WO2019172702A1 - 신규한 프로모터 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법 - Google Patents

신규한 프로모터 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법 Download PDF

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WO2019172702A1
WO2019172702A1 PCT/KR2019/002708 KR2019002708W WO2019172702A1 WO 2019172702 A1 WO2019172702 A1 WO 2019172702A1 KR 2019002708 W KR2019002708 W KR 2019002708W WO 2019172702 A1 WO2019172702 A1 WO 2019172702A1
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WO
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polynucleotide
microorganism
present application
gene
atcc13869
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PCT/KR2019/002708
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최선형
장진숙
김형준
윤병훈
이지연
최윤정
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씨제이제일제당 (주)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01027—L-Lactate dehydrogenase (1.1.1.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine

Definitions

  • the present application relates to a novel promoter and a method for producing L-amino acid using the same, and more particularly, to a novel polynucleotide having a promoter activity, a vector including the same and Corynebacterium microorganisms, and L-amino acid using the microorganism. It relates to a production method, a method for producing a fermentation composition, and the fermentation composition.
  • Glutamic acid is a representative amino acid produced by fermentation, and has one of its own unique tastes, which is one of important amino acids widely used in the food field, the pharmaceutical field, and other animal feed fields.
  • the organic acid is an acidic organic compound and includes lactic acid, acetic acid, formic acid, citric acid, oxalic acid, uric acid, and the like.
  • Organic acids in foods exhibit a sour and umami taste, and have an effect of preventing decay by lowering the pH of the food.
  • lactic acid is known to account for the largest proportion of organic acids produced through microbial fermentation.
  • the present inventors have developed a novel polynucleotide having a promoter activity of the present application, which confirmed that the strain can increase the glutamic acid producing ability and lower the lactic acid producing ability. This application has been completed.
  • One object of the present application is to provide a polynucleotide having a promoter activity, wherein the 37th nucleotide of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is substituted with G.
  • Another object of the present application is the polynucleotide; And it provides a vector comprising a gene encoding a target protein operably linked with the polynucleotide.
  • Another object of the present application is the polynucleotide; And it provides a microorganism of the genus Corynebacterium comprising a gene encoding a target protein operably linked to the polynucleotide.
  • Another object of the present application is to culture the microorganism of the genus Corynebacterium in a medium; And it provides a method for producing a target substance, comprising the step of recovering the target substance in the medium.
  • Another object of the present application is to provide a method for producing a fermentation composition comprising the step of fermenting the microorganism of the genus Corynebacterium in a medium.
  • Another object of the present application is to provide a fermentation composition prepared by the above method.
  • novel promoters of the present application can be introduced into microorganisms producing amino acids, thereby increasing the amount of amino acids produced in the microorganisms and reducing the amount of organic acids produced. Specifically, when preparing glutamic acid using the novel promoter of the present application, it is possible to improve the taste and palatability of the fermented product by adjusting the amount of glutamic acid and the amount of organic acid in the fermented product.
  • one embodiment of the present application provides a polynucleotide having a promoter activity, wherein the 37th nucleotide of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is substituted with G.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 may refer to a portion of a promoter sequence of a gene encoding lactate dehydrogenase (LDH).
  • LDH lactate dehydrogenase
  • lactate dehydrogenase is an enzyme that generates lactate, that is, lactic acid using pyruvate as a substrate, and may be interchangeably referred to herein as "LDH".
  • the gene of the lactate dehydrogenase may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, the protein thereof may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • promoter refers to a non-translated nucleotide sequence upstream of a coding region, i.e., a polymerase, comprising a binding site for polymerase and having a transcription initiation activity of the promoter gene into mRNA. DNA region that binds to initiate transcription of a gene.
  • the promoter may be located at the 5 'region of the mRNA transcription start site.
  • the target gene of the promoter may be lactate dehydrogenase, but is not limited thereto.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 that is, the promoter sequence of the lactate dehydrogenase gene is mutated. Specifically, the mutation is performed by replacing T, which is the 37th nucleotide of the sequence, with G. It may be. Accordingly, the polynucleotide may be (consist of) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • mutation refers to a genetic or non-genetically stable phenotypic change, and may be used interchangeably with “mutation” herein.
  • the polynucleotide may have a mutated (increased or reduced) promoter activity compared to a polynucleotide that does not include the mutation. Therefore, the expression of the gene of interest linked to the polynucleotide and the activity of the protein encoded by the gene of interest can be regulated (increase or decrease), and further, the expression of genes other than the gene of interest can be controlled.
  • the polynucleotide may be for the weakening of the activity of lactate dehydrogenase.
  • polynucleotide may be for increasing the amount of glutamic acid and / or decrease the amount of lactic acid.
  • lactate dehydrogenase is involved in lactic acid production, but there is no known association with glutamic acid production and was first identified by the present inventors.
  • the effect of reducing the lactate dehydrogenase activity by the above-described promoter mutation of lactate dehydrogenase, and thus the effect of increasing the amount of glutamic acid produced and the amount of lactic acid produced was first identified by the present inventors.
  • glutamic acid is a kind of amino acids are classified as non-essential amino acids. It is known as the most common excitatory neurotransmitter in the central nervous system, and because it is umami, its monosodium glutamate (MSG) has been widely used as a seasoning. Typically produced through fermentation of microorganisms that produce glutamic acid.
  • lactic acid is a type of organic acid with a sour taste, called lactic acid, lactic acid and the like.
  • lactic acid For food use, it is used as an acidic agent for fruit extract, syrup, and soft drink. It is also used to prevent the propagation of decaying bacteria in the early stage of fermentation of liquor. In general, it is prepared through the fermentation of lactic acid-producing microorganisms, when excessively produced because the excessive acidity can lower the quality of the fermentation product, the concentration of lactic acid needs to be properly adjusted during the culture.
  • polynucleotide may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • nucleotide sequence of the present application may be modified by conventionally known mutagenesis methods such as direct evolution and site-directed mutagenesis.
  • the polynucleotide is at least 60%, in particular at least 70%, more specifically at least 80%, even more specifically at least 83%, at least 84%, 88% relative to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • Polynucleotides comprising a nucleotide sequence having at least 90%, at least 93%, at least 95%, or at least 97% homology. If the sequence is homologous to the sequence and is a polynucleotide sequence having a biological activity substantially the same as or corresponding to that of SEQ ID NO: 1, the sequence may also have a polynucleotide sequence deleted, modified, substituted or added. It is obvious that it is included in the scope of the present application.
  • homology means the degree to which a given nucleotide sequence corresponds and can be expressed in percentage.
  • homologous sequences thereof having the same or similar activity as a given nucleotide sequence are designated as "% homology”.
  • Homology to the nucleotide sequence is described, for example, in the algorithm BLAST by Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] or FASTA by Pearson (Methods Enzymol., 183, 63, 1990). Based on this algorithm BLAST, a program called BLASTN or BLASTX has been developed (see http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • stringent conditions is meant a condition that enables specific hybridization between polynucleotides. Such conditions are described specifically in the literature (eg, J. Sambrook et al., Homology). For example, genes with high homology, 60% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 97% or more, particularly specifically 99% or more homologous genes 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically 60 ° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1, which is a condition for hybridizing with each other and not having homologous genes with each other, or washing conditions for normal Southern hybridization.
  • Hybridization requires that two nucleotides have complementary sequences, although mismatch between bases is possible depending on the stringency of the hybridization.
