutação em uma posição específica na região promotora de um gene que codifica desidrogenase lática.

[0088] Especificamente, foi confirmado que ATCC13869-m7 e ATCC13869-m9 continham uma mutação na qual o trigésimo sétimo nucleotídeo, T, na sequência da região promotora de SEQ ID NO: 2 é substituída por G. Foi confirmado que a região promotora de SEQ ID NO: 2 era uma sequência comumente incluída em um microrganismo do gênero Corynebacterium, mais especificamente, o tipo selvagem Corynebacterium

20 / 28 glutamicum (ATCC13032, ATCC13869, e ATCC14067).

[0089] Portanto, nos Exemplos 3 e 4, tentativas foram feitas para confirmar se a mutação acima afetava a quantidade de produção de ácido glutâmico e ácido lático no microrganismo do gênero Corynebacterium. EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DE CEPA INTRODUZIDA COM

MUTAÇÃO E CONFIRMAÇÃO DE QUANTIDADE DE PRODUÇÃO

DE ÁCIDO LÁTICO EXEMPLO 3-1: PREPARAÇÃO DE CEPA INTRODUZIDA COM

MUTAÇÃO

[0090] Uma tentativa foi feita para preparar uma cepa mutante introduzida com a mutação confirmada no Exemplo 2. Especificamente, a fim de introduzir a mutação dentro do tipo selvagem Corynebacterium glutamicum ATCC13869 e ATCC13032 (isto é, fim de substituir o trigésimo sétimo nucleotídeo da sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2 com G), o oligonucleotídeo em uma direção reversa, a qual contém uma mutação- alvo, foi destinado a um comprimento de 75 mer.

[0091] Especificamente, o oligonucleotídeo (30 µg) de SEQ ID NO: 5 foi transformado no tipo selvagem Corynebacterium glutamicum cepas ATCC13869 e ATCC13032 usando um método de pulso elétrico (Appl. Microbiol. Biotechnol., 1999, 52:541 a 545), e depois um meio líquido complexo (1 ml) foi adicionado ao mesmo. Os resultantes foram depois cultivados a 30 °C por 30 minutos enquanto agitavam em 160 rpm. Depois disso, o meio de cultivo foi incubado em gelo por 10 minutos, centrifugado em 4.000 rpm a 4 °C por 10 minutos, e depois o sobrenadante foi removido para obter células microbianas. Depois disso, 1 ml de uma solução de glicerol 10% (4 °C) foi adicionada ao mesmo e misturado, e depois os resultantes foram centrifugados em 4.000 rpm a 4 °C por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e depois as células microbianas foram lavadas. Tal procedimento foi repetido uma vez mais para lavar as células microbianas novamente, e uma

21 / 28 solução de glicerol 10% (4 °C e 0,1 ml) foi adicionada ao mesmo para preparar as cepas para a próxima transformação. Depois disso, o processo para a transformação foi repetido 10 vezes com o oligonucleotídeo de SEQ ID NO: 5 usando o método de pulso elétrico descrito acima, e depois os resultantes foram cromados em um meio de placa complexo para obter colônias (Nat. Protoc., outubro de 2014; 9(10): 2301-16).

[0092] Como resultado de executar as análises das sequências de gene das colônias obtidas, foi confirmado que a mutação-alvo foi introduzida dentro das cepas. Além disso, as cepas dentro das quais a mutação foi introduzida foram nomeadas como “ATCC13869::ldh-pro-1mt” e “ATCC13032::ldh-pro-1mt”. EXEMPLO 3-2: CONFIRMAÇÃO DE QUANTIDADE DE

PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁTICO

[0093] As cepas mutantes ATCC13869::ldh-pro-1mt e ATCC13032::ldh-pro-1mt, as quais eram preparadas no Exemplo 3-1, e seus tipos selvagem Corynebacterium glutamicum cepa ATCC13869 e ATCC13032 eram cultivadas no mesmo modo que no Exemplo 1-2.

[0094] Depois que o cultivo estava completo, as concentrações de L- ácido glutâmico e ácido lático em cada meio foram medidas. As concentrações medidas de L-ácido glutâmico e ácido lático são mostradas na Tabela 2 abaixo. [TABELA 2] Cepa L-ácido glutâmico (g/l) Ácido lático (g/l) ATCC13869 14,5 1,5 ATCC13869::ldh-pro-1mt 19,2 0,0 ATCC13032 8,2 2,7 ATCC13032::ldh-pro-1mt 10,8 0,3

[0095] Conforme mostrado na Tabela 2, foi confirmado que a concentração de L-ácido glutâmico produzido pela Corynebacterium glutamicum cepa ATCC13869::ldh-pro-1mt, dentro da qual a mutação foi introduzida, foi maior do eu aquela produzida pelo tipo selvagem

22 / 28 Corynebacterium glutamicum cepa ATCC13869 por cerca de 4,7 g/l (cerca de 32%). Por outro lado, o tipo selvagem Corynebacterium glutamicum cepa ATCC13869 produziu 1,5 g/l de ácido lático, porém ácido lático não foi medido no meio no qual a cepa ATCC13869::ldh-pro-1mt foi cultivada.

