JP2021514602A - 新規なプロモーター及びこれを用いたl−アミノ酸の生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
実施例1-1.UV調査を介したランダム突然変異の誘発
発酵の目的産物であるグルタミン酸の生成能は向上され、発酵産物の嗜好性を低下させる乳酸の生成能が低下した変異菌株を選別するために、まず野生型コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum、ATCC13869)を寒天を含む栄養培地に塗抹して、30℃で16時間培養した。このように獲得した数百個のコロニーを室温でUVを照射して菌株内ゲノム上にランダム突然変異を誘発させた。
以後、ランダム突然変異が誘発された前記突然変異菌株を対象に発酵力価実験を実施した。
グルコース1%、肉汁0.5%、ポリペプトン1%、塩化ナトリウム0.25%、酵母エキス0.5%、寒天2%、ウレア0.2%、pH7.2
発酵培地:
粗糖6%、炭酸カルシウム5%、硫酸アンモニウム2.25%、1リン酸カリウム0.1%、硫酸マグネシウム0.04%、硫酸鉄10mg /L、ビオチン0.3mg/L、チアミン塩酸塩0.2mg/L
前記条件でそれぞれのコロニーを培養して、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム(ATCC13869)と同等するか、それ以上のL−グルタミン酸を生産する突然変異菌株を選別した。その後、選別した突然変異菌株に対してYSIを用いてL−グルタミン酸濃度を測定し、HPLCを用いて乳酸濃度を測定した。測定したL−グルタミン酸及び乳酸の濃度は下記表1に示した。
前記突然変異菌株の遺伝子変異を確認するために、ATCC13869−m7及びATCC13869−m9菌株の遺伝子を野生型菌株と比較した。
実施例3−1.変異が導入された菌株の製作
前記実施例2を介して確認した変異が導入された変異菌株を製作した。具体的には、前記変異を野生型コリネバクテリウム・グルタミカム(ATCC13869及びATCC13032)に導入(配列番号2で表されるポリヌクレオチド配列の37番目ヌクレオチドをGに置換)するために、ターゲット変異を含む逆方向のオリゴヌクレオチドを75マー(mer)の長さにデザインした。
前記実施例3−1を介して製作した変異菌株ATCC13869::ldh−pro−1mt及びATCC13032::ldh−pro−1mtと、これらの各野生型コリネバクテリウム・グルタミカム(ATCC13869及びATCC13032)は、それぞれ実施例1−2と同様の方法で培養した。
実施例4−1.変異が導入されたベクターの製作
野生型菌株の他に、グルタミン酸の生産能が増加された菌株でも前記変異が同様の効果を示すかどうかを確認するために、グルタミン酸生産菌株として知られているKFCC11074菌株(特許文献3)に前記変異を導入した。
前記実施例4−1を介して製作した遺伝子置換ベクターをKFCC11074菌株に導入して変異が導入されたグルタミン酸生産菌株「KFCC11074::ldh−pro−1mt」を製作した。変異が導入されないコリネバクテリウム・グルタミカムKFCC11074及び前記KFCC11074::ldh−pro−1mt菌株は、それぞれ実施例1−2と同様の方法で培養した。
前記実施例4−2を介して製作したKFCC11074::ldh−pro−1mt菌株の乳酸生成能の減少に対するメカニズムを確認するとともに、前記変異は乳酸脱水素酵素(lactate dehydrogenase:LDH)のプロモーター内に含まれていることを確認し、前記変異に伴う乳酸生産酵素である乳酸脱水素酵素の活性を確認した。
グルコース2%、ポリペプトン1%、(NH4)2SO41%、KH2PO40.52%、K2HPO41.07%、酵母エキス1%、ウレア(urea)0.15%、MgSO4−7H2O0.05%、d−ビオチン(d-Biotin)1.8mg/L、チアミン−HCl(Thiamin-HCl)9mg/L、パントテン酸カルシウム(Ca-pantothenic)9mg/L、ナイアシンアミド(Niacinamide)60mg/L
以後、ビードチューブで得られた上澄み液(サンプル)に含まれているタンパク質の濃度を確認及び標準化するために、ブラッドフォードアッセイ(Bradford assay)を行った。ブラッドフォードアッセイは、以下の表5及び6を参照し、標準曲線(standard curve)を確保して、サンプルの濃度を確認した。この時、総20μl体積のサンプルに1×バイオラッドプロテインアッセイ(Biorad protein assay)試薬を980μl添加及びボルテックス(vortexing)して吸光度を3分内外で595nmで測定した。
Claims (13)
- 配列番号2で表されるヌクレオチド配列の37番目ヌクレオチドがGに置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号1のヌクレオチド配列からなる、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、目的タンパク質をコードする遺伝子と作動可能に連結される、請求項1または2に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1または2のポリヌクレオチド;及び前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、ベクター。
- 前記目的タンパク質が、乳酸脱水素酵素(lactate dehydrogenase)である、請求項4に記載のベクター。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチド;及び前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、コリネバクテリウム属微生物。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号1のヌクレオチド配列からなる、請求項6に記載のコリネバクテリウム属微生物。
- 前記目的タンパク質が、乳酸脱水素酵素(lactate dehydrogenase)である、請求項6に記載のコリネバクテリウム属微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項6〜8のいずれか一項に記載の微生物。
- 請求項6〜8のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階;及び前記の培地から目的物質を回収する段階を含む、目的物質を生産する方法。
- 前記目的物質が、アミノ酸である、請求項10に記載の方法。
- 請求項6〜8のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養して発酵する段階を含む、発酵組成物の製造方法。
- 請求項12に記載の方法により製造された、発酵組成物。
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