  • the term "complementary" is used to describe the relationship between nucleotide bases that can hybridize with each other. For example, with respect to DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine.
  • the present application may also include isolated polynucleotide fragments that are complementary to the entire sequence as well as substantially similar polynucleotide sequences.
  • polynucleotides having homology can be detected using hybridization conditions including hybridization steps at Tm values of 55 ° C. and using the conditions described above.
  • the said Tm value is 60 degreeC, 63 degreeC? Or 65 ° C., but is not limited thereto, and may be appropriately adjusted by those skilled in the art according to the purpose.
  • Proper stringency for hybridizing polynucleotides depends on the length and degree of complementarity of the polynucleotides and variables are well known in the art (see Sambrook et al., Supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • polynucleotide having a promoter activity consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is hybridized under stringent conditions with complementary sequences to all or a portion of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to thereby promote the promoter activity of the present application.
  • Any nucleotide sequence may be included without limitation.
  • polynucleotide of the present application can be operably linked with the gene encoding the protein of interest.
  • gene expression control sequence refers to a sequence capable of expressing a gene of interest, including polynucleotides of the present application, operably linked thereto.
  • operatively linked in this application means that the polynucleotide having the promoter activity of the present application is functionally linked with said gene sequence to initiate and mediate transcription of the gene of interest. Operable linkages can be prepared using known genetic recombination techniques, and site-specific DNA cleavage and ligation can be made using, but are not limited to, cleavage and ligation enzymes in the art.
  • the gene expression control sequences of the present application may include any operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a DNA for controlling termination of transcription and translation, in addition to a promoter for transcription of a gene. It may further include.
  • suitable regulatory sequences for prokaryotes may further include, but are not limited to, ribosomal binding sites in addition to promoters.
  • Polynucleotides having the promoter activity of the present application can be constructed by the person skilled in the art as necessary for the regulation of gene expression as described above.
  • the target gene means a gene encoding a target protein to be controlled in microorganisms.
  • the gene may be a gene involved in the production of a product selected from the group consisting of amino acids (such as glutamic acid), organic acids (such as lactic acid), and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the gene may be a gene encoding an enzyme related to amino acid (glutamic acid) biosynthesis and / or a gene encoding an enzyme related to organic acid (such as lactic acid) biosynthesis, but is not limited thereto.
  • the gene may be a gene encoding lactate dehydrogenase (LDH), but is not limited thereto.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • the sequence of the gene encoding the LDH can be easily obtained by those skilled in the art through a known database such as GenBank of the National Institutes of Health.
  • the gene expression control sequence of the present application may be operably linked with the gene sequence encoding LDH, thereby increasing the amount of glutamic acid produced in the microorganism and reducing the amount of lactic acid produced.
  • Another aspect of the present application provides a vector comprising the polynucleotide and a gene encoding a target protein operably linked with the polynucleotide.
  • the polynucleotide is as described above.
  • the target protein may be lactate dehydrogenase (LDH).
  • LDH lactate dehydrogenase
  • vector refers to an artificial DNA molecule that carries a genetic material to enable expression of a gene of interest in a suitable host, the polynucleotide or a suitable gene expression control sequence; And a DNA preparation comprising a nucleotide sequence of a gene encoding a target protein operably linked thereto.
  • the vector used in the present application is not particularly limited as long as it can be expressed in the host cell, and any vector known in the art may be used to transform the host cell.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, ⁇ LB3, ⁇ BL4, ⁇ IXII, ⁇ ASHII, ⁇ APII, ⁇ t10, ⁇ t11, Charon4A, Charon21A, etc. can be used as a phage vector or cosmid vector, and pBR, pUC, and pBluescriptII based , pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based and the like can be used.
  • a vector for chromosome insertion in a host cell can replace an endogenous promoter in a chromosome with a polynucleotide having the promoter activity of the present application.
  • pECCG117, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pCES208, pXMJ19 vectors and the like can be used, but are not limited thereto.
  • the insertion of the polynucleotide into the chromosome can be by any method known in the art, for example by homologous recombination.
  • the vector of the present application may be inserted into a chromosome by causing homologous recombination
  • the vector may further include a selection marker for confirming whether the chromosome is inserted.
  • Selection markers are used to screen for cells transformed with a vector, i.e. to confirm the insertion of polynucleotides, and to provide selectable phenotypes such as drug resistance, nutritional requirements, resistance to cytotoxic agents or expression of surface proteins. Markers can be used. In an environment in which a selective agent is treated, only cells expressing a selection marker survive or exhibit different expression traits, so that transformed cells can be selected.
  • the term "transformation” refers to introducing a vector comprising the polynucleotide or gene expression control sequence and the gene encoding the target protein into the host cell, such that the gene can be expressed in the host cell. . Furthermore, as long as the target gene can be expressed in the host cell, the transformed polynucleotide and the gene encoding the target protein include both of these cases regardless of whether they are located on or outside the chromosome of the host cell. can do.
  • the transformation method includes all methods of introducing the gene expression control sequence and the gene encoding the target protein into the cell, and may be performed by selecting a suitable standard technique as known in the art depending on the host cell. .
  • electroporation calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, and Lithium acetate-DMSO method and the like, but is not limited thereto.
  • polynucleotide provides a microorganism of the genus Corynebacterium comprising a gene encoding a target protein operably linked with the polynucleotide.
  • the gene encoding the polynucleotide and the target protein operably linked with the polynucleotide are as described above.
  • microorganism includes both wild-type microorganisms and microorganisms in which natural or artificial genetic modification has occurred, and a certain mechanism is weakened due to the insertion of an external gene or an enhanced or weakened activity of an endogenous gene.
  • the concept includes both microorganisms that have been enhanced or fortified.
  • the microorganism may include the polynucleotide, and specifically may include the polynucleotide and / or a gene operably linked with the polynucleotide and encoding a target protein.
  • the microorganism may include a vector including the polynucleotide or gene expression control sequence and the gene encoding the target protein, but is not limited thereto.
  • the polynucleotide, the gene encoding the target protein and the vector may be introduced into the microorganism by transformation, but are not limited thereto.
  • the microorganism is irrelevant whether the gene encoding the polynucleotide and the protein of interest is located on or outside the chromosome if the gene can be expressed.
  • the microorganism comprising the gene encoding the polynucleotide and the target protein may be one in which the amount of glutamic acid is increased and the amount of lactic acid is reduced.
  • the microorganism may be one in which the polynucleotide is attenuated the activity of lactate dehydrogenase.
  • the microorganism may be included without limitation as long as the microorganism having a polynucleotide having the promoter activity of the present application is introduced and can operate as a promoter.
  • the microorganism may be a microorganism of the genus Corynebacterium, more specifically Corynebacterium glutamicum or Corynebacterium flavum , most specifically Cory Nebacterium glutamicum, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application comprises the steps of culturing the Corynebacterium genus microorganisms in a medium; And it provides a method of producing a target substance, comprising the step of recovering the target substance in the medium.
  • the polynucleotides and microorganisms are as described above.
  • the target substance may be an amino acid.
  • the amino acid may be an L-form amino acid unless otherwise stated, and may be glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, threonine, serine, cysteine, glutamine, methionine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, lysine , Arginine, histidine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, proline, and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • amino acid may be glutamic acid, but is not limited thereto.
  • the term "culture” refers to the growth of microorganisms under appropriately artificially controlled environmental conditions.