[0096] Adicionalmente, foi confirmado que a concentração de L- ácido glutâmico produzido pela Corynebacterium glutamicum cepa ATCC13032::ldh-pro-1mt, dentro da qual a mutação foi introduzida, foi maior do que aquela produzida pelo tipo selvagem Corynebacterium glutamicum cepa ATCC13032 por cerca de 2,6 g/l (cerca de 32%). Por outro lado, o tipo selvagem Corynebacterium glutamicum cepa ATCC13032 produziu 2,7 g/l de ácido lático, porém uma quantidade vestigial de ácido lático (0,3 g/l) foi medida no meio no qual a cepa ATCC13032::ldh-pro-1mt foi cultivada.

[0097] Ou seja, foi confirmado que a mutação aumentou a produtividade de L-ácido glutâmico e reduziu a produtividade de ácido lático nos microrganismos.

[0098] Adicionalmente, a cepa ATCC13869::ldh-pro-1mt foi nomeada como CA02-9209 e depositada no Centro Coreano de Cultivo de Microrganismos (KCCM), a qual é uma autoridade de depósito internacional sob o Tratado de Budapeste, em 28 de fevereiro de 2018, e foi designada Adesão nº KCCM12227P. EXEMPLO 4: CONFIRMAÇÃO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA E

QUNTIDADE DE ÁCIDO LÁTICO PRODUZIDO EM CEPA KFCC11074 DENTRO DO QUAL MUTAÇÃO É INTRODUZIDA EXEMPLO 4-1: PREPARAÇÃO DE VETOR DENTRO DO QUAL

MUTAÇÃO É INTRODUZIDA

[0099] A fim de confirmar se a muta de apresenta o mesmo efeito nas cepas com produtividade melhorada de produtividade meal produt, l produtselvagem, tentativas foram feitas para introduzir a mutaroduzida o da cepa KFCC11074 (Patente Coreana nm mtente Coreana qual conhecida como

23 / 28 cepa produtora de as para introduzi

[00100] Especificamente, um vetor para substituição de gene foi construído a fim de substituir o trigésimo sétimo nucleotídeo da sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2, o qual está contido na cepa, com G. Os fragmentos de gene para construir o vetor foram obtidos por PCR que usa DNA genômico ATCC13869 como um modelo. Baseado em informação de genes e sequências adjacentes da Corynebacterium glutamicum (ATCC13869) registradas no GenBank dos Instituos Nacionais de Saúde (NIH GenBank), primários que incluem os polinucleotídeos de SEQ ID NOS: 6, 7, 8, e 9 foram preparados.

[00101] Depois da desnaturação a 95 °C por 5 minutos, PCR foi executado por um total de 30 ciclos sob as condições seguintes: desnaturação a 95 °C por 20 segundos, hibridização a 55 °C por 20 segundos, e polimerização a 72 °C por 30 segundos. Depois disso, a reação de polimerização foi executada a 72 °C por 5 minutos. Mais especificamente, o polinucleotídeo (500 bp) amplificado que usa os primários de SEQ ID NOS: 6 e 7 e o polinucleotídeo (500 bp) amplificado que usa os primários de SEQ ID NOS: 8 e 9 foram obtidos. Os dois fragmentos de DNA obtidos foram ligados ao vetor pDZ (Patente Coreano nº 10-0924065 e Publicação Internacional nº 2008-033001), o qual foi digerido com enzimas restritivas BamHI e SalI, usando-se uma enzima de infusão, e desse modo um vetor para substituição de gene foi preparado. O vetor preparado foi nomeado como “pDZ-ldh-pro- 1mt”. A informação nas sequências primárias usadas para a preparação de vetor é mostrada na Tabela 3 abaixo. [TABLE 3]

SEQ ID Iniciador Sequência (5′ a 3′) NO: 6 ldh-pro-1mt-AF CGGTACCCGGGGATCCTGTGGGTGGCGTTGTA 7 ldh-pro-1mt-AR CTTTGTTACACCTTTACTTATGCCCGATTATGT 8 ldh-pro-1mt-BF GTAAAGGTGTAACAAAGGAATCCGGGCACAAGC 9 ldh-pro-1mt-BR ATGCCTGCAGGTCGACCCACACTGCGTAGGTC EXEMPLO 4-2: PREPARAÇÃO DE KFCC11074 DENTRO DO QUAL

24 / 28

MUTAÇÃO É INTRODUZIDA E CONFIRMAÇÃO DE QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁTICO

[00102] O vetor para substitui é introduzida e confirmação de quantidade de4-1, foi introduzido dentro da cepa KFCC11074 para preparar ara preparardo dentro da no qual e a cepa produtora de entro da ntroduzida e confirmae confirmao da ntroduproduA Corynebacterium glutamicum cepa KFCC11074, dentro da qual a mutamicumntroduzida e confirmarodKFCC11074: ldh-pro-1mt foram, cada uma, cultivadas no mesmo modo do que no Exemplo 1-2.