  • a method for producing a target substance using a microorganism including the polynucleotide may be performed using a method well known in the art.
  • the culture may be continuously cultured in a batch process, an injection batch or a repeated fed batch process, but is not limited thereto.
  • the medium used for cultivation must meet the requirements of the particular strain in an appropriate manner.
  • Culture media for Corynebacterium strains are known (eg, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981).
  • Sugar sources that may be used in the medium include glucose and saccharose, lactose, fructose, maltose, starch, sugars and carbohydrates such as cellulose, soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil and the like, palmitic acid, stearic acid Fatty acids such as linoleic acid, alcohols such as glycerol, ethanol, and organic acids such as acetic acid. These materials can be used individually or as a mixture, but are not limited thereto.
  • Nitrogen sources that can be used include peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean wheat and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate. Nitrogen sources can also be used individually or as a mixture, but are not limited thereto.
  • Personnel that can be used can include salts containing potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium.
  • the culture medium may contain a metal salt such as magnesium sulfate or iron sulfate required for growth.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used.
  • suitable precursors to the culture medium may be used. The above-mentioned raw materials may be added batchwise or continuously in a manner appropriate to the culture during the culturing process.
  • the pH of the culture can be adjusted by using a basic compound such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or an acid compound such as phosphoric acid or sulfuric acid in an appropriate manner.
  • a basic compound such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or an acid compound such as phosphoric acid or sulfuric acid in an appropriate manner.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to inhibit bubble generation.
  • Oxygen or an oxygen-containing gas eg, air may be injected into the culture to maintain aerobic conditions.
  • the temperature of the culture can usually be 20 ° C to 45 ° C, specifically 25 ° C to 40 ° C. Incubation time may be continued until the desired amount of the desired material is obtained, but may specifically be 10 to 160 hours.
  • Recovery of the desired material from the culture (medium) can be recovered separately by conventional methods known in the art.
  • methods such as centrifugation, filtration, chromatography, and crystallization may be used.
  • the supernatant obtained by removing the biomass by centrifuging the culture at low speed may be separated by ion exchange chromatography, but is not limited thereto.
  • cell separation and filtration from the culture (medium) may be performed and the desired material may be recovered without a separate purification process.
  • the recovery step may further comprise a purification process.
  • Another aspect of the present application provides a method of preparing a fermentation composition comprising the step of culturing the microorganism of the genus Corynebacterium in a medium.
  • Another aspect of the present application provides a fermentation composition prepared by the above method.
  • the polynucleotide and the microorganism are as described above, and the step of culturing the microorganism in the medium is also as described above.
  • the fermentation composition in the present application means a composition obtained by culturing the microorganism of the present application.
  • the fermentation composition may include a liquid or powder composition obtained after culturing the microorganism, and after an appropriate post-treatment process.
  • a suitable post-treatment step may include, for example, a culture step, a cell removal step, a concentration step, a filtration step, and a carrier mixing step of the microorganism, and may further include a drying step.
  • the post-treatment process may not include a purification process.
  • the fermentation composition may have an optimal taste by culturing the microorganisms of the present application, including a composition in which the amount of glutamic acid is increased and the amount of lactic acid is reduced.
  • the fermentation composition does not exclude seasoning products (eg, broth powder products, snack seasoning products, etc.) containing the composition in liquid or powder form.
  • seasoning products eg, broth powder products, snack seasoning products, etc.
  • the fermentation composition as long as it includes a composition obtained by culturing the microorganism of the present application, and the case of further mixing the material obtained by the non-fermentation process and / or another material obtained by the non-natural process Do not exclude
  • Example 1-1 Random mutagenesis through UV irradiation
  • wild-type Corynebacterium glutamicum (ATCC13869) was first agar. The nutrient medium containing the plate was incubated for 16 hours at 30 °C. Hundreds of colonies thus obtained were irradiated with UV at room temperature to cause random mutations on the genome in the strain.
  • Example 1-2 Mutagenic Strain Fermentation Activity Test and Strain Selection
  • Each colony was subcultured in nutrient medium and then incubated for 5 hours in fermentation medium. Then, 25% Tween40 was added to each medium at 0.4% concentration, and each colony was incubated again for 32 hours.
  • Each colony was incubated under these conditions to select mutant strains that produced L-glutamic acid equivalent to or greater than wild type Corynebacterium glutamicum (ATCC13869). Then, for the selected mutant strains, L-glutamic acid concentration was measured using YSI, and lactic acid concentration was measured using HPLC. The measured concentrations of L-glutamic acid and lactic acid are shown in Table 1 below.
  • ATCC13869-m7 and “ATCC13869-m9” were selected as mutant strains in which glutamic acid production increased and lactic acid production decreased compared to wild-type strains.
  • the genes of the ATCC13869-m7 and ATCC13869-m9 strains were compared with the wild type strain.
  • ATCC13869-m7 and ATCC13869-m9 strains contained the same mutation at a specific position of the promoter region of the gene encoding lactate dehydrogenase.
  • ATCC13869-m7 and ATCC13869-m9 confirmed that the 37th nucleotide T in the sequence of the promoter region represented by SEQ ID NO: 2 includes a G substitution.
  • the promoter region represented by SEQ ID NO: 2 was identified as a sequence commonly included in Corynebacterium spp., More specifically, wild type Corynebacterium glutamicum (ATCC13032, ATCC13869, ATCC14067).
  • Example 3-1 Production of strains with mutations introduced
  • Example 2 Introduced by the mutations identified in Example 2, it was intended to produce a variant strain. Specifically, a reverse oligo containing a target mutation for introducing the mutation into wild-type Corynebacterium glutamicum (ATCC13869 and ATCC13032) (substituting G for the 37th nucleotide of the polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2). Nucleotides were designed to be 75-mers long.
  • oligonucleotide of SEQ ID NO: 5 was transformed into the Corynebacterium glutamicum wild type ATCC13869 strain and the ATCC13032 strain by an electric pulse method (Appl. Microbiol. Biothcenol., 1999, 52: 541-545), 1 ml of the mixed liquid medium was added and shaken at 160 rpm for 30 minutes at 30 ° C. Thereafter, the culture solution was incubated for 10 minutes on ice, centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes at 4 ° C, and the supernatant was removed to secure cells.
  • an electric pulse method Appl. Microbiol. Biothcenol., 1999, 52: 541-545
  • the mutant strains ATCC13869 :: ldh-pro-1mt and ATCC13032 :: ldh-pro-1mt and their respective wild-type Corynebacterium glutamicum (ATCC13869 and ATCC13032) prepared in Example 3-1 are respectively shown in Examples.
  • the culture was carried out in the same manner as 1-2.
  • the concentration of L-glutamic acid produced by the strain Corynebacterium glutamicum ATCC13869 :: ldh-pro-1mt was introduced by the wild type Corynebacterium glutamicum ATCC13869. -About 4.7 g / L (about 32%) higher than the glutamic acid concentration was confirmed.
  • wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13869 produced 1.5 g / L of lactic acid, but lactic acid was not measured in the culture medium of the ATCC13869 :: ldh-pro-1mt strain.
  • the concentration of L-glutamic acid produced by the strain Corynebacterium glutamicum ATCC13032 :: ldh-pro-1mt was about the concentration of L-glutamic acid produced by the wild type Corynebacterium glutamicum ATCC13032. 2.6 g / L (about 32%) was found to be higher.
  • wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13032 produced 2.7 g / L of lactic acid, but very low (0.3 g / L) of lactic acid was measured in the culture medium of the ATCC13032 :: ldh-pro-1mt strain.
  • the mutation was confirmed to increase the L-glutamic acid production ability of microorganisms and reduce the production capacity of lactic acid.
  • strain ATCC13869 :: ldh-pro-1mt was named CA02-9209 and was deposited on February 28, 2018 by the Korea Microorganism Conservation Center (KCCM), which is a depository under the Treaty of Budapest, and was given a deposit number of KCCM12227P.
  • KCCM Microorganism Conservation Center
  • the mutations were introduced into the KFCC11074 strain (Korean Patent Publication No. 10-0292299) known as glutamic acid production strain.
  • a gene replacement vector was prepared to replace the 37th nucleotide of the polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 included in the strain with G.
  • Gene fragments for constructing the vector was obtained by PCR using ATCC13869 genomic DNA as a template.
  • ATCC13869 Corynebacterium glutamicum
  • the polynucleotides of SEQ ID NOs: 6, 7, 8, and 9 Primer was prepared.
  • PCR was denatured at 95 ° C. for 5 minutes, followed by 30 cycles of 95 ° C. 20 seconds denaturation, 55 ° C. 20 seconds annealing and 72 ° C. 30 seconds polymerization, followed by polymerization at 72 ° C. for 5 minutes. More specifically, 500 bp polynucleotides amplified using the primers of SEQ ID NOs: 6 and 7, and 500 bp polynucleotides amplified using the primers of SEQ ID NOs: 8 and 9 were obtained.
  • Gene replacement vectors were prepared by linking the two obtained gene fragments with pDZ vectors (Korean Patent No. 10-0924065 and International Publication No. 2008-033001) digested with restriction enzymes BamHI and SalI, using an infusion enzyme. This was named "pDZ-ldh-pro-1mt". Primer sequence information used for the vector production is shown in Table 3 below.
  • Example 4-1 The gene replacement vector prepared in Example 4-1 was introduced into a KFCC11074 strain to prepare a glutamic acid producing strain "KFCC11074 :: ldh-pro-1mt". Corynebacterium glutamicum KFCC11074 and KFCC11074 :: ldh-pro-1mt strains without mutations were cultured in the same manner as in Example 1-2.
  • the concentration of L-glutamic acid produced by the strain of Corynebacterium glutamicum KFCC11074 :: ldh-pro-1mt with the mutation introduced was Corynebacterium glutamicum KFCC11074 without the mutation. It was confirmed that about 8 g / L (about 88%) higher than the produced L- glutamic acid concentration.
  • the concentration of lactic acid produced by the KFCC11074 :: ldh-pro-1mt strain was confirmed to be 17 g / L lower than the concentration of lactic acid produced by Corynebacterium glutamicum KFCC11074 without a mutation.
  • the mutation is in the promoter of lactate dehydrogenase (LDH) When it was confirmed that it was included, it was intended to confirm the activity of the lactate dehydrogenase, the lactic acid producing enzyme according to the mutation.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • the activity evaluation of the enzyme was performed by the following method. First, the cells were incubated in 25 ml (250 ml flask) of medium # 3 medium for 6 hours (30 ° C., 200 rpm), followed by precipitation of cells (4000 rpm, 10 minutes) to remove supernatant and 20 mM Tris. Cell washing was repeated three times with 25 ml of -HCl (pH 7.5). After washing, the supernatant was removed, and resuspended with 2 ml of 15% glycerol buffer in a composition of 20 mM Tris (pH 7.5) for cell extraction, and 1 ml was placed in a bead tube. Homogenization was carried out six times under conditions of 46/30 seconds using a homogenizer. After centrifuged at 4 °C, 13000rpm for 20 minutes.
  • the mutation was confirmed to reduce the ability of lactic acid to produce by reducing the activity of lactate dehydrogenase of the microorganism.
  • the polynucleotide of the present application is a promoter of lactate dehydrogenase containing a mutation in which one base is substituted, and from the wild-type or glutamic acid producing strain to the lactate dihard through the mutated promoter activity.
  • By weakening the activity of the genease it is possible to increase the production capacity of glutamic acid, which is a target product of fermentation, and further reduce the production capacity of lactic acid, which lowers the palatability of fermentation products. It can be usefully used.

Abstract

본 출원은 신규한 프로모터 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 프로모터 활성을 가지는 신규 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터 및 코리네박테리움 속 미생물, 상기 미생물을 이용한 L-아미노산의 생산 방법, 발효 조성물의 제조 방법, 및 상기 발효 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 프로모터 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법
본 출원은 신규한 프로모터 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 프로모터 활성을 가지는 신규 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터 및 코리네박테리움 속 미생물, 상기 미생물을 이용한 L-아미노산의 생산 방법, 발효 조성물의 제조 방법, 및 상기 발효 조성물에 관한 것이다.
글루탐산은 발효에 의하여 생산되는 대표적인 아미노산으로, 특유의 독특한 맛을 지니고 있어 식품 분야에서는 물론 의약품 분야, 기타 동물 사료 분야 등에 널리 이용되고 있는 중요한 아미노산 중의 하나이다.
글루탐산을 생산하는 통상적인 방법으로는 주로 브레비박테리움(Brevibacterium)이나 코리네박테리움 속 및 그 변이주를 포함한 코리네형 박테리아(Coryneform bacteria)를 이용해 발효를 통해 생산하며(Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center: 195-215, 1986) 그 외에도 대장균(Escherichia coli), 고초균(Bacillus), 방선균(Streptomyces), 페니실리움(Penicillum) 속, 크렙시엘라(Klebsiella), 어위니아(Erwinia), 판토에아(Pantoea) 속 등의 미생물을 이용하는 방법 등이 알려져 있다(미국 특허 제3,220,929호, 제6,682,912호). 미생물 발효를 통하여 글루탐산을 제조하는 경우, 발효물 내에는 L-글루탐산 외에도 유기산을 비롯한 다양한 물질이 혼합된다.
상기의 유기산은 산성의 유기화합물로서, 젖산, 아세트산, 포름산, 시트르산, 옥살산, 요산 등을 포함한다. 식품 내 유기산은 신맛과 감칠맛을 나타내며, 식품의 pH를 낮춰주어 부패를 방지하는 효과를 갖는다. 통상적으로, 젖산은 미생물 발효를 통해 생성되는 유기산 중에서 가장 많은 비중을 차지하고 있는 것으로 알려져 있다.
하지만, 발효로 생산되는 젖산의 비중이 높을수록 발효물 내 신맛이 증가하므로, 기호성이 저하될 우려가 있다. 따라서, 미생물 발효를 통하여 생성되는 발효물 내 젖산의 생성량을 조절할 필요가 있다.
본 발명자들은 글루탐산을 생산하는 미생물의 유기산 생성능을 저감시키기 위해 노력한 결과, 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 신규 폴리뉴클레오티드를 개발하였고, 이는 균주의 글루탐산 생성능을 증가시키고 젖산 생성능은 저하시킬 수 있음을 확인하여 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 37번째 뉴클레오티드가 G로 치환된, 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기의 배지에서 목적 물질을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 물질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하여 발효하는 단계를 포함하는, 발효 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 방법에 의해 제조된 발효 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 신규 프로모터는 아미노산을 생산하는 미생물에 도입되어, 미생물의 아미노산의 생성량은 증가시키고 유기산의 생성량은 감소시킬 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 신규 프로모터를 이용하여 글루탐산을 제조하는 경우, 발효물 내 글루탐산의 양과 유기산의 양을 조절하여 발효물의 맛과 기호성을 개선시킬 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 출원의 하나의 양태는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 37번째 뉴클레오티드가 G로 치환된, 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 출원에서 용어 "서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열"은 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase: LDH)를 코딩하는 유전자의 프로모터 서열의 일부를 의미할 수 있다.