[00103] Depois da conclusão do cultivo, as concentrações de L-ácido glutâmico e ácido lático em cada meio foram medidas. As concentrações medidas de L-ácido glutâmico e ácido lático são mostradas na Tabela 4 abaixo. [TABELA 4] Cepa L-ácido glutâmico (g/l) Ácido lático L (g/l) KFCC11074 9,1 22,5 KFCC11074::ldh-pro-1mt 17,1 6,5

[00104] Conforme mostrado na Tabela 4, foi confirmado que a concentração de L-ácido glutâmico produzido pela Corynebacterium glutamicum cepa KFCC11074::ldh-pro-1mt, dentro da qual a mutação é introduzida, foi maior do que aquela produzida pela Corynebacterium glutamicum cepa KFCC11074, dentro da qual a mutação não é introduzida, por cerca de 8 g/l (cerca de 88%).

[00105] Por outro lado, foi confirmado que a concentração de ácido lático produzido pela cepa KFCC11074::ldh-pro-1mt foi menor do que aquela produzida pela Corynebacterium glutamicum cepa KFCC11074, dentro da qual a mutação não é introduzida, por 17 g/l.

[00106] Ou seja, foi novamente confirmado que a mutação aumenta a produtividade de L-ácido glutâmico nos microrganismos e diminui a produtividade de ácido lático.

25 / 28 EXEMPLO 4-3: CONFIRMAÇÃO DE ATIVIDADE DE ENZIMA LDH DE KFCC11074 DENTRO DO QUAL MUTAÇÃO É INTRODUZIDA

[00107] Já que o mecanismo para a redução da produtividade de ácido lático na cepa KFCC11074::ldh-pro-1mt, o qual foi preparado no Exemplo 4- 2, foi confirmado, e já que foi confirmado que a mutação estava contida no promotor de desidrogenase lática (LDH), tentativas foram feitas para identificar a atividade de deidrogenase lática, a qual é uma enzima produtora de ácido lático, que depende da mutação.

[00108] Especificamente, a atividade da enzima foi avaliada no modo seguinte. Primeiramente, células foram cultivadas em meio no 3 (25 ml), a qual tem a composição abaixo, em um frasco (250 ml) em 200 rpm a 30 °C por 6 horas. Depois disso, o sobrenadante foi removido precipitando-se as células em 4.000 rpm por 10 minutos, e a lavagem de célula foi repetida três veze usando 20 mM Tris-HCl (25 ml, pH 7.5). Depois de lavar, o sobrenadante foi removido, e as células foram novamente suspensas usando 15% tampão glicérico (2 ml) em 20 mM Tris (pH 7.5) para extração de célula. As células novamente suspensas (1 ml) foram colocadas em um tubo micro esférico e homogeneizado seis vezes sob uma condição de 46/30 segundos usando um homogeneizador. Depois disso, os resultantes foram centrifugados em 13.000 rpm a 4 °C por 20 minutos. MEIO NO 3:

[00109] Glicose 2%, polipeptona 1%, (NH4)2SO4 1%, KH2PO4 0,52%, K2HPO4 1,07%, extrato de levedura 1%, ureia 0,15%, MgSO4·7H2O 0,05%, biotina (1,8 mg/l), tiamina-HCl (9 mg/l), pantotenato de cálcio (9 mg/l), niacinamida (60 mg/l)

[00110] Depois disso, o ensaio Bradford foi executado para confirmar e padronizar a concentração de proteína contida no sobrenadante (amostra) obtida a partir do tubo micro esférico. O ensaio The Bradford obteve uma curva padrão com referência às Tabelas 5 e 6 abaixo e confirmou a

26 / 28 concentração da amostra. Em particular, o reagente de amostra da proteína 1x Biorad (980 µl) foi adicionado à amostra que tem um volume total de 20 µl e depois centrifugado para medir a absorção a 595 nm por cerca de 3 minutos. [TABELA 5] STD e Amostragem de Extrato mg/ml 0 0,025 0,05 0,1 0,2 BSA (1 mg/ml) (µl) 0 0,5 1 2 4 Tampão de extração (µl) 20 19,5 19 18 16 Volume total (µl) 20 20 20 20 20 [TABELA 6] Extrato de célula diluição 1:10 diluição 1:5 diluição1:20 diluição1:50 Extrato de célula (µl) 2 4 (1/10)10 (1/10)4 Tampão de extração (µl) 18 16 10 16 Volume total (µl) 20 20 20 20