이때, 상기 용어 "락테이트 디하이드로게나제"는 피루베이트를 기질로 하여 락테이트, 즉 젖산을 생성하는 효소이며, 본 명세서에서 "LDH"로 혼용되어 명명될 수 있다. 구체적으로, 상기 락테이트 디하이드로게나제의 유전자는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 이의 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "프로모터"는 폴리머라제(polymerase)에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 목적 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 코딩 영역의 상위(upstream)의 비 해독된 뉴클레오티드 서열, 즉 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 의미한다. 상기 프로모터는 mRNA 전사 개시부위의 5' 부위에 위치할 수 있다. 이때, 상기 프로모터의 목적 유전자는 락테이트 디하이드로게나제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열, 즉 락테이트 디하이드로게나제 유전자의 프로모터 서열이 변이된 것이며, 구체적으로 상기 변이는 상기 서열의 37번째 뉴클레오티드인 T가 G로 치환된 것일 수 있다. 그에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것(consist of)일 수 있다.
이때, 상기 용어 "변이"는 유전적 또는 비유전적으로 안정적인 표현형적 변화를 의미하며, 본 명세서에서 "돌연변이"와 혼용되어 명명될 수 있다.
구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 변이를 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드에 비해 변이된(증가 또는 감소된) 프로모터 활성을 가질 수 있다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 목적 유전자의 발현 및 상기 목적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 조절(증가 또는 감소)할 수 있으며, 나아가 목적 유전자 이외의 다른 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
본 출원의 목적상, 상기 폴리뉴클레오티드는 락테이트 디하이드로게나제의 활성 약화를 위한 것일 수 있다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 글루탐산의 생성량 증가 및/또는 젖산의 생성량 감소를 위한 것일 수 있다.
상기 락테이트 디하이드로게나제는 젖산 생성에 관여한다는 것이 알려져 있었으나, 글루탐산 생성과의 연관성에 대해서는 공지된 바 없으며 본 발명자들에 의해 처음으로 규명되었다. 특히, 상기와 같은 락테이트 디하이드로게나제의 프로모터 변이에 의한 락테이트 디하이드로게나제의 활성 감소, 및 이에 따른 글루탐산 생성량 증가와 젖산 생성량 감소 효과는 본 발명자들에 의해 처음으로 규명되었다.
이때, 상기 용어, "글루탐산"(L-glutamic acid, L-glutamate)은 아미노산의 일종으로 비필수 아미노산으로 구분된다. 중추 신경계에서 가장 흔한 흥분성 신경 전달 물질로 알려져 있으며, 또한 감칠맛이 난다고 하여 이의 모노나트륨염(monosodium glutamate: MSG)이 조미료로 개발되어 널리 사용되고 있다. 일반적으로 글루탐산을 생산하는 미생물의 발효를 통해 제조된다.
또한, 상기 용어, "젖산"은 신맛이 나는 유기산의 일종으로, 락트산, 유산 등으로 불린다. 식용으로는 과실엑기스, 시럽, 청량음료의 산미제로 이용되며 주류의 발효 초기에 부패균의 번식 방지에도 사용된다. 일반적으로 젖산을 생산하는 미생물의 발효를 통해 제조되는데, 과다 생성되는 경우 과도한 신맛에 의해 발효물의 품질을 저하시킬 수 있으므로 젖산의 농도는 배양 시 적절히 조절될 필요가 있다.
구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
또한, 본 출원의 뉴클레오티드 서열은 종래 알려진 돌연변이 유발법, 예를 들면 방향성 진화법(direct evolution) 및 부위특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis) 등에 의하여 변형될 수 있다.
따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 대해서 적어도 60% 이상, 구체적으로는 70% 이상, 보다 구체적으로는 80% 이상, 보다 더 구체적으로는 83% 이상, 84% 이상, 88% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 또는 97% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 서열과 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 경우도 역시 본 출원의 범주에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 용어 "상동성"은 주어진 뉴클레오티드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 상기 뉴클레오티드 서열에 대한 상동성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]나 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
상기 "엄격한 조건"은 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 60% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 상기 용어 "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃? 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
특히, 상기에서 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다(consist of)는 표현은 해당 폴리뉴클레오티드를 프로모터로서 목적 유전자에 연결하여 사용할 때, 제한효소 사용과 같이 목적 유전자에 연결하는 과정 중에 발생할 수 있는 뉴클레오티드의 추가, 및/또는 삭제, 및/또는 변이 등의 경우를 배제하지 않는다.
예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프로모터 활성을 갖는 상기 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되어 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.
나아가, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 목적 단백질을 코딩하는 유전자와 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 출원에서 용어 "유전자 발현 조절 서열"은 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 이에 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 서열을 의미한다.
본 출원에서 용어 "작동 가능하게 연결된"(operatively linked)은 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 목적 유전자의 전사를 개시 및 매개하도록 상기 유전자 서열과 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
나아가, 본 출원의 유전자 발현 조절 서열은 유전자의 전사를 실시하기 위한 프로모터 외에 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 DNA 등을 더 포함할 수 있다.
예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터 외에, 리보좀 결합 부위를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 통상의 당업자에 의해 필요에 따라 상기한 바와 같은 유전자 발현 조절을 위한 서열을 구성할 수 있다.
본 출원에서, 상기 목적 유전자는 미생물에서 발현을 조절하고자 하는 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다.
예를 들면, 아미노산(글루탐산 등), 유기산(젖산 등) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 산물의 생산에 관여하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 유전자는 아미노산(글루탐산 등) 생합성 관련된 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 유기산(젖산 등) 생합성에 관련된 효소를 코딩하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로, 상기 유전자는 락테이트 디하이드로게나제(LDH)를 코딩하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 LDH를 코딩하는 유전자의 서열은 미국 국립보건원의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스를 통하여 당업자가 용이하게 입수할 수 있다.
예를 들면, 본 출원의 상기 유전자 발현 조절 서열은 LDH를 코딩하는 유전자 서열과 작동 가능하게 연결되어, 미생물 내 글루탐산 생성량을 증가시키고, 젖산 생성량을 감소시킬 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 앞서 설명한 바와 같다.
구체적으로, 상기 목적 단백질은 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase: LDH)일 수 있다.
본 출원에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 유전 물질을 보유하는 인위적 DNA 분자로서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 적합한 유전자 발현 조절 서열; 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 제조물을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 발현 가능한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용하여 숙주세포를 형질전환시킬 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다.
예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λLB3, λBL4, λⅨII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다.
또한, 숙주세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 내재적 프로모터를 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 예를 들면, pECCG117, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pCES208, pXMJ19 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다.
본 출원의 벡터는 상동재조합을 일으켜서 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 발현 조절 서열 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여, 숙주세포 내에서 상기 유전자가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 나아가, 숙주세포 내에서 목적 유전자가 발현될 수 있기만 한다면, 형질전환된 상기 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자는, 숙주세포의 염색체 상에 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두의 경우를 포함할 수 있다.
상기 형질전환하는 방법은 상기 유전자 발현 조절 서열 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 세포 내로 도입하는 모든 방법을 포함하며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 앞서 설명한 바와 같다.
본 출원에서 용어 "미생물"은 야생형 미생물이나, 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 약화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물을 모두 포함하는 개념이다.
본 출원에서, 상기 미생물은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 구체적으로 상기 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결되고 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 또는, 상기 미생물은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 발현 조절 서열 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 벡터는 형질전환에 의해 상기 미생물에 도입될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 나아가, 상기 미생물은 상기 유전자가 발현될 수 있다면, 상기 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자가, 염색체 상에 위치하거나 염색체 외에 위치하는 것과는 무관하다.
본 출원의 목적상, 상기 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 미생물은 글루탐산의 생성량이 증가되고, 젖산의 생성량이 감소된 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 미생물은 폴리뉴클레오티드는 락테이트 디하이드로게나제의 활성이 약화된 것일 수 있다.
본 출원에서 상기 미생물은 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 도입되어 프로모터로 작동할 수 있는 미생물이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 또는 코리네박테리움 플라붐(Corynebacterium flavum)일 수 있고, 가장 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기의 배지에서 목적 물질을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 물질을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드 및 미생물은 앞서 설명한 바와 같다.
본 출원에서, 상기 목적 물질은 아미노산일 수 있다. 구체적으로, 상기 아미노산은 다른 언급이 없는 한 L-형태의 아미노산일 수 있으며, 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 아이소로이신, 트레오닌, 세린, 시스테인, 글루타민, 메치오닌, 아스파라트산, 아스파라긴, 글루탐산, 라이신, 알지닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 프롤린, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
더욱 구체적으로, 상기 아미노산은 글루탐산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원에서 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 이용하여 목적 물질을 생산하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리움 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981).
배지 중에서 사용될 수 있는 당원으로는 포도당, 사카로즈, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨을 함유하는 염이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
상기 미생물의 배양 중 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다.
배양물(배지)의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양 시간은 원하는 목적 물질의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으나, 구체적으로는 10 내지 160시간일 수 있다.
배양물(배지)로부터의 목적 물질의 회수는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리되어 회수될 수 있다. 이러한 분리 방법에는, 원심분리, 여과, 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 방법으로, 배양물(배지)로부터 균체 분리 및 여과 공정을 수행하고, 별도의 정제 공정 없이 목적 물질을 회수할 수도 있다. 또 다른 방법으로, 상기 회수 단계는 정제 공정을 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하여 발효하는 단계를 포함하는, 발효 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 방법에 의해 제조된 발효 조성물을 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드 및 미생물은 앞서 설명한 바와 같으며, 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계 역시 앞서 설명한 바와 같다.
본 출원에서 용어 "상기 발효 조성물"은, 본 출원의 미생물을 배양하여 수득된 조성물을 의미한다. 나아가, 상기 발효 조성물은 상기 미생물을 배양한 후, 적절한 후처리공정을 거친 후 수득된 액상 또는 분말 형태의 조성물을 포함할 수 있다. 이 때, 적절한 후처리공정은, 예를 들어, 상기 미생물의 배양 공정, 균체 제거 공정, 농축 공정, 여과 공정, 및 담체 혼합 공정을 포함할 수 있으며, 추가적으로 건조 공정을 더 포함할 수도 있다. 경우에 따라서, 상기 후처리공정은 정제 공정을 포함하지 않을 수 있다. 상기 발효 조성물은 본 출원의 미생물을 배양함으로써 글루탐산의 생성량이 증가되고 젖산의 생성량이 감소된 조성물을 포함함에 따라 최적의 맛을 낼 수 있다.
또한, "상기 발효 조성물"은 상기의 액상 또는 분말 형태의 조성물이 포함된 조미료 제품(예를 들어, 육수용 분말 제품, 스낵 시즈닝 제품 등)을 배제하지 않는다. 나아가, "상기 발효 조성물"은 본 출원의 미생물을 배양하여 수득된 조성물을 포함하기만 한다면, 비발효 공정으로 수득된 물질 및/또는 비천연 공정으로 수득된 또 다른 물질을 추가로 혼합한 경우를 배제하지 않는다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1. 젖산 생성능 저하 변이주 선별
실시예 1-1. UV조사를 통한 무작위 돌연변이 유발
발효의 목적 산물인 글루탐산의 생성능은 향상되고, 발효 산물의 기호성을 저하시키는 젖산의 생성능은 저하된 변이 균주를 선별하기 위하여, 먼저 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum, ATCC13869)을 한천을 포함하는 영양배지에 도말하여 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이렇게 획득한 수백 개의 콜로니를 실온에서 UV를 조사하여 균주 내 게놈상에 무작위 돌연변이를 유발시켰다.
실시예 1-2. 돌연변이 유발 균주 발효역가 실험 및 균주 선별
이후, 무작위 돌연변이가 유발된 상기 돌연변이 균주들을 대상으로 발효 역가 실험을 실시하였다.
각각의 콜로니를 영양배지에서 계대 배양한 후, 발효배지에서 5시간 배양하였다. 그런 다음, 각각의 배지에 25% 트윈40(tween40)를 0.4% 농도로 추가하였으며, 각각의 콜로니를 다시 32시간 동안 배양하였다.
영양배지:
포도당 1%, 육즙 0.5%, 폴리펩톤 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모엑기스 0.5%, 한천 2%, 유레아 0.2%, pH 7.2
발효배지:
원당 6%, 탄산칼슘 5%, 황산암모늄 2.25%, 일인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.04%, 황산철 10 mg/L, 바이오틴 0.3 mg/L, 티아민 염산염 0.2 mg/L
상기 조건에서 각각의 콜로니를 배양하여, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC13869)과 동등하거나 그 이상의 L-글루탐산을 생산하는 돌연변이 균주들을 선별하였다. 이후, 선별한 돌연변이 균주들에 대하여, YSI를 이용하여 L-글루탐산 농도를 측정하였고, HPLC를 이용하여 젖산 농도를 측정하였다. 측정한 L-글루탐산 및 젖산의 농도는 하기 표 1에 나타내었다.
균주명 L-글루탐산(g/L) 젖산(g/L)
ATCC13869 14.5 1.5
ATCC13869-m1 15.1 1.2
ATCC13869-m2 14.0 0.7
ATCC13869-m3 17.7 1.5
ATCC13869-m4 13.9 2.0
ATCC13869-m5 14.4 1.8
ATCC13869-m6 16.7 0.9
ATCC13869-m7 18.8 0.4
ATCC13869-m8 16.2 0.7
ATCC13869-m9 18.9 0.1
ATCC13869-m10 12.4 2.1
ATCC13869-m11 13.8 2.1
ATCC13869-m12 15.7 1.4
ATCC13869-m13 15.3 0.8
ATCC13869-m14 16.4 1.0
ATCC13869-m15 17.2 1.1
ATCC13869-m16 18.2 0.7
표 1을 참고하여, 야생형 균주에 비하여 글루탐산의 생산량이 증가하고, 젖산의 생산량이 감소한 돌연변이 균주로서 "ATCC13869-m7" 및 "ATCC13869-m9"을 선별하였다.