[00111] Depois disso, o experimento com atividades de desidrogenase nas cepas KFCC11074 e KFCC11074::ldh-pro-1mt foi executado usando a solução reativa, cuja relação de composição é mostrada na Tabela 7 abaixo. Adicionalmente, pivurato de sódio 30 mM foi usado como um iniciador. Adicionalmente, as atividades de desidrogenase lática nas duas cepas, as quais foram medidas sob as condições mostradas na Tabela 8, são mostradas na Tabela 9 abaixo. [TABELA 7] Solução reativa Reação 1 por 0,2 M Tris-HCl pH 7.5 (µl) 500 Pivurato de sódio (µl) 30 mM 100 6,6 mM NADH (µl) 50 Extrato de célula (mg/ml) 178 μg DDW Até 1 ml [TABELA 8] Frasco refratário 10 mm Comprimento de onda 340 nm Unidade U Fator -1 Casas decimais 3 Temperatura em em Procedimento 25 °C de Medida de Temperatura lin. regr. Atraso 00:01 min:seg Tempo medidor 1:30 min:seg Intervalo 00:8 min:seg

27 / 28 Autoprint desligado [TABELA 9] Cepa Atividade LDH (U) KFCC11074 0,398 KFCC11074::ldh-pro-1mt 0,150

[00112] Conforme mostrado na Tabela 9, foi confirmado que a atividade de desidrogenase lática foi reduzida nas cepas dentro das quais a mutação é introduzida.

[00113] Ou seja, foi confirmado que a mutação reduziu a atividade de desidrogenase lática nos microrganismos, desse modo reduzindo a produtividade de ácido lático.

[00114] Em resumo, o polinucleotídeo da presente revelação é um promotor de desidrogenase lática que inclui a mutação na qual um único nucleotídeo é substituído, e, portanto, o polinucleotídeo pode atenuar a atividade de desidrogenase lática nas cepas selvagem ou nas cepas produtoras de ácido glutâmico por via da atividade do promotor transformado; como resultado, a produtividade de ácido glutâmico, o qual é um produto alvo de fermentação, é aumentada, e adicionalmente, a produtividade de ácido lático, a qual abaixa a palatabilidade do produto fermentado, é reduzida. Em concordância, o polinucleotídeo da presente revelação pode ser efetivamente usado em vários campos industriais para produzir ácido glutâmico em uma alta produção.

[00115] A partir da parte anterior, uma dentre as pessoas de habilidade comum na técnica a qual a presente revelação pertence será capaz de entender que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais da presente revelação. Nesse sentido, as modalidades exemplares reveladas no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser construídas como limitantes do escopo da presente revelação. Pelo contrário, a presente revelação pretende cobrir não apenas as modalidades exemplares, mas também várias alternativas, modificações, equivalentes, e outras

28 / 28 modalidades que podem ser incluídas dentro do espírito e do escopo da presente revelação conforme definido pelas reivindicações anexadas. [NÚMERO DE ADESÃO] Instituição Depositária: Centro Coreano de Cultivo de Microrganismo (Autoridade Depositária Internacional) Número de Adesão: KCCM12227P Data de Depósito: 28 de fevereiro de 2018

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polinucleotídeo que tem atividade promotora, caracterizado pelo fato de que o trigésimo sétimo nucleotídeo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 ser substituído por G.

2. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo consistir na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1.

3. Polinucleotídeo de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo ser ligado de modo operável a um gene que codifica uma proteína-alvo.

4. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2; e um gene que codifica uma proteína-alvo ligada de modo operável ao polinucleotídeo.

5. Vetor de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a proteína-alvo ser desidrogenase lática.

6. Microrganismo do gênero Corynebacterium, caracterizado pelo fato de que compreender o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1; e um gene que codifica uma proteína-alvo ligada de modo operável ao polinucleotídeo.

7. Microrganismo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo consistir na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1.

8. Microrganismo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a proteína-alvo ser desidrogenase lática.

9. Microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o microrganismo do gênero Corynebacterium ser Corynebacterium glutamicum.

10. Método para produção de substância-alvo, caracterizado pelo fato de que compreende:

cultivar o microrganismo do gênero Corynebacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, em um meio; e recuperar a substância- alvo do meio cultivado.

11. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a substância-alvo ser um aminoácido.

12. Método para preparar uma composição fermentada, caracterizado pelo fato de que compreender fermentar através da cultura do microrganismo do gênero Corynebacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, em um meio.

13. Composição fermentada, caracterizada pelo fato de ser preparada pelo método de acordo com a reivindicação 12.