실시예 2. 유전자 시퀀싱을 통한 변이 확인
상기 돌연변이 균주의 유전자 변이를 확인하기 위하여, ATCC13869-m7 및 ATCC13869-m9 균주의 유전자들을 야생형 균주와 비교하였다.
그 결과, 상기 ATCC13869-m7 및 ATCC13869-m9 균주는 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자의 프로모터 영역(promoter region)의 특정 위치에 동일한 변이를 포함하고 있다는 것을 확인하였다.
구체적으로, ATCC13869-m7 및 ATCC13869-m9는 서열번호 2로 표시되는 프로모터 영역의 서열 내 37번째 뉴클레오티드 T가 G로 치환된 변이를 포함하고 있음을 확인하였다. 서열번호 2로 표시되는 상기 프로모터 영역은 코리네박테리움 속 미생물, 보다 구체적으로, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC13032, ATCC13869, ATCC14067)에 공통적으로 포함된 서열임을 확인하였다.
따라서, 이하 실시예 3 및 4에서는, 상기 변이가 코리네박테리움 속 미생물의 글루탐산 및 젖산 생성량에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.
실시예 3. 변이가 도입된 균주 제작 및 젖산 생성량 확인
실시예 3-1. 변이가 도입된 균주 제작
상기 실시예 2를 통해 확인한 변이가 도입된, 변이 균주를 제작하고자 하였다. 구체적으로, 상기 변이를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC13869 및 ATCC13032)에 도입(서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 37번째 뉴클레오티드를 G로 치환)하기 위하여 타겟 변이를 포함하는 역방향의 올리고뉴클레오티드를 75-머(mer)의 길이로 디자인하였다.
구체적으로, 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 30 ㎍을 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 ATCC13869 균주와 ATCC13032 균주에 전기펄스법(Appl. Microbiol. Biothcenol.,1999,52:541-545)으로 형질전환하고, 복합액체배지를 1 ml 첨가하여 30℃에서 30분 동안 160 rpm으로 진탕 배양하였다. 이후, 배양액을 얼음에서 10분간 인큐베이션(incubation)하고, 4℃에서 10분 동안 4000 rpm으로 원심분리한 후 상등액을 제거하여 균체를 확보하였다. 이후, 4℃의 10% 글리세롤 용액을 1 ml 첨가하고 혼합한 후, 4℃에서 10분 동안 4000 rpm으로 원심분리하고 상등액을 제거하여 균체를 세척하였다. 이와 같이 균체를 1회 더 세척하고, 4℃의 10% 글리세롤 용액을 0.1 ml 첨가하여 다음 형질전환을 위한 균주를 준비하였다. 이후, 상기와 같은 전기펄스법으로 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 형질전환하는 과정을 10회 반복한 후, 복합평판배지에 도말하여 콜로니를 확보하였다(Nat. Protoc., 2014 Oct;9(10):2301-16).
상기 확보한 콜로니의 유전자 서열 분석을 수행한 결과, 균주에 상기의 타겟 변이가 도입된 것을 확인하였으며, 변이가 도입된 상기 균주를 "ATCC13869::ldh-pro-1mt" 및 "ATCC13032::ldh-pro-1mt"로 명명하였다.
실시예 3-2. 젖산 생산량 확인
상기 실시예 3-1을 통해 제작한 변이 균주 ATCC13869::ldh-pro-1mt 및 ATCC13032::ldh-pro-1mt와 이들의 각 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC13869 및 ATCC13032)은 각각 실시예 1-2와 동일한 방법으로 배양하였다.
배양이 완료된 후, 각 배지 내 L-글루탐산 농도 및 젖산 농도를 측정하였다. 측정한 L-글루탐산 및 젖산의 농도는 하기 표 2에 나타내었다.
균주명 L-글루탐산(g/L) 젖산(g/L)
ATCC13869 14.5 1.5
ATCC13869::ldh-pro-1mt 19.2 0.0
ATCC13032 8.2 2.7
ATCC13032::ldh-pro-1mt 10.8 0.3
표 2에 나타낸 바와 같이, 변이가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869::ldh-pro-1mt 균주가 생산한 L-글루탐산의 농도는, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869이 생산한 L-글루탐산 농도 대비 약 4.7 g/L(약 32%) 더 높음을 확인하였다. 반면에, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869은 젖산을 1.5 g/L 생산하였으나, ATCC13869::ldh-pro-1mt 균주를 배양한 배지에서는 젖산이 측정되지 않았다.
또한, 변이가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032::ldh-pro-1mt 균주가 생산한 L-글루탐산의 농도는, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032이 생산한 L-글루탐산 농도 대비 약 2.6 g/L(약 32%) 더 높음을 확인하였다. 반면에, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032은 젖산을 2.7 g/L 생산하였으나, ATCC13032::ldh-pro-1mt 균주를 배양한 배지에서는 젖산이 매우 미량(0.3 g/L) 측정되었다.
즉, 상기 변이는 미생물의 L-글루탐산 생성능을 증가시키고 젖산의 생성능을 감소시킨다는 것을 확인하였다.
또한, 상기 균주 ATCC13869::ldh-pro-1mt를 CA02-9209로 명명하고 2018년 2월 28일자로 부다페스트 조약 하의 기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제 기탁하여 KCCM12227P의 기탁번호를 부여받았다.
실시예 4. 변이가 도입된 KFCC11074 균주의 젖산 생성량 및 효소 활성 확인
실시예 4-1. 변이가 도입된 벡터 제작
야생형 균주 이외에, 글루탐산 생산능이 증가된 균주에서도 상기 변이가 동일한 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 글루탐산 생산 균주로 알려진 KFCC11074 균주(한국 등록특허공보 제10-0292299호)에 상기 변이를 도입하고자 하였다.
구체적으로, 상기 균주가 포함하는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 37번째 뉴클레오티드를 G로 치환하기 위하여 유전자 치환 벡터를 제작하였다. 벡터를 제작하기 위한 유전자 단편은 ATCC13869 게노믹 DNA를 주형으로 PCR을 통하여 획득하였다. 미국 국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)에 등록되어 있는 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC13869) 유전자 및 주변 염기서열에 대한 정보를 바탕으로, 서열번호 6, 7, 8 및 9의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 제작하였다.
PCR은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 55℃ 20초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응으로 수행하였다. 보다 구체적으로, 서열번호 6 및 7의 프라이머를 이용하여 증폭한 500 bp의 폴리뉴클레오티드와 서열번호 8 및 9의 프라이머를 이용하여 증폭한 500 bp의 폴리뉴클레오티드를 얻었다. 상기 수득한 두 유전자 단편를 제한효소 BamHI, SalI으로 절단한 pDZ 벡터(대한민국 등록특허 제10-0924065호 및 국제 공개특허 제2008-033001호)에 인퓨전 효소를 이용하여 연결함으로써 유전자 치환 벡터를 제작하였고, 이를 "pDZ-ldh-pro-1mt"로 명명하였다. 상기의 벡터 제작을 위해 사용된 프라이머 서열 정보는 하기 표 3에 나타내었다.
서열번호 프라이머 명 5'서열3'
6 ldh-pro-1mt-AF CGGTACCCGGGGATCCTGTGGGTGGCGTTGTA
7 ldh-pro-1mt-AR CTTTGTTACACCTTTACTTATGCCCGATTATGT
8 ldh-pro-1mt-BF GTAAAGGTGTAACAAAGGAATCCGGGCACAAGC
9 ldh-pro-1mt-BR ATGCCTGCAGGTCGACCCACACTGCGTAGGTC
실시예 4-2. 변이가 도입된 KFCC11074의 제작 및 젖산 생성량 확인
상기 실시예 4-1을 통해 제작한 유전자 치환 벡터를 KFCC11074 균주에 도입하여 변이가 도입된 글루탐산 생산 균주 "KFCC11074::ldh-pro-1mt"를 제작하였다. 변이가 도입되지 않은 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC11074 및 상기 KFCC11074::ldh-pro-1mt 균주는 각각 실시예 1-2와 동일한 방법으로 배양하였다.
배양이 완료된 후, 각 배지 내 L-글루탐산 농도 및 젖산 농도를 측정하였다. 측정한 L-글루탐산 및 젖산의 농도는 하기 표 4에 나타내었다.
균주명 L-글루탐산(g/L) L-젖산(g/L)
KFCC11074 9.1 22.5
KFCC11074::ldh-pro-1mt 17.1 6.5
표 4에 나타낸 바와 같이, 변이가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC11074::ldh-pro-1mt 균주가 생산한 L-글루탐산의 농도는, 변이가 도입되지 않은 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC11074이 생산한 L-글루탐산 농도 대비 약 8 g/L(약 88%) 더 높음을 확인하였다.
반면에, 상기 KFCC11074::ldh-pro-1mt 균주가 생산한 젖산의 농도는, 변이가 도입되지 않은 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC11074가 생산한 젖산의 농도 대비 17 g/L 낮음을 확인하였다.
즉, 상기 변이는 미생물의 L-글루탐산 생성능을 증가시키고 젖산의 생성능을 감소시킨다는 것을 다시 한 번 확인하였다.
실시예 4-3. 변이가 도입된 KFCC11074의 LDH 효소 활성 확인
상기 실시예 4-2를 통해 제작한 KFCC11074::ldh-pro-1mt 균주의 젖산 생성능 감소에 대한 메커니즘을 확인함과 동시에, 상기 변이는 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase: LDH)의 프로모터 내에 포함되어 있음을 확인한바, 상기 변이에 따른 젖산 생산 효소인 락테이트 디하이드로게나제의 활성을 확인고자 하였다.
구체적으로, 상기 효소의 활성 평가는 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 먼저, 세포를 하기 조성의 #3호 배지 25 ml(250 ml flask)에 6시간(30℃, 200rpm) 동안 배양한 뒤, 세포를 침전시켜(4000rpm, 10분) 상층액을 제거하고 20 mM Tris-HCl(pH7.5) 25 ml로 세포 세척을 반복적으로 3회 실시하였다. 세척 후 상층액을 제거하였고, 세포 추출을 위해 20 mM Tris(pH 7.5)의 조성에 15% 글리콜 버퍼(glycerol buffer) 2 ml로 재현탁(resuspension)하여 1 ml을 비드 튜브(bead tube)에 넣고 균질기를 이용해 46/30초 조건으로 균질화를 6회 진행하였다. 이후 4℃, 13000rpm에서 20분 동안 원심분리하였다.
#3호 배지:
(포도당 2%, 폴리펩톤 1%, (NH4)2SO4 1%, KH2PO4 0.52%, K2HPO4 1.07%, 효모엑기스 1%, 유레아(urea) 0.15%, MgSO4-7H2O 0.05%, d-비오틴(d-Biotin) 1.8 mg/L, 티아민-HCl(Thiamin-HCl) 9 mg/L, 칼슘-판토텐산(Ca-pantothenic) 9 mg/L, 니아신아미드(Niacinamide) 60 mg/L
이후, 비드 튜브에서 수득한 상층액(샘플)에 포함되어 있는 단백질의 농도를 확인 및 표준화하기 위하여 브래드포드 어세이(Bradford assay)를 진행하였다. 브래드포드 어세이는 아래의 표 5 및 6을 참고하여 표준 곡선(standard curve)을 확보하고, 샘플의 농도를 확인하였다. 이때, 총 20 ㎕ 부피의 샘플에 1x 바이오라드 프로틴 어세이(Biorad protein assay) 시약을 980 ㎕ 첨가 및 볼텍싱(vortexing)하여 흡광도를 3분 내외로 595nm에서 측정하였다.
<STD 및 추출 샘플링>
mg/mL 0 0.025 0.05 0.1 0.2
BSA(1mg/mL) (㎕) 0 0.5 1 2 4
추출 버퍼 (㎕) 20 19.5 19 18 16
총 부피 (㎕) 20 20 20 20 20
세포 추출물 1/10희석 1/5희석 1/20희석 1/50희석
세포 추출물 (㎕) 2 4 (1/10)10 (1/10)4
추출 버퍼 (㎕) 18 16 10 16
총 부피 (㎕) 20 20 20 20
이후, KFCC11074 및 KFCC11074::ldh-pro-1mt 균주의 락테이트 디하이드로게나제에 대한 활성 실험은 하기 표 7의 반응액 조성비를 이용하여 진행하였고, 스타터(Starter)로서 30 mM 피루브산나트륨(sodium pyruvate)을 사용하였다. 또한, 하기 표 8의 조건으로 측정한 상기 두 균주의 락테이트 디하이드로게나제 활성은 하기 표 9에 나타내었다.
반응액 1번 반응 기준
0.2 M 트리스-HCl pH 7.5 (㎕) 500
30 mM 피루브산나트륨 (㎕) 100
6.6 mM NADH (㎕) 50
세포추출물 (mg/ml) 178μg
DDW Up to 1 ml
Figure PCTKR2019002708-appb-T000001
균주명 LDH 활성 (U)
KFCC11074 0.398
KFCC11074::ldh-pro-1mt 0.150
표 9에 나타낸 바와 같이, 변이가 도입된 균주에서는 락테이트 디하이드로게나제의 활성이 감소함을 확인할 수 있었다.
즉, 상기 변이는 미생물의 락테이트 디하이드로게나제의 활성을 감소시킴으로써 젖산의 생성능을 감소시킨다는 것을 확인하였다.
상기 결과를 모두 종합하면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 하나의 염기가 치환된 변이를 포함하는 락테이트 디하이드로게나제의 프로모터인바, 변이된 프로모터 활성을 통해 야생형 또는 글루탐산 생산 균주에서 락테이트 디하드로게나제의 활성을 약화시켜 발효의 목적 산물인 글루탐산의 생산능을 증가시키며, 나아가 발효 산물의 기호성을 저하시키는 젖산의 생산능을 감소시킬 수 있으므로, 글루탐산을 고수율로 생산하고자 하는 다양한 산업 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본원이 속하는 기술분야의 당업자는 본원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2019002708-appb-I000001

Claims (13)

  1. 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 37번째 뉴클레오티드가 G로 치환된, 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 단백질을 코딩하는 유전자와 작동 가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 또는 제2항의 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 목적 단백질은 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase)인, 벡터.
  6. 제1항의 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 코리네박테리움 속 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, 코리네박테리움 속 미생물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 목적 단백질은 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase)인, 코리네박테리움 속 미생물.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 미생물.
  10. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기의 배지에서 목적 물질을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 물질을 생산하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 목적 물질은 아미노산인, 방법.
  12. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하여 발효하는 단계를 포함하는, 발효 조성물의 제조 방법.
  13. 제12항의 방법에 의해 제조된 발효 조성물.
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